Transferencia de Embriones

Procedimiento de
Transferencia de
Embriones en Bovinos
Un manual de instrucciones para el veterinario,
criador de ganado de carne, lechero, técnico de insemi-
nación artificial y zootecnista
Por
John L. Curtis, Ph.D.
Presidente, Agtech, Inc.
www.agtechinc.com
© 2009 por John L. Curtis
Todos los derechos reservados. Prohibida su reproducción total o parcial en cualquier

forma o medio, ya sea electrónico o mecánico, incluida la fotocopia, grabación o cualquier
sistema de almacenamiento y recuperación de información, sin la autorización por escrito
del propietario de los derechos de autor..
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8801 Anderson Ave.
Manhattan, KS 66503 USA
agtech@agtechinc.com
ISBN 978-0-615-31349-8
Publicado por Agtech, Inc.
Originalmente publicado por John L. Curtis bajo ISBN 0-12-200240-7. Posteriormente,

publicado por Academic Press, Inc. Derechos de autor y derechos de publicación reasig-
nados por Academic Press, Inc., para el Dr. Curtis en 2006.
Impreso en los Estados Unidos de América
– ii –
Contenido
Prefacio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . iii
Definición de Términos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . iv
Visión General del Procedimiento de Transferencia de Embriones . . . . . . . . vi
Capítulo 1: Manejo del Ganado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.1 Programa de salud . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.2 Programa de nutrición . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Capítulo 2: Superovulación, Inseminación Artificial, Sincronización . . . . . . . 7
2.1 Superovulación de donadoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.2 Inseminación de donadoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2.3 Sincronización de receptoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
Capítulo 3: Recuperación de Embriones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
3.1 Fecha de recolección e identificación de receptoras . . . . . . . . . . 15
3.2 Instrumentos, suministros y plan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
3.3 Preparación de donadoras para el lavado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
3.4 Procedimiento de recuperación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Capítulo 4: Manipulación de Embriones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
4.1 Enjuagando el filtro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
4.2 Búsqueda y extracción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
4.3 Clasificación de embriones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
4.4 Asignación de embriones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
4.5 Carga de pajuela . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
Capítulo 5: Congelación de Embriones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
5.1 Equipo y suministros . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
5.2 Certificación de apareamiento, transferencias y congelación . . . . 36
5.3 Etiquetado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
5.4 Criterios para la congelación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
5.5 Secuencia para la congelación de embriones para TD . . . . . . . . . 39
Capítulo 6: Transferencia de Embriones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
6.1 Identificación de receptoras utilizables . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
6.2 Compatibilidad de embriones con receptoras . . . . . . . . . . . . . . . . 44
6.3 Descongelación de embriones en glicerol . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
6.4 Descongelación de embriones para TD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
6.5 Instrumentos de transferencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
6.6 Procedimiento de transferencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
Apéndice A. Etapas gráficas de desarrollo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
Apéndice B. Formulario ABC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
Apéndice C. Procedimiento de tratamiento con tripsina . . . . . . . . . . . . . . . . 52
Apéndice D. Descongelación de embriones en glicerol . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
Apéndice E. Organizaciones profesionales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
– iii –
Prefacio
Este texto está diseñado como un manual de instrucciones para veterinarios, criadores
de ganado de carne, lechero, técnicos de inseminación artificial, y zootecnistas
previamente capacitados en la técnica de inseminación artificial de bovinos. En una
secuencia paso a paso, se explican o ilustran los elementos necesarios para implementar
la tecnología de transferencia de embriones en su hato (o para ofrecer servicios de
transferencia de embriones a sus clientes). El DVD que se acompaña en el interior de la
contraportada proporciona ayudas visuales de la instrucción que complementan este
manual. Si su deseo es sólo transferir embriones congelados/descongelados, esta
información se puede encontrar en las secciones 2.3, 3.1, 3.3, el capítulo 6
completo, y en el DVD que se incluye.
El Dr. Curtis recibió su capacitación en transferencia de embriones en la Universidad

Estatal de Colorado mientras cursaba un Máster en Fisiología y Biofísica, bajo la
dirección del Dr. Peter Elsden y el Dr. George Seidel. Su Doctorado en Zootecnia lo
obtuvo en la Universidad Estatal de Kansas. Antes de fundar Agtech, Inc., el autor
registra doce exitosos años de práctica profesional con un récord de miles de gestaciones
en los Estados Unidos a lo largo de catorce estados del medio oeste y noreste del país.
Se ha desempeñado como director técnico de Twin Brook Genetics, Wilton, New
Hampshire, como propietario/operador de Curtis Embryo Transfer Co., Oneonta, Nueva
York, como vicepresidente de Operaciones de Embriones para Dreamstreet Holsteins,
Inc., Walton, Nueva York y es actualmente el fundador y presidente de Agtech, Inc. en
Manhattan, Kansas, EE.UU.
El Dr. Curtis sigue llevando a cabo cursos prácticos de recolección, congelación y

transferencia de embriones bovinos a nivel nacional e internacional. Ha capacitado
formalmente a más de 500 estudiantes (veterinarios y ganaderos) en la tecnología de
transferencia de embriones. Se desempeña como consultor de clínicas y cooperativas
nuevas que recién se inician en el campo de la transferencia de embriones y dirige las
actividades comerciales diarias de Agtech incluyendo las negociaciones con fabricantes
extranjeros, asumiendo un rol activo en las actividades de marketing e investigación y
desarrollo de productos.
Agtech, Inc. proporciona instrucción sobre Transferencia de Embriones e Inseminación

Artificial en su Centro de Entrenamiento en Manhattan, Kansas - EE.UU. y también
distribuye instrumentos y suministros para Transferencia de Embriones e Inseminación
Artificial en Estados Unidos y en otros 79 países. Información adicional se puede
encontrar en www.agtechinc.com.
– iv –
Glosario
I.A. Inseminación Artificial. El acto de colocar semen congelado/descongelado en el
útero.
CC Centímetro cúbico, una medida de volumen. La abreviatura representa el mismo
volumen que el mililitro (ml) y se utiliza indistintamente con ml.
CIDR™ Implante vaginal del material “silastic” para la liberación interna controlada de
progesterona, se usa con el fin de regular el ciclo de las vacas.
CL Cuerpo lúteo o cuerpo amarillo. Una estructura de producción de progesterona
que se desarrolla en el ovario donde tiene lugar la ovulación.
Quiste Una estructura llena de fluido en el ovario que por lo general tiene más de 20
mm de diámetro, y es persistente (usualmente durante más de 10 días). Se cree
que generalmente es el resultado de un folículo que a pesar de estar maduro no
logra ovular, un quiste es a menudo clasificado en función de su producción de
progesterona (lúteo) o estrógeno (folicular).
Donadora La vaca o ternera que es superovulada para la producción de embriones.
TD Transferencia directa. Una técnica para la congelación de embriones en
etilenglicol que permite que los embriones congelados/descongelados sean
colocados directamente en el útero sin necesidad de un examen microscópico.
EG Etilenglicol; el criopreservante químico en el que son congelados los embriones
para transferencia directa.
TE Transferencia de embriones. Puede referirse al acto específico de colocación de
un embrión en el útero, o el término puede referirse a los procesos combinados
de superovulación de donadoras, la recuperación y la transferencia de embriones,
y la sincronización del ciclo estral de las receptoras.
Lavado El acto de administrar una solución de lavado en el útero con el fin de extraer
los embriones. También se le denomina recolección.
Folículo Una vesícula llena de líquido (cavidad) que sobresale de la superficie del ovario
y contiene un ovocito.
HFE Hormona Folículo Estimulante como Response™, Folltropin™, Pluset® o sus
equivalentes locales.
HLGn Hormona Liberadora de Gonadotropina, tal como Cystorelin, Ovacyst, Factrel,
Fertagyl o sus equivalentes locales.
SITE La Sociedad Internacional de Transferencia de Embriones
Infundíbulo Estructura en forma de “guante de béisbol con pelota” que recoge y canaliza los
ovocitos ovulados en el oviducto.
Oocitos Óvulos no fertilizados (huevo).
PG Prostaglandina, una hormona producida por el tejido endometrial, que actúa
sobre el cuerpo lúteo. También conocida como PGF2 Alfa, Lutalyse,
Prostamate, o sus equivalentes locales. El Estrumate (Cloprostenol sódico),
análogo de la prostaglandina, actúa sobre el CL de manera similar.
Receptora La hembra (vaca o ternera) que recibe los embriones de la donadora en su útero.
Superovulación La administración exógena de la HFE dando como resultado la maduración y la
ovulación de múltiples folículos.
Zona pelúcida La capa de aspecto gelatinoso que rodea y encierra el embrión aproximadamente
ocho días y medio.
–v–
– vi –
Información General del Procedimiento

de Transferencia de Embriones
Durante los últimos setenta años la inseminación artificial ha permitido que se alcance
avances genéticos en el ganado con relativa rapidez a través de la utilización
generalizada y eficaz de semen congelado. Hasta hace treinta años, el progreso genético
rápido se limitaba a la parte masculina de la contribución genética a través de la I.A.
porque las vacas de manera realista sólo pueden producir un ternero por año. Hoy en
día, debido al perfeccionamiento de las técnicas de transferencia de embriones, las
vacas pueden producir veinticinco o más crías al año. La incorporación de la
tecnología de TE a un programa exitoso de IA trae consigo beneficios genéticos en
forma más rápida que los que podrían obtenerse utilizando únicamente la IA.
El proceso de transferencia de embriones bovinos comienza con la selección de una
donadora de embriones no preñada, bien alimentada, y de excelentes características
genéticas, (novilla o vaca). Al mismo tiempo, se procede a identificar de ocho a doce
hembras no preñadas como receptoras del embrión.
La donadora es superovulada con inyecciones diarias de la hormona folículo
estimulante y luego inseminada artificialmente usando semen congelado de alto valor
genético. Simultáneamente, los ciclos estrales de las hembras receptoras se
sincronizan con los ciclos de la donadora mediante inyecciones de prostaglandinas.
Los embriones normalmente son recuperados siete días después de la inseminación
artificial en la donadora. El método de recolección de embriones que se describe en
este manual es un procedimiento reconocido en la industria. Sin embargo, también se
dispone de modificaciones de esta técnica. Una vez recolectados e identificados, los
embriones pueden ser congelados para su uso posterior o transferidos de inmediato
como embriones frescos.
Un exitoso programa de transferencia de embriones culmina con la transferencia de
muchos embriones y una alta tasa de procesos de gestación en las receptoras en forma
consistente. Todo el proceso implica numerosos procedimientos, programaciones,
técnicas y materiales. La minuciosidad es de suma importancia para el éxito de un
programa de transferencia de embriones.
1
Capítulo 1:
Manejo del Ganado
El manejo del ganado es uno de los componentes auxiliares más importantes en un

programa de TE exitoso. La gestión incluye la selección y el mantenimiento de donadoras
y receptoras sanas y aptas para la reproducción apoyándose en una nutrición balanceada.
1.1 PROGRAMA DE SALUD

Si usted está recibiendo donadoras y/o receptoras en su clínica, granja o centro
de TE, el ganado debe llegar acompañado de un certificado sanitario indicando
resultado negativo en las pruebas de brucelosis y tuberculosis (TB) realizadas en
los últimos treinta días. Los nuevos animales deben ser puestos en cuarentena
separados del ganado existente durante treinta días en espera de la verificación de
las pruebas negativas de tuberculosis, brucelosis, anaplasmosis y lengua azul. Por
supuesto, se esperan los mismos estándares para el ganado dentro de su propio
hato para el cual está recolectando y transfiriendo los embriones.
Para asegurar la salud y la solidez de la reproducción, todos los animales deben

ser tratados inmediatamente tras su llegada a la clínica o a su establo o rancho.
El tratamiento a las donadoras y receptoras debe incluir:
2
PROCEDIMIENTO DE TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN BOVINOS
a. Un examen visual completo para detectar y tratar la tiña, parásitos externos,

cojera severa, mastitis, conjuntivitis/ceguera.
b. Un examen minucioso del tracto reproductivo para confirmar:
• Un útero maduro no preñado libre de endometritis, tumores y adherencias.
Palpar todo el ganado treinta días después de identificar gestaciones no
detectadas el día de su arribo.
• Dos ovarios de tamaño normal, sin quistes y libres de adherencias.
c. Evaluación de la edad y tamaño de la receptora.
• La edad y el tamaño son consideraciones importantes cuando las vaquillas
se utilizan como receptoras. Sin duda alguna hay importantes influencias
maternas sobre el peso al nacer, en general el tamaño del ternero al nacer
está determinado genéticamente, y la mayoría de los embriones disponibles
para transferencia tienden a ser de hembras y toros grandes. Por lo tanto, es
esencial que las receptoras sean lo suficientemente grandes para parir crías
de buen tamaño. Lo ideal sería que las vaquillas tengan por lo menos
catorce meses de edad y aproximadamente 800 libras (365kgs) de peso.
Las vacas receptoras deben ser menores de ocho años de edad y haber
transcurrido como mínimo cincuenta días después de su último parto.
• El ganado que resulta aceptable después del examen visual, interno, y
verificación de edad/tamaño son luego identificados y vacunados.
d. Identificación del Ganado Bovino.
• Las donadoras y las receptoras deben ser fácilmente identificadas por un
esquema de marcado visual simple. Un método común es insertar una
etiqueta numerada de buen tamaño en la oreja. Un sistema puede asignar
grandes etiquetas de color blanco a las donadoras (pre-numeradas con tinta
indeleble) y grandes etiquetas amarillas a las receptoras. El número debe
ser grande y en negrita y aparecer en ambos lados de la etiqueta.
• Todas las otras marcas auriculares, cadenas en el cuello, u otras formas de
identificación (excepto los clips metálicos de vacunación en las orejas)
deben retirarse para evitar confusiones. Una etiqueta pérdida o dañada debe
ser sustituida de inmediato con una etiqueta que lleve el mismo número.
e. Pruebas y Vacunaciones.
Las siguientes pruebas y vacunas están indicadas y son procedimiento normal
en los Estados Unidos. Fuera de los Estados Unidos, el protocolo que usted
aplique debe estar adaptado en función de su país y las condiciones locales.
• Tan pronto como sea posible después de la llegada de las donadoras y las
receptoras a la clínica (o a su hato personal), todos los animales son sometidos
a análisis (extracción de sangre) para detectar brucelosis, anaplasmosis y
lengua azul, y también se les realiza la prueba de tuberculosis (intradérmica,
en el pliegue caudal derecho). Las vacunaciones recomendadas incluyen
3
MANEJO DEL GANADO
RIB, DVB, PI3, leptospirosis (cinco antígenos) y vibrio fetus. Tres días más
tarde, cuando se lean las pruebas de tuberculosis, el ganado será vacunado
contra la mancha (séxtuple).
• Con base en los resultados de los análisis de sangre, consulte con su
veterinario local o federal para obtener más instrucciones sobre la
cuarentena, pruebas adicionales, venta de animales positivos, tratamientos
y vacunas adicionales.
1.2 PROGRAMA DE NUTRICIÓN

El establecimiento y mantenimiento de la salud y eficiencia reproductiva de un
animal está altamente correlacionada con la nutrición apropiada. Se debe tener
cuidado para cumplir todos los requisitos mínimos de proteína cruda (PC), total
de nutrientes digestibles (TND), minerales y vitaminas.
Aproximadamente veinte nutrientes esenciales deben estar presentes en niveles

adecuados en las raciones del ganado para garantizar un rendimiento óptimo
(Cuadro 1). Una deficiencia en cualquier nutriente esencial afectará adversamente
el rendimiento de un animal de alguna manera.mente el rendimiento de un animal
de alguna manera.
CUADRO 1. NUTRIENTES ESENCIALES EN LAS RACIONES DE LAS

DONADORAS Y LAS RECEPTORAS
Nutriente Nivel Mínimo Nutriente Nivel Mínimo
TND 59% of MS PC 9.75%
FC 9.00% Sal 0.50%
Calcio 0.30% Fósforo 0.20%
Magnesio 0.15% Azufre 0.20%
Hierro 44.0 mg/kg MS Manganeso 19.8 mg/kg MS
Cobre 11.0 mg/kg MS Cobalto 0.11 mg/kg MS
Selenio 0.11 mg/kg MS Molibdeno 0.99 mg/kg MS
Vitamina A 4000 UI/kg MS Vitamina D 880 ui/kg MS
Vitamina E 4.40 UI/kg MS
*véase datos más actuales del Consejo Nacional de Investigación de los EE.UU. (NRC por sus siglas en inglés)
para niveles precisos
4
Notas:
a) La calidad (es decir, la composición de aminoácidos) de la proteína cruda en la
ración no es de importancia crítica, ya que los bacterias en el rumen de la vaca
sintetizan todos los aminoácidos necesarios y las resultantes moléculas de proteína.
b) El forraje de alta calidad es un componente importante en las raciones para
mantener la función del rumen. Por lo menos 9% de la ración debe estar
constituida por fibra cruda (FC).
c) No es necesario agregar ninguna de las vitaminas del complejo B a la ración ya
que todas son sintetizadas en el rumen.
Al diseñar un programa de alimentación se debe agrupar ganado por requisitos

nutricionales y/o tamaño, y luego formular las raciones para satisfacer las necesidades
de cada grupo. Idealmente, el ganado será pesado mensualmente, el incremento o
pérdida de peso será el indicador para la variación de la cantidad de la ración brindada
al animal diariamente.
En ocasiones, es conveniente “adelgazar”, a una donadora con sobrepeso. Esto puede

conseguirse manteniendo los niveles y proporciones adecuadas de los nutrientes
esenciales y reduciendo a su vez la ingesta de energía. Sin embargo, durante al menos
tres semanas antes de la superovulación y/o la descongelación-transferencia, tanto
donadoras como receptoras deben encontrarse en un nivel positivo de ingesta de
energía (es decir, obtención de energía).
El ganado puede tolerar un exceso sustancial de la mayoría de los nutrientes. Sin

embargo, las manifestaciones de desnutrición (niveles inferiores a los recomendados
por el Consejo Nacional de Investigación) en la reproducción han sido bien
documentados, contribuyendo a:
• Disminución de la tasa de concepción post parto
• Aumento del intervalo entre el parto y el primer estro
• Alteración de los ciclos estrales
• Terneros pequeños y débiles nacidos de madres desnutridas
• Alteración de los niveles de las hormonas de reproducción (HFE, HL,
progesterona, HLGn)
• Alteración de los niveles de insulina y glucosa, influyendo posiblemente en
los niveles de substratos de esteroides ováricos
• Influencia sobre el crecimiento folicular y la ovulación posterior
Las raciones de las donadoras y las receptoras pueden ser formuladas por nutriólogos
profesionales acreditados en base a una amplia variedad de alimento disponible para
ganado (Cuadro 2).
5
MANEJO DEL GANADO
CUADRO 2. Composición de los Piensos Utilizados Comúnmente para

