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2012 – 2013
ÍNDICE
Resumen/Abstract 2
1. Introducción 4
Proteínas ABC 4
Subfamilia ABCA 5
Proteína ABCA1 5
Funciones 6
Regulación 8
ABCA1 y diabetes tipo 2 9
2. Objetivos 11
3. Materiales y métodos 12
Muestras 12
Polimorfismos – ABCA1 12
Genotipado 12
Análisis estadístico 16
4. Resultados 17
5. Discusión 27
6. Conclusiones 31
7. Anexos 32
8. Bibliografía 34
1
RESUMEN
El polimorfismo rs2740483 mostró relación estadística con niveles de colesterol total y LDL.
Los individuos G/G presentaron concentraciones mayores de colesterol y LDL respecto de
los G/C-C/C.
Al analizar por sexo, se observaron asociaciones diferentes en cada grupo. Los genotipos
C/T-T/T y G/C-C/C de los polimorfismos rs2422493 y rs2246293 respectivamente, mostraron
asociación a niveles altos de colesterol total y LDL, y a valores bajos de HDL en hombres.
Mientras que en mujeres se asociaron a niveles bajos de LDL.
Los resultados obtenidos en este trabajo muestran que existe una posible asociación de
estos SNPs con parámetros bioquímicos de importancia clínica. Es necesario analizar otras
poblaciones y realizar estudios funcionales a fin de validar los resultados.
2
ABSTRACT
ABCA1 plays a key role in maintaining cellular cholesterol concentrations. The regulation of
its expression is vital, since both the deficit and excess cholesterol could be harmful to the
cell. Genetic variants in this gene have been associated with various metabolic disorders,
including lipid levels in plasma, glucose levels and even the risk of developing diabetes. The
possible role that ABCA1 plays in the development of type 2 diabetes could be due to
alterations in cholesterol levels in β cells. The main objective of this study was to identify
single nucleotide polymorphisms in the ABCA1 gene promoter and evaluate its association
with type 2 diabetes, and clinical or biochemical parameters related to lipid abnormalities in
Spanish population.
Eight polymorphisms have been identified in the region between -500 and +250 bp of 5 'and
3', respectively, in the start of exon 1.
The rs2740483 polymorphism was associated to the levels of total cholesterol and LDL in
general population, G/G individuals presented higher levels of cholesterol and LDL compared
to G/C-C/C.
The analysis according to sex showed differences in each group. The genotypes C/T-T/T
and G/C-C/C of the rs2422493 and rs2246293 polymorphisms, respectively, showed
association with high levels of total cholesterol and LDL, also with low levels of HDL in men.
While in women were associated with low levels of LDL.
New sequence variations were identified in the promoter region of this gene, and although
they have no apparent effect on the phenotype, their association and function should be
investigated in further studies.
The results obtained in this study show the possible effect of these SNPs in clinical and
biochemical parameters. It is necessary to analyze other populations and conduct functional
studies in order to validate these results.
3
1. INTRODUCCIÓN
Proteínas ABC
Las proteínas ABC (ATP-binding cassette) constituyen una de las más grandes súper-
familias de transportadores conocida. Los sustratos transportados por las proteínas ABC
incluyen lípidos, péptidos, aminoácidos, carbohidratos, vitaminas, iones, glucurónidos,
conjugados de glutatión, xenobióticos, entre otros. En los eucariotas, los transportadores
ABC se encuentran en la membrana plasmática, y en las membranas de compartimentos
intracelulares, tales como el aparato de Golgi, endosomas, cuerpos multivesiculares, retículo
endoplásmico, peroxisomas, y en las mitocondrias.
Gráfico 1.1. Genes ABC humanos, ubicación cromosómica y función. (Dean et al. 2001)
4
Subfamilia ABCA
Proteína ABCA1
Los transportadores ABC muestran una organización global común, que comprende dos
mitades de estructura similar (Gráfico 1.3). Cada mitad tiene un dominio transmembrana
que contiene seis hélices y un dominio de unión a ATP, también conocido como dominio de
unión a nucleótido. Este último contiene dos motivos peptídicos conservados conocidos
como Walker A y Walker B, separados entre sí por aproximadamente 90 a 110 aminoácidos
presentes en muchas proteínas que utilizan ATP, y un dominio Walker C característico de
los transportadores ABC. ABCA1 tiene su extremo NH2 terminal orientado hacia el citosol y
posee dos bucles extracelulares que están altamente glicosilados y unidos por uno o más
enlaces de cisteína (Oram & Heinecke 2005, Singaraja et al.2003, Kaminski et al. 2006).
