Introduccion A La Biotecnologia Vegetal PDF

Actualización Profesional en Manejo de Recursos
Naturales, Agricultura Sostenible y Pobreza Rural
Introducción a la
Biotecnología Vegetal
William M. Roca, Ph.D.
Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT)
Hernando Ramírez, M.Sc.
Universidad Nacional de Colombia
Centro para el Desarrollo Agropecuario y Forestal, Inc.

CEDAF
Octubre, 2000
Introducción a la Biotecnología CEDAF
© Centro para el Desarrollo Agropecuario y Forestal, Inc. (CEDAF), Santo Domingo, República Dominicana. Octubre del 2000.
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Hecho el depósito que prevé la ley 418. Impreso en la República Dominicana.
Cita correcta:
William M. Roca, Hernando Ramírez. 2000. Introducción a la Biotecnología Vegetal. Coordinador de la Producción de
Documentos Originales: Vicente Zapata S., Ed. D., Cali , Colombia. 174p.
Palabras Claves:
1. Biotecnología 2.Cultivo de Tejido 3. Marcadores Moleculares 4. Genética de Plantas 5. Perspectivas Futuras.
ISBN: 99934-821-4-5
Octubre del 2000
Santo Domingo, República Dominicana
William M. Roca / Hernando Ramírez

CEDAF Introducción a la Biotecnología
Tabla de Contenido
Presentación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i
Agradecimiento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ii
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . iii
Autoevaluación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v
Autoevaluación - Información de retorno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vi
Objetivos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii
Estructura General. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . viii
Originales para transparencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ix
Sección 1 Una Introducción a la Biotecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

Estructura de la Sección . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Preguntas Orientadoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.1 ¿Qué es la Biotecnología? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.2 Breve Historia de la Biotecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.3 La Nueva Biotecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.4 Ejercicio 1.1 Introducción a la Biotecnología Vegetal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
Originales para Transparencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
Sección 2 Cultivo de Tejidos Vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

Estructura de la Sección . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Preguntas Orientadoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.1 Fundamentos del Cultivo de Tejidos Vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.2 Aplicaciones del Cultivo de Tejidos Vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.3 Ejercicio 2.1El Cultivo De Tejidos Vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

Sección 3 Tecnología del DNA Recombinante. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.1 ¿Qué es la Ingeniería Genética? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
3.2 Aspectos Fundamentales y Tecnológicos de la Ingeniería Genética . . . . . . . . . . . . . 47
3.3 Aislamiento de genes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
3.4 Secuenciación del DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
3.5 Ejercicio 3.1 Tecnología del DNA recombinante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
Sección 4 Marcadores Moleculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
4.1 El genoma y la variabilidad genética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
4.2 Los marcadores moleculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
4.3 Breve reseña de algunos marcadores moleculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
4.4 Ejercicio 4.1 Marcadores moleculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
Originales para transparencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

Sección 5 Transformación Genética de Plantas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
5.1 ¿Porqué transformar plantas? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
5.2 Un vector natural para introducir genes foráneos a las plantas . . . . . . . . . . . . . . . . 95
5.3 Transformación genética de plantas utilizando Agrobacterium tumefaciens . . . . . . . . 98
5.4 Transformación por introducción directa de DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
5.5 Logros de la ingeniería genética de plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
5.6 Ejercicio 5.1 Transformación genética de plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
Originales para transparencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
Sección 6 Perspectivas Futuras de la Biotecnología Vegetal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117

Estructura de la Sección. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
Preguntas orientadoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
6.1 Relaciones institucionales y la biotecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
6.2 Costo - beneficio de la biotecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
6.3 Propiedad intelectual y comercialización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
6.4 Producción de alimentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125
6.5 Ejercicio 6.1 Perspectivas futuras de la Biotecnología Vegetal . . . . . . . . . . . . . . . . 125
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
Originales para trasparencias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127

Anexos
Anexo 1. Evaluación final de conocimientos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135

Anexo 2. Evaluación final de conocimientos - Información de retorno . . . . . . . . . . . . . 138
Anexo 3. Evaluación del evento de capacitación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142
Anexo 4. Evaluación del desempeño del instructor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144
Anexo 5. Evaluación de los materiales de capacitación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145
Anexo 6. La Biotecnología Vegetal en la República Dominicana. . . . . . . . . . . . . . . . . 146
Anexo 7. Glosario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149

Pr e s ent aci ón
Numerosos diagnósticos aseveran un grave deterioro de la base de recursos naturales de la República Do-
minicana. Estos estudios indican que la cobertura forestal, de cuestionable calidad y uniformidad, no pasa
del 12 por ciento y que una parte importante de los 2.8 millones de hectáreas con aptitud forestal en el país
han sido y están siendo utilizadas inadecuadamente. Al igual que en la mayoría de los países tropicales, el
mal manejo de los suelos y de los sistemas de cultivo ha resultado en una acentuada perdida de su fertili-
dad, estructura y materia orgánica; así como en erosión y contaminación. El resultado ha sido una dismi-
nución de la productividad agrícola y un incremento significativo en los costos de producción.
Se han logrado avances significativos en las regiones tropicales en el desarrollo de tecnologías adecuadas
para mejorar la productividad agropecuaria en sistemas sostenibles. Sin embargo, estos resultados raras
veces llegan al campo, debido principalmente a deficiencias en el entendimiento de las relaciones entre
los componentes de los sistemas agrícolas tropicales por aquellos que dirigen el sector, incluyendo profe-
sionales agropecuarios y extensionistas. En el orden institucional, se observan organismos del sector pú-
blico débiles y con duplicidad de funciones, con escasos recursos para atender problemas que sobrepasan
sus capacidades. Más aún, faltan liderazgos institucionales que coordinen la formulación e implementa-
ción de las políticas.
Quizás, el mayor de todos los problemas que enfrenta la sociedad dominicana es la falta de entendimiento
de la profundidad y complejidad de problemas relacionados con el deterioro de los recursos naturales del
país. Ese entendimiento podría variar si científicos, administradores, profesionales y líderes tuvieran la
oportunidad de discutir, informar y persuadir a la comunidad en general acerca de la necesidad de enfren-
tar los problemas ambientales en general y en particular aquellos relacionados a la sostenibilidad de los
recursos naturales y la agricultura. Brindar esa oportunidad es precisamente lo que pretende el Proyecto
Ágora.
El Proyecto Ágora es, en esencia, un cambio del enfoque tradicional de un proyecto piloto para promover
cambios sistemáticos. El mismo propone un atajo: agricultores claves, líderes y tomadores de decisiones
en los sistemas alimentario y agropecuario, expertos, políticos, periodistas y ONG son convocados y apo-
yados técnicamente, para que lleguen a un entendimiento de consenso en temas claves relacionados al
manejo de los recursos naturales, la sostenibilidad de la agricultura y el combate de la pobreza rural. Basa-
do en ese entendimiento, ellos guiarán o dirigirán sus propias instituciones o negocios para que sean más
compromisarios a las necesidades de un mejoramiento sostenible de la calidad de vida de los pobladores
rurales. El componente Actualización Profesional de Ágora busca dotar al profesional dominicano de co-
nocimientos actualizados sobre aspectos conceptuales de desarrollo reciente y sobre tecnologías de punta
de uso potencial en el país. Por esta razón se han elaborado los documentos de capacitación que ponemos
a disposición del país.
Altagracia Rivera de Castillo
Directora Ejecutiva del CEDAF
William M. Roca / Hernando Ramírez i

Ag r a d e c i mi ent os
La estrategia para la elaboración de los documentos de la Serie Proyecto Ágora ha sido muy interesante y
ardua. Después de muchos meses identificando autores dominicanos para la elaboración de los documen-
tos, nos dimos cuenta que no disponían de tiempo para escribirlos. De ahí vino la idea de Vicente Zapata,
Gerente de La Organización que Aprende de Colombia, de contratar especialistas colombianos para ela-
borar los documentos y a expertos dominicanos que colaborarían con éstos en el suministro de informa-
ciones y datos dominicanos así como en la revisión de los contenidos. Por eso debemos agradecer al Dr.
Vicente Zapata por la idea, por diseñar la metodología para la elaboración de los documentos y por la co-
ordinación general de los trabajos. De la misma manera debemos reconocer y agradecer el esfuerzo de
los autores William M. Roca, del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), y Hernando Ra-
mírez, de la Universidad Nacional de Colombia.
En diferentes momentos varios especialistas dominicanos aportaron sus ideas y recomendaciones sobre
el documento. Entre ellos debemos agradecer a Rafael Ortiz Quezada de la Universidad Nacional Pedro
Henríquez Ureña (UNPHU), a Rafael Pérez Duvergé del CEDAF, y a Bienvenido Cabral del Instituto Su-
perior de Agricultura (ISA) por sus aportes iniciales y sugerencias en la estructura del documento. Agra-
decemos además a Bernarda Castillo, del Centro de Biotecnología Vegetal de la Secretaría de Estado de
Agricultura y Expedito Diloné, del Jardín Botánico Nacional, por su participación y sugerencias en las
etapas avanzadas de edición.
Todo el personal del CEDAF ha participado de alguna forma en la elaboración, revisión, digitación e im-
presión de los documentos que ha originado el Proyecto Ágora. A todos ellos muchas gracias por su dedi-
cación y cooperación.
Finalmente, queremos agradecer a todas las personas, incluyendo a profesores y técnicos que ofrecieron
sus sugerencias sobre los documentos durante los talleres y reuniones que para esos fines se celebraron
durante los casi dos años de trabajo que duró el proceso completo de elaboración y edición de los docu-
mentos.
Gracias a todos.
Teófilo Suriel E.
Coordinador Proyecto Ágora
ii William M. Roca / Hernando Ramírez

I n troducci ón
La agricultura moderna se basa en la utilización de variedades mejoradas (generalmente híbridos) en

combinación con paquetes tecnológicos de producción agrícola, como fertilización, protección de plantas
y técnicas de riego y cosecha. Esta alta tecnología agrícola ha tenido gran éxito, especialmente en los paí-
ses desarrollados. Sin embargo, aún se presentan altas pérdidas en los cultivos, debido principalmente al
ataque de enfermedades y plagas y por estreses abióticos, como salinidad, acidez y toxicidad por metales
pesados. Estos problemas son la principal causa del aumento en el uso de los agroquímicos, lo cual ha
contribuido al incremento no sólo del costo de la producción agrícola sino también al deterioro del medio
ambiente.
Mientras tanto, aumenta la demanda de alimentos, especialmente en los países en desarrollo, que tienen
una alta tasa de crecimiento poblacional, por lo cual se requiere con urgencia incrementar la productivi-
dad agrícola.
Para lograr este objetivo se precisa la obtención de variedades mejoradas con menor requerimiento de in-
sumos, reduciendo significativamente los costos de producción y el daño ambiental.
En aproximadamente 25 años los avances en biología molecular y celular se han traducido en una tecno-
logía emergente (la biotecnología) que encuentra aplicación en diversos sectores de la actividad humana.
La salud humana, la agroalimentación, la producción de energía y la protección del medio ambiente son
los sectores más importantes que utilizan la biotecnología. Hasta el presente la biotecnología aplicada a la
salud humana ha tenido el desarrollo más rápido. Unos cuarenta medicamentos y vacunas se han aproba-
do y más de cien están en fase avanzada de estudio y/o pendientes para su aprobación. Gracias a la bio-
tecnología, disponemos o están a punto de comercializarse productos terapéuticos para tratar deficiencias
de la sangre, enfermedades autoinmunes, cardiovasculares, inflamatorias, algunos tipos de cáncer, o para
combatir agentes infecciosos como el virus de la hepatitis B, el HIV, o el virus del papiloma.
En el ámbito de la agricultura, la producción de semillas resistentes a plagas, a herbicidas, o que mejoran
la calidad del fruto ya son realidad. Las ventajas de estas nuevas variedades son evidentes para los secto-
res productivos, incluyendo, en algunos casos, al consumidor.
Será preciso que los consumidores tengan la información necesaria para poder elegir basados en la cali-
dad y/o el precio y la seguridad de los productos.
El desarrollo de la biotecnología está en sus inicios y el crecimiento previsto para la primera década del si-
glo XXI significará duplicar el valor de sus ventas cada cinco años. Se prevé un aumento significativo de
las aplicaciones en la agricultura, ya que se estima un crecimiento anual cercano al 20%. Es evidente que
si no es posible aumentar el área de la tierra cultivable, y la población de los países en desarrollo crece al
ritmo actual, la agrobiotecnología se constituye en una solución para producir los alimentos que necesi-
tará la humanidad en el futuro próximo.
William M. Roca / Hernando Ramírez iii

La biotecnología vegetal comprende una serie de técnicas que incluyen:

a. Las técnicas de cultivo de células y tejidos in vitro, muy utilizadas para la clonación de plantas y la
transformación genética;
b. Las técnicas de DNA recombinante, que permiten hacer las construcciones genéticas para la
transformación de plantas;
c. Los marcadores moleculares que permiten "marcar" los genes de interés; para la construcción de
mapas genéticos y para estudios de caracterización y filogenéticos.
El objetivo de este módulo, Introducción a la Biotecnología Vegetal, es presentar a los participantes, en

forma clara y amena los principios básicos de la Biotecnología Vegetal y su aplicación en la obtención de
materiales mejorados.
Este módulo ha sido concebido de tal forma que el participante, al finalizar su lectura, no sólo tendrá un
concepto actualizado de la biotecnología vegetal, sino que tendrá nuevos elementos de juicio para ser uti-
lizados en el desarrollo agrícola.
iv William M. Roca / Hernando Ramírez

A u toeval uaci ón
1. Elabore una definición de lo que usted considera es biotecnología.

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2. ¿Por qué cree usted que la cerveza, el vino el queso y el pan son productos biotecnológicos?
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3. Defina qué es el cultivo de tejidos vegetales
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4. ¿Qué aplicación práctica le vería usted a esta técnica?
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5. ¿Qué conoce usted de la ingeniería genética?
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6. ¿Qué es un gen?
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7. ¿Qué es un genoma?
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8. ¿Qué entiende por marcador molecular?
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9. ¿Qué son plantas transgénicas?
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10. ¿Usted cree que es posible introducir un gen de una bacteria a una planta? Explique.
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11. ¿Qué entiende usted por bioseguridad en biotecnología?
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12. ¿Usted considera que el consumo de cultivos transgénicos representan un peligro para la salud humana?
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William M. Roca / Hernando Ramírez v

Au to e v a l uaci ón - I nf ormaci ó n d e R e to r n o
Respuestas
Para la pregunta 1
Biotecnología es la aplicación de principios científicos y de ingeniería para el procesamiento de materiales por medio de
agentes biológicos con el objetivo de producir bienes y servicios, en donde los agentes biológicos se refieren principalmen-
te a microorganismos, celulares de animales y plantas, enzimas, material genético aislado y clonado.
Para la pregunta 2
La cerveza, porque se obtiene por un proceso de fermentación.
El queso: es un producto obtenido por un proceso enzimático.
El vino: Se obtiene por un proceso de fermentación.
El pan : en su elaboración interviene un proceso de fermentación.
Para la pregunta 3
El cultivo de tejidos vegetales es una técnica que consiste en aislar una porción de una planta (tejido, órgano o célula), lla-
mado explante, para cultivarlo en un medio nutritivo en condiciones físicas y químicas artificiales, para regenerar una plan-
ta completa.
Para la pregunta 4
El cultivo de tejidos vegetales puede ser útil para la recuperación de cultivos que estén en vía de extinción, o para la propa-
gación masiva de plantas ornamentales, como el caso de rosas, orquídeas, etc.
Para la pregunta 5
La Ingeniería genética es un conjunto de técnicas que permiten la manipulación del DNA y del RNA. Gracias a la Ingenie-
ría genética se pueden aislar y modificar genes que luego son utilizados para producir animales y plantas transgénicas.
Para la pregunta 6
Un gen es un pequeño segmento de DNA que contiene información para una característica genética. Unidad básica de la
herencia.
Para la pregunta 7
Genoma es el contenido genético total de un organismo. En las plantas el genoma está constituido por el contenido genético
del DNA mitocondrial, del cloroplasto y del DNA nuclear.
Para la pregunta 8
Un marcador molecular es un segmento específico de DNA que está ligado a una característica genética y se utiliza para el
monitoreo de esta característica en un programa de mejoramiento.
Para la pregunta 9
Las plantas transgénicas son plantas a las que se les ha introducido un gen "extraño", el cual les confiere ciertas ventajas so-
bre las que no lo tienen, como por ejemplo, resistencia a una enfermedad, plaga, herbicida, o el aumento en la producción
de un producto de uso comercial.
Para la pregunta 10
Sí es posible. Algunos genes que confieren resistencia al ataque de insectos en las plantas son aislados de bacterias. El
caso más conocido es el de los genes de Bt, que confieren resistencia a algunos insectos lepidópteros.
Para la pregunta 11
La Bioseguridad consiste de políticas y mecanismos que se establecen para prevenir posibles riesgos de la tecnología del
DNA recombinante en la salud, el medio ambiente y la biodiversidad.
Para la pregunta 12
No. En una planta transgénica sólo se introduce uno o pocos genes cuyos productos han sido cuidadosamente evaluados
antes de ser introducidos a las plantas para descartar cualquier riesgo en la salud, el medio ambiente y la biodiversidad.
Mientras que en el mejoramiento tradicional se introducen muchos genes, de los que se desconocen sus productos y su po-
sible riesgo para la salud, medio ambiente y biodiversidad.
vi William M. Roca / Hernando Ramírez

O b jet i vos
• Presentar a los participantes los principios básicos de la biotecnología vegetal en la obtención de

materiales mejorados.
S e cci ón 1
• Conocer los conceptos básicos de la biotecnología en general.

• Conocer algunas etapas de su desarrollo.
• Diferenciar algunos tipos de biotecnologías.
S e cci ón 2
• Entender los principios básicos de las técnicas de cultivo de tejidos vegetales.

• Conocer algunas aplicaciones de estas técnicas.
S e cci ón 3
• Conocer los fundamentos de la tecnología del DNA recombinante.

• Describir las herramientas más importantes de esta tecnología.
• Conocer algunas de sus aplicaciones.
S e cci ón 4
• Entender los principios básicos de los marcadores moleculares.

• Conocer algunas de sus aplicaciones en el mejoramiento vegetal.
S e cci ón 5
• Conocer los fundamentos de la transformación genética de plantas.

• Conocer los dos métodos más utilizados para transformar plantas.
• Conocer algunas aplicaciones de esta tecnología.
S e cci ón 6
• Entender los conceptos de bioseguridad, propiedad intelectual y patentes.

• Conocer algunos factores que se consideran podrían ser causa de riesgo por la introducción de
cultivos transgénicos al campo.
• Entender por qué los cultivos transgénicos son seguros.
William M. Roca / Hernando Ramírez vii

Est r u c tura general
Marc ado re s y Mapas

• Ca ra cte riza ción de la biodive rs ida d
Mo le c ulare s
• Ide ntifica ción de ge ne s útile s
• Ma pe o de ca ra cte re s comple jos (QTLs )
Clona ción y modifica ción

de ge ne s Ing e nie ría Ge né tic a
Marc ado re s y Mapas Mo le c ular

Introducción y e xpre s ión Cultivo de Te jido s y Trans fo rmac ió n
de ge ne s Ge né tic a
P la nta s Tra ns gé nica s
• Marc ado re s Cultivo de

Mo le c ulare s Me jo ramie nto Multiplic ac ió n Te jido s
• Cruzamie nto s
Ens ayo s de Evaluac ió n
Explicación
Este flujograma muestra la interacción de las diferentes metodologías de la Biotecnología Vegetal (mar-
cadores moleculares, ingeniería genética o DNA recombinante, la técnica de cultivo de tejidos y la trans-
formación genética de plantas), que en forma lógica permiten la obtención de un cultivo transgénico,
desde la caracterización del germoplasma para la búsqueda de genes útiles, hasta la introducción de estos
genes a los cultivos, que luego son sometidos a todo un proceso de valuación antes de ser comercializa-
dos.
viii William M. Roca / Hernando Ramírez

Ori gi na l e s pa r a t r a n sp a r e nc i a s
William M. Roca / Hernando Ramírez ix

x
Marcadores y Mapas
· Caracterización de la biodiversidad
Moleculares
· Identificación de genes útiles
· Mapeo de caracteres complejos (QTLs)
Introducción a la Biotecnología
Clonación y modificación
de genes Ingeniería Genética
Marcadores y Mapas Molecular

Introducción y expresión Cultivo de Tejidos y Transformación
de genes Genética
Plantas Transgénicas
· Marcadores Cultivo de
Moleculares Mejoramiento Multiplicación Tejidos
· Cruzamientos
Ensayos de Evaluación

CEDAF
CEDAF

Objetivo General
Presentar a los participantes
los principios básicos de la
biotecnología vegetal en la
obtención de materiales mejorados.
xi
xii
Secciones
- Una introducción a la biotecnología
- Cultivos de tejidos vegetales
- Tecnología del DNA recombinante
- Marcadores moleculares
- Transformación genética de plantas
- Perspectivas futuras de la Biotecnología vegetal

CEDAF
Un a In tr o d u cc i ó n a l a B i o t ec n o lo g ía
Sección 1
William M. Roca / Hernando Ramírez 1

Sección 1 . Una In t r odu c c i ón a l a B i ot e c n ol ogí a
Tabla de Contenido
Estructura de la Sección . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Preguntas Orientadoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.1 ¿Qué es la Biotecnología? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.2 Breve Historia de la Biotecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.3 La Nueva Biotecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.4 Ejercicio 1.1 Introducción a la Biotecnología Vegetal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
Originales para Transparencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2 William M. Roca / Hernando Ramírez

Estructura de la Sección
BIOTECNOLOGÍA
Prime ra Prác tic a e mpíric a

Ge ne rac ió n Po c o c o no c imie nto
c ie ntífic o
S e g unda Co no c imie nto

c ie ntífic o y de
Fe rme ntac ió n Ge ne rac ió n
ing e nie ría
Te rc e ra
• Be bidas
Fe rme ntac ió n Ge ne rac ió n
• Alime nto s
• Co mbus tible s Indus trial
Té cnica s de
Fe rme nta ción y
bioproce s os Cultivo in vitro
• Fármac o s de cé lula s y DNA
• Alime nto s te jidos re combina nte y
• Pro c e s amie nto
de de s e c ho s tra ns forma ción
ge né tica
Objetivos
• Conocer los conceptos básicos de la biotecnología en general.