Alimentar al Ganado
Nombre del pienso TND PC FC Ca P
% % % % %
Heno de alfalfa, 2do. corte
floración temprana 60.0 18.0 23.0 1.41 0.22
Ensilaje de alfalfa, marchita
o saraza en floración media 58.0 15.5 30.0 * *
Ensilaje de maíz, de bien espigado 70.0 8.1 24.0 0.23 0.22
Ensilaje de sorgo 60.0 7.5 28.0 0.35 0.21
Sorgo en grano, rolado 92.0 10.1 3.0 0.04 0.34
Heno de bromus (Pasto bromus),
2do. corte floración tardía 55.0 10.0 37.0 0.30 0.35
Trigo, fresco, crecimiento
vegetativo temprano 73.0 28.6 17.0 0.42 0.40
Heno de pasto Timothy, 2do.
corte, floración tardia 62.0 17.0 27.0 0.66 0.34
Harina de semilla de algodón,
extraccion con solventes 76.0 45.2 13.0 0.18 1.21
Harina de soja, extraída por
solventes 84.0 49.9 7.0 0.33 0.71
Existen procedimientos químicos directos que los laboratorios pueden utilizar para
establecer el contenido de nutrientes específicos de los piensos. Además, hay fracciones
alimenticias que pueden aislarse químicamente, pero que son combinaciones de
nutrientes que tienen algunas propiedades comunes lo que permite un análisis químico
del grupo. Estas importantes fracciones alimenticias se separan químicamente por un
procedimiento denominado análisis proximal, que determina los siguientes componentes:
• Agua
• Extracto etéreo (grasas, aceites)
• Fibra cruda (FC; es decir lignina, celulosa)
• Extracto libre de nitrógeno (azúcares simples, almidón)
• Proteína cruda (compuestos nitrogenados)
• Cenizas (minerales, es decir, calcio y fósforo)
Mientras los piensos disponibles sean apetecibles para el ganado individualmente o en

combinación, estos pueden ser remitidos a un laboratorio analítico para el análisis
proximal. Es a partir del análisis proximal que se calculan los valores para el total de
nutrientes digestibles (TND).
6
Todas las fracciones de materia seca de un pienso son separadas con el análisis proximal,
con excepción de la ceniza, y son fuentes potenciales de energía (carbohidratos,
proteínas y grasas).
La lógica detrás de la utilización del TND es muy simple. Si uno suma las porciones
digestibles de fibra cruda, extracto libre de nitrógeno, proteínas y extractos etéreos de
un pienso, cada uno ponderado de acuerdo con su valor calórico adecuado, la cifra
resultante representa la energía digerida total expresada en términos de calorías para
ese pienso. En general se afirma que un gramo de TND es igual a 4,400 calorías. Una
caloría es la cantidad de calor necesaria para elevar la temperatura de 1,0 g de agua de
14,5 a 15,5°C.
En general, las raciones diarias para las receptoras y las donadoras no lactantes deben
ser formuladas para satisfacer las necesidades en el Cuadro 3. Tenga en cuenta que las
proporciones de las raciones se expresan en base a 100% de materia seca.
CUADRO 3. Requisitos Diarios Mínimos de Nutrientes de 350 kg para
Receptoras y 600 kg para donadoras no lactantes
Daily Feed, TND, PC, % Ca P Vit. A Vit. D
gain, g kg DM % g g 1000iu 1000iu
Receptora 700 8.0 63.0 10.3 24 17 14.8 2.3
de 350 kg
Donadora no 200 9.6 56.0 9.2 23 20 25.4 3.9
lactante 600 kg
Un programa de nutrición normal requiere de alimentación con heno. El Cuadro 4 es

una demostración práctica del Cuadro 3, pues el Cuadro 4 muestra el suministro de 9.6
kg (MS) de heno de bromo diariamente a una vaca donadora de 1,320 libras (600kg)
de peso. Asumimos 55% de TDN y 10% de contenido de proteína cruda.
Nota de cálculo: Los kilogramos de MS del heno divididos por el porcentaje de MS
del heno que se suministra a los animales es igual a los kilogramos de heno que se
debe proveer como alimento “tal y como se encuentran”.
CUADRO 4. Ejemplo de Alimentación

Nutriente Requerido para una Suministrado dando de
vaca de 600 kg comer 9.6 kg de Bromo
TND 5.40 kg (56%) 5.30 kg (55.2%)
Proteina Cruda 0.88 kg (9.2%) 0.96 kg (10.0%)
En este esquema de alimentación simple para donadoras no lactantes, solo se requiere
suplementar el equilibrio mineral. La excepción sería en temporadas de clima frío
severo cuando la vaca necesita más energía. La energía extra puede ser proporcionada
incrementando la ingesta de heno o mediante la adición de grano a la ración. (Corah,
1987; Dunham and Call, 1989).
7
Capítulo 2:
Superovulacíón, I.A.,
Sincronización
2.1 SUPEROVULACIÓN DE DONADORAS

El ganado bovino tiene un ciclo estral de veintiún días, el día 0 se caracteriza por la
manifestación visual del celo. Aproximadamente doce horas después del periodo de
celo, un solo ovulo no fecundado (comúnmente conocido como huevo), es liberado
(ovulación) desde uno de los dos ovarios. Ya sea que la hembra sea servida por un toro
durante el celo, o inseminada artificialmente al final del periodo de celo, el huevo será
fertilizado poco después de la ovulación y se desarrollará en un embrión.
El proceso de transferencia de embriones incluye un tratamiento con hormonas de

donadoras al que se le conoce como superovulación, con resultados promedio de seis
ovocitos (“huevos” no fecundados) y/o embriones degenerados, y seis embriones
transferibles. En términos generales, un embrión transferible será una mórula en esta-
dio 4 hasta un blastocisto expandido en estadio 7. Más detalle sobre este punto se puede
encontrar en la sección 4.3. Normalmente, las hembras liberan un óvulo por ciclo. El
componente más importante en el protocolo de TE es la superovulación, sin embargo,
no se entiende completamente la función de la fisiología y la bioquímica en un proceso
de superovulación exitoso. En general, el 85% de todas las donadoras “normales”
responderán al tratamiento de superovulación con un promedio de seis embriones
transferibles, y estas donadoras puede ser superovuladas varias veces con un intervalo
de 45 a 60 días, con solo un ligero descenso en la producción de embriones en el tiempo.
8
La mayoría de las donadoras de embriones son vacas lecheras con niveles de producción
de leche por encima del promedio, o ganado de carne que ha demostrado producir
terneros con buen peso al destete y/o ejemplares populares que participan en
exhibiciones. Sin embargo, si una vaca posee características genéticas paternas y
maternas deseables, puede ser superovulada exitosamente tan pronto como se
establezcan los patrones regulares del estro.
Los ovarios normales superovulados el día del lavado serán aproximadamente del
tamaño de las pelotas de golf (40-45 mm de diámetro) con cinco a siete CLs, y uno o
dos folículos de más de 7 mm de diámetro por ovario. Un exceso de respuesta a la
HFE se caracteriza por ovarios de gran tamaño (del tamaño de una pelota de tenis o
más grandes), muchas ovulaciones, y un alto porcentaje de ovocitos no fecundados y/o
embriones degenerados. Conociendo la anchura de sus dedos, debe medir y registrar
el volumen (largo x ancho x espesor) de cada ovario el día del lavado, y también
anotar el número de CLs y folículos retenidos (no ovulaciones). Esta información debe
ser considerada al decidir cómo ajustar la dosis de la HFE en estimulaciones posteriores.
Si la donadora tuvo una respuesta excesiva, reducir el total de la HFE un 30% en la
siguiente estimulación. Si la donadora mostró una baja estimulación (los ovarios el día
del lavado son de tamaño normal y básicamente no muestran CLs), aumentar el total
de la HFE en 30% a 40% en la próxima estimulación.
A continuación se describen dos protocolos para superovulación de ganado bovino.
Cada método ha sido utilizado con éxito durante muchos años en miles de donadoras. Se
espera que se produzcan variaciones de cada método en relación con la dosis de la HFE
y el uso de la HLGn (o benzoato de estradiol o estradiol 17 beta donde sea permitido
por la ley en lugar de la HLGn) conforme usted registra y estudia el rendimiento de
embriones transferibles (la respuesta) en cada tratamiento de superovulación posterior
de una donadora específica. (Chesta, Marana, Peres, & Bo, enero 2006).
Protocolo #1) Superovulación basada en NO observación de fecha de celo
utilizando el implante CIDR y la HLGn (o reemplazando la HLGn con benzoato
de estradiol o estradiol 17 beta donde se encuentre aprobado). El texto en Rojo en
el Cuadro 5 (página 13) ilustra la secuencia de las donadoras para el protocolo #1.
La combinación de un implante de progesterona CIDR con una inyección de 2cc de
HLGn ha demostrado que influye positivamente en la superovulación de la especie
bovina, resultando en más embriones transferibles en promedio en comparación con
el protocolo de superovulación #2. La sustitución de la HLGn por 2,5 mg de benzoato
de estradiol o estradiol 17 beta (donde se encuentre aprobado por ley) es una alternativa
probada, equivalente a la HLGn.
Una donadora puede ser superovulada con este método en cualquier momento durante
su ciclo, siempre y cuando los ovarios sean de tamaño normal (los CLs de la
9
SUPEROVULACIÓN, I.A., SINCRONIZACIÓN
superovulación previa hayan sido lisados totalmente) y el útero sea normal (es decir,
sin proceso de gestación, involucionado por completo, y no presentar indicaciones
palpables o visibles de una infección uterina). Otra característica de este método es que
se puede estimular a múltiples donadoras al mismo tiempo para la recuperación de
embriones el mismo día sin tener en cuenta las fechas de celo previas de la donadora.
Para las donadoras sin antecedentes previos de superovulaciones, excepto como se
indica a continuación (*), inyectar la totalidad de los 20cc de la HFE (2 inyecciones
al día) durante cuatro días consecutivos, disminuyendo la dosis. Por ejemplo:
Inyección Día #1: 4cc FSH A.M., 4cc P.M.

(*) En el caso de ganado Bos indicus (de orejas largas/con influencia de la raza Cebú),
novillas vírgenes (Bos indicus o Bos Taurus), y donadoras que se conocen se sobre
estimulan, se debe reducir el total de la HFE un 35% (es decir, inyectar 13cc en total).
Por ejemplo:

Inyección Día #4: 0.5cc FSH A.M., 0.5cc P.M.
El implante vaginal CIDR se añade en el calendario de superovulación de acuerdo a

las fechas que aparecen en el Cuadro 5.
NOTA: Fig. 1. Implante vaginal
1. Si bien la dosis típica de la HFE es 20cc, CIDR y aplicador
encontrará donadoras a través de estimulaciones
secuenciales que demuestran responder bien a
una dosis total significativamente menor (es
decir, 10-15cc). Esta información histórica de
respuesta de donadoras le permite rehidratar
la pastilla liofilizada de la HFE con los 20cc
del diluyente, e inmediatamente colocar los 5
a 10 cc restantes de la HFE que no serán
utilizados en una jeringa estéril. Registre la
fecha de la hidratación en el tubo de la jeringa
y luego guarde la jeringa en un congelador
para superovulaciones futuras.
10
2. En el caso de donadoras superovuladas que se conoce que no ovulan

completamente (presencia de múltiples folículos retenidos el día del lavado), o
aquellas que muestren periodos de celo prolongados (más de catorce horas),
deberá proceder a inyectar a estas donadoras con 2-4cc de HLGn al inicio del
periodo de celo de la superovulación.
Protocolo #2) Superovulación después de un estro observado visualmente con

fecha de referencia confirmada. El texto en azul en el Cuadro 5 ilustra la secuencia
de la donadora para el protocolo #2.
La fecha del estro al que se hace referencia puede ser producto de un celo natural o un
celo inducido por fármacos (prostaglandina o implante CIDR). Sin embargo, tenga en
cuenta que un CIDR no es parte de la secuencia de superovulación. Este protocolo
requiere que se observe a la donadora y se registre la referencia de su fecha de celo.
El octavo día (Fecha de celo de referencia = Día 0) palpar a la donadora para confirmar
la presencia de un CL. Si se identifica un CL, inyectarla con 2cc de HLGn, dos días
después (el décimo día) iniciar las inyecciones de la HFE. Sin embargo, si no se haya
presente un CL, no puede iniciarse la superovulación. Las cantidades de la HFE serían
las mismas que se describen en el Protocolo #1.
2.2 INSEMINACIÓN DE DONADORAS

La tecnología de transferencia de embriones es la combinación de muchos pequeños
pasos, cada uno de ellos realizado correctamente. La minuciosidad es esencial. Un
paso crucial es la inseminación artificial (IA) de las donadoras. Un programa de IA
que produce una alta tasa de fertilización de embriones es el resultado de tres factores:
1. Dedicada detección del celo
2. Semen de alta calidad (alta fertilidad)
3. Correcta técnica de IA (manipulación y colocación del semen)
DETECCIÓN DEL CELO

Normalmente, la donadora se encontrará en iniciación del periodo de celo dieciocho a
veinticuatro horas después de retirar el implante CIDR e inyectarla con Estrumate. Sin
embargo, no es raro que el inicio del periodo de celo de la donadora se produzca doce
horas antes o después del tiempo previsto. Una donadora se encuentra en la iniciación
del periodo de celo cuando se queda quieta de pie y permite que otra vaca o novilla la
monte, de forma similar a la copula de un toro con una vaca. Las siguientes pautas
fomentarán la determinación precisa del periodo de inicio del celo.
a) Después que la donadora recibe Estrumate (y se retira el CIDR), no debe ser
mantenida en un espacio sola. Colóquela con varias otras vacas, o con un
grupo de receptoras que se encuentren en celo.
11
b) Los corrales del ganado no deben ser estrechos o resbaladizos. El ganado activo
sexualmente necesita espacio para maniobrar y poder mantenerse en pie en
forma segura para la monta.
c) Las señales que indican que se aproxima el estro son:
• La donadora se niega a comer (falta de apetito)
• Descenso brusco en la producción de leche
• Cambios en el comportamiento, inquietud
• Aumento en el flujo de mucosidad clara por la vagina
d) La mejor “herramienta” para la detección del celo son sus ojos. Cuando vea
a la donadora de pie quieta “esperando” que otra vaca la monte, registre la
fecha y la hora.
CALIDAD DEL SEMEN Y TIPO DE GRUPO SANGUINEO

Antes de la superovulación se debe verificar la calidad del semen. Se debe tener cuidado
de comprar semen de reconocida alta fertilidad. Siempre que se tenga duda sobre la
calidad del semen, la organización encargada de realizar la IA o un veterinario con
experiencia en evaluación de motilidad en semen debe examinar una muestra (antes
del inicio de la superovulación).
La verificación positiva del padre y la madre de un ternero por transferencia de embriones
requiere la determinación del grupo sanguíneo del ternero, y por lo tanto el tipo de
sangre tanto del padre como de la madre deben constar en el registro conjuntamente con
el dato asociado de la raza de la donadora. Dado que algunos tipos de sangre son muy
similares y no pueden ser diferenciados por el análisis, se recomienda (sobre todo en el
caso de múltiples apareamientos del padre) que la asociación de la raza de la donadora
sea consultada antes de la inseminación artificial de la donadora para comprobar que un
apareamiento seleccionado pueda ser diferenciado mediante tipificación sanguínea.
MANIPULACIÓN DEL SEMEN

Una vez que el semen es comprado y entregado al rancho, establo lechero, o clínica,
debe ser mantenido en un tanque para semen y sumergido en nitrógeno líquido. Debe
revisarse el tanque de nitrógeno cada dos días para confirmar que el tanque se encuentre
al menos lleno hasta la mitad de su capacidad de nitrógeno.
Se debe tener cuidado al retirar una pajuela individual de su recipiente. Usando pinzas,
coja el recipiente deseado dentro del cuello del tanque, manteniendo el recipiente al
menos 5 cm (2") debajo del límite superior del vapor de nitrógeno por no más de diez
segundos. Con esta técnica, los recipientes restantes que quedan en el depósito no están
sujetos a fluctuaciones de temperatura. Usando un segundo par de pinzas, agarre la
pajuela que desee y elévela parcialmente sacándola fuera de su recipiente para verificar
el nombre del toro y el número de registro. Una vez identificada, la pajuela puede ser
retirada del recipiente y colocada en un baño de agua.
12
La temperatura universal del agua del baño para descongelar pajuelas de semen es de
35°C (95°F) durante un tiempo mínimo de cuarenta segundos. Algunos centros de
recolección de semen recomiendan procedimientos de descongelamiento ligeramente
diferentes, de modo que es mejor solicitar recomendaciones de descongelamiento
específicas al comprar el semen.
Un termo, caja de tecnopor (espuma de poliestireno), o unidad de descongelación

eléctrica son apropiadas para la descongelación de semen. Cualquiera que sea el envase
utilizado, la temperatura de descongelación debe ser monitoreada estrechamente, sobre
todo cuando se descongelan varias pajuelas en forma simultánea. Una vez descongelada,
la pajuela ser secada, cortar en forma recta el extremo opuesto al conector, y la punta
de inserción con algodón colocada primero en el extremo abierto de una varilla de
inseminación precalentada (30°C). Cuando la inseminación se realice en exteriores en
clima frío y/o en un lugar que reciba luz solar, colocar la varilla de inseminación en una
funda de plástico estéril y luego transportar la varilla con la funda para proteger el
semen de choques fríos y la exposición a la luz solar directa. Inseminar a la donadora
inmediatamente después de que el semen haya sido descongelado.
COLOCACIÓN DEL SEMEN