Funciones
Existen varios modelos para explicar el mecanismo de formación de HDL mediada por
ABCA1 (Nagao et al. 2011). Uno de ellos, propuesto por varios estudios, sugiere que
ABCA1 genera dominios lipídicos, en la cara externa de la bicapa lipídica, incluso en
ausencia de apolipoproteínas. Estos dominios sirven para aliviar la tensión que generan los
fosfolípidos densamente empaquetados en la cara interna de la membrana. La generación
de estas superficies curvadas ricas en lípidos en la membrana favorece la interacción con
las apolipoproteínas. La interacción de ABCA1 con las apolipoproteínas activa vías de
señalización, como la JAK2, que a su vez favorecen la unión de apolipoproteinas a ABCA1.
Estas interacciones facilitan el contacto de apoA-I con los dominios lipídicos, la
solubilización de éstos y su salida de la célula (Vedhachalam et al. 2007, Liu y Tang 2011).
6
Gráfico 1.4. Formación de HDL mediada por ABCA1.
(i) Traslocación de fosfolípidos y colesterol a través de la membrana por ABCA1
(ii) apoA-I recepta los lípidos transportados (iii) las curvaturas de la membrana
creadas por ABCA1 interactúan con apoA-I facilitando la captación de
fosfolípidos y colesterol (Nagao et al. 2011)
7
Regulación
En estado basal, LXRβ y RXR (retinoid X receptor) forman un heterodímero, que se une a
elementos de respuesta (LXREs, liver X response elements) en la región promotora de sus
genes diana. Cuando el colesterol se acumula en las células, aumentan las concentraciones
de oxiesteroles, la unión de estas moléculas a LXRβ/RXR favorece la transcripción de
ABCA1, y también de LXRα.
Mir-33, también regula la expresión de ABCA1. Este es un micro RNA ubicado en el gen
SREBF2. Uno de los principales reguladores de la síntesis de colesterol pero también se ha
definido como un inhibidor de la expresión de ABCA1 (Rayner et al.2010).
Debido al papel primordial del colesterol como componente esencial de las células y
principalmente su función estabilizadora de membranas, su eliminación o acumulo excesivos
podrían causar la muerte celular. De ahí la importancia de regular el eflujo de colesterol y
por ende la actividad de ABCA1.
ABCA1 tiene una vida media de 1-2 horas. Se proponen varias vías para la degradación de
este transportador, así: ABCA1 de la superficie celular es endocitado y reciclado a la
superficie celular, o entregado a los lisosomas mediante endosomas tempranos y tardíos
para su degradación. Otra vía es la degradación mediada por calpainas, proteasas que
degradan a ABCA1 a nivel de la membrana plasmática e intracelularmente, especialmente
en ausencia de la unión con apoA-I. Finalmente, otra vía propuesta para la degradación de
ABCA1 es la mediada por proteasoma (Nagao et al. 2011).
8
Una forma de regular la degradación de este transportador es mediante la fosoforilación en
diferentes residuos. Varios estudios revelan que la unión de apoA-I evita la fosforilación de
los residuos de treonina-1286 y treonina-1305 de la secuencia PEST de ABCA1,
consecuentemente disminuye la degradación de la proteína mediada por calpainas (Liu y
Tang 2011).
Algunos estudios indican además, que ABCA1 podría estar asociado al desarrollo de
diabetes tipo 2, principalmente por el papel que desempeña en la homeostasis de la célula β
pancreática.
El colesterol forma parte de los gránulos de secreción como de las membranas, y juega un
papel importante en la formación y tráfico de gránulos. Los islotes pancreáticos deficientes
de ABCA1 presentan una disminución en su capacidad secretora, sin embargo tienen un
alto contenido de insulina intracelular, sugiriendo que en estos existe una alteración en el
proceso de exocitosis más que en la sensibilidad a la glucosa (Brunham et al. 2008, 2010).
Por otro lado, las lipoproteínas aterogénicas, tales como LDL y VLDL inducen la muerte por
apoptosis de islotes en cultivo. Este efecto es bloqueado por las HDL, proponiendo que la
carga de colesterol en los islotes pancreáticos puede ser citotóxica. Las LDL oxidadas
reducen la secreción de insulina mediada por glucosa en la línea celular HIT-T15 (células β
de hámster). Estas lipoproteínas oxidadas reducen también la insulina y el RNAm de la
preproinsulina, además de aumentar la apoptosis. Aparentemente, el colesterol afecta
directamente la función de la célula β y la estimulación de la secreción de insulina mediada
por glucosa (Hao et al. 2007, Brunham et al. 2008).
10
2. OBJETIVOS
General
Específicos
- Secuenciar la región del promotor del gen ABCA1 en individuos de población general
española.
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3. MATERIALES Y MÉTODOS
Muestras
Forman parte de este trabajo 1430 individuos con un rango de edades entre 21 – 96 años de
edad, 709 mujeres y 721 hombres de la población de Valladolid – España.