Preguntas Orientadoras
1. ¿Algún participante nos puede explicar que es biotecnología?
2. ¿Algún participante puede dar ejemplos de productos biotecnológicos?
3 ¿Sabían ustedes que el queso, el pan la cerveza son productos biotecnológicos?

1 .1 ¿ Q u é es l a B i ot ecnol ogí a ? selección), bioquímica e ingeniería química. Esta

La biotecnología se puede definir como: "la aplica- segunda generación incluye: la utilización de fer-
ción de principios científicos y de ingeniería para mentaciones (bioconversiones y biocatálisis) para
el procesamiento de materiales por medio de agen- la producción de fármacos, combustibles, alimen-
tes biológicos con el objetivo de producir bienes y tos y procesamiento de desechos. En esta segunda
servicios, en donde los agentes biológicos se refie- fase también se incluye el desarrollo de algunas
ren principalmente a microorganismos, células de técnicas recientes, como las de inmovilización de
animales y plantas, enzimas, y material genético enzimas y las de cultivo de tejidos vegetales y
aislado y clonado" (Sasson, 1989). animales.
El concepto de biotecnología fue ampliado a partir La biotecnología de tercera generación, también

de 1970, cuando se inician las tecnologías que per- denominada "Nueva Biotecnología" surge a co-
miten la manipulación de la molécula del DNA, mienzos de 1970 y se inicia con el descubrimiento
dando origen a la ingeniería genética y con ella de la tecnología del DNA recombinante. Esta ge-
nace la "nueva biotecnología". neración se basa en la biología molecular, la cual
tuvo un acelerado desarrollo después del descubri-
La biotecnología comprende un conjunto de técni-
miento de la estructura del DNA en 1953. Este
cas aplicables a diversas actividades de la socie-
evento y el posterior descubrimiento de las enzi-
dad, cuya base fundamental es multidisciplinaria,
mas de restricción dieron origen a la ingeniería ge-
con disciplinas básicas como la biología celular,
nética y con esta nace la nueva biotecnología.
la biología molecular, la bioquímica, la genética,
Estas nuevas tecnologías dieron origen a empresas
la microbiología, la inmunología, la ingeniería
biotecnológicas, que explotan las técnicas de inge-
química y la ingeniería de procesos.
niería genética para "cortar" y "confeccionar" los
1 .2 Bre v e H i s t or i a de l a B i ot e c n o l o g í a genes que son colocados en microorganismos,
como bacterias o levaduras, para que "fabriquen
Históricamente el desarrollo de la Biotecnología
por encargo" productos químicos y farmacéuticos
puede ser dividido en tres generaciones o etapas:
de interés.
La biotecnología de primera generación se basó en
la fermentación como proceso básico para la pro- 1.3 La Nueva Biotecnología
ducción de bebidas, alimentos y combustibles. Los inicios de la biotecnología se caracterizan por
Esta práctica era esencialmente empírica, se hacía un lento progreso de los conocimientos. La rápida
en pequeña escala, y estaba caracterizada por el expansión llegó con el descubrimiento de la es-
mínimo conocimiento científico y de ingeniería. tructura del DNA. La comercialización de mu-
chos de estos descubrimientos ha abierto un
La biotecnología de segunda generación se carac-
mercado de gran envergadura, que incluye no sólo
terizó por la utilización de los conocimientos cien-
la medicina y la genética, sino también, la indus-
tíficos y de ingeniería para la obtención de
tria alimentaria, la agrícola, la zootecnia y espe-
procesos a escala industrial. Estos procesos esta-
cialmente la farmacéutica, con un aumento de la
ban basados en la aplicación integrada de la micro-
propiedad intelectual.
biología (usando procesos de mutación y de

> 1970
Los eventos más importantes del desarrollo de la
Smi t h y Wi l cox descubr en las enzimas de res -
biotecnología incluye:
t r i cci ón.
> 1 944
> 1973 -1974
A ve ry, Mc Ca rty y Mc L e od demuest r an que el
B er g pr oduce l a pr i mer a molécula de DNA re-
D NA pue de tra ns fe rir una car act er í st i ca he -
combi nant e ( un pl ásmi do) mediante el corte y
r e dita ria de una c e pa ba c te ri ana a ot r a.
post er i or uni ón de dos f r a gmentos distintos
> 1 948 de D N A .
B e a dle y T a tun e s ta ble c e n q ue el papel de l os > 1975
g e ne s e s e s pe c ific a r la informaci ón necesar i a
Sanger , Maxam y G i l ber t desarrollan técnicas
p a ra la produc c ión de proteí nas.
par a l a secuenci aci ón del DNA.
> 1 951
> 1975
W ilkins y F ra nklin obtie ne n l as pr i mer as i má -
En A si l omar , C al i f or ni a, s e realiza la prime-
g e ne s de un c ris ta l de DNA .
r a conf er enci a sobr e l a bi oseguridad en el uso
> 1 952 del D N A r ecombi nant e y l os organismos ge -
nét i cament e mani pul ados.
H e rs he y y Cha s e c onfirm a n que el D N A es el
ma te ria l ge né tic o. > 1977
> 1 953 Se descubr e que no t odo el DNA de un gen
si r ve par a l a sí nt esi s de una proteína, la cual
W a ts on y Cric k e s ta ble c e n l a est r uct ur a de l a ocur r e sól o en l os "exones", es decir, las par-
d oble hé lic e , proponie ndo un model o t r i di - t es que son t r anscr i t as en el RNA mensajero.
me nc iona l e n e l que la s c ua t r o bases del D N A Los "i nt r ones" son el i mi nados del RNA.
se a c opla n e ntre s í, s iguie nd o r egl as muy pr e-
cisas. > 1978
> 1 957 La compañí a G enet ech ( EE. UU. ) utiliza bac-
t er i as par a l a pr oducci ón de insulina humana
K ornbe rg ide ntific a la DNA pol i mer asa, enzi - r ecombi nat e, que se comer cializa cuatro años
ma que pe rm ite la duplic a c ión de l a dobl e hé- después.
l ic e de l DNA.
1982
> 1 958
Pal mi t er y B r i nst er cr ean el primer animal
S t e wa rd logra la re ge ne ra ci ón de una pl ant a t r ansgéni co, i nt r oduci endo la hormona de
c o m ple ta a pa rtir de c é lul as somát i cas del cr eci mi ent o de r at a en un r atón.
f loe m a de la z a na horia , m edi ant e l a embr i o -
g é ne s is s om á tic a . > 1982
La compañí a C al gene ( EE.UU. ) clona el gen
> 1 961
r esponsabl e de l a r esi st encia a un herbicida.
Ja c ob y Monod propone n un model o de r egu-
l a c ión de los ge ne s ba s a d o en l a act i vi dad > 1982
i nhibidora de c ie rta s prote í nas. V anMont agu y Schel l pr o ducen la primera
pl ant a t r ansgéni ca ( t abaco) usando el plásmi-
> 1 966
do Ti del A gr obact er i um t u mefaciens.
K hora na y Nire nbe rg de s ci f r an el l enguaj e
d e l c ódigo ge né tic o: la le ct ur a del D N A se > 1983
p roduc e e n grupos de tre s b ases ( t r i pl et as) . Mul l i s pone a punt o l a t écnica de la reacción
en cadena de l a pol i mer asa (PCR), que permi -
> 1 970
t e ampl i f i car ( mul t i pl i car) secuencias de
K hora na s inte tiz a de form a quí mi ca el pr i mer DNA.
g e n.

> 1984 > 1995

S a n f o r d logra tra ns form a r te jidos de pl ant as Se desar r ol l an l os pr i mer os sec uenciadores
m e d i a n t e e l bom ba rde o de pa rtícul as ( bi ol í s- aut omat i zados de D N A .
tic a ).
> 1996
> 1985
N ace l a ovej a "D ol l y", l a pr i mera oveja clo -
J e ffre y s de s c ubre que e l DNA de cada i ndi vi - nada: el núcl eo de una cél ul a somática de una
d u o p roduc e fra gm e ntos c a ra ct er í st i cos al ovej a adul t a donant e f ue i nt r od ucido en un
s e r t ra ta dos c on e nz im a s de re s tr i cci ón. Por óvul o enucl eado.
lo ta n t o s irve n c om o " hue lla s da ct i l ar es" mo-
le c u l a re s . > 1996
Se si embr an l os pr i mer os cul t i vo s comercia-
> 1985
l es de pl ant as t r ansgéni cas ( EE.UU. ): 3 mi -
S e a p r u eba e l pa te nta m ie nto de pl ant as t r ans - l l ones de hect ár eas.
g é n ic a s e n E E . UU.
> 1998
> 1986
La si embr a de cul t i vos t r ansgénicos comer-
T a n k s le y c re a los prim e ros m a pas genét i cos ci al es cubr en 30 mi l l ones de hectáreas, prin -
m o l e c u l a re s us a ndo RF L P s . ci pal ment e en EE.U U ., C anadá, Argentina,
C hi na y Mexi co.
> 1987
> 1998
L a c o mpa ñía Ce tus Corpora tion ( EE. U U .)
a u t o m a t iz a la té c nic a de l P CR. Se f abr i can si st emas aut omat i zad os (robots)
par a l a ext r acci ón, di st r i bucci ón y plaqueo de
> 1988 muest r as de D N A y ot r as act i vi da des de biolo-
S e p a te nta ofic ia lm e nte e n E E .UU . el pr i mer gí a mol ecul ar .
a n i m a l tra ns gé nic o, e l " onc ora tó n".
> 1998
> 1988 Se pr oducen l os l l amados "chi ps" de DNA:
S e i n i c ia e l proye c to de l " Ge noma H umano", mat r i ces di mi nut as de pl ást i co para fijar gran
c o n e l f in de ide ntific a r todos lo s genes que numer o de muest r as de D N A par a el tamizado
c o n fo r m a n e l DNA de l hom bre . y/ o l ect ur a masi va de expr esi ón de genes.
> 1990 > 1999

W i llia m s de s a rrolla la té c nic a de R A PD par a Se i ni ci a l a "nanobi ot ecnol ogí a" (miniaturi -
la m a rc a c ión y m a pe o de ge ne s . zaci ón del anál i si s, det ecci ón y separación
de mat er i al genét i co de maner a masiva).
> 1991
> 1999
S e a n a liz a n los c om pone nte s genét i cos
(QT L s ) re s pons a ble s de c a ra c te rí st i cas com- Se da i mpul so a l a bi oi nf or mát i ca: la obten -
p l e ja s u s a ndo m a rc a dore s m ole cul ar es. ci ón , acumul aci ón, anál i si s, co mparación e
i dent i f i caci ón de dat os mol ecul ares / genéti -
> 1993 cos que son ut i l i zados par a l a i d entificación
de nuevas secuenci as y genes.
S e d e sa rrolla la biote c nología de bi or r eact o -
re s p a ra e l c ultivo de c é lula s y te ji dos veget a -
le s d e f orm a m a s iva .
> 1994
L a c o mpa ñía Ca lge ne re c ibe la apr obaci ón
p a r a c o m e rc ia liz a r tom a te s tra n sgéni cos de
m a d u ra c ión re ta rda da .

Un aspecto importante de la nueva biotecnología capacidad para superar ciertos límites naturales
es que es extensiva en el uso del conocimiento para el desarrollo de nuevos productos o procesos.
científico. En el período anterior a Pasteur, la bio-
Entre los eventos claves de la nueva biotecnología
tecnología se limitaba a la aplicación de una expe-
que permitieron el desarrollo de la biotecnología
riencia práctica que se transmitía de generación en
vegetal se incluyen:
generación. Con Pasteur, el conocimiento científi-
a. La regeneración de plantas completas a partir de par-
co de las características de los microorganismos tes de plantas (explante), cultivadas in vitro;
comienza a orientar su utilización práctica, pero las b. Técnicas para identificar y mapear genes y para de-
aplicaciones industriales se mantienen fundamen- tectar diferencias entre individuos comparando di-
talmente como artesanales, con la excepción de rectamente sus genomas ;
unas pocas áreas en la industria química y farma- c. Técnicas para aislar, modificar y clonar genes;
céutica (como los antibióticos), en las cuales se ini- d. Técnicas que permiten la transferencia de estos ge-
nes a plantas. Estas metodologías serán explicadas
cia la actividad de investigación y desarrollo en el
más adelante.
seno de la corporación transnacional. En todos es-
tos casos, la innovación biotecnológica surgió en el Las aplicaciones a corto plazo de la nueva biotec-
sector productivo; en cambio, los desarrollos de la nología en la agricultura incluyen: el manejo y
nueva biotecnología se originan en los centros de conservación de recursos genéticos; la propaga-
investigación, generalmente localizados en el seno ción masiva de plantas; los métodos para detec-
de las universidades. ción de plagas y enfermedades y la construcción
de mapas moleculares para agilizar los programas
Las nuevas biotecnologías pueden agruparse en de mejoramiento tanto animal como vegetal; la in-
tres categorías básicas: troducción y expresión de genes para obtener re-
1. Técnicas para el cultivo in vitro de células y tejidos, sistencia a insectos; patógenos, herbicidas; o para
incluyendo el cultivo de microorganismos.
el mejoramiento de la calidad de proteínas, car-
2. Técnicas de fermentación y bioprocesos, incluyendo
técnicas de inmovilización de enzimas.
bohidratos y aceites o grasas.
3. Técnicas para la identificación, mapeo, clonación, A largo plazo: la manipulación de caracteres com-
manipulación y transferencia de genes. plejos, lo cual requiere de un previo entendimiento
Aún cuando los tres grupos se complementan en- de los mecanismos bioquímicos y genéticos de las
tre sí, existe una diferencia fundamental entre los características poligénicas de interés.
dos primeros y el tercero. Los primeros se basan
Por esta razón, las actuales investigaciones en bio-
en el conocimiento de las características y compor-
tecnología vegetal están encaminadas al aisla-
tamiento de las células y microorganismos y en el
miento y caracterización de genes de importancia
uso deliberado de estas características (de cada or-
económica, sobre todo de secuencias reguladoras,
ganismo en particular), para el logro de objetivos
tales como: floración, fotosíntesis, fijación bioló-
específicos en materia de nuevos productos y pro-
gica de nitrógeno, etc. Mientras tanto, las aplica-
cesos. Mientras que el tercer grupo se caracteriza
ciones más importantes incluyen:
por su potencialidad para manipular la genética y
a. El uso de mapas genéticos y marcadores molecula-
las características estructurales y funcionales de res para la identificación de genes de resistencia a
los organismos y de la aplicación práctica de esta plagas y enfermedades;

Tabla 1.2 Aplicaciones de la biotecnología en el sector

b. Transferencia de caracteres de interés de especies
industrial. Fuente: Bull et al. 1982.
silvestres a cultivadas mediante cruces interespecí-
ficos o distantes; Química Producción de:
c. Producción de plantas transgénicas usando genes • Orgánica • Etanol, Acetona, Butanol, Acidos
simples de resistencia a virus, insectos y herbicidas, orgánicos
de calidad de proteína de semillas, contenido de al- • Enzimas
midón y para retardar la maduración del fruto; • Perfumes
• Polímeros (principalmente polisacáridos)
d. Utilización de marcadores moleculares para el estu-
dio de la diversidad genética de plantas, animales y • Inorgánica • Bioacumulación y Lixiviación
microorganismos. La Tabla 1.1 presenta algunas
aplicaciones de la nueva biotecnología en la produc- Farmacéutica Producción de:
ción vegetal. • AntibióticosAgentes para diagnóstico

(enzimas, anticuerpos)
Un paso crucial para la aplicación de la biotecno- • Inhibidores de enzimas
logía en la solución de problemas de la agricultura • Esteroides
Vacunas
es la identificación de problemas recalcitrantes a
una solución por métodos convencionales, segui- Energía Producción de:
do de un análisis de costo/beneficio de la aplica- • Etanol (gasohol)

• Metanol (biogas)
ción biotecnológica.
Alimentos Producción de :
La biotecnología tradicional y la nueva biotecnolo-
• Lácteos, productos de pescado y de
gía ofrecen también una amplia aplicación no sólo carne
en la industria alimenticia y farmacéutica, sino • Bebidas (alcohólicas, té y café)
• Levadura para panadería
también en muchos procesos industriales (Tabla • Aditivos para alimentos (antioxidantes,
1.2). colorantes, saborizantes, estabilizadores)
• Producción de champiñones
Tabla 1.1 Aplicaciones de la nueva biotecnología. • Aminoácidos, vitaminas
Fuente: Roca, W. 1986. • Producción de almidón
• Glucosa y jarabe de alta fructosa
1. En la Producción Vegetal:
• Modificaciones funcionales de proteínas,
• Recursos genéticos Pectinas
Conservación Remoción de toxinas.
Caracterización
Utilización Agricultura Producción de:
• Mejoramiento genético
• Alimentos para animales
Cruzamientos distantes
Haploidía • Vacunas para animales
Mapas y marcadores moleculares • Ensilaje y procesos de descomposición
Transformación genética
• Pesticidas microbianos
• Control biológico
• Rhizobium y otros inoculantes
Biopesticidas bacteriológicos para la fijación de
• Biofertilizantes nitrógeno
• Agroindustria • Inoculantes de micorrizas
Propagación masiva
Control de calidad Servicios • Purificación de agua
Valor agregado Industriales • Tratamiento de afluentes
2. En el Manejo (Reciclaje) de Productos Agrícolas • Manejo de desechos
• Bioconversión • Recuperación de aceites
3. En la Protección del Ambiente (Aguas y Suelos)

• Biorremediación

1 .4 E j er ci ci o 1. 1 I nt r odu c c i ó n a l a dos en productos biotecnológicos de primera, se-

B i ot ecnol ogí a V eget a l gunda y tercera generación.
Objetivos • Motive una discusión con base a las respuestas
• Elaborar el concepto de biotecnología y sus dadas al ejercicio.
aplicaciones. • Proporcione la información de retorno, señalan-
• Diferenciar productos biotecnológicos de uso do los productos de origen biotecnológico y su
cotidiano. clasificación de primera, segunda o tercera gene-
ración.
Orientaciones para el Instructor
Recursos necesarios
Con el siguiente ejercicio se busca reafirmar el
• Papelógrafo, papel, marcadores
concepto de Biotecnología, a través de la identifi-
• Cuatro mesas grandes
cación y clasificación de productos elaborados me-
• Un sitio de trabajo ( un salón)
diante procesos biotecnológicos.
• Los siguientes productos: Queso, pan, cerveza,
La idea es crear un escenario donde los participan- vino, papel, insulina, penicilina (antibiótico), ve-
tes puedan tener contacto directo con productos de las (de parafina), un "tarro" de grasa, azúcar, sal,
uso cotidiano, muchos de los cuales obtenidos por una planta de tomate, tomate (fruto), vinagre.
procesos biotecnológicos, para motivar una discu- • Fotocopias de las instrucciones e información de
sión sobre su obtención y las aplicaciones de algu- retorno para los participantes.
nos productos biotecnológicos, muchos de los Tiempo sugerido: 60 minutos.
cuales hacen parte de nuestra vida cotidiana.
Instrucciones para el participante
Para la realización de este ejercicio se recomienda
De acuerdo con la información suministrada en la
que el Instructor lea atentamente las siguientes ins-
Sección 1, y mediante el reconocimiento de produc-
trucciones:
tos de origen biotecnológico, los participantes ten-
• Suministrar información sobre los objetivos del
drán la oportunidad de desarrollar el concepto de
ejercicio.
biotecnología.
• Ubique en un salón cuatro mesas grandes. En
cada una de ellas colocar los productos mencio- Pasos a seguir:
nados en la lista de recursos. • Conformen cuatro grupos de trabajo de acuerdo
• Conforme cuatro grupos de trabajo. Ubique con las instrucciones dadas por el instructor.
cada grupo en cada una de las mesas (con los • Nombren un relator por grupo, el cual presentará
productos). en plenaria los resultados obtenidos por el grupo.
• En cada grupo de trabajo, los participantes de- • Realice un listado de los productos de origen bio-
ben separar aquellos productos que ellos consi- tecnológico. Argumenten sus selecciones.
deren son de origen biotecnológico.
• De los productos biotecnológicos selecciona-
• Hacer un listado de los productos seleccionados, realizar un listado de los que corresponden
dos, argumentando por que consideran que son a la primera, segunda o tercera generación. Ar-
productos biotecnológicos en cada selección. gumenten sus selecciones.
• Luego, solicite a los participantes que clasifi- • Al finalizar, el Instructor les proporcionará la
quen los productos biotecnológicos selecciona- información de retorno.

