El nacimiento de una nueva era

En la década de 1950 se descubrió que los genes no eran nada más y nada menos que cadenas de
nucleótidos. Un descubrimiento que parece tan sencillo desencadenó, sin embargo, el nacimiento de
una nueva era: la de la tecnología del ADN recombinante.

La primera molécula de ADN recombinante fue creada por Paul Berg, a comienzos de los 70. Para
aquella época, los biólogos moleculares habían aprendido a alterar genes individuales, cortar y pegar
pedazos de ADN de diferentes organismos y moverlos de uno a otro.

Otros pioneros de esta tecnología fueron Stanley Cohen, un genetista estadounidense, y Herbert
Boyer, un bioquímico de la misma nacionalidad. Cohen estaba interesado en aprender cómo los genes
de plásmidos otorgan resistencia a las bacterias y Boyer trabajaba con enzimas de restricción (ver
apartado 3.3.), por lo que decidieron trabajar juntos en la combinación de dos plásmidos resistentes a
antibióticos diferentes para crear una bacteria resistente a ambos.

¿Qué es la tecnología del ADN recombinante?

ADN recombinante es una molécula que proviene de la unión artificial de dos fragmentos de ADN. Por
lo tanto, la tecnología de ADN recombinante es el conjunto de técnicas que permiten aislar un gen
de un organismo, para su posterior manipulación e inserción en otro diferente. De esta manera
podemos hacer que un organismo (animal, vegetal, bacteria, hongo) o un virus produzca una proteína
que le sea totalmente extraña.

Estas técnicas se emplean normalmente para la producción de proteínas en gran escala, ya que
podemos hacer que una bacteria produzca una proteína humana y lograr una superproducción, como
en el caso de la insulina humana, que actualmente es producida por bacterias en grandes recipientes
de cultivo, denominados biorreactores. Como las bacterias se multiplican muy rápidamente y pueden
expresar grandes cantidades de proteínas, es posible lograr una sobreproducción de la proteína
deseada. A esto justamente se dedica la biotecnología, es decir a la utilización de organismos vivos o
de sus productos con fines prácticos.

El desarrollo de la tecnología del ADN recombinante fue posible gracias a varias líneas de investigación:
1) el conocimiento de las enzimas de restricción, 2) la replicación y reparación de ADN, 3) la replicación
de virus y plásmidos y 4) la síntesis química de secuencias de nucleótidos.

¿Cómo cortar y pegar el ADN? Tijeras moleculares: enzimas de

restricción
En 1975 Daniel Nathans y Hamilton O. Smith descubrieron un tipo de proteínas -las
enzimas endonucleasas o enzimas de restricción- que actúan como "tijeras moleculares", cortando
la doble cadena de ADN a través del esqueleto de fosfatos sin dañar las bases. El descubrimiento de
estas enzimas condujo a dichos microbiólogos al Nobel en 1978 y dio origen a la ingeniería genética.

Las enzimas de restricción son producidas por bacterias como método de defensa contra virus y
degradan el ADN extraño.

A su vez, el propio genoma bacteriano está protegido contra sus enzimas de restricción
mediante metilaciones (es decir, el agregado de un grupo metilo [-CH3)]) en un átomo específico de
ciertos nucleótidos.

Estas moléculas son indispensables para la ingeniería genética, ya que producen fragmentos que se
pueden unir entre sí fácilmente (con la ayuda de un "pegamento molecular": la enzima ligasa).

Las enzimas de restricción cortan dejando extremos cohesivos o romos. Los extremos cohesivos son
generados cuando la enzima corta las dos hebras asimétricamente, dejando los extremos de cada
hebra de simple cadena complementarios entre sí. Por otro lado, los extremos romos son generados
cuando la enzima corta las dos hebras por el mismo lugar, generando dos extremos doble cadena.
Figura 1. Enzimas de restricción. Este tipo de endonucleasas puede dejar dos tipos de extremos. En el
primer caso, el corte genera nucléotidos de simple cadena llamados extremos cohesivos. Estos
extremos se pueden unir por medio de otra enzima, la ADN ligasa. En el segundo caso, se generan
extremos doble cadena (extremos romos). Estos extremos también pueden ser unidos con la ayuda de
una enzima ligasa pero, como no los extremos no son complementarios, la unión será más inespecífica.

Las enzimas de restricción permiten cortar el genoma de cualquier organismo en pequeños fragmentos
llamados fragmentos de restricción. La colección de miles o millones de estos fragmentos se
llama biblioteca génica.

¿Cómo introducir ADN recombinante en las bacterias?