Las muestras de ADN se diluyeron hasta obtener una concentración de trabajo ≈25ng/ul.
Polimorfismos – ABCA1
En este caso el interés es identificar SNPs en el promotor del gen ABCA1 y estimar su
asociación a variables clínicas y/o bioquímicas de interés.
La secuencia de referencia fue tomada del NCBI. Número de acceso NG 007981, versión
NG_007981.1 G: 189458805. La región a amplificar consideró 500 y 250pb en 5’ y 3’,
respectivamente, del inicio del exón 1 según la secuencia de referencia.
Genotipado
Tamaño del
Nombre Secuencia Tm (ºC)
producto (pb)
ABCA1_Prom_a_5’ AGGCAGTAGGTCGCCTATCA
308 62
ABCA1_Prom_a_3’ GCGCCGCAGACTCTCTAGT
ABCA1_Prom_b_5’ TTGGCTGCCGGGAACGTG
322 68
ABCA1_Prom_b_3’ GCAGAGGTTACTATCGGTCA
ABCA1_E1_5’ TTTCTGCTGAGTGACTGAACTACA
318 62
ABCA1_E1_3’ GACAAGCCTTCCGGAGAA
Los oligonucleótidos utilizados en este paso llevan una secuencia adicional “cola”, que será
reconocida por los oligonucleótidos utilizados en el siguiente paso.
12
El producto de esta amplificación se verificó mediante electroforesis capilar utilizando el
equipo QIAxcel, utilizando una dilución de 1:5 con agua.
Una vez obtenidos los amplicones es momento de añadir a cada muestra una secuencia
específica que servirá para identificar a cada una de ellas como un individuo particular. La
figura siguiente representa los oligonucleótidos utilizados y sus partes.
Purificación y cuantificación
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Al “pool” de muestras obtenido en el paso previo se purifica una vez más mediante la
separación en gel de agarosa al 2%, utilizando el equipo y cassettes PippinPrep de
SageScience.
En este paso se realiza una amplificación clonal de los fragmentos de ADN en microesferas
generadas a partir de una emulsión (Figura 3.3.). El éxito de este paso consiste en que en
cada microesfera haya una sola “capture bead” con una única molécula de ADN unida, esta
unión se da a través de los oligonucleótidos añadidos en la PCR2, forward (secuencia A) o
reverse (secuencia B).
Secuenciación
- La adición de uno de los cuatro dNTPs inicia el segundo paso. La polimerasa cataliza la
incorporación del dNTP al molde si es complementario, la cantidad de PPi liberado es
equivalente a la cantidad de dNTP incorporado.
Todo esto ocurre dentro de los pocillos de una placa de fibra óptica, que permite el paso de
luz, y que está diseñada de tal forma para que en cada pocillo se incorpore una “bead”
(454LifeSciences Corp. 2012).
Análisis
Los resultados iniciales de este análisis indican el número de lecturas por amplicon en cada
dirección y por muestra. La cuantificación de las variantes es expresada en porcentaje de
presencia del nucleótido alternativo, tomando como referencia la secuencia indicada por el
usuario.
15
A partir de estos datos se realiza una primera selección de muestras, se dejan fuera del
estudio aquellas con menos de 10 lecturas. Posteriormente se identifican las variantes
indicadas por el AVA y que ya están reportadas en las bases de datos. Aquellas variantes
reportadas por el AVA y que no están descritas deben ser revisadas para definirlas como tal,
para esto se consideró el número de lecturas, cercanía a un homopolimero y porcentaje.
Para evaluar si las variantes nuevas indicadas por el AVA tienen algún efecto sobre los
factores de transcripción que se unen al promotor del gen ABCA1 se utilizó el programa
MatInspector (Genomatix Software GmbH 2013).
Análisis estadístico
Se utilizó el paquete estadístico SPSS v15.0 para determinar los estadísticos descriptivos de
la población. Los datos se presentan como media y desviación estándar para las variables
cuantitativas y porcentajes para las categóricas.
Para definir el modelo genético bajo el cual se presentarán los resultados se tomó en cuenta
los valores medios de cada genotipo y se agruparon los heterocigotos con el homocigoto
correspondiente según su similitud, en consecuencia se escogió el modelo dominante o
recesivo, si los heterocigotos se unían al homocigoto minoritario o mayoritario,
respectivamente.
Sexo, edad, índice de masa corporal, horas de ayuno se utilizaron como variables de ajuste
en los análisis de asociación.
16
4. RESULTADOS
La población estudiada incluye 1430 individuos, de los cuales el 50,4% (721) son hombres.