Ejercicio 1.1 Introducción a la Biotecnología Vegetal - Información de retorno
Producto Clasificación Argumento

Queso Biotecnología Proceso enzimático
1ra.Generación Para elaboración de quesos
Pan Biotecnología Levadura y proceso enzimático.
1ra generación
Cerveza Biotecnología Fermentación
2da generación
Vino Biotecnología Fermentación
1ra generación
Insulina Biotecnología DNA recombinante
3ra generación
Penicilina Biotecnología Bioprocesos
2da generación
Grasa N O -------
Azúcar N O -------
Sal N O -------
Planta de tomatetransgénica Biotecnología Ingeniería genética
3ra generación
Fruto de tomateRetarda en madurar Biotecnología Ingeniería genética
3ra generación
Vinagre Biotecnología Fermentación
1ra generación
Bib lio g r af í a
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Pa l m i r a, C o lo mb ia.

Ori gi n a l e s pa r a T r a n sp a r e nc i a s

12
BIOTECNOLOGÍA
Primera Práctica empírica

Generación Poco conocimiento

científico
Segunda Conocimiento
científico y de
Fermentación Generación
ingeniería
Tercera
• Bebidas
Fermentación Generación
• Alimentos
• Combustibles Industrial
Técnicas de
Fermentación y
bioprocesos Cultivo in vitro
• Fármacos de células y DNA
• Alimentos tejidos recombinante y
• Procesamiento
de desechos transformación
genética

CEDAF
CEDAF
Objetivos

• Conocer los conceptos básicos de la
biotecnología en General.
13
14
¿Qué es la Biotecnología?
Es la aplicación de principios científicos

y de ingeniería para el procesamiento

de materiales por medio de agentes
biológicos para producir bienes y
servicios.
Los agentes biológicos se refieren a:
• Microorganismos
• Células de animales y plantas
• Enzimas
• Material genético aislado y clonado
(Sasson, 1989)

CEDAF
CEDAF
Desarrollo histórico de la
Biotecnología

• Biotecnología de Primera Generación
• Se basó en la fermentación como

proceso básico para producir:
bebidas, alimentos y combustibles.
• Práctica esencialmente empírica.
• Se realizaba en pequeña escala.
• Mínimo conocimiento científico y de

ingeniería.
15
16
Desarrollo Histórico de la Biotecnología
Biotecnología de Segunda Generación
• Se caracterizó por la utilización de los conocimientos científicos y de ingeniería.

• Obtención de procesos a escala industrial.
• Se basa en la aplicación integrada de la microbiología, la bioquímica y la
ingeniería química.
• Utiliza bioconversiones y brocatálisis para producir fármacos, combustibles,

alimentos y procesamiento de desechos.
• También incluye:
• Técnicas de inmovilización de enzimas
• Técnicas de cultivos de tejidos

CEDAF
CEDAF
Desarrollo Histórico de la Biotecnología

• Biotecnología De Tercera Generación
- También llamada “Nueva B iotecnología”

- Se inicia con el descubrimiento del DNA recombinante.
- Se basa principalmente en la biología Molecular y la Ingeniería genética.
- Nacen las empresas biotecnológicas
17
18
La nueva Biotecnología
• Extensiva en el conocimiento científico

• Se agrupa en tres categorías básicas
1. Técnicas de cultivo de tejidos y microorganismos
2. Técnicas de fermentación y bioprocesos y de inmovilización de enzimas.
3. Técnicas para: Identificación mapeo clonación, manipulación y transfer encia de

genes.

CEDAF
C u l t i v o d e T ej i d o s V e g e t a l e s
Sección 2

Sección 2 . Cultiv o de Te j i dos V e ge t al e s
Tabla de Contenido
Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.1 Fundamentos del Cultivo de Tejidos Vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.2 Aplicaciones del Cultivo de Tejidos Vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.3 Ejercicio 2.1El Cultivo de Tejidos Vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

Cultivo de Tejidos Vegetales
Micropropagación Contribución al
fitomejoramiento
Cultivo de Propagación
Cultivo de Cruces
meristemos masiva
ovulos y interespecíficos
embriones
Ápices y yemas Eliminación de

enfermedades Cultivo de Producción de
anteras haploides
Cultivo de Producción de protoplastos para

suspensión transformación o hibridación somática
celulares
Metabolitos secundarios
Objetivos
• Entender los principios básicos de las técnicas de cultivo de tejidos vegetales.

• Conocer algunas aplicaciones de estas técnicas.
1. ¿Sabían ustedes que a partir de una célula somática del floema de la raíz de la zanahoria se puede desarrollar
una planta completa de zanahoria?
2. ¿Algún participante puede dar una definición de cultivo de tejidos vegetales?
3. ¿Sabían ustedes que las flores naturales que venden en floristerías y supermercados son producidas por cultivo
in vitro?

In tro d u c ci ón tructuras organizadas y la formación de plantas

El cultivo de tejidos vegetales es una técnica que completas. Si la formación de la planta completa
consiste en aislar una porción de una planta (tejido, se realiza mediante la formación de brotes o yemas
órgano o célula), llamado explante, para cultivarlo adventicias y posterior enraizamiento de éstos, se
en un medio nutritivo en condiciones físicas y quí- dice que el proceso es de organogénesis. Pero si la
micas artificiales. El objetivo es conseguir que las regeneración se obtiene a través de estructuras se-
células expresen su totipotencialidad, o sea, la ca- mejantes a los embriones sexuales, se dice que la
pacidad que tienen las células vegetales de regene- vía es embriogénesis somática.
rar una planta completa cuando son separadas del Puede suceder que al cultivar in vitro un explante
organismo. La totipotencialidad de las células ve- vegetal no se obtengan células diferenciadas o es-
getales cultivadas in vitro fue establecida por tructuras organizadas, sino la proliferación celular
Steward y colaboradores en 1958, quienes descri- para formar un tejido amorfo no diferenciado. Este
bieron el desarrollo de una planta de zanahoria a tejido recibe el nombre de callo. El callo puede ser
partir de células somáticas del floema de la raíz de sometido a agitación en un medio de cultivo líqui-
zanahoria. (Figura 2.1). do lo cual logra separar sus células constituyentes
Cuando los explantes se cultivan en condiciones para formar un cultivo de células en suspención.
apropiadas, es posible inducir la formación de es- La técnica de cultivo de tejidos puede cubrir un
amplio rango de aplica-
ciones, tales como:
1. Investigación básica so-
bre procesos bioquími-
cos y morfológicos de la
diferenciación celular;
2. Investigación aplicada;
3. Desarrollo de técnicas
para la propagación clo-
nal o para el mejora-
miento genético de
plantas.
El objetivo de este ca-
pítulo es mostrar los
fundamentos básicos
de esta metodología
para que el participante
conozca la importancia
de esta herramienta de
la Biotecnología Vege-
tal.
Figura 2.1. Desarrollo de una planta de zanahoria a partir de células somáticas
del floema de la raíz. Fuente: Villée y Colaboradores, 1998.

2 .1 F undam ent os del C ul t i v o d e 1953 Skoog Descubrimiento de la cinética.

1955
T ej i dos V eget al es
1956 Nichel Subcultivos durante 4 años de
suspensiones celulares.
En el cultivo in vitro n vitro de tejidos vegetales, un
1957 Skoog & Miller Diferenciación del callo en vástago
explante (células, tejido, órgano), se cultiva asépti- y raíz.
camente en un medio de composición definida y en 1960 Bergmann Cultivo y pruebas de regeneración
de células aisladas.
condiciones ambientales controladas. En la Tabla 1960 Cocking Obtención de protoplastos
2.1 se presenta un cronograma de los eventos cien- empleando enzimas.
1962 Murashige & Skoog Medio MS.
tíficos y tecnológicos más importantes que contri-
1964 Morel Cultivo de meristemos, eliminación
buyeron al desarrollo del cultivo in vitro de células de virus.
y tejidos de plantas. 1964 Nitsch Inducción de flores in vitro.
1964 Guha & Plantas haploides a partir de
Tabla 2.1 Eventos científicos y tecnológicos claves en Maheshwar anteras.
la evolución del cultivo in vitro de células y tejidos
1965 Ledoux Introducción de DNA extraño en
vegetales. Fuente: Villalobos (1990). células.
1665 Hooke Primera descripción de una célula. 1966 Lutz Totipotencia: uso de la célula
1674 Leeuwenhoek Observación de la vida celular. aislada.
1835 Von Mohl Descripción de la vida; protoplasta. 1970 Backs – Husemann Técnicas de regeneración completa
Reinert a partir de una célula.
1838 Schilden Conjunto celular de las plantas;
totipotencia de la célula vegetal. 1970 Kao et al Pruebas de regeneración de plantas
1971 a partir de protoplastos.
1839 Schwann Aplicación del concepto a animales.
1971 Tabeke Regeneración de plantas a partir de
1846 Nageli Células vegetales se forman por protoplastos.
divisiones de células existentes.
1972 Carison Et al. Función de protoplastos y
1855 Virchow Aforismo: Omnis cellula e cellula. regeneración de híbridos.
1888 Haberlandt Pruebas de cultivo de células de 1978 Melchers Pomato. Topato.
1902 mesófilo; predicciones.
1922 Kotte Cultivo de ápices de raíces por Para el establecimiento del cultivo in vitro de una
poco tiempo
especie en particular se debe tener en cuenta una
1926 Went Descubrimiento de las auxinas.
1928 Kuster Trabajos con protoplastos obtenidos serie de factores, de cuyo manejo depende el éxito
mecánicamente. del cultivo.
1934 White Cultivo de raíces con crecimiento
activo.
Cada sistema de cultivo in vitro presenta caracte-
1934 Gautheret Cultivo del cambio de árboles.
rísticas particulares que permiten producir plantas
1937 White Importancia de la vitamina B para el
crecimiento de las raíces. completas a partir de explantes. Estas característi-
1937 When & Thimann Trabajos intensivos con auxinas. cas tienen que ver con: el explante, las normas de
1939 Gautheret Uso de las auxinas en los cultivos;
proliferación; potencialmente asepsia, los medios de cultivo y las condiciones
crecimiento sin límites.
ambientales de incubación. La interacción de estos
1939 Nobecourt Cultivo de raíces de zanahoria,
proliferación de células. factores es lo que determina la respuesta del ex-
1939 While Subcultivos sucesivos de Nicotiana. plante al cultivo in vitro.
1942 Van Overbeek Rescate de embriones en cruzas
interespecíficas. La formación de plantas por medio del cultivo de
1949 Camus Diferenciación vascular.
tejidos puede ocurrir como una continuación del
1952 Steward Agua de coco, embriogénesis
somática. crecimiento y desarrollo de estructuras organiza-
1953 Muir Cultivo de suspensiones celulares; das, por ejemplo, meristemas apicales y axilares
ailslamento de células individuales.
1953 Tulecke Cutivo de polén.
del tallo; o puede ser el resultado de un proceso de

formación de novo, a partir de células donde no químico) y las condiciones ambientales de la incu-
existía organización alguna; estas células pueden bación (factor físico).
derivarse de los órganos vegetativos (somáticos) o
Las técnicas de cultivo de meristemos, ápices y ye-
de las estructuras sexuales (gaméticas) de la planta.
mas pueden considerarse como clásicas dentro del
(Figura 2.2).
cultivo de tejidos y su aplicación, en la propaga-
La formación de plantas de novo puede ocurrir a ción clonal de plantas, la recuperación de la sani-
través de la diferenciación de embriones que se ini- dad, así como en la conservación e intercambio de
cia en células individuales o en grupos de células germoplasma, están ampliamente diseminadas.
(embriogénesis somática o asexual) o vía diferen- Por otro lado, el cultivo de microsporas y de ante-
ciación de órganos vegetativos (organogénesis) ras para la producción de haploides es una herra-
que se inicia en grupos de células. mienta importante para el mejoramiento genético
de plantas.
Como se mencionó antes, la regeneración de plan-
tas in vitro depende de varios factores, siendo los Para cultivar células, tejidos y órganos in vitro se
más importantes: la variedad de la planta (genoti- deben seguir los siguientes pasos:
po), la clase de tejido a cultivar (explante), la com- 1. Seleccionar y separar de la planta el explante que
posición química del medio de cultivo (factor se desea cultivar.
2A
2B
Figura 2.2 Formación de plantas in vitro. 1. Cultivo de meristemos y yemas del tallo. 2. Regeneración de
plantas. 2A. Vía organogénesis; 2B. Vía embriogénesis somática. Fuente: George y Sherrington, 1984.

2. Desinfectar el explante. na es baja se puede dar el desarrollo de yemas axi-

3. Sembrar el explante en un medio de cultivo apro- lares, o la inducción de brotes adventicios.
piado. Manipulando las combinaciones y concentracio-
4. Cultivar el explante en condiciones ambientales nes de los reguladores de crecimiento, es posible
controladas.
regenerar plantas completas a partir de células, te-
Entre los factores químicos que influyen en el cul- jidos u órganos.
tivo in vitro están: los nutrientes (macro y microe-
lementos y fuentes de carbohidratos) y algunos 2.2 Aplicaciones del Cultivo de Tejidos
compuestos orgánicos (vitaminas) y los regulado- Vegetales
res de crecimiento. Las aplicaciones de esta técnica se dan básicamen-
te en tres áreas fundamentales:
Entre los factores físicos están: la luz, la tempera-
a. La micropropagación,
tura, el pH y la concentración de O2 y CO2. Estos
b. La contribución del cultivo in vitro en el mejora-
factores ejercen un papel importante en el desarro-
miento vegetal y
llo y diferenciación celular.
El tipo de diferenciación que ocurre en un cultivo c. La producción de metabolitos secundarios. (Tabla
in vitro en general depende de la relación de dos ti- 2.2).
pos de reguladores de crecimiento: las auxinas y
2.2.1 Micropropagación
las citocininas. Cuando la relación auxina/citoci-
nina es alta se puede dar la formación de raíces, la Uno de los mayores usos del cultivo in vitro de teji-
inducción de embriogénesis y la inducción de ca- dos es la propagación vegetativa de plantas, la cual
llos. Mientras que si la relación de auxina/citocini- se realiza en forma extensiva. Esta metodología
Tabla 2.2 Técnicas de cultivo in vitro de células y tejidos vegetales y sus aplicaciones en la agricultura. Fuente: Roca
(1986).
Tecnologías Aplicaciones Plazos para

utilización
Cultivo de Meristemas, ápices, 1. Propagación masiva - Inmediato
yemas, embriogénesis somática
2. Eliminación de enfermedades - Inmediato
3. Conservación de germoplasma - Inmediato
4. Intercambio de germoplasma. - Inmediato
Cultivo de embriones, cultivo de 1. Obtención de híbridos entre especies de géneros distintos - Inmediato
óvulos, fertilización in vitro
Cultivo de anteras, Cultivo de 1. Obtención rápida de líneas genéticamente puras - Inmediato
microsporas, Cultivo de embriones
2. Obtención de variación genética nueva - Mediano
3. Aumento de heterosis
Cultivo de células, callos 1. Obtención de variantes somaclonales - Mediano
2. Acelerar mejoramiento genético intravarietal - Mediano
3. Selección de líneas resistentes a enfermedades, estrés, etc. - Mediano
4. Transformación genética - Largo
Funsion de Protoplastos 1. Obtención de híbridos asexuales. - Largo
2. Transferencia de genes citoplasmáticos - Largo

permite la multiplicación masiva de plantas en es- de formación de las yemas axilares o apicales. Los
pacio y tiempo reducidos, ganancia que es bastante brotes, raíces, bulbos adventicios y otras estructu-
significativa cuando se compara con los métodos ras similares se pueden inducir en segmentos de ta-
convencionales de propagación asexual. llo, hojas, tubérculos, cormos, bulbos, rizomas o
estructuras florales. Normalmente el número de
En general, la micropropagación se puede conse-
propágulos se incrementa por subdivisión de los
guir a través de tres vías:
propios órganos inducidos in vitro. Esta vía puede
a. Por medio de la proliferación de yemas axilares;
resultar en un sistema de multiplicación mayor que
b. Por la inducción de yemas o brotes adventicios y
la propagación por proliferación de yemas axila-
c. Por embriogénesis somática (Figura 2.2).
res.
Las yemas apicales o axilares se pueden desarro-
llar in vitro promoviendo el crecimiento de las ye- La embriogénesis somática es el sistema de mayor
mas latentes o de las yemas activas. Un segmento potencial para la propagación clonal rápida. A tra-
de la planta que contenga una sola yema puede ori- vés de este método es posible obtener miles de em-
ginar un solo tallo o puede producir tallos múlti- briones somáticos a partir de unos pocos gramos de
ples (Figura 2.3). A medida que el tallo o las ramas callo o de pocos mililitros de una suspensión ce-
se desarrollan producen a su vez más yemas axila- lular. Durante este proceso cada célula o grupo de
res; por el subcultivo periódico se podrán producir células es capaz de dividirse y diferenciarse en un
tallos o ramas indefinidamente. Este método de embrión somático, que luego puede dar origen a
micropropagación ha sido el más popular debido a una planta completa. Debido a su similitud con los
su aplicabilidad a un mayor número de especies embriones cigóticos, los embriones somáticos se
vegetales y a su simple implementación. utilizan para la producción de las llamadas semi-
llas artificiales.
Los brotes o yemas adventicias son estructuras que
se originan de novo en áreas diferentes a los sitios La ventaja de la embriogénesis somática, compara-
da con los dos métodos de micropropagación men-
cionados anteriormente, se debe principalmente al
MICRO-PROPAGACIÓN
manejo de un alto volumen de material propagado
y a un bajo costo de producción. Sin embargo, el
principal problema de este sistema es el reducido
número de especies que pueden ser propagadas por
esta vía.
La micropropagación tiene una amplia aplicación
I. INICIACIÓN II. ENRAIZAMIENTO
e n c u l t i v o s c o m e rc i a l e s c o mo p l a n t a s
ornamentales, frutales, forestales y especies
hortícolas comestibles. En América Latina existen
unos 180 laboratorios de micropropagación de
variada capacidad. De éstos, sólo 50 desarrollan
Figura 2.3. Cultivos de meristemos de yuca en dos propagación de plantas a nivel comercial. Sin
etapas de micropropagación por cultivo de nudos. embargo, son pocos los que alcanzan niveles de
Fuent: Roca, W. 1980.

Tabla 2.4 Plantas propagadas in vitro. Fuente:

producción superior al millón de plantas al año Compilado por Roca, W., (1995).
(Tabla 2.3). Las plantas para las cuales se han Número de Variedades o Tipos
desarrollado técnicas de micropropagación Tipo de planta Micropropagadas Propagación
masiva
incluyen principalmente ornamentales, herbáceas, Ornamentales
frutales y forestales, aunque la propagación masiva Herbáceas 189 85
Leñosas 96 9
(a nivel comercial) es más utilizada con las
Frutales 50 40
ornamentales (Tabla 2.4).
Forestales
Tabla 2.3 Laboratorios de micropropagación Angiospermas 60 24
comercial. Gimnospermas 30 15
País Número de laboratorios Hortalizas 60 10
Estados Unidos 105*
Gramíneas 50 10
Australia 35*
Inglaterra 15* Orquídeas 37 28
Nueva Zelandia 15* Medicinales 43 5
Francia 10* 20 3
Plantaciones
China 10*
Oleaginosas 14 6
Brasil 10*
Israel 7* Fibras 17 1
Italia 6 Raíces y tubérculos 8 2
Argentina 6
Total 672 238
Holanda 5*
Canadá 5* % 100 35
Rep. Dominicana 5*
México 5*
Colombia 5 Micropropagación comercial
Costa Rica 5*
Sur Africa 5 Existen numerosas compañías comerciales que
Filipinas 4
Tailandia 4
producen millones de plántulas al año por micro-
Indonesia 3 propagación. Compañías de este tipo se hallan lo-
Singapur 3*
Venezuela 3 calizadas en EE. UU, Australia, Reino Unido, e
Kenya 2 Israel principalmente, donde el principal mercado
Malasia 2
Taiwan 2* son las plantas ornamentales de flores para corte
* Producción mayor de 1 millón de plantas. (Tabla 2.3).
El m er cado pot enci al p a r a l a s p l a n t a s
micropropagadas es muy grande, siendo Holanda Eliminación de virus y otros patóge-
nos
e l pr i nci pal paí s pr oduc t o r d e p l a n t a s
micropropagadas, seguido por los Estados Unidos Las plantas son susceptibles a muchos agentes pa-
de América y por Israel. tógenos como bacterias, hongos, virus, viroides y
nemátodos. Aunque la esterilización superficial de
Es importante anotar que no todas las especies ve-
los explantes elimina agentes superficiales, este
getales responden con facilidad a la micropropaga-
tratamiento no permite la eliminación de infeccio-
ción, como es el caso de especies forestales. Sin
nes sistémicas, de tipo bacteriano o víricas. Aun-
embargo, se debe enfatizar que la micropropaga-
que resulta relativamente sencillo eliminar los
ción es recomendable para la multiplicación rápida
patógenos de etiología fúngica o bacteriana por
de materiales en vía de extinción y materiales va-
tratamiento químico u otros medios, la eliminación
liosos o de alto valor agregado para el comercio.
de los virus representa un verdadero problema.