El sitio correcto para la colocación del semen es en el cuerpo del útero. Hay una
tendencia entre los técnicos que logran una baja tasa de concepción de depositar el
semen demasiado lejos en el útero (quizás en un intento de realizar la inseminación en
los cuernos uterinos), lo que resulta en lesiones o pequeños desgarres en el tejido
endometrial. Los espermatozoides son organismos vivos y son sensibles a materiales
extraños, incluyendo el agua y los lubricantes. Nunca debe reutilizarse las fundas
plásticas desechables y las envolturas de IA. Después de descongelar, secar la pajuela
completamente antes de recortarla y evitar la contaminación de la varilla de
inseminación cuando pase a través de la vulva. Una técnica común para mantener la
vulva abierta es poner como cuña un papel toalla doblado en forma de V (con el
vértice de la V mirando hacia abajo) entre los labios de la vulva.
MOMENTO DE LA INSEMINACIÓN
Los óvulos son liberados al azar (ovulados) de ovarios superovulados durante un
período de aproximadamente doce horas, empezando más o menos veinticuatro horas
después del inicio del celo. Por esta razón, la donadora debe ser inseminada al menos
dos veces. La primera inseminación debe ocurrir doce horas después del inicio del
celo, y la segunda inseminación doce horas después de la primera inseminación. Por
ejemplo, si la donadora comienza el periodo de celo en la mañana del miércoles, la
debe inseminar el miércoles por la noche y nuevamente el jueves por la mañana. El
lavado debe ser realizado el miércoles de la próxima semana.
13
Si la donadora todavía se encuentra en celo durante la segunda inseminación, se le

debe inyectar 4cc de HLGn y ser inseminada por tercera vez doce horas después de la
inyección de HLGn.
2.3 SINCRONIZACIÓN DE RECEPTORAS

El mal estado físico de la vaca a ser inseminada (receptora) influirá negativamente en
la tasa de preñez de un programa de TE. Lo ideal sería que las receptoras hayan estado
en la clínica, rancho, o establo lechero un mínimo de treinta días recibiendo una ración
balanceada que permita un ligero aumento de peso (medio kilo diariamente). Además de
proveer receptoras en buen estado nutricional y de salud, la mayor tasa de concepción se
alcanza cuando un embrión se trasfiere a un medio ambiente uterino que se asemeje en
mayor grado al medio ambiente en el que se originó el embrión.
Los embriones obtenidos de una donadora el séptimo día de su ciclo (estro = día 0)
deben ser transplantados (transferidos) a receptoras que se encuentren en el sexto,
séptimo u octavo día de sus respectivos ciclos. Por ejemplo, para proporcionar seis
embriones a receptoras el día del lavado o el día de la descongelación/transferencia),
debe haber por lo menos seis receptoras que se encuentren en el sexto, séptimo u octavo
día de su ciclo en esa fecha con un CL. Dado que se puede esperar que el 5% de un hato
receptor de ciclo regular (sin ningún tipo de sincronización mediante medicamentos)
muestre celo un día cualquiera, es poco probable que un hato pequeño de receptoras
(menos de cuarenta cabezas) pueda recibir seis embriones en un determinado día de
recuperación. Ciertamente, los periodos de celo naturales producen receptoras de
embriones, sin embargo los hatos grandes con los gastos asociados de alimentación de
ganado requerirían proporcionar suficientes receptoras cuando se realice la
recuperación de embriones de múltiples donadoras el mismo día, o cuando se efectúe
la transferencia de un gran número de embriones congelados en un día específico.
Afortunadamente, existen métodos que nos permiten sincronizar el ciclo de las

receptoras al de las donadoras. El texto en color verde en el Cuadro 5 se refiere a un
popular tratamiento de sincronización de receptoras (Sincronización Seleccionada +
CIDR). Se estima que aproximadamente el 85% debe mostrar celo con este método.
Otro método de sincronización (no indicado en el Cuadro 5) que se traduce en un 50%

de hembras manifestando su ciclo estral requiere de una sola inyección de Estrumate (o
Lutalyse) a todas las receptoras doce horas antes de retirar el implante CIDR a la
donadora (o doce horas antes de la inyección de Estrumate a la donadora, si se sigue el
Protocolo de Superovulación #2). Existen otros métodos de sincronización en la industria,
y todos ellos son exitosos en diversos grados.
14
CUADRO 5. Secuencia de preparación de Donadoras y Receptoras

Dom Lun Mar Mie Jue Vie Sáb
1 2 3 4 5 6
Donadora
observada en celo
7 8 9 10 11 12 13
Insertar CIDR en 2cc de HLGn a
donadora. Inyectar Donadoras. NO
2.5mg de benzoato aplicar HLGn si
de estradiol (o donadora ha
estradiol 17 beta) a recibido estradiol 3
donadora donde se días antes.
encuentre aproba-
do.
Insertar CIDR en Palpar a donadora.

receptoras Inyectar Si presenta CL,
2cc de HLGn a inyectar 2cc de
receptoras. HLGn.
14 15 16 17 18 19 20
HFE A.M. y P.M. HFE A.M. y P.M. HFE A.M. y P.M. HFE A.M. y P.M. Donadora en celo Verificar celo en
Estrumate, 4cc P.M. A.M. I.A. a donadora receptoras A.M.
Retirar CIDR P.M. 12 y 24 hrs después y P.M.
de inicio de periodo
HFE A.M. y P.M. HFE A.M. y P.M. HFE A.M. y P.M. HFE A.M. y P.M de celo.
Estrumate 4 cc P.M.
Donadora en celo
A.M. I.A. a donadora
Estrumate 2cc A.M. Inyectar 2.5mg de a 12 y 24 hrs
a receptoras y retirar benzoato de estradi- después de inicio de
CIDR A.M. a recep- ol P.M. (o estradiol periodo de celo.
toras 17 beta) a recep-
toras donde esté HLGn 2cc a recep-
aprobado. toras, A.M., pero
Verificar celo en NO aplique HLGn
receptoras P.M. si donadora recibió
Registrar # de estradiol 1 día antes.
etiqueta auricular, Verificar celo en
fecha y hora de día receptoras
de inicio de celo. A.M. y P.M.
21 22 23 24 25 26 27
Día de Lavado
Día de Lavado
28 29 30
■ = Protocolo #1. Secuencia de donadora sin fecha de celo observada, usando un CIDR y HLGn
■ = Protocolo #2. Secuencia de donadora tras una fecha confirmada de referencia de estro
observado visualmente
■ = Tratamiento de sincronización de receptora
15
Capítulo 3
Recuperación de
Embriones
3.1 FECHA DE RECUPERACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE RECEPTORAS

La recuperación de embriones de bovinos (lavado) se realiza por lo general el séptimo
día después del estro, lo que brinda una etapa de desarrollo adecuada para la
congelación. Los embriones normalmente se ubican en los oviductos antes del sexto
día y por lo tanto no pueden ser recuperados por medios no quirúrgicos. A los ocho y
medio días, la esfera transparente (zona pelúcida) que rodea a la masa de células
embrionarias se ha fracturado, dejando a un embrión suficientemente maduro para la
congelación. Las tasas de preñez a partir de embriones frescos (no congelados)
transferidos seis a ocho días después del celo no son diferentes. Sin embargo, para
recuperar embriones que tengan más probabilidades de sobrevivir a la congelación y
descongelación, la recuperación debe ser programada para el séptimo día.
Como parte del ciclo estral, el folículo dominante (una estructura similar a una vesícula,
fluctuante, llena de líquido, ubicada en la superficie del ovario, que contiene los
16
óvulos) sigue creciendo. Aproximadamente veinticuatro horas después del inicio del
periodo de celo, el folículo se rompe liberando el oocito.
Ya sea que la recuperación se realice en el rancho o en la clínica, la primera actividad el

día de la recuperación será el examen de las receptoras. Asumiendo una recuperación
el séptimo día, se organizará una lista de todas las receptoras que se encuentran en el
sexto, séptimo y octavo día después del celo. Para una palpación más precisa y sensible,
colóquese una manga plástica, quítele la punta de los dedos, luego póngase guantes de
látex para exámenes ajustados que lleguen hasta la altura de la muñeca. Esta
combinación ofrece una protección económica y desechable en la longitud total del
brazo y permite una identificación precisa de las estructuras del ovario.
Palpar ambos ovarios de cada animal para identificar la presencia de un CL y luego

usar un crayón marcador para poner una marca en la cadera correspondiente al cuerno
uterino asociado con el CL (CL a la derecha = marca en la cadera derecha). Casi el
65% de las ovulaciones del ganado se producen en el ovario derecho, y normalmente
el ovario activo para ese ciclo es significativamente más grande que el ovario opuesto,
y se espera que el ovario de mayor tamaño contenga el CL ese ciclo. Se pueden
encontrar varias estructuras al palpar los ovarios, es decir un CL, un folículo retenido,
un quiste grande, o una combinación de estas estructuras.
La palpación el séptimo día identificará CLs que varían en tamaño. El clásico CL “de
los libros de texto” será similar al borrador de un lápiz, de unos 8 mm de diámetro,
generalmente redondo, y de 3-5mm de altura. Es frecuente encontrar CLs de mayor
tamaño de unos 10-13 mm de diámetro y 8 mm de altura. Mientras sus dedos se
deslizan suavemente sobre la superficie de cada ovario, usted tratará de identificar una
estructura firme y circular que sobresale en la superficie del ovario y muestra una parte
superior más bien plana. El CL en general se asemeja a la forma de una meseta.
Afortunadamente, no hay diferencia en las tasas de preñez entre las receptoras que
muestran un CL grande en comparación con las que tienen un CL pequeño el día de
la transferencia. Por lo tanto, la selección de receptoras requiere que se identifiquen
todas las hembras que presenten un CL el día de la transferencia. Si no puede
identificar un CL, el animal no debe recibir un embrión.
Después de examinarse a todas las receptoras, colocar una copia impresa de los resultados
junto al microscopio para realizar después un conveniente emparejamiento
embrión/receptora el día de la recuperación. La lista de receptoras utilizables identifica
cuántos embriones pueden ser transferidos frescos, y cuántos deben ser congelados.
Nota: La tasa de preñez promedio será ligeramente mayor cuando se usan novillas
vírgenes versus la tasa obtenida al usar vacas, si todas las demás variables son iguales.
17
RECUPERACIÓN DE EMBRIONES
3.2 INSTRUMENTOS, SUMINISTROS Y PLAN

Después de identificar a las receptoras utilizables, el siguiente paso es organizar los
instrumentos y suministros que figuran a continuación para la recuperación.
• D-PBS (Tampón salino fosfatado de Dulbecco) • Sonda en Y (Fig. 2)
• Catéter (Fig. 3) y estilete • Filtro (Fig 4)
• Jeringas de 20cc y 6cc • Agujas calibre 18 x 1.5"
• Lidocaína • Pinzas hemostáticas y tijeras (Fig. 5)
• Mangas desechables hasta el hombro • Guantes de látex para exámenes
• Microscopio estereoscópico binocular (Fig. 6)
• Congelador con tasa de enfriamiento controlada (Fig. 7)
Fig. 2. Sonda en Y Fig. 3. Catéter Vortech™
Fig. 4. Filtro ZONA Fig. 5. Pinzas hemostáticas y tijeras
Fig. 6. Microscopio Fig. 7. Congelador con tasa

estereoscópico binocular de enfriamiento controlada
18
Asegúrese de que el área de trabajo en el laboratorio se encuentre limpia, libre de polvo

y humo, sin corrientes de aire y (idealmente) con temperatura controlada. La mayoría
de las recuperaciones en granjas requieren que se instale el equipo de laboratorio en el
granero del cliente, en la sala de tanques de leche, en una zona de sombra al lado de la
manga de compresión, en la mesa de la cocina del cliente, u ocasionalmente el cliente
puede haber construido una sala especialmente para estos requerimientos.
Siempre que sea posible, es mejor trabajar en laboratorios con temperaturas frías (50-
75°F) en vez de hacerlo en ambientes cálidos. A medida que el embrión microscópico
sale del útero y entra en el dispositivo de filtro, las temperaturas cálidas aceleran la
muerte de los embriones fuera del útero al incrementar el metabolismo del embrión.
Lamentablemente, el medio de recolección es un substituto no perfecto del líquido
uterino en el que ha estado viviendo el embrión.
Este manual de instrucción enseña la técnica conocida como lavado de cuernos donde
el medio de recuperación ingresa al útero mediante gravedad. El séptimo día, los
embriones en las donadoras superovuladas normalmente se encuentran en el tercio
superior de cada cuerno uterino. Por lo tanto, el lavado de los cuernos dirige el 100%
del medio de recuperación hacia la mitad anterior de los cuernos donde es más
probable que se encuentren los embriones. La secuencia siguiente describe la
preparación de los elementos utilizados para la recuperación.
Seleccione una bolsa de 1 litro de D-PBS (Tampón salino fosfatado de Dulbecco) que
contiene el surfactante alcohol polivinílico (AP). Las versiones anteriores de medios de
recuperación requerían que se adicione un suero inmediatamente antes de la recuperación,
sin embargo hoy en día el 95% de todas las recuperaciones utilizan D-PBS suplementado
con AP y bajos niveles de los antibióticos gentamicina y kanamicina. Un ejemplo de
estas soluciones es el Medio de Recuperación BioLife Advantage™.
Inserte una sonda en Y a la bolsa de lavado. Cierre ambas pinzas, y luego inserte el
extremo final de la sonda en el orificio de perforación de la bolsa. Conecte un filtro en el
otro extremo de la sonda. Si se está efectuando el lavado a más de una donadora, escriba
el nombre de la donadora en la parte lateral del filtro con un marcador indeleble.
Mantenga el extremo del adaptador del catéter de la sonda sellado o con la pinza cerrada.
Purgue el aire de la sonda en Y y al mismo tiempo permita el flujo de PBS en el

dispositivo de filtro hasta que haya 20-30mm de PBS en el filtro. Esto se logra mediante
la apertura de las dos pinzas de la sonda, cerrando la sección corta de la sonda que conduce
al catéter Foley con unas pinzas hemostáticas, y abriendo la pinza en el puerto de salida
del filtro. Luego, ponga la bolsa de 1 litro en posición horizontal en una mesa y baje la
sonda y el filtro por debajo de la superficie de la mesa. Sostenga el recipiente del filtro
de manera que el extremo abierto del puerto de salida esté direccionado hacia arriba.
La gravedad hará que el medio de lavado fluya a través de la sonda y llegue al recipiente
19
del filtro. Cuando el recipiente contenga 20-30 mm de solución de lavado, cierre todas
las pinzas y regrese la sonda y el filtro a la superficie de la mesa.
Seleccionar y probar un catéter Foley doble vía. Los catéteres de silicona largos (23") son
los más usados porque pueden ser esterilizados en autoclave y reutilizados, y fueron
diseñados específicamente para la recuperación de embriones de ganado bovino, teniendo
al menos seis ojales grandes compensados para maximizar la eficiencia de la recuperación.
Un ejemplo de este tipo de dispositivos es el catéter Vortech™. Alternativamente, se
dispone de los catéteres de látex desechables de 18" de largo con dos ojales.
También debe seleccionar un diámetro del catéter, al que se le conoce como calibre
francés (fr) o diámetro. La mayoría de los catéteres para transferencia de embriones
de la especie bovina se hallan disponibles en calibre 12 francés y calibre 24 francés
(incrementos en números pares). Sugiero que elija el catéter de mayor diámetro
que pase a través de la cérvix de una donadora específica, utilizando esfuerzos de
manipulación normal. El catéter calibre 16 francés servirá para la mayoría de las
novillas vírgenes, mientras que el calibre 18 Fr y los de mayor diámetro son opciones
populares para las vacas.
Los catéteres son luego seleccionados basados en la capacidad del globo (manguito),
5 cc o 30 cc. La inyección de 15 cc de aire en el modelo de 5cc hace que el manguito
se infle a la altura suficiente y alcance un ancho horizontal de aproximadamente 20
mm, en comparación con el manguito de 30cc que se infla a una menor altura y tiene
una medida horizontal de menor ancho. La selección del globo es de acuerdo a la
preferencia personal, basada en la facilidad con que se puede palpar la inflación y la
ubicación del manguito en el interior del cuerno uterino.
Permita que varias gotas de la solución de lavado caigan desde el extremo de la sonda en
Y donde se ubica el catéter al catéter mismo, y luego inserte el estilete de acero inoxidable
estéril en el catéter. Mantenga el catéter en su bolsa estéril en todo momento cuando no
haya sido introducido en la donadora, para mantenerlo limpio. Utilizando una jeringa
de 20 ml y con el catéter en su paquete, inflar el globo con 20 cc de aire y luego retirar
los 20cc de aire del globo. La preparación del catéter se concluye después de estirar el
catéter 0,5" hacia la boca de conexión del estile y luego suavemente asegurar el extremo
posterior de 0,25" de la boca de conexión del catéter con el estilete usando una pinza
hemostática. Prepare la jeringa epidural colocando una aguja calibre 18 x 1.5" a una
jeringa de 6 cc. Aspirar 5-6 cc de lidocaína al 2% y luego cubra la aguja.
Preparar una jeringa de 6 cc (aguja calibre 18 x 1.0") con 4cc de Estrumate, que será
aplicada a la donadora después de la recuperación. Esta sirve para iniciar la regresión de
los múltiples CLs y debe causar el estro dentro de 4-6 días. Haciendo que se produzca
el ciclo estral en la donadora después de la recuperación, evita que quede preñada
debido a un embrión que no fue recuperado durante el proceso de lavado.
20
Otros elementos que deben ser colocados en su bandeja de recuperación incluyen

mangas hasta la altura del hombro y guantes de látex para exámenes, tres pinzas
hemostáticas, la botella de lidocaína y varias agujas más, y papel y lápiz para anotar
las estructuras y el volumen de los ovarios.
Arme el microscopio y pruebe el iluminador.
Monte el congelador electrónico de embriones, pero no añada nitrógeno al baño.
3.3 PREPARACIÓN DE LAS DONADORAS PARA EL LAVADO