La Tabla 4.1. muestra la media y desviación estándar (DE) de las principales características
de la población. La prevalencia de obesidad en la población total fue del 24,7%; se encontró
un 42,2% de hipertensión, 17,2% de hipercolesterolemia, 21% de hipoalfalipoproteinemia,
7,4% de diabetes y un 33,2% de síndrome metabólico.
p=p-valor de la diferencia entre géneros, U de Mann Whitney para variables continuas/estadístico Fisher para
categóricas. NS= no significativo. IMC= índice de masa corporal. ICC= índice cintura cadera. PAS= presión
arterial sistólica. PAD= presión arterial diastólica. CT= colesterol total.
Los criterios que se tomaron en cuenta para la determinación de los parámetros clínicos
fueron: Obesidad: IMC≥30. Sobrepeso: IMC≥25 y <30. Obesidad central: cintura≥88cm en
mujeres y ≥102cm en hombres.
Síndrome metabólico: tener tres o más de los factores de riesgo que incluyen, obesidad
central, presión arterial elevada, niveles bajos de HDL, niveles altos de TG y glucemia
17
elevada o padecimiento de diabetes. Además del diagnóstico previo (OMS, NCEP-ATPIII
2002, EGIR 1999).
En la región analizada del gen se han descrito varios polimorfismos de un solo nucleótido,
sin embargo en este trabajo se hará referencia únicamente a aquellos encontrados en la
población estudiada.
FRECUENCIA FRECUENCIA
SNP
GENOTÍPICA ALÉLICA
C/C 0.24 C 0.51
rs2422493 C/T 0.53 T 0.49
T/T 0.23
G/G 0.24 G 0.51
rs2246293 G/C 0.53 C 0.49
C/C 0.23
C/C 0.68 C 0.82
rs2246298 C/T 0.28 T 0.18
T/T 0.04
G/G 0.31 G 0.57
rs1800976 G/C 0.52 C 0.43
C/C 0.17
C/C 0.999 C 0.999
rs56064613 C/T 0.001 T 0.001
T/T ---
G/G 0.47 G 0.69
rs2740483 G/C 0.44 C 0.31
C/C 0.09
C/C 0.41 C 0.64
rs1800977 C/T 0.45 T 0.36
T/T 0.14
C/C 0.98 C 0.99
rs111292742 C/G 0.019 G 0.01
G/G 0.001
18
Para realizar el análisis de asociación con el perfil lipídico (colesterol total, LDL, HDL y
triglicéridos) se eliminó aquellos individuos que se encontraban en tratamiento con fármacos
hipolipemiantes, para valorar la asociación con glucemia se eliminó a aquellos que tomaban
medicamentos hipoglucemiantes, para evitar que los resultados de asociación se vean
alterados por el efecto farmacológico.
Tabla 4.3. Análisis de polimorfismos como factor de riesgo frente parámetros clínicos en población
general.
Diabetes Hipoalfa-
SNP Genotipo N HCT HTG
tipo 2 lipoproteinemia
rs2422493 C/C 259 1.00 1.00 1.00 1.00
C/T-T/T 823 0.81 (0.46-1.44) 0.87 (0.60-1.27) 1.10 (0.81-1.50) 1.09 (0.74-1.59)
P 0.47 0.48 0.54 0.66
rs2246293 G/G 260 1.00 1.00 1.00 1.00
G/C-C/C 822 0.80 (0.45-1.43) 0.94 (0.65-1.37) 1.07 (0.79-1.45) 1.09 (0.75-1.60)
P 0.46 0.75 0.66 0.65
rs2246298 C/C-C/T 791 1.00 1.00 1.00 1.00
T/T 35 1.69 (0.94-3.05) 1.63 (0.73-3.60) 1.80 (0.82-3.96) 1.04 (0.42-2.56)
P 0.085+ 0.25 0.14 0.94
rs1800976 G/G 237 1.00 1.00 1.00 1.00
G/C-C/C 539 0.82 (0.43-1.54) 0.78 (0.52-1.19) 1.01 (0.73-1.41) 0.92 (0.61-1.38)
P 0.53 0.25 0.94 0.68
rs2740483 G/G 599 1.00 1.00 1.00 1.00
C/G-C/C 670 1.08 (0.69-1.70) 0.88 (0.65-1.20) 0.94 (0.74-1.19) 0.92 (0.69-1.24)
P 0.73 0.42 0.62 0.6
rs1800977 C/C-C/T 535 1.00 1.00 1.00 1.00
T/T 150 1.26 (0.63-2.50) 0.89 (0.56-1.44) 1.11 (0.76-1.62) 1.08 (0.69-1.68)
P 0.52 0.64 0.58 0.75
rs111292742 C/C 1179 1.00 1.00 1.00 1.00
C/G-G/G 29 1.26 (0.63-2.50) 1.38 (0.55-3.48) 0.54 (0.23-1.27) 0.78 (0.28-2.19)
P 0.52 0.51 0.15 0.63
Valores representan OR (IC 95%). Ajustado por sexo, edad, IMC. HCT= hipercolesterolemia.