De la observación de que la distribución de las par- Para que este procedimiento sea eficiente se deben
tículas virales en la planta es irregular y que existe tener en cuenta factores como: el tamaño del ápice
menor número de partículas virales en los meriste- que se extrae para el cultivo, factores del medio y
mos apicales, fue posible llegar a una soluciónde tratamientos químicos o térmicos antes o durante
este problema. el cultivo in vitro. De todos ellos, el factor más im-
Los meristemas apicales son grupos de células lo- portante es el tamaño del explante; generalmente el
calizadas en el extremo del ápice de crecimiento y porcentaje de obtención de plantas aumenta con el
que normalmente se dividen activamente y de tamaño del explante, pero si el meristemo es relati-
modo organizado. El meristema apical de brotes vamente pequeño, la proporción de plantas sin vi-
esterilizados superficialmente pueden ser cortados rus será relativamente elevada. En algunos casos
conteniendo las células apicales y los primordios resulta efectivo el tratamiento térmico (por ejem-
foliares adyacentes, y cultivados en un medio de plo, durante 10 - 20 días a 35 - 38 oC) antes de que
cultivo y condiciones de crecimiento adecuados se efectúe la extracción del meristemo, ya que la
para obtener plantas completas. multiplicación viral es sensible a las temperaturas
elevadas (Figura 2.4).
Las plantas producidas por este procedimiento ge-
neralmente no presentan infección viral, compro- La técnica del cultivo in vitro de meristemos ha
bada por la técnica ELISA (prueba inmunológica sido efectiva para la propagación de plántulas li-
para detección de virus en tejidos vegetales) con bres de virus en por lo menos unas 65 especies de
indicadores o con sondas de DNA. plantas.
TERMOTERAPIA
Día: 35°C Noche: 35°C Día: 40°C Noche: 35°C
PRUEBAS MATERIAL
DE
DETECCIÓN CLONAL
CLONES INFECTADOS CULTIVO DE MERISTEMAS
SEMBRAR EN POTES
PRUEBAS DE DETECCIÓN
PROPAGACIÓN PLANTAS SANAS (-) (+)

DESTRUCCIÓN
PLANTAS ENFERMAS
PLANTAS SANAS
Figura 2.4. Procedimientos para la producción de plantas de yuca libres de virus mediante la
termopterapia y el cultivo de meristemos. Fuente. Roca y Jayasinghe, 1982.

2 .2 . 2 C ont ri buci ón del c u l ti v o i n v i t ro utilidad en los programas de mejoramiento, tanto

en el mej orami ent o v e g e t a l para la producción rápida de líneas homocigóticas,
como para la detección y selección de mutantes re-
Res cat e de embri ones zi g ó ti c o s
cesivos. La producción de haploides puede ocurrir
Las barreras que se oponen al logro de la produc- por medio de la regeneración de plantas a partir del
ción de híbridos entre especies distantes taxonómi- cultivo de granos de polen inmaduros aislados
camente pueden ser superadas mediante las (cultivo de microsporas) o contenidos en la antera
técnicas de cultivo in vitro. En aquellos casos en (cultivo de anteras). En la cebada, por ejemplo,
que la fecundación tiene éxito, pero el embrión no que posee del orden de 2 - 3x103 granos de po-
consigue desarrollarse, es posible aislar los em- len por antera y 60 anteras aprovechables por cada
briones cigóticos inmaduros y cultivarlos en me- espiga, existen potencialmente 105 microesporas
dios y condiciones apropiadas para regenerar por espiga que pueden ser aprovechadas para el
plantas híbridas (Figura 2.5). cultivo in vitro.
Pr oducci ón de pl ant as h a p l o i d e s m e - Mediante el cultivo de anteras es posible regenerar
d ia nt e el cul t i vo de ant e r a s y d e o v a - plantas haploides en más de 50 especies vegetales,
r io s siendo la mayoría de ellas de las familias Grami-
Las plantas haploides contienen el número gaméti- nae, Solanaceae y Cruciferae. Estas familias inclu-
co de cromosomas, es decir la mitad del número to- yen muchas especies agrícolas de importancia
tal de cromosomas de la planta. Son de gran económica como el trigo, la cebada, el maíz, el
arroz, el centeno, los pastos, las brassicas, la papa,
el tomate y el tabaco.
Los factores más importantes para la producción
eficiente de plantas haploides son los siguientes:
x
1. El crecimiento de las plantas donantes en condicio-
nes óptimas,
P. vulgaris P. coccineus 2. Una muestra adecuada de diferentes genotipos;
Embrión P. acutifolius
P. lunatus 3. Elección del estadio adecuado del desarrollo del
polen ;
4. Condiciones del pretratamiento de las anteras, es-
pecialmente el tratamiento por frío o por calor;
5. Efecto de los aditivos en el medio de cultivo, por
ejemplo, el nitrógeno orgánico, un aumento en el
contenido de sacarosa, carbón activado, etc.
Callo
En el mejoramiento tradicional son necesarias 5 - 6
Plantas generaciones del material segregante para obtener
líneas uniformes, las cuales nunca son 100% ho-
mocigotas. Estas generaciones requieren además
Figura 2.5 Producción de plantas híbridas de cruzas
de tiempo y mano de obra intensa. El cultivo de
interespecíficas mediante el rescate y cultivo in
vitro de embriones inmaduros. Fuente: Muñoz y
anteras permite eliminar varias generaciones se-
Colaboradores, 1990.
gregantes, economizando tiempo, espacio y cos- que por el método tradicional tomaría 3 - 4 años
tos. El cultivo de anteras para la producción de (Figura 2.6).
haploides es ya un proceso rutinario en muchos
La consecuencia genética del cultivo de anteras en
cultivos. Tal es el caso del arroz, que en 7 - 8 meses
el fitomejoramiento se presenta en la Tabla 2.5
es posible obtener semilla totalmente homocigota,
Actividad Número Aproximado Duración calculada
Selección de progenitores
Cruzamientos
Selección de plantas F1. 25-50 plantas/cruce
3 meses
Cultivo de anteras 100 anteras/frasco; 100 frascos/cruzamiento

(10,000 anteras/cruzamiento)
1.5 meses
Inducción de callos 700-4000 callos/100 anteras

7%-40%
1.5 meses
Regeneración de plantas R1. 50-700 plantas verdes/100 anteras

0.5%, 0.7%
50% R1 son DH 4 meses
Obtención de semilla R2. 25-350 líneas R2/cruzamiento.

(homocigótica)
Evaluación de líneas R2. 5-70 líneas R2 seleccionadas/cruzamiento 6 meses

calidad de grano, tipo de planta, resistencia (aprox. 20% selección)
a enfermedades y tolerancias fisiológicas.
Ensayos de rendimiento con líneas R3.
3-4 años
Ensayos regionales en campos de agricultores con líneas R4
Ensayos comerciales con líneas R5
Liberación de la variedad
Figura 2.6 Procedimiento general para el mejoramiento de arroz mediante el cultivo de anteras. Fuente:
Lentini y colaboradores, 1997.

para plantas autógamas. La determinación del be- traquinonas y fenoles simples o polifenoles, tienen
neficio / costo del cultivo de anteras es un paso ne- de manera característica una distribución limitada.
cesario para la implementación del cultivo de
Un gran número de compuestos químicos impor-
anteras en un programa de mejoramiento (Tabla
tantes desde el punto de vista comercial provienen
2.6).
directamente de plantas y estos incluyen los meta-
Tabla 2.5 Consecuencia genética del cultivo de anteras.
bolitos secundarios. La aplicación de estos pro-
Hibrido Gametos Cultivo de Plantas ductos puede clasificarse en cinco grupos:
Anteras Homocigotas
fármacos, aromas, perfumes, pigmentos y plagui-
cidas.
AB AABB
La importancia biotecnológica de los metabolitos
AaBb aB aaBB
secundarios es triple:
Ab AAbb
1. Puede tratarse de compuestos químicos de valor co-
ab aabb mercial;
2. Algunos de ellos son tóxicos y deben eliminarse de
Tabla 2.6 Análisis de costo-beneficio del cultivo de los alimentos; y
anteras para el mejoramiento de arroz: costo total 3. Podrían actuar como agentes protectores, utilizados
estimado para obtener una variedad de arroz usando el
cultivo de anteras, y comparación con el método de por la planta contra agentes patógenos, insectos y
pedigrí. Fuente: Sanint, y colaboradores, (1.993). animales herbívoros.
Existen dos estrategias generales para la produc-
Costo en Dólares
Método ción a gran escala de metabolitos secundarios ve-
Indica Japonica getales. Éstas estrategias se basan en :
1. Sistemas de fermentadores en el que las células en
Método de pedigrí 203.791 348.483
suspensión crecen libremente hasta una fase esta-
Cultivo de anteras 121.385 195.438 cionaria en un proceso de una o dos etapas. Estas
se cosechan para extraer el producto;
Ahorro respecto al método de pedigrí 82.046 153.044
2. Sistema de células inmovilizadas, en los que las cé-
% de ahorro 29 44 lulas son embebidas o atrapadas en una matriz poli-
mérica inerte, como gel, espuma o cartuchos de
Capacidad de operación óptima 60.000 5.500 fibra hueca. En este último sistema el objetivo es
(número de anteras por semana)
conseguir un proceso de producción continuo o se-
micontinuo, que requiere a su vez que el producto
se libere naturalmente, o que la liberación pueda in-
2 .2 . 3 P roducci ón de meta b o l i t o s ducirse permeabilizando reversiblemente las célu-
s ecundari os us and o c u l ti v o d e las.
t ej i dos
Los metabolitos secundarios son compuestos que
no tienen una función reconocida en los procesos
fisiológicos de los organismos que los sintetizan.
Estos compuestos, entre los que se incluyen los al-
caloides, terpenoides, esteroides, antocianinas, an-

2 .3 Eje r ci ci o 2. 1 E l cul t i vo d e t e j i d o s • Coloque en cada mesa las cuatro especies vege-

v e g e t al es tales recomendadas.
Objetivos • Conforme cuatro grupos de trabajo. Ubique
• Elaborar el concepto de cultivo de tejidos vege- cada grupo en cada una de las mesas de trabajo.
tales y sus aplicaciones. • En cada grupo, los participantes deben indicar:
• Identificar el explante y la técnica de cultivo de a. El cultivo de más difícil propagación por vía
tejidos más adecuada para: convencional;
a. el rescate de germoplasma en vía de extin-
b. El cultivo que podría ser usado como modelo
ción,
para la eliminación de patógenos (virus);
b. la eliminación de patógenos de materiales
c. el cultivo que podría ser usado como modelo
"preciosos",
para propagación masiva;
c. la multiplicación masiva de materiales co-
d. el cultivo que podría ser utilizado como mo-
merciales (flores) y
delo para la producción de plantas haploides.
d. la producción de plantas haploides para ser • En cada caso seleccione el explante y la técnica
utilizadas en mejoramiento vegetal. de cultivo de tejidos más apropiada para cum-
plir con cada uno de los objetivos planteados.
Orientaciones para el instructor
• Elaborar una lista del explante(s) y la técnica(s)
El siguiente ejercicio busca que los participantes de cultivo in vitro seleccionados para cada cul-
seleccionen los explantes y técnicas de cultivo de tivo.
tejidos apropiados para el rescate de germoplasma • Motive una discusión con base a las respuestas
en vía de extinción, la eliminación de patógenos de dadas.
materiales "preciosos", la multiplicación masiva • Proporcione la información de retorno, seña-
de materiales comerciales (flores) y la producción lando los explantes y técnicas de cultivo in vitro
de plantas haploides para ser utilizadas en mejora- más apropiadas en cada cultivo para lograr el
objetivo planteado.
miento vegetal.
Recursos necesarios
Con este ejercicio, se busca que los participantes
• Papelógrafo, papel, marcadores.
fijen el concepto de cultivo de tejidos vegetales y
sus aplicaciones. • Cuatro mesas medianas y un sitio de trabajo.
• Las siguientes plantas en materas pequeñas o en
Para la realización de este ejercicio se recomienda bolsas de plástico: Palma, yuca, rosa, y arroz.
que el instructor lea atentamente las siguientes ins-
• Fotocopia de las instrucciones e información de
trucciones: retorno para los participantes.
• Suministre orientación general sobre los objeti-
Tiempo sugerido: 60 minutos.
vos del ejercicio.
• Ubique cuatro mesas en el sitio de trabajo.

Instrucciones para el participante la oportunidad de construir el concepto de cultivo

de tejidos vegetales.
De acuerdo con la información suministrada en a
• Conformen cuatro grupos de trabajo de acuerdo
Sección 2, y mediante la selección del explante y
con las instrucciones dadas por el instructor.
técnica de cultivo más apropiada para:
• Nombrar un relator por grupo, el cual presenta-
rá en plenaria los resultados obtenidos por el
a. el rescate de germoplasma en extinción, grupo.
• Realizar un listado de los explantes y técnicas
b. eliminación de patógenos en materiales "precio- de cultivo in vitro para cada cultivo, de acuerdo
sos", con su objetivo particular.
• Al final el instructor les proporcionará la infor-
c. la multiplicación masiva de materiales comerciales mación de retorno.
y
d. la producción de plantas haploides para ser usadas

en mejoramiento vegetal, los participantes tendrán
Especie Caso particular Explante (s) Técnica de Producto

Vegetal Seleccionado(s) Cultivo in vitro
Palma
Multiplicación Apices laterales Micropropagación Multiplicación rápida
Yuca
Limpieza clonal por ter- Meristemos Micropropagación Plantas libres de virus
moterapia
Rosa
Propagación masiva Yemas axilares Micropropagación Incremento en la produc-
ción de plántulas
Arroz
Producción de plantas Anteras Cultivo de anteras Producción de plantas ha-
haploides ploides para ser usadas
en un programa de mejo-
ramiento

Bib lio g r af í a
G e o r g e , E .F., an d Sh errrin g to n , P.D . 1984. P l a nt R oc a , W .M . y J a ya s i nghe , U . 1982. E l Cul t i vo de
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Ori g i n a l e s pa r a T r a n sp a r e nc i a s

36
Micropropagación Contribución al
fitomejoramiento
Cultivo de Propagación
Cultivo de Cruces
meristemos masiva
ovulos y interespecíficos
embriones
Ápices y yemas Eliminación de

enfermedades Cultivo de Producción de
anteras haploides
Cultivo de Producción de protoplastos para

suspensión transformación o hibridación somática
celulares
Metabolitos secundarios

CEDAF
CEDAF
Objetivos

• Entender los principios básicos
de las técnicas de cultivo de
tejidos vegetales.
• Conocer algunas aplicaciones de
37
estas técnicas.
38
¿Qué es el Cultivo de Tejidos Vegetales?
Es una técnica que consiste en aislar

una porción de una planta (Tejido,
órgano o célula), llamado explante,
para cultivarlo en un medio nutritivo en
condiciones físicas y químicas
artificiales.

CEDAF
CEDAF
Explante
Callo Organogénesis Embriogénesis

(brotes o yemas, (producción de
raíz adventicia) embriones)
Celulas en
suspensión
Planta
39
40
Utilización de las Técnicas de
• Investigación básica sobre procesos

bioquímicos y morfológicos de la
diferenciación celular.
• Investigación aplicada.
• Desarrollo de técnicas para

propagación clonal o para el
mejoramiento genético de plantas.

CEDAF
CEDAF
Pasos a Seguir en el Cultivo

de Tejidos Vegetales

• Selección y separación del explante.
• Desinfección del explante.
• Siembra en un medio apropiado.
• Cultivar el explante en condiciones

ambientales controladas.
41
42
Aplicaciones del Cultivo de Tejidos Vegetales
1. Micropropagación
• Micropropagación comercial
• Eliminación de virus y otros patógenos
2. Contribución al mejoramiento vegetal
• Rescate de embriones
• Cultivo de anteras para la producción de plantas haploides
3. Producción de metabolitos secundarios

CEDAF
Te c n ol og í a d e l D NA Re c o mb i n a n t e
Sección 3

Sección 3 . Tecno l ogí a de l D N A r e c ombi n an t e
Tabla de Contenido
Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.1 ¿Qué es la Ingeniería Genética? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
3.2 Aspectos Fundamentales y Tecnológicos de la Ingeniería Genética . . . . . . . . . . . 47
3.3 Aislamiento de genes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
3.4 Secuenciación del DNA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
3.5 Ejercicio 3.1 Tecnología del DNA recombinante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

Tecnología del DNA recombinante
Herramientas Clonación y aislamiento

de genes
• Enzimas de restricción
Generación de
• Enzimas modificadoras del DNA
fragmentos de DNA
• Vectores
• Hospederos
Unión de los
fragmentos a un
vector molecular
Introducción del
vector a una célula
hospedante para la
amplificación
Selección de una
secuencia (gen)
específica
Utilizand o Utilizando
“sondas" anticuerpos
específicos
Objetivos
Conocer los fundamentos de la tecnología del DNA recombinante

Describir las herramientas más importantes de esta tecnología.
Conocer algunas de sus aplicaciones.
1. ¿Sabían ustedes que la insulina, hormona que regula los niveles de azúcar en la sangre es producida a nivel in-
dustrial por una bacteria que vive en su intestino?
2. ¿Algún participante puede decir que es la ingeniería genética?
3. ¿Sabían ustedes que pequeños segmentos de DNA pueden ser aislados secuencias modificados y transferidos de
un organismo a otro.?

3 .1 ¿ Q u é es l a I ngeni er í a G en é t i c a ? de resistencia a un antibiótico presente en el plás-

En muchos laboratorios alrededor del mundo, ya es mido vector (Figura 3.1).
una rutina el aislamiento de fragmentos específi-
cos de DNA de un organismo para determinar su
secuencia de bases y utilizar esta información Plásmidio bacteriano
para determinar su función. Lo que es realmente

interesante es que es posible su acceso, a nivel ex- DNA de otro organismo
perimental básico, con muy poco equipo y a un

AAGCTT AAGCTT
TTCGAA TTCGAA
costo relativamente bajo.

Un gen de interés
Ingeniería genética es el término más utilizado

para referirse al conjunto de técnicas involucradas
en la manipulación del material genético (DNA y AGCTT
A
A
T T CGA
RNA). La ingeniería o manipulación genética se

basa en la tecnología del DNA recombinante. b
T T
La tecnología del DNA recombinante básica- G
C A
T
A
A
C
T
mente consiste en aislar segmentos específicos de
G
A
La mezcla hace que los extremos
complementarios se apareen y
DNA (genes) e introducirlos en vectores especia- que la DNA ligasa una estos
extremos
les (plásmidos) para formar moléculas de DNA c
recombinantes. Este proceso es posible gracias a

un grupo de enzimas que permiten la manipula-
ción del DNA, tales como las enzimas de restric-
ción, que reconocen y cortan en sitios específicos Figura 3.1 Principio básico de la tecnología del DNA
recombinante. Fuente: Villée y colaboradores, 1992.
la molécula de DNA, y las ligasas, que sellan per-
manentemente los fragmentos insertados en el vec-
tor. Los vectores recombinantes son introducidos a Hay cuatro áreas principales en las cuales la tecno-
una célula hospedera (generalmente a la bacteria logía del DNA recombinante es de gran utilidad.
Escherichia coli) para el mantenimiento y amplifi- a. Investigación básica de la estructura y función de los
genes.
cación (multiplicación) de las moléculas de DNA
b. Identificación y mapeo de genes
recombinante.
c. Nuevos métodos de producción de proteínas útiles.
El proceso por el cual un segmento específico de d. Producción de plantas y animales transgénicos.
DNA o un gen es amplificado en forma selectiva se
La clonación genética es el aislamiento de una se-
llama clonación. En este caso, el DNA foráneo se
cuencia específica de DNA del genoma. La esencia
inserta in vitro en un plásmido pequeño (por ejem-
de la clonación de genes se puede resumir en las
plo, al plásmido comercial pUC19). El plásmido
cuatro etapas mostradas en la Figura 3.2, cuyo pro-
recombinante se introduce por transformación a
ducto es el aislamiento de una secuencia específica
una célula hospedera (la bacteria E. coli) en la que
de DNA la cual puede ser utilizada para varios pro-
se mantiene mediante selección a través de un gen
pósitos.