Una vez que los biólogos encontraron cómo fabricar ADN recombinante usando enzimas de restricción y
ligasas, el desafío siguiente fue cómo producir grandes cantidades de genes y cómo introducirlos en
bacterias u otras células huésped. El primer problema fue solucionado con el uso de plásmidos,
pequeñas moléculas de ADN circular presente en muchas bacterias.

Los plásmidos contienen uno o más genes de resistencia a antibióticos y son capaces de
autorreplicarse, ya que contienen una secuencia de iniciación. Esto les permite replicarse de manera
independiente del ADN genómico.

Podemos crear una molécula de ADN recombinante usando un plásmido. Este proceso consta de las
siguientes etapas:

1. Cortamos el ADN circular del plásmido con enzimas de restricción, para generar extremos
cohesivos.
2. Cortamos el ADN que queremos multiplicar. Debemos asegurarnos de que los extremos del
plásmido y los del ADN a insertar sean complementarios y puedan unirse.

3. Unimos el gen que queremos introducir (inserto) por medio de la enzima ADN-ligasa y luego
introducimos el plásmido con inserto en bacterias.

4. Seleccionamos las bacterias que hayan introducido el plásmido con la ayuda de antibióticos.
Dado que los plásmidos contienen un gen de resistencia a antibiótico, al exponer las bacterias a
ese antibiótico, sólo las que hayan incorporado el plásmido (y con él la resistencia)
sobrevivirán, mientras que las que no lo tengan morirán.

Esta es una manera relativamente eficaz de obtener millones de copias del ADN incorporado. Dado que
todas las copias del gen provienen de una sola molécula multiplicada a partir de una única bacteria que
dio origen a la colonia, esta técnica lleva el nombre de clonación. El término clon proviene de la
jardinería; desde hace siglos los jardineros generan plantas nuevas a partir de gajos. Estas plantas son
genéticamente idénticas y constituyen un clon.

Un clon es un grupo de células u organismos genéticamente idénticas.

El uso fragmentos de ADN como vectores cumple un rol fundamental en la ingeniería genética, ya que
sirven para transferir material genético de un organismo a otro.
Vector: cualquier organismo o virus capaz de mover genes de un organismo a otro

¿Cómo amplificar el ADN? Reacción en cadena de la polimerasa

Durante las décadas de 1970-1980, la manera más práctica de hacer múltiples copias de una secuencia
particular de ADN era intro|duciendo una molécula de ADN recombinante (un plásmido más un gen) en
una célula huésped. Esto podía resultar un poco engorroso, ya que muchas veces se disponía de una
cantidad muy pequeña de moléculas de ADN para realizar pruebas.

A mediados de la década de los 80, la invención de una técnica capaz de generar centenares de miles
de copias de una secuencia sin la necesidad de clonarla en ningún tipo de vector resolvió este
problema. Kary Mullis, un bioquímico americano que trabajaba sintetizando ADN, resolvió este
problema con la invención de la reacción en cadena de la polimerasa.

Esta se basa en la separación de ambas hebras de ADN, la posterior unión de pequeños fragmentos
(denominados primers) y la extensión de estos fragmentos usando de molde el ADN de la muestra. Así
se obtienen dos copias idénticas por cada molécula en cada ciclo de reacción. Para llevar a cabo esta
reacción se requiere de una enzima polimerasa que sea capaz de soportar la alta temperatura del
proceso de desnaturalización. Esta enzima es una ADN-polimerasa especial obtenida de una bacteria
termófila (la Thermus aquaticus), resistente a altas temperaturas.

La reacción en cadena de la polimerasa permite amplificar la muestra de manera espectacular y su

sensibilidad es tal que alcanza con una molécula para que la reacción genere una infinidad de copias.
Esto la convierte en una importante, si no imprescindible, herramienta para el análisis de filiación o de
criminalística forense, ya que con sólo una pequeñísima muestra se pueden realizar diferentes estudios
comparativos que nos permiten conocer el dueño de un "rastro" genético en particular.

También se usa para el desarrollo de nuevas estrategias de diagnóstico médico, como la detección de
virus o de mutaciones que provocan enfermedades genéticas, a partir de una muestra de ADN tan
pequeña como un cabello o una gota de sangre.

Otra aplicación de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa es la transcripción inversa de

ARNm. Mediante el uso de una enzima de origen viral denominada transcriptasa reversa puede usarse
como molde una molécula de ARNm, transcribirla a una secuencia de ADN, y luego ser amplificada
como cualquier otra secuencia por la reacción en cadena de la polimerasa, con lo que se obtiene una
gran cantidad de ADN a partir de unas pocas moléculas de ARNm. Esta técnica es muy empleada para
el estudio de expresión génica, así como para la producción de proteínas en diferentes organismos.