HTG= hipertrigliceridemia. += modelo dominante C/C vs C/T-T/T
Estatus (individuos que lo presentan) (individuos que no lo presentan)= Diabetes tipo 2: (106) (1324),
HCT: (245) (1182), HTG: (683) (648), Hipoalfalipoproteinemia: (298) (1130)
Como indican los datos mostrados en la Tabla 4.3. no se encontró asociación entre ningún
polimorfismo individual y el riesgo de padecer diabetes tipo 2, hipercolesterolemia,
hipertrigliceridemia e hipoalfalipoproteinemiaen la población general. Al realizar el análisis
por sexo tampoco se encontró que estos polimorfismos actuaran como factores de riesgo
para estas alteraciones (datos no mostrados).
Cabe indicar que se revisaron también las asociaciones entre polimorfismos y obesidad,
sobrepeso, obesidad central y las variables cuantitativas asociadas. Con la finalidad de
descartar alguna asociación a estos factores, por la influencia que tienen sobre el riesgo de
padecer diabetes.
19
Tabla 4.4. Asociación entre polimorfismos y variables cuantitativas en población general.
Los valores representan la media ± desviación estándar (número). p=p-value. Ajustado por sexo, edad, IMC,
horas de ayuno.
Los análisis realizados muestran que el genotipo G/G del polimorfismo rs2740483 se asocia
a niveles más altos de colesterol total y de LDL (p= 0.036 y p= 0.02, respectivamente) Tabla
4.4. Al realizar el análisis por sexo, se mantiene esta tendencia de asociación a los niveles
de colesterol total y LDL, sin embargo solo alcanza significancia estadística con los niveles
de LDL en hombres (p=0.039) (Tabla 4.5.).
20
Tabla 4.5. Asociación entre polimorfismos y variables cuantitativas por sexo.
+
Los valores indican la media ± desviación estándar (número). p=p-value. = p-value modelo dominante.
++
= p-value modelo aditivo. Ajustado por edad, IMC, horas de ayuno.
Los hombres portadores del alelo C del polimorfismo rs1800976 presentaron niveles más
altos de colesterol total frente a los portadores del genotipo G/G (p=0.009). Además, este
polimorfismo mostró asociación con valores de LDL al considerar el modelo aditivo, donde
cada copia del alelo C se relaciona con niveles 5.49mg/dL (IC 95% 0.12 - 10.87) más altos
de LDL, respecto del genotipo G/G (p= 0.046) (Tabla 4.5.).
21
En mujeres, cada copia del alelo T del polimorfismo rs1800977 se asoció con valores
5mg/dL y 4 mg/dL más bajos de colesterol total y LDL, respectivamente (p= 0.024 y p=
0.034, respectivamente) (Tabla 4.5.).
Los genotipos G/C-C/C del polimorfismo rs2246293 mostraron asociación a niveles altos de
colesterol total (p=0.014) y LDL (p=0.009), y a valores bajos de HDL (p=0.035) en hombres.
Mientras que en mujeres se asociaron a niveles bajos de LDL (p= 0.024).
En la Tabla 4.6. se muestran los haplotipos encontrados en la población con una frecuencia
superior al 5%, estos haplotipos son los más frecuentes también en mujeres y hombres pero
con frecuencias distintas entre los haplotipos 2 y 3 (Tabla 4.7. y 4.8.).
22
en la muestra total como al separarla por sexo. Tampoco se encontró asociación con
obesidad y sobrepeso (datos no mostrados).
El haplotipo, TCCCGCC, se mostró como factor protector frente a la diabetes tipo 2, con un
OR de 0.45 (IC 95% 0.21 - 0.98) y p= 0.045, en población general (Tabla 4.6.). Al evaluar
por sexo se pierde la significación estadística.
El haplotipo CGCGGCC, se asoció a niveles altos de glucosa (Diferencia 2.02, IC 95% 0.07
- 3.97 y p= 0.042), colesterol total (Diferencia 5.67, IC 95% 1.18 - 10.16 y p= 0.013) y LDL
(Diferencia 5.9 IC 95% 1.84 - 9.97 y p=0.004) en toda la muestra (Tabla 4.6.). Esta
asociación se mantiene con significancia estadística para el grupo de hombres en el caso de
la glucosa (p= 0.048) y en mujeres para colesterol (p=0.009) y LDL (p= 0.018)(Tabla 4.7 y
4.8.).
Solamente en hombres TCTCGTC, se asoció a niveles más altos de colesterol y LDL (p=
0.02) (Tabla 4.8.), y también con el riesgo a desarrollar obesidad central con un OR 1.97
(1.10 - 3.53) y p= 0.023, respecto del haplotipo más frecuente (datos no mostrados).