Generación de Fragmentos de ADN lizadas en los cromosomas, cuyo principal consti-

tuyente es la molécula del DNA. Los segmentos
de esta gran molécula que codifican las diferentes
características de un individuo se denominan ge-
nes.
Unión de los Fragmentos Los genes de los organismos eucarióticos están
a un Vector Molecular
conformados básicamente de tres regiones: la es-
tructural, la promotora y la reguladora. La región
estructural está constituida por secuencias codifi-
cadoras, llamadas exones y secuencias no codifica-
Introducción del Vector a una Célula Hospedante, doras, denominadas intrones, las cuales son
para la Amplificación removidas del mRNA después de la transcripción.
La región estructural está además flanqueada en
su extremo 5' por un sitio de iniciación de la trans-
cripción y en su extremo 3' por un sitio de termina-
ción. La región promotora contiene secuencias
Selección de una Secuencia Específica específicas que interactúan con varios factores
proteínicos para regular la transcripción, y la re-
Figura 3.2 Las cuatro etapas básicas para la clona- gión reguladora determina cuando el gen debe co-
ción de genes.
menzar a transcribirse. Estos reguladores son de
dos tipos: los amplificadores, que incrementan la
3 .2 A s pect os F undam ent a l e s y velocidad de la transcripción y los silenciadores,
T ecnol ógi cos de l a I n g e n i e rí a que son los que la disminuyen. En la Figura 3.3, se
G enét i ca muestran los componentes más importantes de los
genes de los organismos eucarióticos.
3 .2 . 1 L os áci dos nucl ei c o s
Las características hereditarias que se transmiten
de los parentales a su descendencia se hallan loca-
Potenciador Elementos
cuesta arriba TATA hnRNA
Exón Intrón Exón Intrón Exón
a 100 pares de bases Sitio de

iniciación de
la transcripción
Elementos hnRNA
cuesta arriba TATA Exón Intrón Potenciador Intrón Exón
b Sitio de
iniciación de
la transcripción
Figura 3.3 Componentes de un gen eucariótico. Fuente: Villée y colaboradores, 1992.

El flujo de la información genética es unidireccio- dos estan formados por tres componentes: un azú-
nal: car (2-desoxirribosa para DNA y ribosa para
RNA), un grupo fosfato y una base nitrogenada.
DNA Þ mRNA Þ proteína
Las bases nitrogenadas son de dos tipos: las puri-
El proceso que permite copiar la información ge- nas que presentan doble anillo y se llaman adenina
nética (a través de una molécula intermediaria de- y guanina, designadas por las letras A y G, respec-
nominada mRNA) se llama transcripción, y la tivamente; y las pirimidinas, que presentan un
conversión de la información genética en el pro- solo anillo, y se llaman timina, citosina y uracilo,
ducto final (una proteína) se denomina traduc- designados por las letras T, C y U, respectivamen-
ción. Este concepto del flujo de la información ge- te. La timina no se presenta en el RNA, en su lugar
nética es conocido como el Dogma Central de la se encuentra el Uracilo.
Biología. Dos excepciones que se deben agregar
La estructura del DNA tiene la forma de una doble
al dogma central de la biología son los siguientes:
hélice, donde las bases nitrogenadas se hallan en el
1. La duplicación de material genético, que ocurre an-
interior. Cada base se aparea con la base de la ca-
tes de la división celular, representada como DNA ⇒
DNA, se denomina replicación y dena complementaria a través de puentes de hidró-
2. La información genética de algunos organismos, geno (H), que unen a la A con la T mediante dos
como los retrovirus, se halla codificada en la molécu- puentes de hidrógeno y a la G con la C mediante
la de RNA en vez de DNA. Estos virus contienen tres puentes.
una enzima llamada transcriptasa reversa que pro-
duce una molécula de DNA de doble cadena a partir Hay tres tipos de moléculas de RNA en las células:
de la cadena simple del RNA genómico. En este caso RNA mensajero (mRNA), RNA ribosomal (rRNA
el flujo de la información genética será en "reversa",
comparado con la convención normal, de modo que
) y RNA de transferencia (tRNA). El rRNA es el
el dogma central completo de la biología se esque- más abundante de los tres (85% del RNA total) y
matiza en la Figura 3.4. está asociado con los ribosomas, que son parte
Los ácidos nucleicos son conglomerados en forma esencial de la maquinaria de traducción. El tRNA
de cadena (heteropolímeros) formados por unida- (10% del RNA total) se encarga de insertar ami-
des (monómeros) llamadas nucleótidos; por esta noácidos siguiendo un orden codificado por el
razón una cadena de ácido nucleico se le conoce mRNA. El mRNA (5% del RNA total), actúa
como un polinucleótido. Las unidades o nucleóti- como transportador de la información genética
Transcripción Traducción
Replicación D NA mRNA PRO TEINA

Transcripción
Reversa
Figura 3.4 El dogma central de la biología.

desde el DNA hasta el sitio de traducción (los ribo- La mayoría de las enzimas de restricción usadas en
somas), cuyo producto final son las proteínas. ingeniería genética presentan un modo de acción
relativamente simple. Estas enzimas son nuclea-
El arreglo lineal de la secuencia de aminoácidos de
sas y como cortan una sección interna del DNA
una proteína está determinado por la secuencia de
son denominadas endonucleasas de restricción.
bases en el mRNA, cuyo orden es especificado por
el DNA, de donde se copió o transcribió.
Una secuencia de tres bases que codifica para un
aminoácido se llama un codon. Como hay cuatro a)
G-A-A-T-T-C
bases diferentes entonces existen 64 codones posi- C-T-T-A-A-G
bles para los 20 aminoácidos esenciales diferentes.
Eco RI
Tres de esos codones son utilizados como señales
G A-A-T-T-C
de terminación de la traducción, el resto correspon- C-T-T-A-A G
de a los aminoácidos. Por ejemplo, hay seis codo-
nes para leucina, cuatro para treonina, uno para
b) G-A-A-T-T-C
metionina, uno para triptofano, etc.
C-T-T-A-A-G
El ingeniero genético necesita cortar y unir seg-
DNA Ligasa
mentos de DNA de diferentes fuentes (Figura 3.1).
G-A-A-T-T-C
Además, es necesario realizar ciertas modificacio-
nes en el DNA en la diferentes etapas requeridas C-T-T-A-A-G
para producir, clonar e identificar moléculas de

DNA recombinante. Las herramientas que hacen
Figura 3.5 Enzimas que cortan y ligan moléculas
posible todas esas manipulaciones son enzimas. de DNA. a) La enzima de restricción EcoRI reco-
Algunas de estas enzimas utilizadas en la ingenie- noce y corta en la secuencia GAATTC, generando
ría genética, son las siguientes : segmentos con extremos pegajosos. b) En condi-
ciones apropiadas, los segmentos con extremos
pegajosos complementarios se realinean y los
3 .2 . 2 L as enzi mas de res t r i c c i ó n cortes son reparados con la enzima DNA Ligasa.
Fuente: Astec, 1993.
Las enzimas de restricción permiten cortar el DNA
de doble cadena por sitios específicos o secuencias
de reconocimiento (Figura 3.5). Estas enzimas son La nomenclatura para nombrar las enzimas de res-
extraídas de bacterias, en donde funcionan como tricción se basa en algunas convenciones: Por
parte de un mecanismo de protección de la bacteria ejemplo,
contra la invasión de DNA extraño. Para prevenir Hind III: Se refiere a la tercera enzima de restricción
la digestión o la hidrólisis del DNA de la propia cé- caracterizada de la cepa Rd de la bacteria
Haemophilus influenzae.
lula, una enzima (una metilasa) que modifica el
EcoRV Se refiere a la quinta enzima de restricción
DNA de la célula, metilando ciertas bases de la se- caracterizada de la cepa RY13 de la bacteria
Escherichia coli
cuencia de reconocimiento, lo cual evita que la en-
zima de restricción corte su propio DNA.

Cada enzima de restricción reconoce una secuen-

cia específica de pares de bases en la molécula de
DNA, siendo las secuencias más comunes las de
cuatro, cinco o seis pares de bases.
3 .2 .3 O t ras enzi mas i mport a n t e s

p ara l a i ngeni erí a gené t i c a
DNA Ligasas
Estas enzimas catalizan la formación de enlaces
entre dos nucleótidos contiguos en una cadena de
DNA de doble banda, por lo que uno de los usos de
esta enzima es para reparar "huecos" en una de las Figura 3.6. Replicación del DNA, antes de la di-
bandas del DNA. Esta enzima también se usa para visión celular. Las dos cadenas del DNA se se-
paran y sirven de moldes para la síntesis de dos
unir fragmentos en un vector de clonación, origi- nuevas cadenas. Fuente: Astec, 1993.
nando un vector recombinante (Figura 3.5).
La Taq polimerasa
DNA Polimerasas Es una DNA polimerasa extraída de la bacteria

Thermus aquaticus, que habita en los baños terma-
Estas enzimas son las que permiten la formación les. Por esta razón, esta enzima no pierde su activi-
de cadenas (polímeros) de DNA, como se puede dad catalítica cuando se incuba a una temperatura
apreciar en la Figura 3.6. La síntesis es exclusiva- de 94oC. Debido a esta propiedad la Taq polimera-
mente en la dirección 5' ⇒ 3' con respecto a la ban- sa es utilizada en la técnica de la Reacción en Ca-
d a q u e s e es t á s i nt et i za n d o . C a d a dena de la Polimerasa (PCR) utilizado para la
desoxirribonucleótido que es incorporado durante multiplicación in vitro de DNA a partir de poca
la polimerización es complementario al de la ban- cantidad de éste.
da molde (dA es complementaria a dT y dG es
complementaria a dC). 3 . 2 . 4 V e c to r g e n é t i c o
La transcriptasa reversa Un vector genético es una molécula pequeña de
DNA con un origen de replicación autónomo y que
Es una DNA polimerasa que forma polímeros de
posee zonas que no son esenciales para su multipli-
DNA de cadena sencilla usando como molde una
cación. Al eliminar estas regiones, éstas pueden
cadena de RNA. Esta enzima es utilizada para sin-
ser reemplazadas por DNA foráneo. Estos vecto-
tetizar cadenas de DNA a partir mRNA en el pro-
res actúan como portadores y multiplicadores de
c e s o d e pr oducci ón de cD N A ( D N A
DNA exógeno, cuando el vector se replica dentro
complementario), paso importante en la construc-
de la célula hospedera. En general, el DNA del
ción de bancos de cDNA, los cuales son muy úti-
vector es fácilmente separable del DNA genómico
les para el aislamiento de genes de interés.

del hospedero, pudiéndose obtener buenas cantida- Dos vectores plasmídicos comúnmente utilizados
des del DNA exógeno insertado en el vector. son el plásmido pBR322 y el plásmido pUC19 (Fi-
gura 3.7).
Los vectores más comúnmente utilizados en inge-
niería genética son algunos plásmidos de Escheri- 3.2.6 Hospederos
chia coli y el bacteriófago Lambda (l).
Un hospedero ideal debe ser de fácil manipulación
3 .2 . 5 L os pl ás mi dos y propagación. Debe estar disponible en un amplio
rango de cepas definidas genéticamente, y debe
Los plásmidos son pequeñas moléculas circulares
aceptar un amplio rango de vectores. La bacteria
de DNA de doble banda, que están presentes en al-
Escherichia coli reúne todos estos requisitos, por
gunas bacterias como elementos extracromosoma-
lo cual es utilizada en muchos protocolos de clona-
les. Los plásmidos confieren a sus hospederos
ción.
bacterianos una variedad de características fenotí-
picas que no son necesarias para su reproducción, La entrada de un vector al interior de un hospedero
pero que pueden conferirle alguna ventaja, como se denomina transformación cuando el vector es un
por ejemplo, la resistencia a un antibiótico. plásmido o transfección si el vector es un fago
Para que un plásmido pueda ser utilizado como como el fago λ.
vector en ingeniería genética debe poseer las si-
guientes propiedades:
a. Tener una replicación autónoma
en la célula hospedera;
EcoO 109 2674
b. Conferirle a la célula hospedera Aatll 2617 396
resistencia a uno o varios antibio- Sspl 2501
Ndel 183
EcoRl
Narl 235
ticos, para identificar aquellas Sacl
bacterias que lo contienen; Xmnl 2294 Kpnl

Smal Xmal
c. Poseer una región con secuencias lac´z BamHl
Scal 2177
de reconocimiento y corte único Xbal
Plac Hincl
para varias enzimas de restric- Pstl
ción de manera que sea inactiva- Hindll
do en los eventos de inserción del amp´

pUC19
´lacl
DNA exógeno, permitiendo la 2686bp 447
selección de los plásmidos re-

combinantes; Gsul 1784
Afllll 806
ori
Cfr10l 1779
d. Desde el punto de vista de biose-
Ppal 1766
guridad, los plásmidos usados
como vectores no deben ser
transmisibles ni móviles, y deben 400 420 440 460
tener hospederos específicos que AGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCAT
sólo sobrevivan en medios de EcoRI Sacl Kpnl

Smal
BamHi Xbal Hincll
Accl
Pstl Sphl Hin dlll
lacZ´ ThrlleMetThr(Met)
cultivos específicos. Xmal Sail
Figura 3.7 Mapa de un vector comercial (el plásmido pUC19).

Fuente: Ausubel y colaboradores, 1988.

Algunos vectores comerciales como los plásmidos En un banco genómico están presentes todas las se-
de la serie pUC, presentan una región de clona- cuencias del DNA genómico, como son los exo-
miento múltiple (polilinker) dentro de la secuencia nes, los intrones, y secuencias regulatorias. El
que codifica por la subunidad alfa de la enzima be- número de clones requeridos para tener un banco
ta-galactosidasa, la cual se complementa con otra genómico completo depende del tamaño del geno-
subunidad codificada en el cromosoma del hospe- ma de la planta y del tipo de vector de clonaje utili-
dero, para formar la enzima activa. La enzima be- zado.
ta-galactosidasa actúa sobre el sustrato X-gal,
Los pasos básicos que se siguen para la construc-
liberando el colorante azul índigo, tiñendo de azul
ción de un banco genómico son los siguientes: (Fi-
las colonias bacterianas que expresan la enzima.
gura 3.8).
Cuando se inserta un segmento de DNA foráneo en
• Aislamiento de DNA genómico de alta calidad
la región de clonamiento múltiple del vector, se
y de alto peso molecular.
inactiva la enzima y las colonias bacterianas pre-
• Digestión con una endonucleosa de restricción.
sentan su color blanco natural. Esta estrategia
• Separación de los fragmentos por electroforesis
ofrece la posibilidad de identificar rápidamente las
o por cromatografía de columna.
colonias con plásmidos recombinantes a través de
• Selección de fragmentos del tamaño deseado.
esta sencilla prueba.
• Unión de los fragmentos a un vector.
3 .3 Aislam i ent o de genes • Introducción del vector a un hospedero, para la
Uno de los principales usos de la tecnología del multiplicación de los vectores recombinantes.
DNA recombinante es el aislamiento y clonación
de genes de interés de un organismo. Sin embargo,
esta tarea es más complicada cuando se trata de ais-
lar genes de organismos complejos, como son los DNA Genómico
animales y plantas. Fragmentos de Restricción
Existen algunas estrategias para aislar un gen espe-

Separación por Electroforesis
cífico de entre los miles presentes en el genoma ve-
getal. Primero, hay que construir un banco de
"genes", ya sea un banco genómico o un banco de
Electroclución
cDNA y seguir procedimientos específicos para

Fragmentos de
aislar el gen de interés de los bancos de genes. 500-3000 bp
Lac Z
3 .3 .1 Ba nco de D N A genómi c o
Lac Z
AMP
Plásmidio AMP
Un banco genómico es una colección de vectores

Plásmidio
Abierto
recombinantes (en un hospedero como E. coli ) que Bacteria Competente
contienen segmentos de DNA, los cuales represen- Selección de

Colonias con Insertos
tan el genoma del organismo.
Figura 3.8. Pasos básicos para la construcción de

un banco de DNA genómico.

3 .3 . 2 B anco de cD N A se aislan los vectores recombinantes portadores de

Un banco de cDNA es una colección de vectores las secuencias presentes en cada uno de los ban-
recombinantes que contienen cDNAs de todos los cos.
mRNAs presentes en un tejido o célula, en un de-
3 . 3 . 3 Id e n t i f i c a c i ó n y a i s l a m i e n t o
terminado estado de desarrollo, y en condiciones
de genes
de crecimiento definido.
Existen varios métodos para la identificación y
En un banco de cDNA no están representados to- aislamiento de secuencias de genes específicas, a
dos los genes de un organismo, pues la proporción partir de un banco genómico o de cDNA :
de cada tipo de cDNA particular depende de: 1. Hibridación de ácidos nucleicos, utilizando sondas
a. Los genes expresados al momento de la toma de la construidas a partir de una secuencia parcial de la
muestra; proteína codificada por el gen (Figura 3.9).
b. Los genes expresados en el tejido utilizado par ex- 2. Utilizando anticuerpos específicos que pueden de-
traer el mRNA y, tectar la presencia del producto génico (proteína).
c. La abundancia relativa de los
mRNAs del tejido seleccio-
nado.
Colonias de un banco de cDNA
Los pasos básicos para la Transferencia de las colonias a una
construcción de un banco de membrana de nylon
cDNA son los siguientes:

• Aislamiento del RNA to- Lisis de la
bacteria y liberación
tal del tejido selecciona- del DNA
do.
Las cadenas de DNA
• Aislamiento del mRNA . Membrana
se separan y se ligan
a la membrana
sumergida en
• Síntesis del cDNA . solución alcalina
• Adición de adaptadores
al cDNA .
Sonda radioactiva
• Unión de los cDNA al
vector. Membrana La sonda radioactiva se
sumergida en una
• Introducción del vector solución con la
sonda radioactiva
hibridiza a una secuencia
complementaria en la
recombinante a un hospe- membrana de nylon
dero para la multiplica-

ción de los vectores Autorradiografía
recombinantes.
Película fotográfica
Los dos tipos de bancos (ge- colocada sobre la
membrana de nylon
nómico y de cDNA) son in- Identificación de la colonia con

c re ment ados en cepas el "gen" en la caja madre
bacterianas especiales. De
éstas se pueden aislar colo-
nias; y en su turno, de éstas Figura 3.9 Aislamiento de un gen a partir de un banco de DNA genómico.

3 .4 S e c uenci aci ón del D N A Existen dos técnicas para secuenciar segmentos de

Cuando se ha aislado un gen de interés es necesario DNA:
conocer la secuencia lineal de sus nucleótidos para 1. El método enzimático (Método de Sanger) y,
estudios sobre la estructura génica y las secuencias 2. El método químico (Método de Maxam y Gilbert).
que controlan su expresión. Este conocimiento El método más utilizado es el método enzimático
además permite la modificación necesaria para que (Figura 3.10). Este método consiste en sintetizar
dicho gen pueda ser transferido y expresado en una cadena complementaria a una cadena molde
otro organismo. que se quiere secuenciar, de tal forma que el creci-
miento de la cadena complementaria se puede de-
O
tener en posiciones específicas, lo cual se logra
O= P =O
utilizando compuestos análogos a los cuatro deso-
O xinucleótidos (dNTPs) que conforman la molécula
O= P =O
NH2
de DNA. Estos compuestos análogos son denomi-
O nados dideoxinucleótidos (ddNTPs).
N
O= P =O
La alta resolución de esta técnica permite separar
O
CH2 N
por tamaño segmentos de DNA que se diferencian
N
O
Trifosfato de
didesoxiadenosina
en tan sólo un nucleótido. La secuencia del frag-
(ddATP)
H H
(a) Grupo 3´ desoxi Fragmento de la cadena sencilla de DNA cuya secuencia se determinará
5´
A T G C T A T G C T C C
400
Todas las mezclas de reactivos contienen 350
dATP, dTTP, dGTP y dGTP y DNA polimerasa 300
250
200
(b)
150
+ddATP +ddCTP +ddGTP +ddTTP
Fragmentos
Mayores
ddA ddC ddG ddT
T 100
5´
A
A T G C T A T G C T C C C
dd A C G A T A C G A G G G
A
ddA T A C G A G G T
A 75
ddA C G A G G C
G
ddA G G
A
G
G 50
Sentido de la
síntesis Fragmentos GCAT
Menores
Productos de la reacción
(c) en la mezcla con (d) (e)
dideoxiATP
Figura 3.10 Secuenciación de segmentos de DNA por el método enzimático.