El procedimiento de recuperación normalmente demora veinte a treinta minutos, de
modo que si la donadora está inquieta, enciérrela en una manga de compresión o en
cornadizas. Si la donadora es un ejemplar grande, de cuerpo profundo (el útero se
extiende en la parte baja de la cavidad del cuerpo y es pesado), el proceso de
recuperación se realizará en forma más fácil si el tren anterior de la donadora puede
ser elevado 10-12". Por ejemplo, el piso de la manga o conducto puede ser diseñado
de forma que se incline mientras la vaca ingresa a la manga. O si la recuperación se
efectúa en un establo cerrado, ate el cuello de la donadora a la barra horizontal delante
de ella (dándole cierta holgura) y luego disminuya la incomodidad en su parte posterior
hasta que sus patas traseras ingresen a la canaleta que corre detrás de su establo. Para
evitar que se mueva más atrás en el establo, ponga una barra horizontal debajo de su
cuello y asegure cada extremo a los divisores en cada lado de su establo.
Después de asegurar a la donadora, eliminar los restos de heces o mugre del maslo de
la cola donde se le aplicará la anestesia epidural. Lave la zona con un antiséptico líquido
como por ejemplo una solución yodada. Enjuague con agua limpia. Con fines
descriptivos, en este texto, asumiremos que usted palpa con la mano izquierda.
Póngase una manga que le cubra todo el brazo y elimine todo el estiércol de su recto.
Luego, con la misma mano enguantada, agarre firmemente la cola 3" debajo del recto
y eleve la cola a una posición ligeramente por encima del plano horizontal. Este control
de la cola y la posición le permite controlar sus movimientos y reducir su deseo de
patear cuando se administre la anestesia epidural. Usando la uña del pulgar de la mano
derecha sin guante, presionar firmemente la región del maslo de la cola ya limpia para
localizar una hendidura entre dos vértebras. Este será el lugar de la inyección. Colocar
la aguja (anexa a la jeringa de lidocaína) haciéndola ingresar profundamente en el
espacio intervertebral hasta que la aguja haga contacto con el hueso. Una vez que se
produzca el contacto, comience a inyectar la lidocaína. Inicialmente habrá presión de
retorno sobre el émbolo, de modo que retire la aguja lentamente en intervalos de 1mm
a medida que continúa empujando el émbolo. Conforme la abertura de la aguja ingresa
en el espacio intervertebral, el émbolo ejercerá presión fácilmente y todos los 5-6 ml
de lidocaína fluirán rápidamente en el área. Cuando esta inyección es administrada
correctamente, la cola se quedará flácida después de un minuto y el peristaltismo rectal
21
esencialmente se detiene. Si la cola no se quedará flácida, repetir la inyección (con

una nueva aguja) prestando atención a la profundidad de colocación de la aguja y a la
facilidad de la inyección (falta de presión de retorno). Ate la cola flácida apartándola
hacia el lado izquierdo.
Quitarse la manga sucia y colóquese una manga limpia, sin dedos y guante de látex
para exámenes. Usando agua limpia, lave para quitar toda la materia fecal del esfínter
anal y la vulva. Abra los labios de la vulva y enjuague bien. Seque con toallas de papel.
Esta misma secuencia de preparación será utilizada en receptoras inmediatamente

antes de la transferencia.
Suspender la bolsa de 1 litro de D-PBS con una sonda en Y anexa y el filtro de modo
que el borde inferior de la bolsa se encuentre aproximadamente a un metro por encima
del empalme de su cola.
3.4 PROCEDIMIENTO DE RECUPERACIÓN

Lubrique con agua su mano y brazo izquierdo (que utiliza para la palpación) con agua
e ingrésela por el recto. Si necesita un lubricante que no sea agua, asegúrese de que si
gotea lubricante sobre la vulva, no se permita que el lubricante ingrese al catéter (o a
la varilla de transferencia) mientras penetra en el animal. ¡Todos los lubricantes son
tóxicos para el embrión!
Una vez dentro de la donadora, identificar el cérvix y los cuernos uterinos (Fig. 8).
Figura 8. Diagrama de los órganos

reproductivos del ganado
Estimar el número de ovulaciones (CLs) y
los folículos retenidos, y medir el volumen
(largo x ancho x altura) de cada ovario.
Midiendo el ancho de los dedos utilizados
en la palpación, usted puede ponerlos
rápidamente encima de cada ovario y
estimar el volumen. Registre esta
información para ajustes futuros de la
dosis de la HFE.
Retire el catéter de su empaque de protección, abra la vulva, inserte el catéter en la vagina,

y manipúlelo a través del cuello como si estuviera realizando la IA. A medida que trabaje
con el cuerpo y los cuernos desde este momento en adelante, trate de recoger y retirar la
mayor cantidad de útero como sea posible hacia el suelo pélvico. De lo contrario, el
aparato seguirá estirándose y alejándose de usted y si la donadora es más bien grande y
de cuerpo profundo, la colocación del catéter y la recuperación de fluido puede ser una
22
tarea complicada. Inmediatamente después que la punta del catéter entre en el cuerpo
uterino, manipule el tracto de modo que el cuerno derecho (o izquierdo) se ubique
directamente enfrente del catéter, en lugar de dirigir el catéter hacia el cuerno.
La presión descendente por el dedo medio identificará la zona de división en Y donde

se separan los cuernos derecho e izquierdo (la bifurcación palpable). A medida que
siga ascendiendo y se posicione en el cuerno derecho, la suave presión descendente
por el dedo índice en el cuerno derecho identificará la ubicación de la punta del catéter
mientras se desliza hacia el cuerno derecho. Avance la punta del catéter 6-7cm más
allá de la bifurcación. El catéter se encuentra ahora en la ubicación correcta y está listo
para inflarse. Una técnica exitosa de lavado de cuernos se centra en la ubicación y el
inflado, es decir, (1) su capacidad de ubicar el catéter lo suficientemente lejos delante
de la bifurcación de manera que el globo se encuentre sellado en forma precisa contra
la pared interior del cuerno y no se desplace durante el lavado, y (2) asegurar el volumen
correcto de inflado del globo. Si hay demasiado aire el tejido endometrial se dividirá.
Si no hay suficiente aire el globo se desplazará de su posición, lo que causará un lavado
del cuerpo y una recuperación de líquido menos precisa.
En este punto, pida a su asistente que coapte una jeringa de 20 cc a la válvula de inflado
del catéter (con el émbolo hacia atrás en la marca de los 20) y luego presione 12 cc de
aire en el globo. El asistente sostiene el émbolo en esta marca, mientras usted palpa el
cuerno para localizar el globo parcialmente inflado. Si el globo se siente
prominente/es fácil de identificar y fácil de definir su ubicación, entonces hay
suficiente aire en el globo. Si el globo no es fácil de identificar, añada aire en
volúmenes parciales de 1 cc hasta que se sienta a gusto con el aspecto del globo. Si la
ubicación es correcta, no requerirá un inflado de más de 16cc en las donadoras de
mayor tamaño para cerrar el interior del cuerno y mantener la ubicación.
La mayoría de las vacas necesitan 14-16cc de aire en el globo mientras que las novillas
vírgenes sólo necesitarán 12-13cc de inflado. No tire hacia atrás el catéter en esta fase
para determinar si el globo esté bien asentado, ya que esto sólo sirve para desplazar el
globo de su ubicación. Aprenda a confiar en lo que siente con los dedos a medida que
palpa suavemente el globo inflado. Si el globo se siente prominente, fácil de identificar
y fácil de definir su ubicación, entonces hay suficiente aire en el globo. Es importante
evitar inflar en exceso, lo que resulta en la separación de la membrana y que el liquido
del lavado sea absorbido por el tejido. La ubicación del catéter dentro del cuerno, y el
inflado del globo son factores críticos para una recuperación exitosa.
Una vez que esté seguro de que la ubicación del globo y el grado de inflado sean correctos,
retire la pinza hemostática que mantiene el catéter al estilete y sujete la pinza hemo-
stática adelante de la válvula de inflado del catéter (es decir, en el tramo corto de la
sonda que conecta la válvula de inflado al eje del catéter). Con la pinza hemostática
en el lugar, el asistente luego desconecta la jeringa de aire de la válvula de inflado.
23
Para retirar el estilete, coloque su dedo pulgar y el dedo índice alrededor de la abertura
del catéter para servir como “tope trasero”, de modo que el catéter no tire hacia atrás
mientras su asistente suavemente gira y saca el estilete del catéter. Coloque el estilete
en el interior del empaque vacío del catéter en la bandeja de instrumentos.
Para contrarrestar la tracción hacia abajo en el catéter que podría desprender el globo,
deslizar las puntas de unas segundas pinzas hemostáticas cerradas a través de un anillo
de la primera pinza hemostática, que bloquea la válvula de inflado, y luego sujete la
segunda pinza hemostática en el pelo de la donadora cerca del maslo de su cola.
Usando las dos manos, su asistente luego inserta firmemente el extremo del adaptador
Foley de la sonda en Y en el extremo abierto del catéter. Ahora está listo para
introducir el D-PBS en el cuerno uterino.
El objetivo es llenar y vaciar varias veces el cuerno derecho, retirar el catéter, y volverlo
a ubicar en el cuerno izquierdo. A continuación, repita el proceso con los restantes 500
ml del medio de lavado. Con el fin de supervisar adecuadamente el llenado y vaciado del
cuerno, es fundamental que el cuerno uterino sea manipulado de modo que usted pueda
colocar sus dedos alrededor de la mitad anterior del cuerno (la sección del cuerno más
alejada del cuello del útero), de modo que la mitad superior (de menor diámetro) del
cuerno descanse en la palma de su mano. Esto permite un tacto muy sensible con las
yemas de los dedos del extremo anterior del cuerno que tiene un menor diámetro, donde
se ubican los embriones siete días después del estro.
Una vez que usted se sienta cómodo con la posición del cuerno, cierre la pinza en la
sonda en Y que conduce al filtro, y abra la pinza que permite que la solución DPBS
ingrese al útero. Recuerde, el cuerno uterino es un músculo y se debe permitir que se
estire gradualmente. Por lo tanto el primer llenado que se realice debe ser conservador,
básicamente para establecer el flujo, que le permite visualizar que el fluido circula en
forma descendente por la sonda y llega al útero, y luego sale y entra al filtro. Asegúrese
de que el puerto de salida en el filtro esté abierto. El llenado y expansión del cuerno es
monitoreado constantemente dando suaves golpecitos en el tercio superior del cuerno
mientras se llena.
Cuando sus dedos le indican que el cuerno está lleno (apretado, firme, turgente), cierre
el collar de sujeción de ingreso y abra el collar de sujeción de salida que permite que el
líquido discurra hacia el filtro. Inmediatamente comience a masajear suavemente el
cuerno con un movimiento manual similar a cuando se ordeña los pezones de la vaca,
empezando en la zona de menor diámetro del cuerno y terminando en la parte media del
cuerno. Repita este procedimiento de masaje hasta que deje de fluir liquido al filtro.
Nota: Normalmente, sólo tarda de 60 a 90 segundos llenar el cuerno. Sin embargo, se
vaciará en veinte o treinta segundos.
24
Cuando queden 500cc de medio en la bolsa colgada, el catéter debe ser reubicado en el
otro cuerno de acuerdo a los siguientes pasos. Si hay materia fecal alrededor de la vulva,
lavarla con agua. Confirme que el puerto de salida del filtro se encuentre abierto, el collar
de sujeción que conduce a la bolsa esté cerrado, y el collar de sujeción que lleva al filtro
esté abierto.
Retire las pinzas hemostáticas anexas al catéter y desinfle el globo anexando la jeringa
de aire a la válvula de inflado del catéter y tirando hacia atrás del émbolo.
Alternativamente, presione una de las puntas de las pinzas hemostáticas en la válvula por
dos a tres segundos, lo que hará salir el aire del globo. Sujete el catéter entre el pulgar y
el dedo índice donde el catéter se une con la sonda en Y. Retire el catéter (aún conectado
a la sonda en Y) de la vaca y elévelo de manera que el líquido restante en el conducto
inferior de la sonda en Y penetre en el filtro.
Tenga cuidado manipulando el catéter al retirarlo del útero para que permanezca
limpio. El día del lavado el ganado se encuentra en la “mitad del ciclo” y propenso a
infección uterina, más que el ganado en el periodo de estro que está siendo inseminado
artificialmente.
Su asistente luego separa la sonda en Y del catéter, inserta el estilete en el catéter, sujeta
el extremo abierto del catéter en el estilete, y le alcanza el catéter. Inserte el catéter en el
cuerno que no ha sido lavado y siga el mismo procedimiento que utilizó en el primer
cuerno. Cuando la bolsa suspendida se encuentre vacía, retirar el catéter, separar el filtro
de la sonda en Y y llevar el filtro a una ubicación segura cercana al microscopio. Antes
de liberar a la donadora, algunos técnicos inyectarán el útero con un producto antimicro-
biano (es decir, clorhexidina diluida). Sin embargo, esto no es necesario si su técnica de
lavado es limpia y correcta.
Se sugiere que busque los embriones antes de la infusión (si esta es su elección), o la
liberación de la donadora. Si la búsqueda da como resultado un número de embriones u
ovocitos mucho menor que lo indicado por el recuento de CL, ponga a la donadora en
el establo y practíquele un nuevo lavado. Usted siempre aprenderá u obtendrá algo de
este segundo lavado, como lo señalado a continuación:
A) Si recupera embriones en el segundo lavado, sus esfuerzos en el primer lavado
no fueron del todo adecuados.
B) Si el segundo lavado se desarrolla bien (como usted pensó que ocurrió con el
primer lavado) y no se recuperan más embriones, puede concluir que no
habían más embriones u ovocitos que recuperar de los cuernos uterinos. Es
muy probable que los huevos no recuperados asociados con las ovulaciones
se encuentren retenidos en los oviductos, o que nunca fueran capturados por
el infundíbulo. Antes de liberar a la donadora, inyectarle 4cc de Estrumate.
Esta inyección sirve para la lisis de los múltiples CLs y retorna los ovarios a
su tamaño normal. También evita que la donadora quede embarazada si un
embrión se quedo en el útero.
25
Capítulo 4
Manipulación de Embriones
La interpretación precisa de la morfología del embrión es indispensable para:
a. a. La separación de los embriones fecundados de los óvulos sin fertilizar.

b. Emparejar la madurez del ciclo estral de las receptoras con la madurez del
embrión.
c. La selección de la fase embrionaria de desarrollo que es más probable que
sobreviva a la congelación y descongelación.
Al examinar los embriones, una técnica útil es hacer rodar el embrión empujándolo con
la punta de un catéter estéril de fertilización in vitro (FIV), o moviendo suavemente el
líquido en la placa haciendo que el embrión ruede. El embrión debe ser observado
desde todos los ángulos antes de tomar una determinación final sobre su estado y calidad.
Para ayudar a interpretar la variación en la morfología del embrión, por favor véase la
sección de embriología del DVD que se acompaña.
26
4.1 ENJUAGANDO EL FILTRO

¡Siguiendo los pasos secuenciales que se indican en esta sección podrá descubrir si el
trabajo de superovulación y recuperación ha sido fructífero! Empiece por lavar y secar
sus manos, luego encienda el iluminador del microscopio en la potencia más alta.
Ajuste el reflector de la subfase de modo que la luz rebote en el lado traslucido (no
reflejado) del reflector. Si la recuperación la direccionó hacia un filtro tipo taza como
el filtro ZONA™, deberá transferir el contenido del filtro a una plato redondo de
búsqueda con fondo de cuadrícula de 90 mm de diámetro.
Con un marcador de tinta permanente, escriba el nombre de la donadora en la tapa y la

pared lateral de la placa de búsqueda, a continuación, retire la tapa y póngala boca abajo
junto a la placa. Saque de su empaque una jeringa de plástico (de dos piezas) de 20 cc.
(CellSafe™ o HSW), colóquele una aguja calibre 16 y llene la jeringa con 20 cc de medio
de lavado, medio de enjuague, o medio de mantenimiento. El proceso de enjuague del
filtro requiere de 40 a 60cc para enjuagar adecuadamente el filtro y la malla.
Tenga en cuenta que sólo debe utilizar jeringas de dos piezas (de las marcas
CellSafe™ o HSW) si el líquido en la jeringa entrará en contacto con los embriones.
Las jeringas que tienen un tapón de butilo o caucho negro alrededor del extremo del
émbolo son tóxicas para los embriones. El tapón está cubierto con un agente tensoactivo
tipo silicona que se mezclará con el líquido en el cuerpo de la jeringa, lo que ocasionará
una reducción significativa en las tasas de preñez.
Sosteniendo el filtro al nivel de los ojos, abrir el orificio de salida y escurrir el líquido
hasta que quede unos 6-7mm de líquido. Cierre el orificio de salida. Girar suavemente
el filtro, ello hará que se forme una espiral en la solución, luego invierta el recipiente
y vacíe el contenido en la placa de búsqueda (girar y verter).
Utilice la jeringa de 20 cc para lavar las paredes del filtro, dejando 6-7mm de líquido
en el filtro. Retire la aguja de la jeringa, mantenga el filtro al nivel de los ojos, y luego
coloque el niple de la jeringa directamente en la malla. Mueva el niple encima de la
malla a medida que aspira lentamente, extrayendo mucosidad y desechos del útero (y
embriones) de la malla hacia la jeringa. Suavemente expulse el contenido de la jeringa
en la placa de búsqueda. Si hay burbujas en la jeringa, expúlselas en la tapa invertida
para realizar la búsqueda posteriormente (después de que las burbujas se hayan disuelto
en el líquido).
Si aún hay mucosidad y restos evidentes en la malla, llene la jeringa con otros 20cc de
medio de enjuague y realice el procedimiento de aspiración directa de nuevo en la
malla. Finalice el proceso de enjuague del filtro girándolo para formar la espiral y
luego vertiendo el líquido. Ahora puede desecharse el filtro y la jeringa.
27
MANIPULACIÓN DE EMBRIONES
4.2 BÚSQUEDA Y EXTRACCIÓN