Los niveles plasmáticos de HDL se ven disminuidos en hombres portadores del haplotipo
TCCCGTC (p= 0.04) Tabla 4.8.
23
Tabla 4.7.Análisis de haplotipos en mujeres
24
Polimorfismos poco frecuentes:
Para evaluar el posible efecto de estas variantes se considera el fenotipo del portador,
respecto de las características clínicas y bioquímicas que presenta la población general.
Además de analizar si influyen sobre la unión de factores de transcripción.
Como se puede observar en la Tabla 4.9., todos los valores se encuentran dentro de los
percentiles 25 a 75 en hombres y mujeres (datos no mostrados), excepto algunos casos que
se mencionan a continuación.
Los individuos del cambio +29 A/T no presentan un patrón bioquímico y clínico similar. Por lo
que estos valores de triglicéridos y HDL, que se ubican bajo el percentil 10 y sobre el
percentil 90, respectivamente, probablemente no sean efecto de la variante.
Los resultados del análisis con el programa MatInspector mostraron que las variantes de
secuencia -264 G/T, +29 A/T y +233 C/A promueven un cambio en el patrón de factores de
transcripción que reconocen la secuencia. En la Tabla 4.10 se indican aquellos factores de
transcripción que difieren respecto de los que se unen en la secuencia de referencia.
Se han descrito relaciones de importancia clínica con algunos de estos factores, tal es el
caso de la lactoferrina, MYB, GRHL1. Se han publicado en este sentido relaciones con el
metabolismo de lípidos, diferenciación celular y mantenimiento de la integridad de tejidos
(Videm et al. 2012, Yagi et al. 2008, Wilanowski et al. 2008, Lorenzo et al. 2011).
25
Tabla 4.9. Nuevas variantes de secuencia
Edad IMC Cintura Sobre Obesidad PAS PAD Glucosa CT LDL HDL TG
Variante Sexo 2 HTA HTG SM
(años) (Kg/m ) (cm) peso central (mmHg) (mmHg) (mg/dL) (mg/dL) (mg/dL) (mg/dL) (mg/dL)
-264 G/T Hombre 42 28.4 96 Si No 139.5 79.5 No 94 162 81.2 43.6 186 No No
-215 G/T Mujer 74 28.3 90 Si Si 135.7 90.3 Si 95 208 107.8 68.4 159 Yes Yes
Mujer 73 26.3 88 Si Si 138.5 66.5 Si 83 200 111.6 54.8 168 Yes No
+29 A/T Hombre 63 27.7 101 Si No 139.5 89 Si 95 150 87.6 44.8 88 No No
Hombre 70 28.0 104 Si Si 129.5 89 No 86 196 91.8 63.6 203 Yes Yes
+233 C/A Mujer 30 23.6 76 No No 99.5 74.5 No 92 181 102 68.4 53 No No
HTA= hipertensión arterial. HTG= hipertrigliceridemia. SM= síndrome metabólico. En azul los valores que se ubican sobre el percentil 90 o bajo el percentil 10 respecto del
grupo al cual pertenecen.
La proteína muestra un amplio espectro de propiedades, incluyendo la regulación dela homeostasis del hierro, la defensa del
Lactotransferrina y delta-
-264 G/T huésped contra una amplia gama de infecciones microbianas, la actividad anti-inflamatoria, como factor de transcripción regula el
lactoferrinaª
crecimiento y la diferenciación celular y la protección contra el desarrollo del cáncer y la metástasis.
26
5. DISCUSIÓN
A nivel del promotor del gen actúan varios factores de transcripción que regulan su
expresión ya sea promoviendo o inhibiendo su transcripción, la presencia de polimorfismos
a este nivel podría alterar la unión de estos factores reguladores y por ende afectar el
normal funcionamiento celular. Variantes genéticas en ABCA1 se han asociado con diversas
alteraciones, entra ellas los niveles de HDL, la enfermedad cardiovascular y el riesgo a
desarrollar diabetes tipo2 (Tang y Oram, 2009). Considerando esto, el principal objetivo de
este trabajo fue identificar polimorfismos presentes en la región promotora y 5‘ UTR del gen
ABCA1 y evaluar su asociación a diabetes tipo 2 o a parámetros bioquímicos y clínicos
relacionados con alteraciones lipídicas en población española.
El genotipo G/G del polimorfismo rs2740483 mostró asociación con niveles altos de
colesterol total y LDL en la población (Tabla 4.4). En mujeres y hombres se mantiene la
tendencia pero muestra asociación estadística únicamente para los valores de LDL en
hombres (Tabla 4.5). Este polimorfismo junto con otros se ha estudiado en diferentes
poblaciones, pero no se han encontrado asociado a valores lipídicos (Kiriakou et al.2007,
Regieli et al.2011).