Fuente: Villée y colaboradores, 1998.

mento de DNA analizado se puede determinar de rentes de DNA en pocas horas. Dado que la resolu-
un modo directo mediante lectura del gel, visuali- ción de esta tecnología llega hasta un solo
zando las bandas que aparecen escalonadamente nucleótido, la secuenciación se ha convertido en la
leyendo el gel de abajo hacia arriba los cuatro "ca- forma más precisa de medir la variabilidad y diver-
rriles" de la autorradiografía. sidad genética. La masificación también ha redu-
cido significativamente el costo de la
Actualmente existen secuenciadores automáticos
secuenciación.
que permiten secuenciar hasta 96 muestras dife-
3 .5 E j er ci ci o 3. 1 T ecnol o g í a d e l D N A • Conforme cuatro grupos de trabajo. Ubique

r ecom bi nant e cada grupo en cada una de las mesas de trabajo.
Objetivos • En cada grupo, los participantes deben analizar
• Desarrollar el concepto de DNA recombinante. e interpretar los diagramas de los patrones elec-
troforéticos y responder las siguientes pregun-
• Analizar e interpretar los patrones electroforé-
tas:
ticos: a) de un segmento de DNA digerido con
dos enzimas de restricción; y b) de un plásmido a. Los sitios de reconocimiento y de corte de las
recombinante, digerido con una enzima de res- enzimas de restricción EcoRI y Hind III en el
tricción. segmento de DNA son los mismos o diferentes.
Orientaciones para el instructor Explique.
El siguiente ejercicio consiste en el análisis de dia- b. ¿Cuántos sitios de reconocimiento y de corte
gramas con muestras de un segmento de DNA dise presentan en el segmento de DNA para cada
gerido con dos enzimas de restricción y un una de las enzimas de restricción del ejercicio?
diagrama de electroforesis de un plásmido sin in-
c. ¿Por qué el segmento de DNA sin digerir mi-
serto, con inserto y de un plásmido recombinante
gra poco? Explique.
digerido con la enzima de restricción EcoRI. En
este ejercicio se busca que los participantes fijen el d. ¿Por qué el plásmido pUC19:
concepto de DNA recombinante y sus aplicacio- - Sin inserto,
nes.
- con inserto y
- con inserto y digerido con EcoRI presentan di-
que el instructor lea cuidadosamente las siguientes
ferente patrón de bandas? Explique.
instrucciones:
• Suministre orientación general sobre los objeti- e. Haga un dibujo de un gel que presenta las si-
vos del ejercicio. guientes muestras.
• Ubique cuatro mesas en el sitio de trabajo. 1. Plásmido pUC19 sin inserto.
• Colocar en cada mesa un juego de los diagra-
mas de los geles suministrados. 2. Plásmido pUC19 con un inserto de 1Kb.
3. Plásmido pUC19 con inserto de 2Kb

4. Un inserto de 1Kb a. Los sitios de reconocimiento y de "corte" de

las enzimas de restricción EcoRI y Hind III en
5. Un inserto de 2Kb
el segmento de DNA son los mismos o diferen-
• Motive una discusión a base de las respuestas
tes. Explique.
dadas.
• Proporcione la información de retorno, con las b. ¿Cuántos sitios de reconocimiento y de "cor-
respuestas de este ejercicio. te" se presentan en el segmento de DNA para
Recursos necesarios cada una de las enzimas de restricción del ejer-
• Papelógrafo, papel, marcadores. cicio?
• Cuatro mesas medianas y un sitio de trabajo. c. ¿Por qué el segmento de DNA sin digerir mi-
• Diagramas de los patrones electrofréticos : gra poco? Explique.
a. de un segmento de DNA digerido con EcoRI d. ¿Por qué el plásmido pUC19:
y Hind III, (Figura 1) y - Sin inserto,
b. de un plásmido recombinante digerido con - Con inserto y
EcoRI (Figura 2).
- Con inserto y degerido con EcoRI presen-
• Fotocopias con las Instrucciones e información
de retorno para los participantes. tan diferente patrón de bandas? Explique.
Tiempo sugerido: 60 minutos. e. Haga un dibujo de un gel que presenta las si-
guientes muestras.
1. Plásmido pUC19 sin inserto.
De acuerdo con la información suministrada en la 2. Plásmido pUC19 con un inserto de 1Kb.
sección 3 y mediante el análisis e interpretación de 3. Plásmido pUC19 con inserto de 2Kb
los diagramas de geles con un segmento de DNA 4. Un inserto de 1Kb
5. Un inserto de 2Kb
digerido con las enzimas de restricción EcoRI y
Hind III y del gel con el plásmido pUC19: • Al finalizar el Instructor les proporcionará la in-
formación de retorno.
a. sin inserto,
b. con inserto y Respuestas a las preguntas del ejercicio.
c. con inserto y digerido con Eco RI, los participantes Para la pregunta a
deberán desarrollar el concepto de DNA recombi-
nante. Son diferentes.
Pasos a seguir • Primero, porque el número de fragmentos ge-
nerados con EcoRI son 3, mientras que con
• Conforme cuatro grupos de trabajo de acuerdo
Hind III son 4.
con las instrucciones dadas por el Instructor.
• Segundo, porque el tamaño de los fragmentos
• Nombrar un relator por grupo, el cual presenta-
generados con cada una de las enzimas son di-
rá en plenaria las respuestas dadas por el grupo.
ferentes.
• Analizar e interpretar los diagramas suminis-
trados y contestar las siguientes preguntas.

Para la pregunta b
Hay 2 para EcoRI y 3 para Hind III.
Para la pregunta c
El segmento de DNA sin digerir es un DNA de
gran tamaño y la migración en el gel (en la electro-
foresis) es proporcional al tamaño. Fragmentos
grandes migran poco, fragmentos pequeños mi-
gran mucho.
Para la pregunta d
El plásmido pUC19 sin inserto tiene un tamaño de
≈3Kb, el plásmido pUC19 con un inserto de 1Kb
tiene un tamaño de 4 Kb y el plásmido pUC19 con
un inserto de 1 Kb digerido con EcoRI libera el in-
serto, presentando 2 segmentos de DNA uno del
plásmido de ≈3 Kb y el otro que corresponde al in-
serto de 1 Kb.
En una electroforesis migración así:
1. pUC19 (abierto)
2. pUC19 + I (1 Kb)
3. pUC19 + I (1 Kb)
digerido con Eco RI.
Segmento de DNA de 25 kb. 1) Sin digerir. 2) Dige-

rido con EcoRI y 3) Digerido con Hind III.
Para la pregunta e
1. pUC19
2. pUC19 + I (1 Kb)
3. pUC19 + I (2 pK)
4. Inserto (1 Kb)
Plásmido pUC19. 1) sin inserto, 2) con un sinderto
5. Inserto (2 Kb) de 1 kb, y 3) con inserto de 1 kb y digerido con Eco-
RI.
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Ori g i n a l e s pa r a T r a n sp a r e nc i a s

60
Tecnología del DNA recombinante
Herramientas Clonación y aislamiento

de genes
• Enzimas de restricción
Generación de
• Enzimas modificadoras del DNA

fragmentos de DNA
• Vectores
• Hospederos
Unión de los
fragmentos a un
vector molecular
Introducción del
vector a una célula
hospedante para la
amplificación
Selección de una
secuencia (gen)
específica
Utilizando Utilizando
“sondas" anticuerpos
específicos

CEDAF
CEDAF
Objetivos

• Conocer los fundamentos de la
tecnología del DNA recombinante
• Describir las herramientas más

importantes de esta tecnología.
• Conocer algunas de sus aplicaciones.
61
62
¿Qué es la Ingeniería Genética?
Es el conjunto de técnicas involucradas en la

manipulación del material genético (DNA o RNA), la
cual se basa en la tecnología del DNA recombinante.
En DNA recombinante consiste en aislar segmentos
específicos de DNA para introducirlos en vectores
(plásmidos)a fin de formar molé
culas de DNA recombinantes que son introducidas
por transformación a un hospedero (E. Coli) para el
mantenimiento y amplificación del DNA
recombinante.

CEDAF
CEDAF
Utilización del DNA Recombinante
Investigación básica (estructura y función

de los genes).
Identificación y mapeo de genes.
Producción de Enzimas y proteínas por

clonación de genes.
Producción de animales y plantas

transgénicas.
63
64
Etapas Básicas para la
Clonación de Genes
Generacion de fragmentos
de ADN
Unión de los fragmentos

a un vector molecular
Introduccion del vector a una célula

hospedante, para la amplificación
Selección de una secuencia específica

CEDAF
CEDAF

El Dogma Central de la Biología

Transcripción
Reversa
65
66
Herramientas de la Ingeniería
Genética
• Las enzimas de restricción
• Las enzimas modificadoras del DNA
• Los vectores
• Los hospederos

CEDAF
CEDAF
Pasos para el Aislamiento de Genes

1 Construcción de un banco del cDNA.
2 Identificación y aislamiento de genes de un banco de cDNA.
• Utilizando “Sondas” construidas a partir de una secuencia

parcial de la proteína codificada por el gen.
• Utilizando anticuerpos específicos que pueden detectar la
presencia del producto génico (proteina).
67

Ma rc a d o r e s Mo l e c u l a r e s
Sección 4

Sección 4 . Marc ador e s Mol e c u l ar e s
Tabla de Contenido
Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
4.1 El genoma y la variabilidad genética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
4.2 Los marcadores moleculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
4.3 Breve reseña de algunos marcadores moleculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
4.4 Ejercicio 4.1 Marcadores moleculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
Originales para transparencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

Marcardores Molecurales
• Caracterizac ión y análisis

de la variabilidad genética
• Identificación de acervos RFLPs
genéticos Microsatelites
RFLPs
Microsatelites
Mapeo de genes cualitativos y RAPDs
cuantitativos
Selección asistida por
marcadores moleculares Microsatelites
Estrategias de fitomejoramiento
Identificación y transferencia de RFLPs
QTLs de germoplasma silvestre
RFLPs
Introgresión de transgenes Microsatélites
Majoramiento asistido por
marcadores moleculares RFLPs
RFLPs
Clonación de genes con base a
Microsatélites
mapas genéticos
AFLPs
Objetivos
• Entender los principios básicos de los marcadores moleculares.

• Conocer algunas de sus aplicaciones en el mejoramiento vegetal.
1. ¿Sabían ustedes que cada uno de nosotros tiene un huella digital a nivel molecular llamada DNA fingerprin-
ting?
2. ¿Algún participante puede dar una definición de genoma?
3. ¿Sabían ustedes que los marcadores moleculares nos permiten detectar cualquier cambio en los genomas de los
individuos y nos permite diferenciar individuos idénticos fenotipicamente?

In tro d u c ci ón gran utilidad en el desarrollo de los primeros siste-

El estudio de la diversidad genética y la relación mas de clasificación y las primeras versiones de
entre y dentro individuos de especies animales y mapas genéticos. Los marcadores moleculares sin
vegetales es un tema de mucho interés no sólo para embargo, permiten realizar la caracterización y
los mejoradores sino también para otras disciplinas evaluación directa de los genomas de los indivi-
biológicas, incluyendo ecología, medio ambiente y duos.
biodiversidad. Un marcador molecular es un segmento específico
La evaluación de la variabilidad genética entre in- de DNA correspondiente a regiones codificantes o
dividuos de una misma especie puede realizarse no codificantes del genoma y cuya secuencia pue-
mediante el uso de marcadores morfológicos (fe- de o no ser conocida.
notipo), marcadores bioquímicos (isoenzimas) y El objetivo de esta sección es presentar en forma
marcadores moleculares basados en el DNA (ge- didáctica los principios y usos de los marcadores
notipo). Los dos primeros permiten realizar el es- moleculares, más utilizados. En las Tablas 4.1 y
tudio indirecto del genoma, ya que ambos son 4.2 se presenta un análisis comparativo de las ca-
producto de la expresión génica. Estos fueron de
Tabla 4.1 Análisis comparativo de los principales marcadores moleculares utilizados para el análisis genético de
plantas. Fuente: Ferreira y Grattapaglia, 1995.
Variable RFLPs RAPDs Microsatélites AFLPs

Modo de observación del Fragmentos de restricción Segmentos de DNA Ampliación específica de Segmentos amplificados vía
polimorfismo de DNA detectado por amplificados regiones con secuencias PCR después de digestión con 2
hibridización con una sonda aleatoriamente repetitivas. enzimas de restricción
de DNA genómico o de
DNA
Expresión genética Co – Dominante Dominante Co – Dominante Dominante
Número de alelos por locus Multialético 2 alelos (binarios) Altamente Multialético 2 alelos (binario)
Disponibilidad de marcadores Prácticamente ilimitada Prácticamente ilimitada Prácticamente ilimitada Prácticamente Ilimitada
en el genoma
Distribución en el genoma Regiones con bajo número Más o menos en todo el Más o menos en todo el Más o menos en todo el
de copias; mediante genoma genoma genoma
repetitivas en telomeros y
centromeros (minisatelite)
Transferencia de la ocurrencia Intra – específica; alta para Intra– poblacional; media Intra – específica; baja para Intrapoblacional y media
de los marcadores especies próximas Intra – específica especies próximas intraespecífica
Pasos para su detección. · Extracción de DNA · Extracción del DNA · Extracción del DNA · Extracción de DNA
· Digestión con Enzima de . Amplificación vía PCR · Amplificación específica vía · Digestión con EcoRI y MseI
restricción · Electroforesis (agarosa) PCR · Ligación de adaptadores
· Electroforesis (agoniza) · Tincion con bromuro del · Electroforesis en gel de · Amplificación vía PCR
· Transferencia membrana etidio poliacrilamida o agarosa · Electroforesis (acrilamida)
Nylon · Visualización de bandas · Autorradiografía o · Autorradiografía.
· Hibridación con sonda con luz U.V coloración con bromuro del
· Autorradiografía etidio.
Información previa para la Construcción de banco de Utilización inmediato de · Construcción de banco de · Ensayos de combinaciones de
aplicación de la técnica DNA genómico o de cDNA “Primers” arbitrarios DNA genómico enzima / primers con bases
de la especie para obtención disponibles en el · Selección de clones con arbitrarias adecuados.
de las sondas mercado. microsatélites adecuados
· Secuenciación de los clones.
· Construcción de los primers
· Ensayo del polimorfismo
con estos primers
Accesibilidad Media Muy alta Muy baja Media
Costo de implementación / Medio / medio Bajo / bajo Muy alto / medio Bajo / bajo
costo de operación

Telómero
racterísticas de los cuatro principales marcadores
moleculares utilizados en el mejoramiento genético Satélites Variables
de plantas.
Tabla 4.2 Análisis de la eficiencia de los marcadores
moleculares en diferentes aplicaciones del análisis gené- rDNA
tico. Fuente: Ferreira y Grattapaglia (1995).
RFLPs RAPDs MICRO- AFLPs
SATELITES Genes
Identificación de Alta Muy Muy alta Muy alta
genotipos alta Repeticiones en Tandem
Evaluación de Alta Alta Alta Muy alta Centrómero

germoplasma
Mapeo genético Alta Alta Muy alta Alta
Mapeo direccionado Media Muy Media Muy alta

a regiones alta
específicas
Mapeo comparativo Muy Baja Alta Baja
alta Genes
Genética de Media Alta Muy alta Muy alta
autógamas
Genética de Muy Muy Muy alta Muy alta
alógamas alta alta
Análisis filogenético Muy media Alta Media

Telómero
alta
Figura 4.1 Distribución de la información en un cro-
4 .1 E l genom a y l a var i a b i l i d a d g e n é t i c a mosoma. Fuente: Tohme, J., (Comunicación perso-
nal, 1998)
El término genoma se refiere al contenido genético
GEN GEN
total de un organismo. En las plantas el genoma está
constituido por el contenido genético nuclear y orga-
nelar (mitocondrias y cloroplastos). Sin embargo, el
término genoma casi siempre se utiliza para referirse
a la información genética presente sólo en el genoma
nuclear. Los cromosomas de las plantas contienen
una gran cantidad de DNA y su organización es muy
compleja (Figura 4.1). Presenta regiones codifican-
tes (genes) separados por largas regiones de DNA no
codificante; éstas a su vez estan formadas por blo- DNA DNA DNA
Flanqueador Codificante Flanqueador
ques de secuencias repetitivas denominadas VNTRs
Figura 4.2 Organización del DNA en el cromosoma.
(del inglés variable number of tandem repeats), que El DNA en el cromosoma está organizado en genes y
fueron identificados por primera vez en el genoma DNA espaciador. El DNA espaciador adyacente a los ge-
nes se llama DNA flanqueador.
humano. Además dentro de las regiones codificantes El DNA codificante, codifica para proteínas y el DNA
flanqueador regula la expresión de los genes. Por ejem-
(genes) hay pequeñas regiones no codificantes (Intro- plo:
nes), que también están formadas por secuencias re- · Secuencias de Iniciación
· Secuencias de terminación
petidas (Figura 4.2). · Promotores
· Activadores
· Silenciadores

Existen además copias de genes no funcionales En 1959, Market y Moller mostraron diferencias
(seudogens) que son incapaces de expresarse debi- genéticas usando cambios en la tasa de migración
do a deleciones u otras alteraciones en su secuen- de isoenzimas a través de un gel de almidón, en un
cia. En resumen, los genes de los organismos campo eléctrico (electroforesis).
eucariotes pueden presentarse como copia única o
Estos marcadores (morfológicos y bioquímicos)
como copias múltiples organizados en familias de
fueron útiles para la construcción de los primeros
genes, o dispersos en los diferentes cromosomas.
mapas genéticos de algunos organismos en la dé-
Durante la división celular cada organismo repro- cada del 70. Sin embargo, estos marcadores pre-
duce una copia fiel de su genoma. Sin embargo, sentan algunos inconvenientes para una buena
existen muchos mecanismos que pueden causar al- evaluación del genoma de un organismo:
teraciones en el DNA durante la evolución y se- a. Un reducido número de marcadores que no permite
lección natural y / o artificial. Los cambios pueden hacer un buen cubrimiento del genoma;
ser simples, es decir que afectan sólo un par de ba- b. Efecto ambiental en la expresión de ellos;
ses (mutación puntual); o grandes cambios como c. "Enmascaramiento" de la expresión de los genes
recesivos;
resultado de inversiones, translocaciones, delecio-
nes o transposiciones. Si a esto le sumamos los in- d. Efectos epistáticos, etc.
tercambios genéticos que ocurren en los procesos Con el descubrimiento de las enzimas de restric-
de recombinación, durante la reproducción sexual, ción, el desarrollo de las técnicas del DNA recom-
resulta una gran variabilidad en las secuencias de binante, y de la técnica de PCR (Reacción en
los genomas de los individuos. Esta variabilidad cadena de la polimerasa), se desarrolla una nueva
es aprovechada en el mejoramiento genético de clase de marcadores, denominados marcadores
plantas y animales; y es fuente de genes para la moleculares, los cuales son el objetivo de esta sec-
biotecnología. ción.
La variabidad genética puede ser detectada de di- 4 . 2 L o s m a rc a d o re s m o l e c u l a r e s

ferentes maneras:
Los marcadores moleculares (MM) son un grupo
a. Usando marcadores morfológicos y marcadores
bioquímicos (isoenzimas) que son productos de la de técnicas que permiten el estudio del genoma de
expresión de los genes y un organismo a nivel del DNA. Los MM están ba-
b. Usando los marcadores moleculares, que permiten sados en el grado de polimorfismo (diferencias)
detectar diferencias entre individuos directamente que ocurre naturalmente en el material genético de
a nivel de las secuencias del DNA de su genoma.
los organismos eucarióticos superiores, debido a la
Los marcadores visibles (fenotipo) como son las gran complejidad en la estructura de sus genomas.
mutaciones en genes con consecuencias en la mor-
Para ser útil, un marcador molecular debe reunir
fología, por ejemplo, el color de los ojos en la
las siguientes propiedades:
mosca de la fruta (Drosófila melanogaster) han
a. Que sea altamente polimórfico, es decir, que permita
sido usados en estudios genéticos desde comienzos claramente diferenciar dos indivíduos;
del siglo XX. b. Que sea codominante, para que permita discriminar
un individuo homocigoto de uno heterocigoto;
c. Que este distribuido a través del genoma;

d. Que no presente efecto pleiotrópico , es decir, que un 4 . 3 B r e v e r e se ñ a d e a l g u n o s

gen no afecte más de una característica; marcadores moleculares
e. Que sea de fácil y rápida ejecución, con mira a una
posible automatización; 4 . 3 . 1 P o l i m o r fi sm o e n l a l o n g i t u d d e
l o s f r a g m e n to s d e r e s t r i c c i ó n
f. Que tenga alta reproducibilidad;
(en inglés RFLPs)
g. Que permita el fácil intercambio de datos entre
laboratorios. La presencia o ausencia de sitios de reconocimien-
Los marcadores moleculares permiten estimar : to para una determinada enzima de restricción pue-
de variar en los genomas de los diferentes
• El número de genes responsables de una carac-
terística. individuos, lo cual puede generar un polimorfismo
(Figura 4.3). Las diferencias en los sitios de reco-
• La localización cromosómica de genes, por
ejemplo, ¿cerca de qué marcador molecular? nocimiento para una enzima de restricción puede
• El efecto fenotípico, es decir, ¿cuánto afecta ser debido a la ocurrencia de : mutaciones puntua-
cada gen la característica? les, inserciones, deleciones, o rearreglos en el ge-
• La dosis génica (o acción génica): ¿un indivi- noma debido a translocaciones o inversiones,
duo con dos copias del gen es diferente de alterando asi la distancia entre los sitios de corte de
aquel que presente una sola copia? la enzima. Esto genera segmentos de DNA (frag-
• La pleiotropía: ¿un gen afecta más de una ca- mentos de restricción) de diferentes tamaños.
racterística? Cuando el genoma es pequeño (por ejemplo, de
• La sensibilidad ambiental: ¿la función de los una bacteria o de un virus), estos fragmentos pue-
genes es similar en diferentes ambientes? den ser separados por electroforesis en un gel de
• La epistasis: ¿el efecto de un gen influencia el
efecto de otros genes?
Es concepto de marcadores mo- ER
leculares ha revolucionado la
habilidad de detectar regiones A __ __ ___________________________ __ __
(segmentos) dentro del genoma,
1
responsables de caracteres im- B __ __ ________________________ __ __
portantes (cuantitativos), y ha
acelerado el proceso de cons- S onda
trucción de mapas genéticos lo
A B A B
cual permite un mejoramiento
más dirigido. Los MM son dis-
cretos, codominantes, no deleté- 2
reos, sin efecto ambiental, libre
de epístasis y pueden ser genera-
dos en número ilimitado, permi- Figura 4.3 Base molecular del polimorfismo de los marcadores moleculares
tiendo una cobertura saturada RFLPs. 1. Digestión de segmentos homólogos de DNA genómico de dos indi-
viduos (A y B) con una misma enzima de restricción (ER). 2. Separación de los
del genoma. fragmentos por electroforesis. El polimorfismo se aprecia en la diferencia de
los tamaños de los fragmentos de restricción. Fuente: Bernatzky, R., 1988.

agarosa y visualizados al "teñir" el gel con una so- de mejoramiento. Algunas de éstas son: el número
lución de bromuro de etidio (Figura 4.4). de RFLPs es ilimitado, no presentan efectos pleio-
trópicos ni epistáticos, la herencia de los fragmen-
tos es mendeliana y estable, y son codominantes.
(Figura 4.6). También los RFLPs pueden ser anali-
zados en todas los tejidos y a cualquier edad fisio-
lógica del individuo; las muestras de DNA pueden
ser almacenadas por largos períodos de tiempo; se
DNA puede obtener un número ilimitado de combinan-
Genómico
ciones enzimas/sondas; los genes heterólogos pue-
Digestión
con enzima de Restricción den ser usados como sondas y se puede analizar
7kb 1.5kb Fragmentos varios loci con una sonda.
3kb 10kb
5kb de Restricción
0 (-)
10kb
7kb Separación de
5kb los fragmentos Extracción de DNA
3kb por su tamaño
1.5kb
Ezimas de restricción Pst 1
(+) Fragmentos de DNA

Fragmentos de DNA
Plásmido
Figura 4.4 Separación y visualización de los Fragmentos de
fragmentos de restricción utilizando la técnica 500 A 2500 bp
de electroforesis en geles de agarosa.