Usando ambas manos, coloque cuidadosamente la placa de búsqueda en la platina del
microscopio. Los embriones se depositarán en el fondo de la placa dentro de uno o dos
minutos. Comenzar una búsqueda sistemática en la placa ajustando la perilla del zoom
de aumento para que alcance 10-15x de aumento total. Gire la perilla de enfoque
posterior hacia arriba y hacia abajo hasta que el fondo de la placa de búsqueda se
encuentre bien enfocado. A partir de este momento, se puede realizar la búsqueda en
toda la placa sin modificar significativamente la ampliación o enfoque. Sólo cuando el
recipiente contenga mucosidad y desechos suspendidos en la solución necesitará enfocar
el lente hacia arriba o hacia abajo.
Mover la placa en la platina de modo que la búsqueda comience por la cuadrícula

(celda) en la esquina superior izquierda y continúe hacia a la derecha siguiendo un
patrón en “Z”, es decir, al costado, abajo, al costado, abajo, etc. Las celdas son de
10mm x 10mm, y un bajo nivel de aumento permite examinar toda una celda en un
solo campo de visión. Concéntrese en lo que está buscando: un círculo claro y
brillante (la zona pelúcida). Moverse a través de toda la placa examinando todas las
células y extrayendo los embriones que se encuentran en los espacios abiertos, no
enredados en los desechos. Seguidamente, gire lentamente la placa 360°, mientras
examina cuidadosamente la zona oscura donde la pared vertical se une con el plano
inferior horizontal. Es difícil accesar a esta área para lograr enfocarla y puede
requerirse el ajuste del enfoque al girar la placa.
Después de buscar en todas las cuadrículas, utilice la punta del catéter de FIV para agitar
y mezclar suavemente el contenido de la placa. Deje que la solución se asiente durante
uno o dos minutos, y luego realice una búsqueda en toda la placa una vez más. La
mucosidad y los restos de tejido uterino son parte de un lavado normal, sin embargo,
hacen más difícil el proceso de aislamiento y extracción de embriones. Se requiere
paciencia y persistencia en este momento.
Para este segundo proceso en la placa, utilice una aguja calibre 20 x 1,5" para mover,
extender y dar la vuelta a cada pedazo de desecho y mucosidad, para buscar con mayor
minuciosidad embriones incrustados en los desechos. Para retirar un embrión incrustado
en mucosidad, utilice dos agujas calibre 20 x 1.5". Viendo el embrión en baja resolución,
utilice una aguja para inmovilizar la mucosidad de un lado del embrión, y luego
coloque la otra aguja en la mucosidad del lado opuesto del embrión, y suavemente
retire la mucosidad del embrión. Repitiendo varias veces esta acción el embrión
quedará libre de mucosidad y/o desechos. Consejo: Si un embrión con o sin mucosidad
se adhiere a la punta de la aguja y no logra desprender el embrión, eleve la aguja
sacándola del líquido. A medida que la punta de la aguja rompa la tensión superficial,
el embrión se quedará en la placa que contiene el líquido.
28
Cuando halle un embrión, conecte con firmeza un catéter de FIV a una jeringa de 1 cc
de tres piezas (Fig. 9). Prefiero la jeringa de tres piezas porque el tapón de goma negro
con silicona permite que el émbolo se mueva con facilidad y sin problemas a través
del cuerpo. Tenga en cuenta que no será necesario y no debe extraer medio de lavado
al cuerpo de la jeringa. El catéter de FIV proporciona un volumen interno adecuado
para la aspiración y la expulsión (manipulación) de los embriones, por lo tanto el
medio de lavado nunca debe ingresar a la
jeringa.
Fig. 9. Catéter de FIV conectado a una

jeringa de 1cc de tres piezas
CONSEJO: A veces el eje abierto del catéter de FIV es ligeramente más grande que
el niple del conector luer de la jeringa de 1 cc, por lo que no es posible una conexión
ceñida y hermética. Esto se soluciona fácilmente cortando con tijeras 2-3mm en el
largo del eje del catéter.
Preparar una placa de Petri (Solution™ 35x10mm) o una placa de 6 pozos Solution™
para recibir el embrión escribiendo el nombre de la donadora en la tapa de la placa y
las paredes laterales. El uso de utensilios de plástico aprobados para uso con
embriones es esencial para una óptima viabilidad de los embriones (Lane,
Mitchell, Kashman, Feil, Wakefield, & Zander-Fox, enero 2008). Como mínimo, el
material plástico debe contar con aprobación para uso en bioensayos con embriones
unicelulares de ratón (Tucker, & Jansen, 2002). Niveles adicionales de confianza se
logran con material aprobado para uso en HSSA (ensayos de supervivencia de
espermatozoides humanos) y también con certificación de bajo nivel de endotoxina.
La línea de utensilios plásticos Solution™ cuenta con las tres certificaciones.
Extraiga 8-10cc del medio de transferencia/mantenimiento en una nueva jeringa de 10

o 20 ml CellSafe™, retire la aguja y coloque un filtro a la jeringa. El medio de
transferencia/mantenimiento envasado es estéril, sin embargo prefiero la seguridad
adicional de usar un filtro de jeringa (0.2u ETMedia™) para filtrar en forma estéril
cualquier líquido en el que pueda haberse puesto un embrión, el que posteriormente
será colocado en el útero. Aplique presión sobre el émbolo para desechar las primeras
cuatro a cinco gotas de medio del filtro de la jeringa y luego dejar que caigan seis a
ocho gotas en la placa de Petri seca. Enjuagar la placa agitando las gotas en la placa y
luego desechando el medio. Continúe llenando la placa con el filtro de la jeringa hasta
que la placa esté llena en un 65% de su capacidad.
Sujete la jeringa de 1cc que tiene conectado el catéter de FIV y tire del émbolo hacia
atrás 0,2 ml. Este espacio de aire servirá para expulsar el embrión del catéter. Baje la
punta del catéter a la capa superior del medio en la placa de búsqueda y aspire una
columna de líquido de 15 mm. en el pequeño extremo abierto del catéter.
29
Al mirar a través del microscopio con baja potencia teniendo el embrión situado en el
centro del cabezal del microscopio, baje la punta del catéter adyacente al embrión.
Aplicando una lenta y controlada técnica de aspiración con una sola mano,
suavemente “haga ingresar” el embrión en la punta del catéter. Una vez que el embrión
haya ingresado 2-3mm en el interior del catéter, deje de aspirar.
Levante el catéter fuera de la placa de búsqueda y a continuación coloque la punta

directamente sobre el centro de la placa de Petri o placa multipocillos preparada. Baje
la punta hasta que haga contacto con la superficie del líquido, y luego lentamente
empuje el émbolo y expulse todo el líquido contenido en la punta del catéter (15-
20mm de longitud de medio). No expulse el aire en el líquido de la placa de Petri,
lo que daría lugar a burbujas a las que pueden adherirse los embriones, y también
obstaculiza su habilidad para ver a través del líquido. Continúe con la segunda búsqueda
en la placa, removiendo y colocando todos los embriones que se encuentren en la
placa de Petri (o la placa multipocillos).
4.3 CLASIFICACIÓN DE EMBRIONES

Consulte el Apéndice A para familiarizarse con los códigos numéricos que describen
el estadío de desarrollo. A pesar de que una cierta subjetividad visual influirá en los
códigos numéricos de desarrollo que asignamos, es el mejor sistema disponible para
nuestra industria. Por lo tanto, es crucial que se tome el tiempo para examinar con
precisión los embriones desde diversos ángulos. Las imágenes unidimensionales y los
dibujos son buenas herramientas de aprendizaje. Sin embargo, es mejor examinar los
embriones tridimensionales vivos desde varios ángulos para determinar el estadío de
desarrollo más exacto y el nivel de calidad.
Los números de los estadíos 1-9 se refieren a la madurez de la masa celular principal,
es decir, la agregación de células individuales (blastómeros). Haga rodar el embrión a
medida que lo examina a baja resolución, y luego con un mayor grado de aumento (50-
90x). Conforme aumenta la ampliación, tendrá que aumentar el brillo de la
iluminación y tal vez ajustar el reflector inferior. Asigne al embrión un código de
estadío que se asemeje más a los estadíos ilustrados en el Apéndice A.
Normalmente los estadíos más difíciles de identificar correctamente para el estudiante

principiante son el estadío 1 (1-célula) no fértil frente al estadío 4 denominado mórula.
Para ayudar a efectuar esta distinción, recuerde que el estadío no fértil comprende una
sola célula grande encerrada en una membrana. Imagine la célula única como una
pelota playera inflada con una “piel” uniforme suave, ceñida y brillante. ¡Y alrededor
de la pelota playera está la zona pelúcida! Compare esto con el estadío 4 denominado
mórula, que se parece a un racimo de uvas uniformemente compacto, o a una pelota de
fútbol con su cubierta de parches cosidos en forma compacta. Al comparar estos dos
estadíos, concéntrese en el borde de la masa. La línea de borde del organismo no fértil
será suave y continua, mientras que el borde de la mórula tendrá una apariencia ondulada.
30
Una buena regla general es que si usted puede contar aproximadamente treinta
blastómeros, se trata de un estadío 3 denominado mórula temprana. El protocolo
comercial de TE describe los embriones en estadío 2 (2-16 células) como degenerados
(muertos) y los desecha, y por supuesto también los óvulos en estadío 1.
Las calificaciones de calidad 1 al 4 generalmente se refieren a la composición y la

cantidad de “desechos” que no forman parte de la masa celular principal. Los desechos
se componen básicamente de blastómeros extruídos que se quedaron fuera de la masa
celular principal. Estos blastómeros extruídos se encuentran en el espacio perivitelino
(PV), que es la zona comprendida entre la masa celular principal y la zona pelúcida.
Los estadíos 3, 4, y 5 con frecuencia reciben una puntuación de calidad diferente a 1.
A medida que los blastómeros en estos estadíos más tempranos continúan dividiéndose,
las células que se quedan fuera de la masa principal son fácilmente visibles en el espacio
PV. Si no hay blastómeros extruídos en el espacio PV, la calificación de calidad es 1,
de lo contrario asígnele un puntaje de 2 o 3.
Tenga en cuenta que las directrices sugeridas por el Manual de la Sociedad

Internacional de Transferencia de Embriones (Stringfellow y Seidel, 1998) relativas a
la puntuación de calidad se basa en la interpretación subjetiva visual. La SITE se creó
en 1974 en Denver, Colorado, EE.UU. para servir como un foro profesional para el
intercambio de información, y para seguir los desarrollos de la transferencia de embriones
en zootecnia. La página web de la organización es www.IETS.org.
No hay ninguna diferencia en la tasa de preñez entre los embriones con calificación
de calidad 1 en estadíos de desarrollo 4, 5, 6 o 7, en comparación con embriones con
calificación de calidad 2 en los mismos estadíos de desarrollo. La “fuerza” del
embrión procede de la integridad y la madurez de la masa celular principal, y no es
influenciada significativamente por los blastómeros extruídos, vacuolas o células
muertas en el espacio PV.
Los embriones buenos para fines de TE comercial normalmente serán los
embriones en estadío de desarrollo 4 (mórula), 5 (blastocisto temprano), 6
(blastocisto) y 7 (blastocisto expandido). Un embrión en estadío 3 de mórula
temprana no debe ser congelado. Sin embargo, se pueden lograr buenos resultados con
una mórula temprana cuando se le transfiere fresca a una receptora en el sexto día de
celo. El DVD que se acompaña incluye una sección de embriología que muestra los
estadíos de desarrollo de numerosos embriones. La fase de desarrollo, la calidad del
embrión y la integridad de la zona pelúcida determinan si el embrión es adecuado para
la congelación. Otra excelente referencia, que incluye fotografías de embriones
clasificados, es el Manual de la Sociedad Internacional de Transferencia de
Embriones.
31
4.4 ASIGNACIÓN DE EMBRIONES

Preparar dos placas de Petri nuevas, cada una con su respectiva etiqueta de
identificación en la tapa y la pared lateral con el nombre de la donadora. También
puede usarse una placa multipocillos. Enjuage y luego llene cada placa a un 65% con
el medio de mantenimiento filtrado. Escriba “transferencia” en la tapa de una placa, y
escriba “congelar” en la otra tapa. Al terminar este proceso de evaluación/
clasificación, lo que quede en la placa original serán óvulos no fértiles y embriones
degenerados, a los que colectivamente se les denomina “huevos malos o embriones
malos”. Los embriones buenos son los que producen tasas de preñez promedio al ser
congelados o transferidos frescos. Las tasas de preñez promedio son 65% para
transferencias en estado fresco y 55% para embriones congelados/descongelados.
Con todos los embriones en nuestro ejemplo ahora aislados en una placa de Petri, el
siguiente paso es asignar a cada uno el código correspondiente al estadío de desarrollo y
la puntuación del nivel de calidad. Una recuperación típica estará compuesta de embriones
en diversos estadíos de desarrollo aptos para transferencia o congelación, además de
varios embriones degenerados y (desafortunadamente) uno a dos óvulos no fértiles.
Para este ejemplo vamos a suponer que tenemos cinco receptoras utilizables, y en el
proceso de recuperación hemos obtenido un total de doce huevos. La clasificación de
los doce huevos ha dado como resultado lo siguiente: siete embriones transferibles (dos
en estadío 7 blastocistos expandidos, dos en estadío 6 blastocistos, tres en estadío 4
mórulas), tres embriones degenerados en estadío 2, y dos óvulos no fértiles. Por lo
tanto, debemos decidir qué embriones serán transferidos frescos y cuales serán congelados.
Debido a que la tasa de supervivencia para embriones congelados o descongelados en
estadío 7 blastocitos expandidos puede ser un 5% a 10% menor que la de los blastocistos
y las mórulas, me permito sugerir la siguiente asignación.
a) Congelar los dos blastocistos en estadío 6.

b) Transferir en fresco los dos blastocistos expandidos en estadío 7 y también las
tres mórulas en estadío 4.
Tenga en cuenta que los embriones en estadío 7 y 4 producirán los mismos buenos
resultados al ser transferidos frescos, asumiendo que tenga receptoras con fechas de
celo similares a la fase de desarrollo de los embriones. Esto significaría transferir
embriones en estadío 7 a receptoras que iniciaron su periodo de celo ocho días antes, y
transferir embriones en estadío 4 a receptoras que iniciaron su ciclo seis días antes.
4.5 CARGA DE PAJUELAS

Los embriones deben ser aspirados a pajuelas de 0.25cc en forma previa a la
congelación o antes de la transferencia. Su habilidad para cargar las pajuelas en forma
correcta, eficiente y repetitiva es parcialmente un arte que se perfecciona y se hace
32
más fácil con la práctica. Ya sea que se cargue pajuelas con EG para congelación,
o con medio de mantenimiento para transferir embriones frescos o embriones
descongelados en glicerol, la secuencia
de carga es esencialmente la misma.
Véase la Fig. 10 con imágenes de
pajuelas cargadas.
Fig. 10. Pajuelas cargadas mostrando

columnas de medio y aire
a. Si realiza la transferencia de embriones frescos o descongelados en glicerol,

etiquete una placa de Petri en la parte lateral y en la tapa con la palabra
MANTENIMIENTO y luego filtre con una jeringa el medio de mantenimiento
en la placa. La placa se utilizará para aislar el embrión que está cargando, y
para enjuagar la pajuela y extraer los remanentes del medio de mantenimiento
a la pajuela.
La secuencia que sigue describe el proceso de carga de embriones para la

transferencia en estado fresco, o para recargar embriones descongelados en
glicerol para la transferencia. Sin embargo, los pasos son los mismos si está
cargando embriones para congelación. La diferencia es que se utilizará EG en
lugar del medio de mantenimiento. Nótese que prácticamente todos las
columnas de medio y aire son cargadas visualmente (no mirando a través del
microscopio) de modo que la longitud de las columnas sea correcta. Sólo
cuando haga ingresar al embrión en la pajuela se utilizará el microscopio.
b. Poner la placa que contiene todos los embriones a ser transferidos en la

platina del microscopio. Aspirar uno de los embriones del grupo en el catéter
de FIV. Quite esta placa de la platina y reemplácela con la nueva placa
etiquetada con medio de mantenimiento. Suelte el embrión en la placa y luego
llévelo hacia el centro de la placa. Clasifique el embrión por estadíos de
desarrollo y nivel de calidad y registre esta información en la sección B del
Certificado de Transferencia.
c. Inserte el extremo con la punta de algodón de la nueva pajuela seca de 0.25cc

directamente en la punta de una jeringa de 3 piezas con conector luer. Puede
que tenga que sostener la pajuela con un ligero ángulo de inclinación a medida
que empuja y gira la pajuela contra la abertura de la punta. La mayor parte de
la longitud del extremo con la punta de algodón se insertará en la punta de la
jeringa, dando como resultado un cómodo sello hermético que le permite
obtener un vacío mediante la pajuela.
33
d. Enjuague la pajuela tirando primero del émbolo de la jeringa hacia atrás