27
Resulta llamativo el efecto contrario que presentaron los genotipos de los polimorfismos
rs2422493, rs2246293 en ambos sexos, respecto a las concentraciones lipídicas. Estos
polimorfismos inducen la unión de factores de transcripción diferentes respecto de la
secuencia de referencia, sin embargo estos no muestran una relación directa con el sexo
aunque sí podrían tener un efecto sobre la expresión del promotor (Anexo 1). El efecto de
las condiciones fisiológicas propias de cada sexo podría estar modulando este efecto a
través de diferentes señales y actuando de diferente forma mediante estos factores de
transcripción. Los polimorfismos señalados anteriormente se han estudiado en varias
poblaciones para evaluar su efecto sobre parámetros clínicos y bioquímicos.
rs2246293 ha sido relacionado con la edad de aparición de los síntomas en pacientes con
enfermedad coronaria, apareciendo los síntomas 2.8 años más tarde en los portadores del
alelo C respecto de los portadores del alelo de referencia (G), quienes además presentaban
estenosis coronaria a temprana edad. Además, la región promotora con el alelo C mostró
mayor actividad favoreciendo la transcripción del gen (Kiriakou et al.2007).
rs1800977 se ha relacionado con niveles altos de HDL en hombres y a valores altos de HDL
en ambos sexos cuando se presenta en combinación con el polimorfismo R219K (Hodoglugil
et al. 2005). En un estudio realizado en pacientes con enfermedad coronaria y controles
sanos, rs1800977 mostró asociación a niveles bajos de triglicéridos y VLDL, aunque no se
mostraron diferencias significativas entre los dos grupos de estudio (Ergen et al. 2008). En el
presente trabajo el alelo T del polimorfismo rs1800977 estuvo asociado a niveles bajos de
colesterol y LDL en mujeres.
Los polimorfismos rs1800976 y rs1800977 se han postulado también como factores que
aumentan el riesgo de eventos coronarios, esto sin que necesariamente tengan efecto sobre
valores de lípidos plasmáticos (Zwarts et al. 2002).
28
Si bien se ha indicado por varios estudios el efecto de los polimorfismos de ABCA1 sobre los
valores de lípidos en plasma, existen discrepancias en los resultados, posiblemente debido
a las características de las poblaciones analizadas, esto es origen, edad, características
clínicas, alimentarias, entre otras. Las diferencias entre géneros en cuanto a la expresión
fenotípica de un mismo polimorfismo probablemente sean el resultado de un efecto complejo
y multifactorial que involucre las hormonas sexuales (Hodoglugil et al. 2005, Abellán et al.
2010).
Tal como se indicó en los resultados, las asociaciones encontradas en esta población
pierden significación estadística al aplicar la corrección de Bonferroni. El presente estudio es
un estudio piloto para determinar si es interesante el estudio de esta región en una muestra
amplia; si bien, los resultados obtenidos no son concluyentes a nivel estadístico sí que
podría considerarse que confirman nuestras sospechas de un posible efecto en las variables
de interés.
Ninguno de los polimorfismos individualmente mostró relación con los niveles plasmáticos
de glucosa o el padecimiento de diabetes tipo 2 en toda la muestra, sin embargo el haplotipo
TCCCGCC se presentó como factor protector frente a la diabetes tipo 2 (OR de 0.45, IC
0.21 - 0.98, p=0.045), y el haplotipo CGCGGCC se asoció a niveles altos de glucosa
(p=0.048) (Tabla 4.6.). Cabe señalar, que la significancia de esta asociación es débil,
probablemente el número de individuos limita el poder estadístico, por lo que nuevos
estudios son necesarios para validar estos resultados.
El haplotipo CGCGGCC, además mostró asociación a valores altos de colesterol total y LDL
(p=0.01 y p=0.004, respectivamente). Cabe indicar que el haplotipo CGCGGCC contiene el
alelo G del polimorfismo rs2740483, el cual estuvo asociado a colesterol y LDL en la
población cuando se evaluó su efecto individualmente, y es el único alelo que difiere
respecto del haplotipo más frecuente.
29
Finalmente, cabe indicar que se encontraron nuevas variantes de secuencia en el promotor
del gen ABCA1 (Tabla 4.10 y 4.11). In silico los cambios -264 G/T, +29 A/T y +233 C/A
modifican el patrón de factores de transcripción que reconocen el promotor del gen,
considerando como referencia la secuencia NG 007981 del NCBI. Aparentemente, estos
factores de transcripción no tendrían influencia directa sobre ABCA1. Harían falta estudios
funcionales para descartar esta opción.