Ligamiento
Cuando el genoma es grande (por ejem-

Plásmidio
plo, plantas o animales), los fragmentos Transferencia a membrana abierto
+
de nitrocelulosa
generados son separados por electrofore- Fragmento
Células
Competentes
sis, transferidos a una membrana de Sonda radiactiva
Célula
nylon (Southern blot), donde son fijados Fragmentos
transformada
por el plásmido
de DNA
a la membrana con luz ultravioleta. Las
Hibridación
(Muchas copias PstI)
membranas se tratan con una solución al-

calina para abrir las cadenas y luego se Plásmido con
fragmento Colonias de
hibridiza con una sonda radioactiva o no de DNA Plásmidos
radioactiva (hibridización). Finalmente Autorradiografía Genoteca
la membrana se expone a una película de Selecciona

colonias con
plásmido que
rayos X que al revelar se obtiene una au- contienen los
fragmentos
torradiografía que permite visualizar el Análisis
polimorfismo. (Figura 4.5).

Figura 4.5 Secuencia del proceso de detección de los RFLPs en ge-
Los RFLPs presentan ventajas que los nomas grandes (por ejemplo, animales y plantas).
hacen atractivos y útiles en programas Pst1= Endonucleasa de restricción obtenida de la bacteria Providen-
cia Stuartii; bp= pares de bases. Fuente: Ramírez y colaboradores,
1991.
R/R
b. Alineamiento de los "primers" a las cadenas del
r/r 8 kb
DNA patrón, a una temperatura muy cercana al Tm
6 kb (temperatura a la cual el 50% del DNA está
6kb/6kb 8kb/8kb
desnaturalizado), generalmente entre 37-60 oC;
c. Extensión de los "primers": la Taq polimerasa
R/r 8 kb
incorpora desoxirribonucleótidos a la cadena nueva,
6 kb F1 produciendo una copia complementaria del DNA
8kb/6kb
patrón, a una temperatura de 72 oC.
Las copias de DNA aproximadamente se duplican
R/R R/r R/r r/r en cada ciclo. En la práctica la amplificación no es
100% eficiente, pues en 20 ciclos, la producción es
de 105 a 108 veces la cantidad inicial de segmentos
8 kb 8 kb 8 kb
de DNA. Esta escala de amplificación permite ini-
F2 6 kb 6 kb 6 kb
ciar el proceso con cantidades mínimas de DNA
6kb/6kb 8kb/6kb 8kb/6kb 8kb/8kb
(del orden de picogramos o nanogramos), y termi-
nar con grandes cantidades de una secuencia espe-
Figura 4.6 Análisis genético de plantas utilizando marca-
dores moleculares RFLPs. Fuente: Kochert, G. 1989.
cífica de DNA. (Figura 4.7).
Secuencia que se va
a amplificar
DNA Original
4 .3 . 2 M arcadores mol ec u l a r e s b a sa -
dos en l a reacci ón e n c a d e n a d e
l a pol i meras a ( P C R ) Ciclo 1
La reacción cadena de la polimerasa (PCR) es un

método para la multiplicación in vitro de secuen-
cias específicas de DNA. Se utilizan "primers" (ce-
badores) que delimitan la región de interés en el Ciclo 2
DNA que se va a amplificar o multiplicar. El PCR

fue descubierto por K. Mullis en la década de los
80s. En 1988, Saiki y colaboradores aislaron una
DNA polimerasa de la bacteria termofílica Ther-
mus aquaticus, denominada "Taq polimerasa", la
cual es termoestable a altas temperaturas. Este ha-
llazgo permitió la automatización del PCR.
Ciclo 3
La técnica PCR consiste de una serie repetitiva de

ciclos (20-40), consistiendo cada una de tres eta-
pas:
a. Desnaturalización del segmento de DNA que se va a
amplificar, generalmente se utiliza una temperatura Ciclo 4, etc.
de 94oC;
Figura 4.7. Principio de la reacción en cadena de la poli-
merasa (PCR).Fuente: Weising y colaboradores, 1995.

La técnica del PCR es aplicable a muchas áreas bá- La naturaleza molecular del polimorfismo de los
sicas y prácticas; por ejemplo: diagnóstico, investi- RAPDs no está totalmente conocida. Evidencias
gaciones médicas, medicina forense, y es base para experimentales indican que diferencias de apenas
la utilización práctica de los marcadores molecu- un par de bases (mutación puntual) es suficiente
lares como: RAPDs, microsatélites, AFLPs, etc. para que no haya una perfecta complementaridad
del "primer" con el sitio de iniciación, impidiendo
4 .3 .3 Po l i morf i s mo de D N A a m p l i fi c a - la amplificación de este segmento.
d o al eat ori ament e ( en i n g l é s
RA P D s ) El polimorfismo genético detectado por los marca-
Esta metodología permite detectar polimorfismos dores RAPD también son de naturaleza binaria,
de secuencias de nucleótidos, utilizando solamente esto significa que un segmento amplificado (banda
un "primer" (decanucleótido) de secuencia "arbi- en el gel) puede estar presente o ausente (Figura
traria" para la amplificación del DNA. 4.8).
La mayor ventaja de esta técnica es que no se re- Una limitación de los RAPDs (por ser marcadores
quiere información de la secuencia del DNA, ade- dominantes), es la dificultad de discriminar direc-
más el protocolo es relativamente rápido y fácil de tamente los genotipos homocigotos.
realizar y no utiliza radioctividad. Como esta técni- Además, los perfiles de amplificación pueden va-
ca esta basada en la amplificación de segmentos riar de un laboratorio a otro debido a diferencias en
por medio del PCR, se necesita poca cantidad de los termocicladores utilizados.
DNA genómico (nanogramos
Individuo A Individuo B
5´
P rime rs
1.5 kb 1.0 kb 3.0 kb 1.5 kb 2.5 kb 3.0 kb
3kb
5kb
S e pa ra ción de los
fra gmentos por
1.5kb e le ctrofores is
1.0kb
Figura 4.8 Base molecular del polimorfismo de los RAPDs. Fuente: Adaptado por Ramírez, H., 1993.

4 .3. 4 M i cros at él i t es c. Disponibilidad de una buena colección de diferentes

microsatélites, algunos de los cuales ocurren en alto
Los microsatélites o secuencias simples repetidas
número de copias;
(SSR - Simple Sequence Repeats) son secuencias
d. Están más o menos dispersos a través del genoma;
pequeñas de 1a 4 nucleótidos que se repiten en blo-
e. La técnica puede ser automatizada.
ques. En los genomas de los organismos eucarióti-
cos, estas secuencias simples son más frecuentes, Por estas características, los microsatélites son
bién distribuidas y presentan loci genéticos alta- ideales para el mapeo genético y mapeo físico de
mente polimórficos. genomas, para la identificación y discriminación
de genotipos y para estudios de genética de pobla-
Este tipo de secuencias varían entre animales y ve- ciones.
getales. Por ejemplo, en mamíferos las secuencias
más comunes son (GT)n y (CA)n, donde n repre- 4.3.5 Polimorfismo en la longitud de
senta el número de veces que se repite la secuencia. f r a g m e n to s a m p l i f i c a d o s ( e n i n-
En plantas, las secuencias más comunes son (AA)n glés AFLPs)
y (AT)n. Wu y Tanksley encontraron en 1993 que La técnica AFLP se basa en la amplificación selec-
en el genoma de maíz y arroz las secuencias más tiva, vía PCR, de fragmentos de restricción de
comunes son (GA)n, (GT)n y las complementarias DNA genómico. La técnica comprende cuatro eta-
(CT)n y (CA)n. pas:
Los microsatélites pueden ser amplificados indivi- 1. Generación de fragmentos de restricción de DNA
genómico.
dualmente vía PCR, utilizando un par de "primers"
2. Ligación de adaptadores específicos a los
especialmente diseñados (de 20-30 bases), com- fragmentos.
plementarios a las secuencias únicas que limitan 3. Amplificación selectiva de un grupo de fragmentos
(flanquean) los microsatélites. Los segmentos am- vía PCR.
plificados son separados por electroforesis en un 4. Separación de los fragmentos amplificados por
gel de agarosa y visualizados, después de la tinción electrosforesis y análisis de los fragmentos
con bromuro de etidio, en una pantalla con luz ul- amplificados.
travioleta. La base molecular del polimorfismo de los AFLPs,
al igual que el de los RFLPs, se debe a las diferen-
La base molecular del polimorfismo radica en la
cias en los sitios de reconocimiento de las enzimas
diferencia del número de unidades repetidas en los
de restricción utilizados en el estudio (en este caso
diferentes loci de microsatélites. Cada segmento,
EcoRI y MseI). Estos cambios se deben a mutacio-
de tamaño diferente (amplificado generalmente
nes puntuales, inserciones, deleciones, o rearreglos
desde varias decenas hasta centenas de pares de
en el genoma debido a translocaciones e inversio-
bases) representa un alelo diferente de un locus.
nes, lo cual causa la pérdida o ganancia de secuen-
Los microsatélites amplificados vía PCR ofrece cias de reconocimiento.
ventajas como:
Los AFLPs, al igual que los RAPDs, son marcado-
a. Su alto polimorfismo, y por consiguiente son
altamente informativos; res dominantes, lo cual no permite diferenciar in-
b. Son codominantes, lo que permite diferenciar dividuos homcigotos de heterocigotos.
individuos homocigotos y heterocigotos;

El poder de la técnica de AFLP se basa en las varia- Los ESTs son útiles para la construcción de "son-
ciones genéticas que existen entre especies, varie- das" de genes específicos para el análisis de la ex-
dades o cultivares estrechamente relacionados. presión diferencial de familias multigénicas.
Estas variaciones en su secuencia del DNA son ex- Además se usan para el mapeo y secuenciación del
plotadas por esta técnica para la obtención rutina- genoma, utilizando clones de cromosomas artifi-
ria de "fingerprintings" (huellas dactilares) de un ciales (YACs o BACs).
genotipo en particular. Estos "fingerprintings" son
En conclusión, los ESTs constituyen una valiosa
simples RFLPs amplificados selectivamente vía
herramienta que es muy útil en los programas de
PCR.
mejoramiento animal y vegetal.
Desde su desarrollo, esta técnica ha sido utilizada
para discriminar genotipos, para mapeo genético 4 . 3 . 7 M i n i sa t é l i te s
localizado (Bulk Segregant Analysis) y para la Los organismos superiores presentan gran abun-
construcción de mapas genéticos. dancia de DNA repetitivo, que podría comprender
más del 90% del DNA total en ciertos genomas de
4 .3 .6 Marcaj e de s ecuenci as e x p r e sa - plantas. El término minisatélite designa a una fa-
d as ( en i ngl és E ST s )
milia de secuencias repetitivas organizadas en blo-
Los ESTs son secuencias cortas de DNA (200-500 ques. Esta clase de DNA consiste de pequeñas
pb) de clones seleccionados al azar de un banco de unidades (10-60 pb) y presentan un bajo grado de
cDNA. El propósito de estas secuencias es realizar repetición en locis determinados.
un monitoreo rápido de todos los genes que confor-
En 1985 Alec J. Jeffreys y su grupo, describieron la
man el genoma de un cultivo en particular, con el
presencia de minisatélites en el genoma humano y
fin de "marcar" su localización en los cromosomas.
aislaron dos regiones conservadas: una llamada
Una aplicación obvia de los ESTs es la identifica- 33.6 de 16 pb, y otra denominada 33.15 de 20 pb.
ción, localización y aislamiento de nuevos genes, Ambas regiones conservadas son conocidas como
en donde la secuencia EST es utilizada como "son- las sondas de "Jeffreys".
da" para "pescar" el gen completo en un banco ge-
Genomas humanos hibridizados con una sonda de
nómico o en bancos de cromosomas artificiales
Jeffreys produce un patrón de bandas un poco
YACs (yeast artificial chromosomes) o BACs
complejo. Este patrón de muchas bandas es lo que
(bacterial artificial chromosomes).
constituye un "fingerprinting" de DNA el cual es
Los ESTs también se utilizan para identificar y ais- único para cada individuo. Esto se debe a la gran
lar genes homólogos en cultivos relacionados. En variabilidad en los minisatélites dentro de la espe-
especies no relacionadas, la comparación de los cie Homo sapiens.
ESTs permite la identificación de secuencias alta-
En los últimos años, no sólo se han descubierto
mente conservadas que luego se utilizan para dise-
marcadores moleculares de gran poder de resolu-
ñar "primers" apropiados para aislar los genes
ción, sino que también se ha simplificado y masifi-
completos en bancos genómicos o de cromosomas
cado su uso. Entre los usos más importantes de los
artificiales de los respectivos cultivos.

Ensayo de Campo con
Mapa Molecular con RFLPs Poblaciones de Interés
MM en el mejoramiento genético de
plantas se encuentran: 20
2
23
7
12 1 18
1. En el manejo de germoplasma:
9
caracterización y análisis de la 19
11 3
variabilidad genética, identificación de 16
13
acervos genéticos y de parentales para 5
el mejoramiento. Los marcadores más 21
apropiados para estas aplicaciones son 25
los RFLPs, y los microsatélites. 4

8 10
14
15
2. El mapeo de genes cualitativos y 17

cuantitativos (QTLs). Los marcadores 6
24
más usados: RFLPs, microsatélites y
RAPDs.
3. En estrategias de fitomejoramiento:
selección asistida por marcadores
(marcador apropiado: microsatélites), Correlación de datos de campo con
identificación y transferencia de QTLs marcadores de RFLP
de germoplasma silvestre (marcador:
RFLPs) e introgresión de transgenes
(marcadores apropiados: RFLPs y Los marcadores RFLPs con correlaciones positivas
son útiles para el monitoreo de los caracteres
microsatélites).
4. Mejoramiento asistido por marcadores
moleculares (marcador: RFLP). (Figura Un programa de mejoramiento con estas población puede tener
4.9). éxito si se seleccionan los marcadores RFLPs apropiados
5. Clonación de genes con base a mapas Figura 4.9 Utilización de un mapa molecular en un programa de mejora-
genéticos (marcadores apropiados: miento vegetal. Fuente: Tohme, J. (comunicación personal, 1997).
RFLPs, microsatélites y AFLPs).
Cromosoma 4
Para realizar numerosas aplicaciones, REC Diat Marcador Nombre
la construcción de mapas genéticos mo- Frac. cM Id
leculares es un paso previo necesario (Fi- (45) RG 143
gura 4.10). Actualmente existen mapas (10.3%) 10.4
(11) RG 463
genéticos basados en marcadores mole- (7.7%) 7.8 (23) RG214
culares para un número grande de espe- (2.6%) 2.6 (36) RG864
cies económicamente importantes.
Entre estas se encuentran : maiz, tomate, (17.9%) 18.8
arroz, soya, frijol, yuca, algodón, caña de
(2.8%) 2.8 (3) Pi (t)
azúcar, naranjo, tabaco, manzano, ceba- (3.2%) 3.2 (25) B10700
da, zanahoria, espárrago, alfalfa y gira- (15) B8350
sol. (16.9%) 17.6
(33) C15600
Figura 4.10 Ejemplo de un grupo de ligamiento construido con marca-

dores moleculares. Fuente: Tohme, J., 1996.

4 .4 Eje r ci ci o 4. 1 Mar cador es b. Si se cruzan dos plantas F1, ¿de qué color serán las
m o le cul ar es flores de las plantas de la F2?
Objetivos c. ¿En la F2 es posible diferenciar las plantas de flores
rojas homocigotas de las plantas de flores rojas
• Desarrollar el concepto de marcadores molecu- heterocigotas? Explique.
lares .
d. Utilizando marcadores moleculares, ¿cómo haría
• Identificar individuos homocigotos y heteroci- usted para diferenciar plantas de flor roja
gotos utilizando: a) marcadores morfológicos, homocigotas de plantas de flor roja heterocigotas?
y b) marcadores moleculares. e. Explique con un ejemplo, cómo se puede utilizar un
• Confirmar el poder de discriminación que tie- marcador molecular en un programa de
nen los marcadores moleculares. mejoramiento.
Orientaciones para el instructor - Presentar por escrito las respuestas a las

Este ejercicio consiste en identificar en un diagra- preguntas de este ejercicio.
ma, individuos homocigotos y heterocigotos utili-
- Motive una discusión con base en las
zando marcadores morfológicos y marcadores respuestas dadas.
moleculares (RFLPs).
- Proporcione la información de retorno
Con este ejercicio se busca que los participantes fi-
suministrando las respuestas a las preguntas a
jen el concepto de marcadores moleculares y sus este ejercicio.
aplicaciones.
Para la realización de este ejercicio se recomienda Recursos necesarios
que el Instructor lea cuidadosamente las siguientes
- Papelógrafo, papel, marcadores.
instrucciones:
• Suministre orientación general sobre los objeti- - Cuatro mesas medianas y un sitio de trabajo.
vos del ejercicio.
• Ubique cuatro mesas en el sitio de trabajo. - 20 plantas con flores rojas (por ejemplo,
claveles) y ocho plantas con flores blancas en
• Colocar en cada mesa 5 plantas con flores rojas materas o bolsas de plástico.
( por ejemplo, claveles) y dos plantas con flores
blancas.
Tiempo sugerido: 60 minutos.
• Conforme cuatro grupos de trabajo. Ubique
cada grupo en cada una de las mesas. Instrucciones para el participante
• En cada grupo los participantes deben respon- Con la información suministrada en la Sección 4 y
der las siguientes preguntas: con la identificación de un marcador molecular
Si el color de la flor es un carácter monogénico para diferenciar plantas de flores rojas homocigóti-
(RR = rojo y rr = blanco). Al cruzar una planta de cas de plantas de flores rojas heterocigóticas, los
flor roja homocigótica (RR) con una planta de flor participantes deberán construir el concepto de
blanca (rr) : marcadores moleculares.
a. ¿De qué color serán las flores de las plantas de la F1?
Explique.