0.2cc, y luego coloque el extremo abierto de la pajuela en el recipiente del
medio de transferencia que contiene un solo embrión. Coloque la punta de la
pajuela cerca del borde del recipiente, alejado del embrión que se encuentra
en el centro del recipiente. Aspirar una columna de medio de 20mm, sacar la
pajuela del medio, y luego hale el medio hasta 10 mm del tapón de algodón.
¡No moje ninguna parte del conector! Lentamente presione el émbolo para
descartar el medio.
e. La pajuela está ahora lista para cargarse con columnas de medio, aire, y el
embrión (las medidas de longitud de la columna que se indican son
aproximadas). Aspirar 10mm de medio y luego saque la punta de la pajuela
del recipiente. Esta columna finalmente mojará el tapón de algodón.
f. Empuje suavemente el embolo hacia arriba y hacia abajo con el dedo pulgar
y el dedo índice hasta que se muestre un espacio de 6 mm de aire en el
extremo de la pajuela.
g. Coloque la pajuela en el recipiente y aspire 40 mm de medio, y luego saque la

punta de la pajuela del recipiente. A esta columna se le conoce como líquido
“de empuje”.
h. Empuje suavemente el embolo hacia arriba y hacia abajo con el dedo pulgar
y el dedo índice hasta que aparezca un espacio de 6 mm de aire en el extremo
de la pajuela.
i. Coloque la pajuela en el recipiente y aspire 3mm de medio. Esto crea el

comienzo de la columna que contendrá el embrión. Mientras ve el embrión a
bajo aumento, coloque el borde de la pajuela al lado del embrión. Suavemente
empuje el embrión y levante ligeramente la punta de la pajuela hacia arriba,
en forma similar a la acción de una pala. Este movimiento hará que el
embrión se levante del fondo del recipiente y “flote” directamente en frente
de la pajuela, permitiéndole aspirar el embrión en la pajuela.
Tan pronto como vea que el embrión ingresa a la pajuela, retire sus ojos de los
oculares y controle visualmente la longitud de la columna, mientras continúa
extrayendo medio de mantenimiento hacia la pajuela hasta que la sección
tenga una medida de 45mm de largo aproximadamente. Mantener la pajuela
a un ángulo aproximado de 45° a medida que continúa alargando esta columna,
para ayudar a que el embrión permanezca en el centro de la columna. Saque la
punta de la pajuela del recipiente. Esta columna contiene el embrión.
34
j. Suavemente empuje el émbolo hacia arriba y hacia abajo con el dedo pulgar
y el dedo índice hasta tener un espacio de 6 mm de aire al final de la pajuela.
k. Coloque la pajuela en la placa y aspire 5 mm de medio, y luego saque la punta

de la pajuela de la placa. A esto se le conoce como la primera entrada de
medio. Los 4 a 5mm restantes de la pajuela no deben contener medio y
servirán para el ingreso del tapón de sellado. No humedezca el tapón.
l. Antes de humedecer el tapón, debe confirmar que el embrión se encuentre en

la columna apropiada de medio. Quite la placa con el medio de mantenimiento
de la platina. Coloque la pajuela cargada horizontalmente en la platina del
microscopio y manténganla allí sujetándola con el dedo índice. El embrión se
hundirá en el borde inferior de la pajuela. Sin embargo, no es posible enfocar
el fondo de la pajuela. Por lo tanto, enfocar (en bajo aumento) el borde
superior de la pajuela, en el extremo de la columna que contiene el embrión.
Al mirar a través del microscopio, atraviese lentamente la pajuela en la platina
y al mismo tiempo gire la pajuela. Si el embrión se encuentra en la columna,
usted podrá verlo cuando el embrión flote momentáneamente en el borde
superior de la pajuela. Si no ve el embrión en la parte media de la columna,
asegúrese de examinar de cerca cada extremo de la columna en la curva oscura
del menisco.
m. Si usted identifica al embrión y se encuentra en la columna correcta de medio,

debe entonces tirar del émbolo de la jeringa hacia atrás hasta que el centro del
tapón de algodón se empape con el medio. El centro del tapón de algodón
contiene polvo de cloruro de polivinilo (PVC) que se hincha y se expande
cuando está húmedo, sirviendo como un sello semi-permanente en el extremo
de la pajuela. Separe la jeringa de la pajuela, que está lista para la transferencia.
Si el examen determina que el embrión se encuentra en posición incorrecta o no está

en la pajuela, puede presionar suavemente el émbolo y expulsar el contenido en la
placa de petri y luego volverla a cargar. Si no puede expulsar el contenido porque el
tapón ya está mojado, simplemente corte el tapón de algodón. Esto libera el vacío y
permite verter el contenido en la placa de Petri.
35
Capítulo 5:
Congelación de Embriones
Los embriones congelados comercialmente hace veinte o treinta años eran congelados
en compuestos de glicerol, DMSO, y/o sacarosa. El proceso de descongelación
requería que el embrión pasará a través de numerosas soluciones de medio antes de
ser cargado nuevamente en una pajuela para la transferencia. Esto requería tiempo, la
formulación del medio, y la instalación de un microscopio. Sin embargo, era la mejor
técnica disponible en ese entonces.
Afortunadamente la investigación privada así como la académica, y numerosas

pruebas de campo en los últimos diez a quince años, utilizando etilenglicol en lugar
de glicerol dieron como resultado una metodología aceptable para la transferencia
directa de embriones congelados. Esto permite que los embriones congelados sean
descongelados y transferidos en forma muy similar al semen congelado. Hoy en día,
más del 95% de los embriones congelados a nivel mundial son congelados por la
metodología de transferencia directa (TD). Sin embargo, aún hay cientos de
embriones en glicerol en tanques para semen en todo el mundo.
Para evitar confundir las pajuelas con glicerol con las pajuelas para TD y descongelar
unas u otras incorrectamente, la SITE recomienda que todos los embriones para TD
sean congelados y almacenados en contenedores amarillos, es decir, pajuelas, tapones,
etiquetas, y recipientes amarillos.
36
Para lograr los mejores resultados en embriones congelados/descongelados, deben

realizarse muchos pasos con precisión y de manera oportuna antes de la congelación
y también inmediatamente después de la descongelación. Los embriones están
muriendo desde el momento en que son extraídos de la donadora. Por lo tanto, deben
ser colocados en la criocámara dentro de las dos horas de la recuperación, o ser
transferidos frescos poco después. Tan pronto como los embriones han sido designados
para la congelación, colocarlos en un medio de mantenimiento estéril y dejarlos a un
lado mientras se preparan los siguientes instrumentos e insumos.
5.1 EQUIPOS Y SUMINISTROS

Los siguientes instrumentos y suministros deben estar disponibles el día del lavado si
prevé la congelación de embriones.
• Congelador con sistema de enfriamiento controlado Cryologic Modelo 2200.
Requiere corriente de 110V o 220V, o módulo de alimentación por batería.
Actualmente existen en el mercado varios congeladores de embriones
electrónicos, confiables y portátiles, con sistema de enfriamiento controlado.
Algunos modelos utilizan alcohol, mientras que otros utilizan el nitrógeno
líquido como refrigerante.
• Nitrógeno líquido (3-4 litros), taza aislante de 0,25 litros; tanque de semen
con depósitos para mantener los embriones congelados.
• Microscopio (el mismo que se utilizó para la búsqueda).
• Pajuelas amarillas de 0.25cc, tapones amarillos de pajuelas de 47mm, goblets
amarillos de 13mm, cánulas de aluminio.
• Impresora de etiquetas Brady con stock de etiquetas amarillas; marcador de
tinta permanente.
• Formulario ABC Recuperación, transferencia y congelación de embriones;
información sobre la donadora y semental(es) que participaron en el lavado.
• Placas de Petri de 35 mm, o placas de 6 pozos.
• Jeringas de 20ml CellSafe™, agujas calibre 16 x1".
• Catéteres de FIV, jeringas de 1 ml de tres piezas, pinzas hemostáticas largas
con puntas rectas de 5,5".
• Cronómetro
• 20 ml de etilenglicol (EG) medio de congelación.
• Filtros de jeringa ETMedia™.
• Kit de tripsina y medio de mantenimiento (si los embriones son para la
exportación).
5.2 CERTIFICACIÓN DE APAREAMIENTO, TRANSFERENCIAS Y

CONGELACIÓN
La identificación precisa, la certificación y el mantenimiento de registros son
absolutamente esenciales, no sólo para asegurar a los compradores que están recibiendo
los embriones que acordaron comprar mediante contrato, sino también para asegurar
37
CONGELACIÓN DE EMBROINES
las crías y ascendencia en procesos de transferencia de embriones, para correlacionar

los embriones con los certificados de salud correctos, y para garantizar un mínimo de
confusión cuando los embriones pasen de un técnico a otro o de un país a otro.
Algunas asociaciones de criadores pueden exigir la determinación del grupo sanguíneo,

certificación o registro del personal que participa en la transferencia de embriones,
además de permiso previo para propagar a determinados progenitores (padre y madre)
mediante transferencia de embriones. La SITE recomienda, como mínimo, que se
determine el grupo sanguíneo de la madre donadora y el padre(s) antes de la
recuperación de los embriones.
Un formulario elaborado por la SITE, y utilizado universalmente para registrar

información sobre la recuperación, transferencia y congelación se le conoce como
formulario “ABC”, y figura anexo como Apéndice B.
Cuando se recuperan los embriones transferibles, se debe llenar y firmar el certificado

A (Recuperación de Embriones). Cuando se transfieren los embriones (frescos o
congelados), se debe llenar el certificado B (Transferencia de Embriones) y debe ser
nuevamente firmado por la persona o empresa que realiza las transferencias. Por último,
cuando se congelan los embriones, el certificado C (Congelación) debe ser llenado y
firmado por la persona o empresa que congela los embriones. El certificado D
(Exportación de Embriones) está disponible y debe ser presentado a la entidad
encargada del registro de razas en el país de exportación al cual se van a remitir los
embriones. En el reverso de cada certificado se incluyen instrucciones específicas para
el llenado de los formularios.
Los certificados A y C (Recuperación de Embriones y Congelación de Embriones)

deben ser llenados por el técnico para cada grupo de embriones congelados por
donante, por cada recuperación. Una copia de este formulario combinado debe ser
entregada al propietario de los embriones, una copia debe quedarse en poder del
técnico de TE, y otra remitirse al organismo respectivo encargado del registro de razas.
Debe acompañarse una copia de este formulario A-C al realizar cualquier movimiento
o traslado de los embriones de cada recuperación. La información en el formulario
debe corresponder a la identificación del embrión en la pajuela.
También para fines de exportación, se recomienda que las copias de todas las pruebas
oficiales de salud de las donadoras se adjunten al formulario A-C para su conservación
permanente y referencia.
Un código estandarizado que describe las etapas de desarrollo del embrión y su calidad
se incluye en el reverso de cada certificado.
38
5.3 ETIQUETADO
La SITE reconoce un sistema estandarizado para la identificación de los contenedores de
embriones. La información esencial que debe ser impresa en tinta permanente, ya sea en
la mitad superior de la pajuela o en el tapón de la pajuela debe figurar en dos líneas e
incluir la siguiente información.
1 E656HO 7947108 Bessie (esta información en la línea #1)

09AU22 28495 Elevation (esta información en la línea #2)
Explicación de la información de etiquetado arriba indicada:

1 pajuela #1 de este lavado
E656 El número de código único asignado por la SITE, a la persona o empre-
sa que realiza la congelación del embrión.
HO Holstein (o cualquiera sea la raza que esté siendo congelada)
7947108 Número de registro de la donadora
Bessie Establo o nombre común de la donadora
09AU22 Año, mes, día de la recuperación
28495 Número de registro del semental del lavado
Elevation Establo o nombre común del semental del lavado
Además de etiquetar el contenedor del embrión, se requiere el correcto etiquetado de

los goblets y cánulas. La misma información que usted registré en la pajuela debe
anotarse en la parte inferior del goblet (menos el número de la pajuela) y en la parte
lateral de la cánula de aluminio. Normalmente, sólo la parte inferior del goblet
contiene pajuelas de embriones y la parte superior se invierte y luego se desliza sobre
las pajuelas para asegurar que no floten fuera del goblet. Además, cuando las cánulas
son reenvasadas para la exportación, deben conservar el mismo número de cánula
como se indica en el certificado C, con la adición de una letra indicando que la cánula
ha sido empacada nuevamente, por ejemplo, cánula 1A.
5.4 CRITERIOS PARA LA CONGELACIÓN

El estadío de desarrollo y la integridad de la zona pelúcida determinarán si un
embrión debe ser congelado. Los estadíos 4, 5, 6 y 7 son aceptables para la
congelación, teniendo en cuenta que los embriones en estadío 7 de blastocitos
expandidos tienen un 5% a 10% de menores probabilidades de resultar en preñez luego
de ser congelados/descongelados en comparación con los otros estadíos de desarrollo.
La congelación daña un determinado porcentaje de los blastómeros en todos los

estadíos, lo que es causado principalmente por la formación de cristales de hielo dentro
de las células. Los embriones con nivel de desarrollo menor al estadío 4 tienen bajas
tasas de supervivencia luego de ser congelados/descongelados ya que sólo tienen unos
pocos blastómeros inicialmente y la pérdida de células producto de los daños causados
por los cristales de hielo conlleva a un mayor porcentaje de pérdida. Al inducir la formación
39
de cristales de hielo mediante el protocolo de cristalización a -6°C, los cristales de hielo

son más pequeños y menos perjudiciales que si permitimos que el EG se cristalice
espontáneamente a una temperatura inferior a -15ºC.
Dado que la zona pelúcida es una barrera eficaz de patógenos, es esencial que todos
los embriones congelados tengan una zona pelúcida intacta (sin fracturas/sin grietas).
Los estudios microbiológicos han demostrado que la zona pelúcida es una excelente
barrera contra la mayoría de las enfermedades de la especie bovina. Un lavado
cuidadoso de los embriones conservando intacta la zona pelúcida eliminará
completamente cualquier rastro de la mayoría de los agentes patógenos. Por lo tanto
la SITE recomienda especialmente, e igualmente así lo exigen los países
importadores, que todos los embriones sean lavados en un mínimo de diez baños
separados antes de ser expuestos al medio de congelación EG.
Para garantizar la integridad de la zona, cada embrión después del lavado debe
ser examinado en toda su superficie, a un aumento no menor de 50x. Se hace rodar
suavemente a los embriones en la placa de modo que todas las superficies de la zona
puedan ser examinadas en busca de grietas. Esta evaluación debe tener lugar después
de los diez lavados y antes de la congelación. Si los embriones no se destinan para la
exportación, el lavado no es necesario antes de la congelación.
El procedimiento de lavado recomendado por la SITE requiere la transferencia de

embriones en grupos de diez o menos, a través de diez cambios de medio de manten-
imiento. Debe utilizarse una nueva pipeta estéril (catéter de FIV) para la transferencia
de embriones entre lavados sucesivos. Para maximizar la dilución de patógenos entre
lavados, aspirar los embriones en el catéter con la menor cantidad de medio posible.
En la actualidad, sólo los virus de rinotraqueítis infecciosa bovina (VRIB) y estomatitis

vesicular (VEV) han demostrado que se adhieren a la zona tan firmemente que el proceso
de lavado normal no los eliminará. Los embriones expuestos a estos dos virus
requieren tratamiento con tripsina para hacerlos no infecciosos. Por lo tanto, si el país
importador especifica embriones libres de VRIB y VEV, debe realizarse un lavado de
doce pasos con tripsina. Consulte el Apéndice C para instrucciones paso a paso del
lavado con tripsina.
5.5 SECUENCIA DE CONGELACIÓN DE EMBRIONES PARA TD