¿Cómo encontrar el gen adecuado? Imanes biológicos: sondas y

anticuerpos
Hasta hace relativamente poco, encontrar un gen en un genoma era como encontrar una aguja en un
pajar. Si tuviéramos que realizar dicha tarea, probablemente usaríamos un imán para atraer la aguja
(siempre y cuando esta sea de metal y posea propiedades magnéticas). De manera análoga, hoy día
podemos encontrar genes o proteínas usando, respectivamente, sondas y anticuerpos, que actúan
como imanes moleculares.

Las sondas son fragmentos de ADN o ARN de simple cadena complementarias a la región de ADN o
ARN que queremos encontrar. Contienen alguna "marca" que permite revelar su unión (hibridación) a
la secuencia elegida y de esa manera revela presencia de la región buscada.

¿Cómo se marcan esas sondas o fragmentos de ácidos nucleicos? Las sondas pueden ser
"coloreadas" durante su síntesis utilizando nucleótidos marcados con isótopos radiactivos. Otra manera
de marcarlas es mediante la unión con una molécula que pueda ser detectada posteriormente como
fluorescente, un marcador químico que puede ser detectado por un anticuerpo, o una enzima cuya
actividad produce el cambio de color de su sustrato.

Una de las técnicas más empleadas para localizar fragmentos determinados del genoma (o la expresión
de algún gen en particular por medio de la detección de la presencia de su correspondiente ARNm) es
la hibridación in situ. Durante este proceso se incuba el ADN con una sonda (de ADN o ARN)
complementaria a la secuencia buscada, y marcada radiactiva o químicamente.

La sonda "navega" por el interior de la célula hasta encontrar una secuencia complementaria a ella.
Una vez que esto ocurra se formará una doble cadena que permitirá no sólo detectar la presencia de
esta secuencia, sino indicar el lugar específico que ocupa dentro de la célula. Si se tratara de un
fragmento de un cromosoma, nos permitiría saber su localización exacta o locus.

Para revelar la presencia de hibridación de la sonda, la muestra debe exponerse a una placa
radiográfica; en el caso de las sondas marcadas químicamente se procede a su revelado mediante el
uso de moléculas fluorescentes o que puedan ser detectadas por colorimetría (utilizando una enzima
que provoque el cambio de color de un sustrato).

Se puede también utilizar colonias de bacterias con ADN recombinante con una técnica similar, pero
que usa anticuerpos en vez de sondas. Se comienza por una colonia de bacterias que contengan y
expresen el gen de ADNc. Luego se trata las bacterias con un anticuerpo marcado, que se unirá a la
colonia que sintetice la proteína deseada. De esta manera se puede localizar el gen en cuestión y
clonarlo para obtener múltiples copias.

¿Cómo estudiar la expresión de diversos genes?

Si visitamos un laboratorio de biología molecular, probablemente encontraremos una cuba con un gel al
cual se le aplica una corriente eléctrica. Este método, llamado electroforesis en gel, es muy usado
para separar moléculas de diversos tamaños y es la base de las técnicas que describiremos para
identificar ADN, ARN, y proteínas. En los párrafos siguientes describiremos entonces la electroforesis
para poder comprender luego cómo funcionan las demás técnicas.

Separación de ácidos nucleicos y proteínas. Electroforesis en gel

La electroforesis en gel es uno de los métodos más utilizados en los laboratorios para separar ácidos
nucleicos o proteínas, de acuerdo con su tamaño. Esto se logra por la diferencia de desplazamiento de
las moléculas a lo largo de un gel sometido a un campo eléctrico. La carga eléctrica sirve como fuerza
impulsora que atrae las moléculas cargadas negativamente hacia el otro extremo del gel que posee
carga positiva. Existen distintos tipos de gel; comúnmente se utiliza agarosa o poliacrilamida.

La velocidad de desplazamiento de las moléculas es inversamente proporcional a su tamaño. En los

ácidos nucleicos la carga está dada por los nucleótidos, por lo que el tiempo que tardará la molécula en
atravesar el gel será directamente proporcional al número de nucleótidos que tenga, es decir a su
tamaño. De esta manera, para un tiempo determinado, las moléculas más grandes quedarán más
retrasadas en el gel que las moléculas más pequeñas.