Dado el importante papel que desempeñan algunos de estos reguladores (lactoferrina, MYB
myeloblastosis viral oncogene homolog, GRHL1 Grainyhead-like1), en procesos como
diferenciación celular, metabolismo lipídico, relación con ciertas manifestaciones clínicas,
regulación de la expresión de otros factores transcripcionales, renovación celular, se
constituyen en objetivos para el desarrollo de estudios en este sentido (Wilanowski et al.
2008, Lorenzo et al. 2011, Videm et al. 2012). Por otro lado, todos estos factores de
transcripción se expresan en el páncreas, hígado, tejido adiposo, etc. lugares donde podrían
regular la actividad del ABCA1, si bien este extremo habría que estudiarlo mediante estudios
específicos.
El análisis del efecto que tienen los polimorfismos rs2422493, rs2246293, rs2246298,
rs1800976, rs2740483 y rs1800977 sobre la unión de factores de transcripción al promotor
del gen ABCA1, indica algunos factores que podrían estar regulando su expresión (Anexo
1). En algunos casos se han descrito funciones importantes en el desarrollo y
funcionamiento del páncreas, e incluso en el desarrollo de diabetes.
Con los resultados de este trabajo se ha obtenido una referencia del posible efecto de estos
polimorfismos sobre variables bioquímicas de interés clínico, sobre todo aquellas
relacionadas con el metabolismo lipídico. Sin embargo es necesario que estos resultados se
valoren en otras poblaciones de características similares, y se realicen estudios funcionales
a fin de validar el efecto de estos polimorfismos.
30
6. CONCLUSIONES
31
7. ANEXOS
El receptor de estrógeno (ER) es miembro de la superfamilia de receptores nucleares. ER se une a secuencias específicas de
Estrogen response ADN denominadas elementos de respuesta a estrógenos y activa la expresión génica en respuesta a estradiol. El estrógeno y
elementsª sus receptores son esenciales para el desarrollo sexual y la función reproductiva, también juegan un papel en otros tejidos como
hueso. Los receptores de estrógenos también están implicados en procesos patológicos, como el cáncer de mama, cáncer de
rs1800976 endometrio, y la osteoporosis.
G/C Regulador transcripcional con once dominios dedos de zinc. Dependiendo del contexto puede unirse una histona
CCCTC-binding factor*
acetiltransferasa, o histona desacetilasa y actuar como activador o represor transcripcional, respectivamente. Se lo ha asociado
con los cánceres invasivos de mama, cánceres de próstata, y tumores de Wilms.
cAMP-responsive element Factor de transcripción que se une como un homodímero al elemento de respuesta a AMPc, un palíndromo octamérico. La
binding proteins * proteína se fosforila por varias cinasas, induce la transcripción de genes en respuesta a la estimulación hormonal por la vía del
cAMP.
rs2740483
GABP: GA binding proteinª Factor de transcripción capaz de interactuar con repeticiones ricas en purina (GA repeticiones). Puede estar implicado en la
C/G
activación de la expresión de la citocromo oxidasa y el control nuclear de la función mitocondrial.
Insulator protein CTCF Regulador transcripcional recononce dominios dedos de zinc. Dependiendo del contexto puede unirse una histona
(CCCTC-binding factor)ª acetiltransferasa, o histona desacetilasa y actuar como activador o represor transcripcional, respectivamente. Se lo ha asociado
con los cánceres invasivos de mama, cánceres de próstata, y tumores de Wilms.
EGR1, early growth Regulador transcripcional. Reconoce y se une a la secuencia de ADN 5'-CGCCCCCGC-3 '(EGR-site). Activa la transcripción de
genes diana, cuyos productos se requieren para la mitogénesis y diferenciación.
32
response 1ª
Kruppel-like factor 6ª Miembro de la familia de factores de transcripción Kruppel. Es un activador transcripcional, y funciona como un supresor
tumoral. Se han descrito isoformas implicadas en la carcinogénesis.
v-Myb* Esta proteína desempeña un papel esencial en la regulación de la hematopoyesis y puede desempeñar un papel en la
tumorogénesis.
Smad4 transcription factor Esta proteína se une al ADN y reconoce una secuencia palindrómica8-bp (GTCTAGAC) llamada elemento de unión a Smad.
rs1800977
involved in TGF-beta Forma complejos con otras proteínas Smad activadas, y regulan la transcripción de genes en respuesta a TGF-beta. Sus
C/T
signalingª alteraciones se han relacionado con cáncer de páncreas, síndrome de poliposis juvenil, y el síndrome de telangiectasia
hemorrágica hereditaria.
Referencias: NCBI, GeneCards.*factor de transcripción que se une a la secuencia de referencia pero no cuando está presente el cambio. ªfactor de transcripción que se une cuando está
presente el cambio y que no se encuentra en la secuencia de referencia.
33
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