(ETILENGLICOL)
El crioprotector etilenglicol podría considerarse un “mal necesario”. Sin el, los embriones
bovinos no pueden sobrevivir a la congelación. Sin embargo, la exposición a EG para
más de diez minutos reduce significativamente la supervivencia de los embriones
congelados. Por lo tanto, la última cosa que usted hace es colocar el embrión en
etilenglicol.
40
1) Lave los embriones siguiendo la secuencia de los doce pasos con tripsina si
se requieren para la exportación. Los embriones a ser congelados se colocan
luego en una placa separada con medio de mantenimiento estéril. Etiquete la
tapa de la placa y la parte lateral con el nombre de la donadora, y anote
también en la tapa la palabra “mantenimiento”.
2) Prepare todo con anticipación, es decir, las pajuelas deben estar etiquetadas
(o los tapones de las pajuelas etiquetados), el congelador regulado a una
temperatura de -6°C, 1 placa de petri llena con el medio EG filtrado con
jeringa (la pared lateral y la tapa de la placa señalan en la etiqueta EG). La
placa de EG será utilizada para el lavado de la pajuela, para extraer las columnas
iniciales de EG a la pajuela, y para exponer el embrión al EG. El cronómetro
ha sido puesto en siete minutos.
3) Coloque la placa con medio de mantenimiento que contiene los embriones en

la platina del microscopio. Utilizando el catéter de FIV, lleve el primer
embrión a ser congelado hacia el centro de la placa. Evalúelo para determinar
el estadío de desarrollo y la calidad, y luego registre esta información en la
sección respectiva del Certificado C de Congelación.
4) Aspire el embrión en el catéter de FIV. Tan pronto como el embrión entre en

el catéter, deje de aspirar. Saque el catéter del medio de mantenimiento,
empuje la placa con medio de mantenimiento hacia adelante, y coloque la
placa con EG en el centro de la platina. Mirando a través del microscopio a
poco aumento, baje suavemente la punta del catéter de FIV hacia el fondo de
la placa con EG y, a continuación, empuje suavemente el émbolo hasta que
vea salir el embrión del catéter. No expulse más medio de mantenimiento en
el EG que el que se requiera para liberar el embrión. Suavemente “remueva”
la punta del catéter alrededor del embrión para mezclar el medio de
mantenimiento expulsado con el EG. El embrión se depositará en el fondo del
plato.
5) Activar el cronómetro de modo que comience a contar hacia abajo a partir de

siete minutos. Cuando se señalen cuatro minutos restantes en el cronómetro,
cargar el embrión en la pajuela amarilla de 0.25cc por el método descrito en
la sección 4.5. MUY IMPORTANTE: (a) la columna de medio que contiene
el embrión debe tener una altura aproximada de 45 mm, y (b), debe confirmar
que el embrión se encuentra en el centro, o muy cerca del centro, de esta
columna de EG. Si no está en el mismo centro o muy cerca del centro de la
columna asignada, debe volver a cargar esta columna. De lo contrario, hay
una gran posibilidad que el protocolo de cristalización congele y mate el
embrión instantáneamente.
41
6) Si el embrión se encuentra de forma segura en el centro de su columna de EG,

puede mojar el tapón. Tenga en cuenta que debido a que esta pajuela será
congelada, es fundamental que el 100% del polvo de PVC (en el centro del
tapón de algodón) se encuentre saturado con EG. Si tira del émbolo hacia
atrás muy lentamente, el contacto inicial del EG con el PVC ocasionará que
únicamente la cara de la sección de PVC se moje, dando un sello muy débil.
Si el sello de PVC es débil, es muy probable que se reviente durante el
proceso de congelación y se pierda el embrión.
7) Por lo tanto, tire del émbolo en forma fuerte de modo que el EG rápidamente
impregne y sature el 100% del polvo de PVC. ¡En el instante en que vea que
la totalidad del polvo se encuentra húmeda, deje de jalar el embolo! De lo
contrario, se puede desprender y fragmentar el tapón de algodón. Sosteniendo
la pajuela en el tapón de algodón, gire suavemente y tire de la pajuela
sacándola de la jeringa.
8) Inserte el extremo del niple del tapón sellador de plástico amarillo etiquetado
(Fig. 11) en el extremo de la pajuela opuesto al tapón de algodón. Asegúrese de
que el tapón se ubique en todo momento en su centro, teniendo cuidado de
no doblar ni aplastar la pajuela. Será difícil realizar la correcta inserción del
tapón de plástico si sus dedos están un tanto aceitosos, por
lo tanto un guante de látex envuelto en esta parte de la
pajuela le ayudará a introducir completamente el tapón en
la pajuela. Tenga en cuenta que si el tapón de plástico no
está totalmente insertado en la pajuela, el tapón puede
reventar y desprenderse de la pajuela en el momento en
Fig. 11. Sealing plug que se coloca la pajuela en el baño de descongelación.
9) Traslade la pajuela a la criocámara y suavemente insértela verticalmente, con

el tapón de algodón hacia abajo, hasta llegar a la parte inferior a una de las 23
ranuras. Si es necesario, pueden ingresar dos pajuelas en cada ranura vertical
duplicando así la capacidad de la criocámara a 46 pajuelas. El congelador
debe estar a -6ºC de temperatura.
10) Cuando el cronómetro finalice y suene a los siete minutos, iniciar el protocolo
de cristalización de la pajuela. No iniciar el protocolo de cristalización
antes de los siete minutos. El protocolo de cristalización es el acto de inducir
la formación de cristales de hielo en el borde superior (el menisco) de la
columna de EG que contiene el embrión. Suponiendo que la pajuela se ha
cargado correctamente, el embrión estará ubicado en la mitad inferior de la
columna de EG. Coloque las puntas (con exclusión de la mordaza) de una
pinza homeostática recta en el baño de nitrógeno líquido que rodea la
criocámara durante veinte segundos.
42
11) Con las puntas de la pinza homeostática aún en el nitrógeno, coja la pajuela
por su tapón plástico etiquetado, levante lentamente la pajuela sacándola de la
criocámara hasta que se vea el menisco de la columna que contiene el
embrión. Mientras sostiene la pajuela en esta posición con una mano, saque
las puntas de la pinza del nitrógeno con la otra mano y apriete suavemente las
puntas de la pinza en torno a las paredes laterales de la pajuela de 1 mm por
debajo del menisco, teniendo cuidado de no aplastar la pajuela. Mantener
contacto durante diez segundos y luego quite la pinza. Usted debe ver una
pequeña mancha blanca helada de medio EG justo por debajo del menisco lo
que confirma que el protocolo de cristalización se ha realizado correctamente.
Baje suavemente la pajuela introduciéndola en la ranura de la criocámara.
12) Si sólo hay una pajuela en la cámara, deslice una pajuela vacía “simulada” en
la ranura al lado de la pajuela que contiene el embrión para asegurar que la
pajuela con el embrión permanezca en forma vertical y en contacto con la
pared de la cámara de acero (no con el núcleo formador de espuma). Si se han
colocado dos pajuelas con embriones en la ranura, no se requiere la adición
de una pajuela vacía “simulada”. Continúe con el proceso de carga y protocolo
de cristalización hasta que todas las pajuelas se hallen en la criocámara.
13) ¡CRITICO! (a) El tiempo entre la colocación del embrión en la placa de EG y

el protocolo de cristalización no debe exceder de diez minutos. (b) Por lo tanto,
coloque un embrión en el EG en el momento que usted pueda fácilmente cargar
y cristalizar la pajuela en siete minutos, dejando tres minutos de “margen de
seguridad” para eventuales correcciones/recargas antes del tiempo límite de
diez minutos. No cargue y coloque múltiples pajuelas en la criocámara y luego
cristalice todas las pajuelas al mismo tiempo. La técnica correcta es cargar un
embrión, colocarlo en la criocámara, e inmediatamente cristalizar esa pajuela en
forma individual.
14) Después de realizar el protocolo de cristalización en la última pajuela, suelte el

botón de pausa para cambiar a la posición de funcionamiento.
Aproximadamente una hora después habrá terminado la congelación,
manteniendo la temperatura a -32°C.
15) Anexe el goblet etiquetado a la parte inferior en una cánula y luego coloque
la cánula en el baño de nitrógeno que rodea la criocámara. Agregar nitrógeno
al baño hasta que el goblet se sumerja. Una por una, levante cada pajuela
sacándola de su ranura y transfiera la pajuela al goblet sumergido (con el
tapón de la pajuela hacia arriba). Deslice el extremo abierto de un goblet sobre
la parte superior de los tapones de la pajuela y luego ejerza presión para hacer
ingresar el goblet en los sujetadores superiores de la cánula. La cánula puede
ahora ser transferida a un tanque de nitrógeno para su almacenamiento por un
periodo de tiempo largo.
43
Capítulo 6:
Transferencia de Embriones
El proceso global de transferencia de embriones cuando se refiere a toda la tecnología

requiere la ejecución de muchas habilidades en secuencia, la atención al detalle, la
comprensión de la fisiología reproductiva del ganado, y un reconocimiento de los
diferentes objetivos en la gestión de la reproducción de ganado. Mientras que el objetivo
de un ganadero podría ser el descongelar y transferir 400 embriones en un período de
dos días cada primavera y otoño, otro cliente puede pedirle transferir todos los embriones
frescos de una recuperación y concluir el día realizando la transferencia de embriones
congelados comprados e importados de otro país. El plan de gestión de un criador
lechero puede ser descongelar y transferir embriones individuales en forma semanal
durante todo el año conforme al ciclo natural del ganado. Todos estos planes de
gestión requieren la inserción de un embrión en el cuerno uterino. En este capítulo se
describe la forma de transferir los embriones.
6.1 IDENTIFICACIÓN DE RECEPTORAS UTILIZABLES

Los criterios para seleccionar una receptora utilizable el día de la transferencia son los
mismos para los embriones frescos y congelados. La hembra no debe estar preñada, y
debe tener un CL en al menos uno de sus ovarios. Careciendo de un CL identificable,
el embrión transferido no dará lugar a un proceso de gestación. Refiérase a la Sección
3.1 para revisar la identificación de un CL, así como las secciones del DVD que se
acompaña que muestran CLs en tractos extirpados.
44
Si el plan del día es realizar el lavado a varias donadoras y transferir los embriones,
debe examinar a las receptoras antes del lavado. Este conocimiento acerca de las
receptoras utilizables le permite moverse rápidamente de la búsqueda a la congelación,
reduciendo el tiempo entre la recolección y la congelación (o transferencia).
Si el trabajo del día es en una pradera a cierta distancia donde se han agrupado a 200
vacas receptoras sincronizadas y usted debe descongelar y transferir 150 embriones,
se acelerará el ritmo de descongelamiento/transferencia. Suponiendo que cuenta con
la ayuda adecuada, conforme la vaca ingresa a la manga de compresión usted se coloca
atrás y rápidamente la palpa. Si se identifica un CL, inmediatamente debe preparar a la
receptora mientras un asistente toma nota de su fecha de celo, selecciona y descongela
un embrión, carga un aplicador de transferencia y se lo alcanza.
6.2 COMPATIBILIDAD DE EMBRIONES CON RECEPTORAS

El tiempo que se tome para emparejar embriones en estadío 4 y 7 con receptoras
conociendo sus fechas de celo le será recompensado con creces a través de más preñeces
con una mayor tasa global de preñez. Este es un detalle que con frecuencia se pasa por
alto. Si compra embriones congelados, debe obtener una copia del formulario ABC si
desea tener la oportunidad de emparejar los embriones con receptoras de la mejor forma
posible. La columna de Código de Estadío en la sección C del Certificado de
Congelación le dirá en qué estadío de desarrollo se encontraba el embrión cuando fue
congelado.
Los embriones en los estadíos 5 y 6 brindan la misma tasa de preñez cuando se

transfieren a receptoras que se encuentran en el séptimo día de su ciclo. Para
maximizar el éxito, considerando todos los estadíos del embrión, debe tratar de colocar
los embriones en estadío 4 (frescos o congelados/descongelados) en receptoras que se
encuentran en el sexto día, y transferir los embriones en estadío 7 a hembras que se
encuentren en el octavo día de su ciclo.
Por ejemplo, si la documentación indica un embrión congelado en estadio 4 de mórula

y la receptora fue observada en inicio de celo el domingo, se debe descongelar el
embrión el sábado (seis días después del inicio del ciclo de la receptora). Del mismo
modo, si el embrión congelado es un blastocisto expandido en estadío 7, debe obtener
una receptora el lunes (ocho días después del inicio del ciclo de la receptora), palparla
y confirmar un CL, a continuación, descongelar y transferir el embrión. Utilice esta
misma estrategia para la asignación de embriones frescos a las receptoras.
Con frecuencia usted no tendrá el lujo de conocer las fechas de celo de las receptoras.
El cliente puede informarle que trató de sincronizar a las receptoras pero no estuvo
disponible para verificar y registrar las fechas de celo. Lo mejor que puede hacer en
esta situación es palpar los cuerpos lúteos, confirmar que la hembra no esté preñada,
y transferir los embriones sin tener en cuenta el estadío de desarrollo.
45
TRANSFERENCIA DE EMBRIONES
Algunos técnicos de forma rutinaria practican “transferencias a tiempo fijo” sin tener
en cuenta las fechas de celo. Simplemente seleccionan el ganado con CLs y luego
transfieren al animal embriones en cualquier estadío de desarrollo. Una vez más, los
resultados serán normalmente aceptables, pero no tan buenos como podrían haber sido
si se hubieran registrado las fechas de detección visual de celo.
El énfasis es que si usted desea que sus resultados sean mejores que el promedio,
debe emparejar el estadío de desarrollo del embrión con la edad del útero
siempre que sea posible.
6.3 DESCONGELACIÓN DE EMBRIONES CONGELADOS EN GLICEROL

Los embriones congelados en glicerol se descongelan tradicionalmente siguiendo tres
pasos o usando el método de un solo paso. Ambos métodos requieren que utilice un
microscopio y pase el embrión a través del medio, siendo la tasa de preñez la misma
en los dos métodos. Consulte el Apéndice D, “Métodos para la descongelación de
embriones congelados en glicerol” para los detalles técnicos.
6.4 DESCONGELACIÓN DE EMBRIONES PARA TD

El advenimiento de la tecnología de TD ha permitido que el día de la transferencia de
los embriones congelados sea bastante fácil y rápido, que es la razón por la cual la
mayoría de los embriones congelados en todo el mundo utilizan hoy en día EG como
crioprotector. No hay diferencia en la tasa de preñez con el uso de glicerol vs. el
etilenglicol. El proceso de descongelación para TD solo requiere un baño de
descongelación y no se necesita microscopio.
Al momento de la descongelación retire la pajuela del tanque de nitrógeno y colóquela

en un baño de agua tibia (30°C/86°F) durante treinta segundos. Retire la pajuela del
baño, séquela con una toalla de papel, y reconfirme la información impresa en el tapón
de la pajuela. Retire el tapón de plástico, inserte el extremo con la punta de algodón
de la pajuela primero en el aplicador de transferencia, y proceda con la transferencia.
Algunos técnicos prefieren descongelar a temperatura ambiente la pajuela durante

cinco o seis segundos antes de colocarla en el baño de agua tibia. Sin embargo, la tasa de
preñez (considerando todos los embriones descongelados) no es diferente entre ambas
técnicas. También tenga en cuenta que los embriones se descongelan a una temperatura
que es aproximadamente 10°F más fría que la temperatura descongelamiento del
semen. Si usted está descongelando muchos embriones en forma secuencial, es
conveniente utilizar una unidad descongeladora en baño de agua eléctrica como la
unidad descongeladora marca CITO. La unidad está pre-programada para descongelar
semen, así que asegúrese de ajustar la perilla de control de la temperatura en la parte
inferior de la unidad hasta que la temperatura resultante sea estable a 86°F.
46
Recuerde, una vez descongelado, el embrión para TD debe ser transferido de inmediato.
Idealmente, el embrión será depositado en el útero dentro de los tres o cuatro minutos
después de la descongelación. A temperatura ambiente, el EG es muy tóxico para el
embrión, por lo tanto la última cosa que debe hacer es descongelar el embrión. Todo
el trabajo de preparación ya debe haberse llevado a cabo, es decir, se ha palpado un
CL utilizable y se ha preparado a la donadora para recibir el embrión. También es
aconsejable descongelar y transferir sólo un embrión a la vez. Usted no quiere tener
embriones descongelados dentro de los aplicadores de transferencia, esencialmente
muriendo, en espera de ser transferidos.
6.5 INSTRUMENTOS DE TRANSFERENCIA

Cuando la práctica de la transferencia de embriones a nivel comercial comenzó treinta
y cinco años atrás, todos los embriones eran transferidos quirúrgicamente. Luego, los
investigadores universitarios empezaron a realizar pruebas de transferencia no quirúrgica
de embriones utilizando aplicadores de inseminación de 0.5 cc y 18" de largo, y luego
usando aplicadores de inseminación de 0.25cc. Inicialmente, las tasas de preñez
fueron bajas, pero rápidamente los técnicos aprendieron el arte y la ciencia de la
transferencia no quirúrgica.
Durante este mismo período la compañía IMV en Francia desarrolló un sistema de

transferencia mejorado compuesto por un aplicador de 21" de largo (esencialmente
idéntico a un aplicador de semen) que utilizaba una vaina de color azul con punta de
acero con orificio lateral para expulsar el embrión (Fig. 12) combinada con una camisa
sanitaria. Este sistema de vaina azul fue bien recibido por la industria y en la actualidad
la mayoría de los embriones se transfieren en todo el mundo a través de un método de
vaina con orificio de descarga lateral. Hoy en día algunos técnicos de transferencia
siguen utilizando sólo el aplicador de inseminación de 0.25cc (18") para la transferencia
de embriones con excelentes resultados. Sin embargo, la mayoría de las personas que
transfieren embriones reportan una tasa de preñez más alta en 10% aproximadamente
usando el sistema de descarga lateral versus el aplicador estándar de inseminación.
Independientemente de que aplicador de transferencia o sistema se utilice, el factor

individual que tiene mayor influencia sobre la tasa de preñez es la habilidad de la per-
sona que realiza la inserción del embrión.
FIGURA 12.
VAINA AZUL CON PUNTA DE
TRANSFERENCIA LATERAL.
47
6.6 PROCEDIMIENTO DE TRANSFERENCIA