La separación de proteínas es un poco mas complicada, ya que éstas poseen una estructura
tridimensional compleja y compacta, además de una carga neta que depende de la identidad de los
aminoácidos que la componen. Esto hace más difícil separarlas sólo por su tamaño y por eso se emplea
una versión modificada conocida como electroforesis en gel de poliacrilamida. Las proteínas
forman bandas de acuerdo con su tamaño; si se corre una muestra con proteínas de tamaño conocido
se puede determinar el tamaño de la proteína estudiada por la distancia recorrida en el gel. Las
proteínas más grandes quedarán arriba y las más chicas quedan abajo (y las de tamaño medio
quedarán entre las demás). Además, el grosor de la banda obtenida dependerá de la cantidad de
proteína que se haya sembrado; cuanto mayor sea la cantidad de proteínas, más gruesa será la banda.
Figura 1. Electroforesis en gel. Se siembra la muestra (ADN, ARN o proteínas) en un gel que es
sometido a una corriente eléctrica. Las moléculas se mueven a través del gel impulsadas por dicha
corriente. Esta técnica permite separar moléculas de acuerdo a su tamaño y carga ya que las más
pequeñas (o aquellas con mayor carga) se mueven con mayor velocidad. El gráfico muestra bandas de
distinto ancho, correspondientes a distinta cantidad y tamaño de la muestra de proteínas.

¿Cómo estudiar la expresión de diversos genes? Southern,

Northern y Western Blot
Existen diferentes técnicas que emplean la separación en gel por electroforesis como primer paso para
identificar la presencia de determinadas moléculas dentro de una muestra. Una de ellas fue inventada
por Edward M. Southern en 1975 para la detección de ADN. Una vez finalizada la corrida en el gel, se
realiza la transferencia (o blotting) de las muestras a una membrana para su posterior revelado. Luego
se utilizó el mismo sistema para detectar ARN y se lo denominó Northern Blot (en clara alusión al
nombre del científico inventor de la técnica basada en ADN).

Estas dos técnicas consisten en una electroforesis seguida de transferencia y emplean secuencias
específicas (sondas) complementarias a la molécula de ácido nucleico a identificar. Es decir, ambas
utilizan la hibridación de ácidos nucleicos para la detección de las moléculas buscadas. Los principios
generales son los mismos, pero hay diferencias en el procedimiento debidas principalmente a que el
ARN se degrada mucho más fácilmente que el ADN; esto hace necesario tomar muchas más
precauciones.

Una vez sembradas las muestras en un gel, se realiza una corrida electroforética hasta lograr que las
moléculas se separen por tamaños de manera tal que se puedan distinguir las buscadas. Luego se
transfieren los ácidos nucleicos del gel a la membrana. De esta manera los que quedan retenidos
pueden ser sometidos a ensayos de hibridación con sondas específicas para detectar la presencia de
determinadas secuencias.

Estas dos técnicas persiguen fines distintos: el Southern Blot, que detecta la presencia de ciertas
secuencias en el ADN, se usa, por ejemplo, para estudiar mutaciones en el genoma. El Northern, en
cambio, permite detectar qué genes son transcriptos en determinadas condiciones. Hemos visto que
dos células del mismo organismo se distinguen por los genes que expresan y no por su ADN. El
Southern Blot nos permite evidenciar el mismo material genético y el Northern Blot, la expresión de
diferentes genes.

Si luego queremos detectar proteínas, usaremos otra técnica similar: el Western Blot, que deriva de la
electroforesis en gel y separa proteínas mediante la utilización de anticuerpos específicos. Una vez que
la muestra con las proteínas que se quiere identificar ha corrido en un gel, se la transfiere a una
membrana especial donde las proteínas quedan "ancladas" o adheridas. Después, se incuba esta
membrana con el anticuerpo específico contra la proteína blanco, y se revela. Con esta técnica pueden
obtenerse datos aproximados del tamaño de la proteína y su concentración en la muestra sembrada.

¿Cómo sacar fotos de genes activados? Microarreglos

Otra técnica que emplea la hibridación de sondas específicas marcadas es la de microarreglos
(Microarrays), que consta de una membrana dividida en celdillas que poseen adheridas sondas que
representan un gen en particular. En conjunto, estas celdillas contienen todos los genes conocidos de
un organismo. De esta manera, cuando se coloca una muestra en estos chips se irá hibridando cada
gen que se encuentre en la muestra con su sonda correspondiente en la casilla determinada. Cuando
una celdilla da positivo, quiere decir que ese gen determinado está presente en la muestra.

Los ensayos con microarreglos son rápidos de realizar, pero muy engorrosos de analizar. Además,
están muy limitados a los genes que ya se conocen. Permiten obtener un pantallazo rápido sobre qué
está pasando en la célula en ese momento determinado, en cuanto a qué genes están encendidos y
cuáles apagados. Sin embargo, los resultados obtenidos nunca deberían ser concluyentes, sino que
tendrían que ser validados mediante otras técnicas (por ejemplo, Northern Blot).

Microarreglos: esta técnica permite analizar simultáneamente miles de genes.