El acto de la transferencia es más un arte que una ciencia, por lo tanto sus resultados
mejorarán a medida que transfiere más embriones. La técnica de transferencia exitosa
requiere concentración mental, como si usted estuviera “viendo” a través de la punta de
los dedos de su mano con la cual realiza la palpación mientras introduce y desliza el
aplicador hacia el extremo anterior del cuerno. El día siete, el embrión normalmente está
situado en el tercio superior del cuerno uterino, que es la sección de menor diámetro del
cuerno, más distante de la cérvix. Por lo tanto, el objetivo consiste en depositar los
embriones frescos o congelados/descongelados tan profundamente como pueda en el
cuerno asociado con el CL, causando el menor daño al endometrio del útero.
La clave para el éxito de la transferencia depende de (A) donde se coloca el embrión, y
(B) su capacidad para minimizar el traumatismo de la mucosa endometrial del cuerno
durante la transferencia.
(A) Para alcanzar el éxito promedio (65% con embriones frescos y 50% con
embriones congelados), debe depositar el embrión al menos a la mitad del
cuerno asociado con el CL. La mitad se refiere al punto medio entre la
bifurcación palpable externa del cuerno y el extremo final del cuerno. En
muchos animales este punto medio es donde el cuerno se dobla hacia abajo.
Para alcanzar tasas de concepción mayores al promedio en 10% o más,
siempre debe depositar el embrión en el tercio superior del cuerno uterino,
que es la sección de menor diámetro del cuerno que se halla más distante de
la cérvix.
(B) Lamentablemente, es imposible introducir profundamente la punta del

aplicador de transferencia en el cuerno y no entrar en contacto con el
endometrio del cuerno. Lo que se trata de evitar es un contacto brusco y
directo de la punta de descarga lateral con la pared uterina. La siguiente
secuencia y recomendaciones le ayudarán a alcanzar el tercio superior deseado
del cuerno uterino con mínimo trauma para la mucosa uterina.
Prepare a la receptora de la misma manera como se describe en la sección 3.3 para la

donadora.
Mientras un asistente separa la vulva, se pasa el instrumento de transferencia con una

camisa sanitaria a través de la vagina y se manipula hacia la entrada del cuello uterino.
Antes de entrar en la cérvix, agarre la camisa con el pulgar y el dedo índice de la mano
derecha y tire de la camisa hacia atrás, haciendo que la punta de la vaina pase a través
de la envoltura plástica. Manipule el aplicador a través de la cérvix y deténgase justo
antes de entrar en el cuerpo uterino. Permita que la cérvix actúe como protección
evitando que la punta de la vaina ingrese y dañe la pared uterina. Suelte la cérvix y
céntrese en retraer los cuernos.
48
Extender la mano hacia adelante y retraer ambos cuernos hacia usted en el suelo de la
pelvis. Suelte los cuernos, y luego rápidamente pase sus dedos por delante, arriba,
abajo y alrededor del cuerno al que desea efectuar la transferencia, teniendo cuidado
de no comprimir el cuerno. A partir de este punto en adelante, es crucial que usted
siempre sepa donde se encuentra la punta de la vaina. Esto se logra protegiendo la
punta de la vaina con la palma de su mano mientras manipula el cuerno y desliza
suavemente el aplicador hacia abajo en el cuerno.
No importa dónde se encuentre usted en el interior del cuerno uterino, no debe permitir
que la punta de la vaina se extienda más allá de la palma de su mano. Percatándose
donde se encuentra la punta en todo momento, será capaz de controlar (reducir) el
contacto brusco con la pared uterina.
Con sus dedos rodeando el cuerno (pero no comprimiéndolo), puede maniobrar el

cuerno hacia arriba y hacia abajo, a la izquierda y a la derecha mientras estira/extiende
una longitud aproximada de 50 mm del cuerno en la palma de su mano, de modo que
la luz del cuerno esté directamente en frente de la punta de la vaina. Cuando esté
seguro de que la apertura (la luz) del cuerno esté directamente enfrente de la punta,
mueva suavemente el aplicador hacia adelante. Deslice sus dedos hacia adelante hasta
la próxima sección del cuerno y repita este proceso de avance de 50 mm.
Al llegar a la ubicación donde se debe depositar el embrión, tómese de cuatro a cinco

segundos para lentamente presionar el émbolo y expulsar el embrión en el útero. Retire
los dedos que rodeaban el cuerno y saque el aplicador de transferencia. Tenga cuidado
de no alterar la ruta de retiro de manera tal que pueda causar que la punta de la vaina
ejerza presión o arrastre la pared del cuerno.
Cada cuerno presentará un reto diferente para la manipulación. Si el cuerno es grueso,

más bien corto, y difícil de levantar y enderezar en frente de la vaina, puede que usted
no sea capaz de colocar el embrión en el cuerno en forma tan profunda como desee
sin causar un trauma significativo. En esta situación, debe depositar el embrión en la
mitad del cuerno. Si el cuerno se presenta largo y recto, será más fácil deslizar la vaina
de una manera muy controlada profundamente en el cuerno.
Cuando se palpa con la mano izquierda, será más difícil manipular el cuerno izquierdo.
De vez en cuando al intentar pasar el aplicador de transferencia (o el catéter de lavado),
en el cuerno izquierdo, se desvía repetidamente hacia el cuerno derecho. Lo más prob-
able es que la punta de la vaina sea desviada hacia el cuerno derecho por el tabique
vertical de tejido localizado en el interior del útero, donde los cuernos se dividen en
izquierdo y derecho. Para evitar este problema, coloque la palma de su mano izquierda
contra el costado del cuerno izquierdo y empuje el útero hacia la derecha. Pare cuando
el cuerno izquierdo se encuentre alineado con la columna vertebral del animal. Hale
la punta de la vaina hacia atrás en dirección al cuerpo uterino de manera que casi entre
49
Otro día de trabajo de TE en campo comienza en Montana.
de nuevo en la cérvix. Luego, suavemente guíe la punta hacia adelante contra la pared
izquierda del cuerpo del útero. Esto le permitirá hacer un bypass por el tabique interior
e ingresar en el cuerno izquierdo.
SUGERENCIA: Algunas receptoras tendrán un CL en cada ovario en el examen. En

esta situación, realice la transferencia en el cuerno en el que se sienta más cómodo con
la manipulación. Si la receptora tiene un CL, y también un folículo retenido de buen
tamaño (8mm+), es aceptable realizar la transferencia en el cuerno ipsilateral (en el
mismo lado) al CL, y luego inyectar a la receptora HLGn. La inyección inducirá la
ruptura del folículo y también estimulará un aumento de la producción de
progesterona en el CL existente. El cuerpo lúteo produce progesterona hasta que el
útero determina que el animal no está preñado, tras lo cual se produce la liberación de
prostaglandina que causa la lisis (regresión) del CL y el ciclo se repite.
SUGERENCIA: Muchos técnicos utilizan las transferencias a tiempo fijo sin

detección de celo, lo que resulta en un promedio de 55% de tasa de preñez con
embriones congelados/descongelados, y 65% con embriones frescos. La secuencia de
tratamiento de la receptora para este proceso sería:
• HLGn e insertar el implante CIDR en todas las receptoras

• PG y retirar el implante CIDR después de siete días
• HLGn (2cc) a todas las receptoras dos días después del retiro del implante
CIDR (día previsto del estro)
• Siete días después de la inyección de HLGn, transferir todos los embriones a
todas las receptoras con un CL
50
APÉNDICE A. Ilustración gráfica mostrando los estadíos de desarrollo

Reproducido con autorización de la SITE.
51
APÉNDICE B. FORMULARIO ABC

52
APÉNDICE C. Procedimiento de Tratamiento con Tripsina

Usando un pipetor de 5ul (0,05 ml), pasar los embriones (con zona intacta / sin grietas)
a través de doce lavados, cambiando las puntas entre cada lavado. Originalmente se
creía que el tampón salino fosfatado de Dulbecco D-PBS sin Ca ni Mg debía ser el
medio de base. Sin embargo, otros estudios han demostrado que el tampón D-PBS con
glucosa y piruvato sódico (D-PBS modificado) es aceptable, como el medio de
transferencia BioLife™ C15. Consulte las páginas 41-43 de la Guía de
Procedimientos de la SITE edición 1990.
Lavados 1-5:
Comience con el medio de transferencia BioLife™ C15 (o similar), que contiene
albúmina sérica bovina (BSA) como el componente sérico. Prepare cinco pocillos,
platos, o líquidos, cada uno con al menos 5ul de C15. En forma secuencial pase los
embriones a través de cada líquido (treinta segundos por exposición), cambiando las
puntas entre cada líquido. Para referencia, tenga en cuenta que 1000ul = 1.0cc.
Lavados 6 y 7:
Preparar Tripsina, como el kit de Tripsina C22A de Agtech.
i) Preparar la solución “a” mediante la combinación de los 25g de tripsina en
polvo en el matraz para mezclar con 100 ml de agua estéril. Agite enérgicamente
durante veinte a treinta segundos. Una capa de espuma aparecerá en el matraz
para mezclar. Espere de cinco a diez minutos para que se disuelva la tripsina
y disminuya la capa de espuma. Etiquete este matraz plástico para mezclar
como “tripsina a”.
ii) Preparar 100cc de “tripsina b” final al 0.25% combinando 1cc de “tripsina a”
con 99cc de D-PBS sin contener ningún producto sérico (ningún surfactante).
Etiquete esta botella final como “tripsina b", que es la solución en la que se
lavan los embriones en los pasos 6 y 7 de la secuencia de 12 pasos.
Todas las soluciones de tripsina que no se utilizan para el lavado de embriones deben
ser congeladas inmediatamente después de su preparación.
Prepare dos pocillos, platos, o líquidos, cada uno con al menos 5ul de “tripsina b” al
0.25%. Secuencialmente pasar los embriones a través de cada líquido (máximo treinta
a cuarenta y cinco segundos por exposición), cambiando las puntas entre cada gota.
Utilizar inmediatamente y luego refrigerar el resto de cualquier solución de tripsina b.
Lavados 8-12:
Utilice el medio de transferencia BioLife™ C15 (o similar), que contiene albúmina
sérica bovina (BSA) como el componente sérico. Prepare cinco pocillos, platos, o
líquidos, cada uno con al menos 5ul de C15. En forma secuencial pase los embriones
a través de cada líquido (treinta segundos por exposición), cambiando las puntas entre
cada líquido.
Todos los embriones que aún tengan una zona intacta (sin grietas) pueden ahora ser
congelados para la exportación.
53
APÉNDICE D. Métodos para descongelar los embriones congelados en glicerol
Método de Un Solo Paso

1) Retire la pajuela congelada del tanque de nitrógeno y colóquela
directamente en un baño de agua a 30°C (86°F). Manténgala en el baño
durante treinta segundos.
2) Quite el tapón del extremo de la pajuela y mantenga la pajuela en un
ángulo de 45 grados por encima de una placa de petri vacía y seca. Con la
tijera, recortar el extremo con tapón de algodón de la pajuela.
3) El líquido en la pajuela drenará fuera de la pajuela y formará una gota en
la placa.
4) Inmediatamente colocar la placa en la platina del microscopio y examinar
la gotita para confirmar que el embrión se encuentra en la gota.
5) Coloque la solución descongelante en un paso Vigro EVM247 (3-5ml) en
una placa de Petri.
6) Transferir el embrión de la gota al baño de solución descongelante de un
paso. Suavemente mueva el embrión a través de la placa por cuatro a cinco
minutos a temperatura ambiente.
7) Transferir el embrión a una nueva placa de petri que contenga medio de
mantenimiento/transferencia. Evaluar/clasificar el embrión y luego cargarlo
en una pajuela para la transferencia.
Método de Tres Pasos
1) Retire la pajuela congelada del tanque de nitrógeno y colóquela
directamente en un baño de agua a 30°C (86°F). Manténgala en el baño
durante treinta segundos.
2) Quite el tapón del extremo de la pajuela, mantenga la pajuela en un
ángulo de 45 grados por encima de una placa de petri vacía y seca. Con la
tijera, recortar el extremo con tapón de algodón de la pajuela.
3) El líquido en la pajuela drenará fuera de la pajuela y formará una gota en
la placa.
4) Inmediatamente colocar la placa en la platina del microscopio y examinar
la gotita para confirmar que el embrión se encuentra en la gota.
5) Colocar cuatro nuevas placas de petri en la mesa de trabajo. Etiquete cada
una apropiadamente (Vigro EVM248 descongelante #1, #2, #3), y medio
de transferencia (como el C15).
54
6) Trabajando a temperatura ambiente y usando una jeringa estéril nueva

de 10cc de plástico con aguja calibre 16 x 1", extraiga 5 – 7 cc del
descongelante # 1 y llene la placa de petri etiquetada descongelante #
1con la solución.
7) Usando otras jeringas nuevas, llenar las placas de petri # 2 y #3 con sus
respectivas soluciones descongelantes. Llene la placa de petri de
transferencia con solución de transferencia (es decir, C15, o EVM024).
8) Usando el catéter para FIV D17 anexo a jeringa de 1ml, aspirar el
embrión de la gota hacia el catéter. La solución NUNCA debe ingresar
en la jeringa. Siempre mantenga el embrión dentro del catéter de
polietileno.
9) Depositar el embrión en el descongelante #1. Manténgalo en la placa
de tres a cuatro minutos. Luego, aspirar el embrión de nuevo en el catéter
y trasládelo al descongelante #2 (tres a cuatro minutos), luego al
descongelante #3 (tres a cuatro minutos), y a continuación, al medio de
transferencia.
10) Evaluar y clasificar el embrión, luego cargarlo en una pajuela para la
transferencia.
55
APÉNDICE E. Organizaciones Profesionales
Sociedad Internacional de Transferencia de Embriones, Inc. 1111 N. Dunlap Ave.,

Savoy, IL 61874 USA
www.iets.org
Asociación Americana de Transferencia de Embriones, 2441 Village Green Place,

Champaign, IL 61822 USA
www.aeta.org
Asociación Canadiense de Transferencia de Embriones, Box 2000, 595 County Road

#44, Kemptville, ON, K0G 1J0, Canada
www.ceta.ca
Asociación Europea de Transferencia de Embriones

www.aete.eu
56
Bibliografía
Chesta, P., Marana, D., Peres, L., & Bo, G. (Enero 2006). Efecto del momento del
retiro de un dispositivo de liberación de progesterona y tratamiento con HLGn en el
intervalo y distribución de las ovulaciones en ganado de carne superestimulado.
Reproducción, Fertildad y Desarrollo, Vol. 18 (1,2), 288.
Corah, L. (1987). Planificación de un programa de nutrición para las vacas de carne

productivas de hoy. (pp. C-680). Servicio de Extensión Cooperativa de la Universidad
Estatal de Kansas.
Dunham, J., & Call, E. (1989). Alimentación de vacas lecheras. (pp. MF-754).
Servicio de Extensión Cooperativa de la Universidad Estatal de Kansas.
Lane, M., Mitchell, M., Kashman, K., Feil, D., Wakefield, S., & Zander-Fox, D.
(Enero 2008). CQ o no CQ: la clave para un laboratorio consistente. Vo. 20 (I), p23-
32. Reproducción, Fertilidad y Desarrollo, Vo. 20(I), p23-32.
Stringfellow, D., & Seidel, S. (1998). Manual de la Sociedad Internacional de

Transferencia de Embriones (3ra edición). Savoy, Illinois, USA: Sociedad
Internacional de Transferencia de Embriones.
Tucker, K., & Jansen, C. (2002). Bioensayo en embriones de ratones: ¿Es el estándar
de oro para las pruebas de control de calidad en el laboratorio de FIV? El Arte y la
Ciencia de las Técnicas de Reproducción Asistida, 249-253.

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Publicado por Agtech, Inc.

Originalmente publicado por John L. Curtis bajo ISBN 0-12-200240-7. Posteriormente,

El Dr. Curtis recibió su capacitación en transferencia de embriones en la Universidad

El Dr. Curtis sigue llevando a cabo cursos prácticos de recolección, congelación y

Agtech, Inc. proporciona instrucción sobre Transferencia de Embriones e Inseminación

Información General del Procedimiento

El manejo del ganado es uno de los componentes auxiliares más importantes en un

1.1 PROGRAMA DE SALUD

Para asegurar la salud y la solidez de la reproducción, todos los animales deben

a. Un examen visual completo para detectar y tratar la tiña, parásitos externos,

1.2 PROGRAMA DE NUTRICIÓN

Aproximadamente veinte nutrientes esenciales deben estar presentes en niveles

CUADRO 1. NUTRIENTES ESENCIALES EN LAS RACIONES DE LAS

Al diseñar un programa de alimentación se debe agrupar ganado por requisitos

En ocasiones, es conveniente “adelgazar”, a una donadora con sobrepeso. Esto puede

El ganado puede tolerar un exceso sustancial de la mayoría de los nutrientes. Sin

CUADRO 2. Composición de los Piensos Utilizados Comúnmente para

Mientras los piensos disponibles sean apetecibles para el ganado individualmente o en

Un programa de nutrición normal requiere de alimentación con heno. El Cuadro 4 es

CUADRO 4. Ejemplo de Alimentación

2.1 SUPEROVULACIÓN DE DONADORAS

El proceso de transferencia de embriones incluye un tratamiento con hormonas de

Inyección Día #1: 4cc FSH A.M., 4cc P.M.

Inyección Día #1: 3cc FSH A.M., 3cc P.M.

El implante vaginal CIDR se añade en el calendario de superovulación de acuerdo a

2. En el caso de donadoras superovuladas que se conoce que no ovulan

Protocolo #2) Superovulación después de un estro observado visualmente con

2.2 INSEMINACIÓN DE DONADORAS

DETECCIÓN DEL CELO

CALIDAD DEL SEMEN Y TIPO DE GRUPO SANGUINEO

MANIPULACIÓN DEL SEMEN

Un termo, caja de tecnopor (espuma de poliestireno), o unidad de descongelación

COLOCACIÓN DEL SEMEN

Si la donadora todavía se encuentra en celo durante la segunda inseminación, se le

2.3 SINCRONIZACIÓN DE RECEPTORAS

Afortunadamente, existen métodos que nos permiten sincronizar el ciclo de las

Otro método de sincronización (no indicado en el Cuadro 5) que se traduce en un 50%

CUADRO 5. Secuencia de preparación de Donadoras y Receptoras

Insertar CIDR en Palpar a donadora.

3.1 FECHA DE RECUPERACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE RECEPTORAS

Ya sea que la recuperación se realice en el rancho o en la clínica, la primera actividad el

Palpar ambos ovarios de cada animal para identificar la presencia de un CL y luego

3.2 INSTRUMENTOS, SUMINISTROS Y PLAN

Fig. 2. Sonda en Y Fig. 3. Catéter Vortech™

Fig. 4. Filtro ZONA Fig. 5. Pinzas hemostáticas y tijeras

Fig. 6. Microscopio Fig. 7. Congelador con tasa

Asegúrese de que el área de trabajo en el laboratorio se encuentre limpia, libre de polvo

Purgue el aire de la sonda en Y y al mismo tiempo permita el flujo de PBS en el

Otros elementos que deben ser colocados en su bandeja de recuperación incluyen

Arme el microscopio y pruebe el iluminador.

Monte el congelador electrónico de embriones, pero no añada nitrógeno al baño.

3.3 PREPARACIÓN DE LAS DONADORAS PARA EL LAVADO

esencialmente se detiene. Si la cola no se quedará flácida, repetir la inyección (con

Esta misma secuencia de preparación será utilizada en receptoras inmediatamente

3.4 PROCEDIMIENTO DE RECUPERACIÓN

Figura 8. Diagrama de los órganos

Retire el catéter de su empaque de protección, abra la vulva, inserte el catéter en la vagina,

La presión descendente por el dedo medio identificará la zona de división en Y donde

La interpretación precisa de la morfología del embrión es indispensable para:

a. a. La separación de los embriones fecundados de los óvulos sin fertilizar.

4.1 ENJUAGANDO EL FILTRO

Con un marcador de tinta permanente, escriba el nombre de la donadora en la tapa y la