Pasos a seguir Respuestas

• Conforme cuatro grupos de trabajo de Para la pregunta a
acuerdo con las instrucciones dadas por el
Instructor. Serán rojas, porque:
• Nombrar un relator por grupo, el cual pre-
sentará en plenaria las respuestas dadas
por el grupo.
P1 P2
• Contestar por escrito las respuestas a las
siguientes preguntas: RR X rr
(roja) (blanca)
Si el color de la flor es un caracter monogéni-
co (RR = rojo y rr = blanco). Al cruzar una
F1
planta de flor roja homocigótica (RR) con Rr
una planta de flor blanca (rr) : (roja)
a. ¿De qué color serán las flores de las plantas de
la F1? Explique.
b. Si se cruzan dos plantas F1, ¿de qué color
serán las flores de las plantas de la F2? Porque el alelo R es dominante sobre el alelo r.
c. ¿En la F2 es posible diferenciar las plantas de
flores rojas homocigotas de las plantas de Para la pregunta b
flores rojas heterocigotas? Explique.
Serán de flores rojas y de flores blancas en una propor-
d. Utilizando marcadores moleculares, ¿cómo
haría usted para diferenciar plantas de flor roja ción de 3 : 1.
homocigotas de plantas de flor roja
heterocigotas?
e. Explique con un ejemplo, cómo se puede
utilizar un marcador molecular en un
programa de mejoramiento.
X
• Al final el instructor les proporcionará la
información de retorno a las preguntas Rr Rr
planteadas. (rojas) (rojas)
(rojas) (blancas)
rr F2
Información de retorno RR Rr Rr
3 : 1
Respuestas a las preguntas realizadas en este
ejercicio.
Si el color de la flor es un caracter monogéni-
co (RR = rojo y rr = blanco). Al cruzar una
planta de flor roja homocigótica (RR) con
una planta de flor blanca (rr) :

Porque: B i b l i o g r a fí a
A us t r a l i a n S c i e nc e a nd T e c hnol ogy C ounc il ( ast ec) . 1993.
Para la pregunta c G e ne T e c hnol ogy I s s ue s f or A us t r a li a. Occasi onal
P a pe r N o. 27. A us t r a l i a n G ove r nm ent Publ i shi ng
No es posible. Las plantas RR y Rr son de flores ro- S e r vi c e . C a nbe r r a . 151 p.
jas porque el alelo R es dominante sobre el alelo B e r na t z ky, R . 1988. R e s t r i c t i on F r a g m ent Lengt h
P ol ymor phi s m . P l a nt M ol e c ul a r B i ol o gy M anual . C2:
r. 1- 18. K l uw e r A c a de mi c P ubl i s he rs. Dor dr echt ,
B e l gi um.
Para la pregunta d B i ot e c hnol ogy R e s e a r c h U ni t ( B R U ) . A nnual Repor t 1991.
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6kb/6kb 8kb/6kb 8kb/6kb 8kb/8kb
Figura 4.6 Análisis genético de plantas utilizando mar-

cadores moleculares RFLPs. Fuente: Kochert, G. 1989.
Para la pregunta e
En tomate, la resistencia a nemátodos es un carác-
ter monogénico. Este carácter está asociado a un
marcador molecular (RFLP). A través de este mar-
cador molecular, es posible seleccionar los mate-
riales de tomate resistentes a nemátodos, en un
programa de mejoramiento para este carácter.


86
Marcardores Molecurales
• Caracterizac ión y análisis

de la variabilidad genética
• Identificación de acervos RFLPs
genéticos Microsatelites
RFLPs
Microsatelites
Mapeo de genes cualitativos y RAPDs
cuantitativos
Selección asistida por
marcadores moleculares Microsatelites
Estrategias de fitomejoramiento
Identificación y transferencia de RFLPs
QTLs de germoplasma silvestre
RFLPs
Introgresión de transgenes Microsatélites
Majoramiento asistido por
marcadores moleculares RFLPs
RFLPs
Clonación de genes con base a
Microsatélites
mapas genéticos
AFLPs

CEDAF
CEDAF
Objetivos

• Entender los principios básicos de los
marcadores moleculares.
• Conocer algunas de sus aplicaciones en

el mejoramiento vegetal.
87
88
¿Qué son los marcadores moleculares?
Son un grupo de técnicas que permiten el

estudio de gemona de los organismos a
nivel del DNA.
Están basados en el grado de polimorfismo

(diferencias) que ocurre naturalmente en el
material genético de los organismos
eucarióticos superiores, debido a la gran
complejidad de sus genomas.

CEDAF
CEDAF
Propiedades de un marcador

molecular
• Que sea altamente polimorfico.
• Que sea co – dominante.
• Que esté distribuido a través del genoma.

• Que sea de fácil y rápida ejecución.
• Que tenga alta reproducibilidad.
89
90
Breve reseña de algunos grupos moleculares
• Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLPs).
• Polimorfismo de DNA amplificado aleatoriamente (RAPDs).
• Microsatélites.
• Polimorfismo en la longitud de fragmentos amplificados (AFLPs).
• Marcaje de secuencias expresadas (ESTs).
• Minisatélites.

CEDAF
T r an sfor ma ci ó n g en é t i c a d e p l a n t a s
Sección 5

Sección 5 . Trans for mac i ón ge n é t i c a de pl an t as
Tabla de Contenido
Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
5.1 ¿Porqué transformar plantas? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
5.2 Un vector natural para introducir genes foráneos a las plantas . . . . . . . . . . . . . 95
5.3 Transformación genética de plantas utilizando Agrobacterium tumefaciens . . . . . . 98
5.4 Transformación por introducción directa de DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
5.5 Logros de la ingeniería genética de plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
5.6 Ejercicio 5.1 Transformación genética de plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
Originales para transparencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111

Transformación Genética de Plantas
Construcción
Genética Transformación
Bombardeo de genética vía Agrobacterium
partículas o biolísticas
Explante
Explante o protoplastos CO - cultivo
Regeneración de plantas en
medio de selección
Prueba de Ensayos
Pruebas
transgénesis agronómicos y de
genéticas
bioseguridad
Mejoramiento
Mercado
convencional
Objetivos
• Conocer los fundamentos de la transformación genética de plantas.

• Conocer los dos métodos más utilizados para transformar plantas.
1. ¿Sabían ustedes que es posible producir hormona de crecimiento humana en plantas de tabaco?
2. ¿Algún participante nos puede decir que es una planta transgénica?
3. ¿Sabían ustedes que el Agrobacterium tumefaciens, una bacteria del suelo, ha venido realizando ingeniería
genética desde hace miles de años?

In tro d u c ci ón
La transformación genética de plantas se refiere a El objetivo de esta sección en mostrar en forma
la introducción de genes modificados (llamados sencilla los dos métodos más utilizados para la
genes quiméricos) al genoma de las células vegeta- transformación genética de plantas: La vía Agro-
les, utilizando un método apropiado. Los métodos bacterium y la vía biolística. Además, se presenta-
de transformación más utilizados son: mediante rán algunos logros de esta metodología que están
Agrobacterium tumefaciens y mediante el bombar- contribuyendo a la solución de algunos problemas
deo de partículas o biolística. El gen o genes intro- agrícolas.
ducido (s) es (son) incorporado (s) al genoma de la
célula vegetal, al que debe integrarse de manera es- 5 . 1 ¿ P o rq u é t ra n sfo r m a r p l a n t a s ?
table y expresarse en la biosíntesis de proteínas es- Las plantas ocupan el primer eslabón de la cadena
pecíficas. La célula o tejido transformado se alimenticia. A través de la fotosíntesis, utilizan la
cultiva in vitro para regenerar plantas normales energía lumínica del sol para producir carbohidra-
que expresen el transgen. tos que son la fuente del 90% de las calorías consu-
La transformación genética amplía grandemente el midas por los humanos. Además, las plantas
rango de genes disponibles para el mejoramiento proporcionan el 80% de las proteínas que consumi-
de plantas. En el mejoramiento convencional, los mos en nuestras dietas alimenticias.
genomas de dos parentales se combinan en alto Por miles de años, el hombre ha manipulado las ca-
grado, a pesar de que el mejorador esté interesado racterísticas genéticas de las plantas. Primero, por
en la transferencia de una sola característica, la selección consciente o inconsciente de caracteres
cual podría estar controlada por un gen simple. específicos; luego, por cruces dirigidos basados en
Para eliminar las características indeseables del hí- las leyes de la herencia.
brido resultante, deben realizarse varios ciclos de
retrocruzamiento hacia el parental deseable, proce- Sin embargo, muchas características genéticas de
so que toma varios años, para finalmente obtener interés agronómico tales como: resistencia a enfer-
un material mejorado. medades y plagas, tolerancia a heladas, salinidad,
sequía, etc., presentes en otras especies no pueden
En contraste, con las técnicas de ingeniería genéti- ser transferidas por cruzamiento genético conven-
ca de plantas, un gen de interés puede ser identifi- cional debido principalmente a barreras de incom-
cado, aislado, clonado y transferido de una planta a patibilidad.
otra en una forma directa, lo que significa que por
esta vía el mejoramiento de un cultivo es más diri- La ingeniería genética y la transformación de plan-
gido. Por otro lado, en el método tradiconal los fi- tas constituye una poderosa herramienta para supe-
tomejoradores solo pueden trabajar con plantas rar estas barreras de cruzabilidad, permitiendo la
que sean compatibles (cruzables), mientras que por transferencia de genes de interés a las plantas, cual-
ingeniería genética se puede transferir cualquier quiera que sea su procedencia. Esta alternativa
gen de interés sin importar su procedencia (virus, permitirá un mejoramiento más dirigido, con una
bacterias, hongos, animales o plantas). reducción significativa del tiempo en la produc-
ción de nuevas variedades. Así, la transformación

genética contribuirá no solamente a la reducción

del costo de la producción agrícola sino también a
una mayor protección del medio ambiente como
consecuencia de la disminución sustancial del uso
de los agroquímicos.
DNA cromosómico
Herida
5 .2 U n vect or nat ur al pa ra i n t r o d u c i r T-DNA
genes f or áneos a l as p l a n t a s Agrobacterium

infecta la herida
Plasmido Ti Agrobacterium
Agrobacterium tumefaciens es una bacteria del DNA cromosómico
suelo que infecta a un buen número de especies ve- de la planta
getales, principalmente dicotiledones, producien- Agalla de la corona

(tumor vegetal)
Integrado al genoma
de la célula vegetal
do la enfermedad denominada Agalla de la Corona
(un tumor vegetal) (Figura 5.1). La producción de
esta enfermedad es el resultado de un evento natu-
ral de ingeniería genética en el que una región es-
Figura 5.2 La bacteria Agrobacterium tumefaciens es la
pecífica del plásmido Ti (inductor de tumores) de causante de la enfermedad Agalla de la Corona. Fuente:
Watson y colaboradores, 1992.
la bacteria, se integra al genoma de la célula infec-
BACTERIA PLANTAS
Cromosoma
9
4 x 10 Fotosintesis
Plasmido Ti T-DNA
Ge
Infecc
ne CO2 + H2O Compuestos orgánicos

Trans
sC
Plásmido Ti ata
bo
ión co
1.2 x 10
8
lico
ferenc
s
C fue nas
de
so iza o s
n plas
a
ia de
co atab nzim
y N nte
p i
E
T-DNA
mido
Genes para crecimiento tumorigénico

mo ol
la
DNA-T
Ti
C
Genes para sintesis de opina

Fotosintesis aminoácidos
Agalla de la corona
DNA de la planta + T-DNA
aminoácidos oPINAS
Agalla de la corona
Proliferación de Agrobacterium
con Plasmido Ti Catabólicos y
Plasmido asociado Ti
Figura 5.1 Principios de colonización genética. Fuente: Calderón, A. 1990.

tada. Este proceso es el resultado de miles de años cimiento del tejido infectado. La región T-DNA
de evolución de la bacteria. (Figura 5.2). presenta otros genes que promueven la síntesis de
opinas (derivados de aminoácidos) que son utiliza-
El plásmido Ti presenta dos regiones claves para el
dos por la bacteria como fuente de carbono y de ni-
proceso de transformación: la región T-DNA que
trógeno. La región T-DNA esta compuesta por
es la región que se transfiere desde el plásmido Ti
tres elementos importantes: la secuencia de bordes
al genoma vegetal; y la región vir (región de viru-
del T-DNA conteniendo secuencias repetidas, los
lencia) que presenta ocho operones (virA, virB,
genes de biosíntesis de fitohormonas (región onc)
virC, virD, virE, virF, virG, y virH), cuyos pro-
y los genes de biosíntesis de opinas (región ops)
ductos procesan el T-DNA y coordinan todo el
(Figura 5.3).
proceso de transferencia del T-DNA al genoma de
la planta (Figura 5.3). Los plásmidos Ti de Agrobacterium tumefaciens
han sido explotados como vectores para la intro-
La región que se transfiere se llama T- DNA (DNA
ducción de DNA foráneo en las plantas. Para que
transferible) y contiene genes responsables para la
estos plásmidos puedan ser utilizados como vecto-
biosíntesis de dos hormonas vegetales una auxina
res de transformación, la región onc (oncogene)
(ácido indolacético) y una citoquinina (riboxido de
debe ser removida, para producir plásmidos Ti
zeatina). Estas son los responsables del sobrecre-
Región T
Producción decitocinina
Producción deauxina
Síntesis de opina
Borde derecho (24pb)

Borde izquierdo (24 pb) Genes onc
Transferencia
conjugativa
Región de Plásmido Ti
virulencia
Catabolismo de
opinas
Replicador
Figura 5.3 Mapa genético de un plasmidio Ti de Agrobacterium tumefaciens. Fuente: Beijersbergen y Hooykaas,
1993.

llamada gus. También es necesario

colocar en la región T-DNA un gen de
selección, como el gen nptII que codifi-
ca para la enzima neomicina fosfotrans-
ferasa. Esta permite el crecimiento de
células transformadas en medios de cul-
tivo que contienen el antibiótico kana-
micina (Figura 5.4).
Un gen quimérico de interés, es un gen
donde el promotor, la secuencia codifi-
cante y las secuencias de terminación
provienen de organismos diferentes. Un
ejemplo de un gen quimérico típico con-
tiene: el promotor 35s del virus del mo-
saico de la coliflor (CaMV35s), la
secuencia codificante CryIA(b), que co-
difica para una d-endotoxina de la bac-
teria Bacillus thurigiensis; y la
Figura 5.4 Proceso de transferencia de la región T-DNA del plásmido secuencia de terminación la región 3'
Ti del Agrobacterium al genoma de una célula vegetal. Fuente:
Lindsey y Jones, 1992. nos del gen nopalina sintetasa de la bac-
teria Agrobacterium tumefaciens. Ge-
"desarmados", y en su reemplazo se coloca un gen quiméri- neralmente el promotor se identifica y
co, portando la secuencia de interés que se va a transferir al se aisla de la planta que se pretende
genoma de la planta. Además se colocan secuencias fácil- transformar (Figura 5.5).
mente identificables en los tejidos transformados (genes re- Existen dos clases de vectores derivados
porteros), como el gen de la b-glucuronidasa comúnmente del plásmido Ti: vectores cis ó co-inte-
Figura 5.5 Mapa de una región de T-DNA de una construcción genética que contiene el gen CryIA(b), el gen reportero
gus-intron y el gen de selección nptII que confiere resistencia al antibiótico kanamicina. Fuente: Mancilla, L. 1997.
(comunicación personal)

grados y vectores trans o binarios. En los vectores mefaciens, básicamente consiste en cultivar con-
co-integrados tanto el T-DNA como la región vir juntamente los explantes ( tejidos, órganos, célu-
están presentes en el mismo plásmido; mientras las) con una cepa de Agrobacterium tumefaciens
que en los vectores binarios el T-DNA y la región portadora de un vector apropiado con el gen de in-
vir se hallan en plásmidos separados dentro de la terés y los genes marcadores (reportero y de selec-
misma bacteria hospedera (Agrobacterium). De ción), que se va a transferir al genoma vegetal.
estos dos tipos de vectores el más utilizado para la
El cultivo se incuba a 28 °C por un período sufi-
transformación genética de plantas es el sistema
ciente (24-48 horas) para garantizar la transferen-
binario (Figura 5.6).
cia del T-DNA del vector (plásmido Ti) a las
5 .3 Tra n s f or m aci ón genét i ca d e células de la planta. La bacteria se elimina con un
p la n t as ut i l i z ando A gr oba c t e ri u m antibiótico y el tejido se coloca en un medio de re-
tu mef aci ens generación (vía embriogénesis o vía organogéne-
La metodología general para la transformación ge- sis) en presencia de un agente de selección (por
nética de plantas se presenta en la Figura 5.7. La ejemplo un antibiótico) para permitir el desarrollo
transformación de plantas con Agrobacterium tu- de sólo los tejidos transformados.
Célula de Agrobacterium T-DNA transferido e integrado en el cromosoma vegetal
Gen opina
Oncogenes
L Oncogenes Gen de síntesis de opina R
L
Plásmido Ti
tipo salvaje
Genes VIR 200 kb
Características:
R Producción de hormona vegetal
Formación de tumor
Producción de opina
No se regeneran plantas
Origen de
replicación
Gen extraño
Gen seleccionable
L Gen seleccionable Gen extraño R
Plásmido Ti
Plásmido
desarmado
T-DNA
100 kb
binario
L R
Vir
25 kb
Características:
Plásmido con amplio espectro de hospedadores
que puede ser construido en E Coli
No hay producción en exceso de hormonas vegetales
Origen de Origen de solo los transformantes seleccionados que contengan
replicación replicación el gen extraño regenerarán plantas normales
Figura 5.6 Sistemas de vectores empleados en la transformación genética de plantas vía Agrobacterium. a) Vector
cointegrado (plásmido Ti en estado silvestre). En este sistema la región T-DNA y la región vir están en el mismo
plásmido. b) Vector binario. En este sistema, las regiones T-DNA y vir están en plásmidos separados. Fuente:
Lindsey y Jones, 1992.

Gen(s) de interés
Gen reportero
Construcción
Gen de selección
Secuencia reguladoras
Introducción a una Cepa de EXPLANTE

Agrobacterium
CO-CULTIVO
medio de selección
Ensayo agronómicos:
Prueba de transgénesis Pruebas genéticas Bioseguridad
Integración del gen (s) Herencia del transgen Invernadero

al genoma vegetal Resistencia/tolerancia/ Campo
Expresión del gen (s) biosíntesis
Nivel de RNA
Nivel De Proteína
Mercado Mejoramiento
convencional
Figura 5.7 Secuencia de pasos para la transformación genética de plantas vía Agrobacterium.
La selección de células transformadas debe cum- Después de la formación de callos a partir de las
plir las siguientes características: células transformadas, éstos se transfieren a me-
a .las células transformadas deben tener un alto nivel de dios apropiados conteniendo el agente de selec-
resistencia al agente de selección; ción, para la inducción de brotes y luego plántulas.
b. las células no transformadas deben ser totalmente
eliminadas por el agente de selección; En la etapa de enraizamiento se reduce el agente de
c. los tejidos transformados deben ser fácilmente detec- selección (si éste es un antibiótico) para favorecer
tables para distinguir posibles "escapes" que pue- el enraizamiento de las plántulas.
dan crecer a expensas de los tejidos transformados,
degradando el agente de selección.

5 .4 Tra n s f or m aci ón por i nt r o d u c c i ó n 5 . 4 . 1 T r a n sfe r e n c i a m e d i a d a p o r

d ire c t a de D N A a g e n t e s o sm ó t i c o s
En las gramíneas, y en concreto, en los cereales, la Fue el primer sistema desarrollado para la intro-
transformación vía Agrobacterium ha tenido poco ducción directa de DNA a protoplastos (células ve-
éxito. Debido a esto, se ha desarrollado métodos getales a las cuales se les ha removido la pared
alternativos que permiten la introducción directa celular). Los protoplastos se tratan con el osmótico
de DNA al genoma vegetal (Figura 5.8). Algunos polietilenglicol (PEG) con fostato de calcio, en
de estos métodos son: presencia del DNA foráneo.
a. Transferencia mediada por agentes osmóticos
El tratamiento PEG/Ca++ permite un aumento en
b. Microinyección la permeabilidad de la membrana del protoplasto
c. Electroporación facilitando así la entrada del DNA foráneo. Aun-
d. Bombardeo de partículas o Biolística que la incorporación de DNA a los protoplastos no
depende de la especie, la regeneración de plantas
completas a partir de protoplastos puede resultar
difícil, lo cual constituye una gran limitación para
A el uso generalizado de esta metodología.
5.4.2 Microinyección
Por tratamiento con
PEG Y Ca
++ Esta técnica consiste en inmovilizar una célula en
la punta de un microtúbulo, usando presión ne-
B
gativa ligera para inyectar una solución de DNA
usando un capilar de vidrio fino. Este atraviesa la
Por electrochoque
membrana citoplasmática de la célula y llega al
núcleo sin producirle ningún daño.
C
Utilizando esta metodología se ha logrado trans-
formar algunas plantas como el tomate y la za-
nahoria. Algunas desventajas de este método
Por microinyección son: la baja viabilidad de las células inyectadas, el
alto nivel técnico y experiencia requeridas, y el
D
hecho de que sólo se pueda inyectar una célula a
la vez. Todo esto hace que éste método sea poco
eficiente.
Por biolística
5 . 4 . 3 E l e c tr o p o r a c i ó n
Figura 5.8 Métodos utilizados para la introducción directa de En esta técnica, protoplastos son sometidos a im-
DNA al interior de las células vegetales. A) Transferencia pulsos eléctricos de alto voltaje por fracciones de
mediada por agentes osmóticos. B) Electroporación. C)
Micro-inyección y D) Bombardeo de partículas o biolística. segundos. Este tratamiento permeabiliza la mem-
Fuente: Calderón y colaboradores, 1991. brana induciendo la formación reversible de po-

ros que permiten la introducción de 5.5 Logros de la ingeniería genética de

macromoléculas como el DNA. Este método ha plantas
permitido la transformación de especies como: En la actualidad se han transformado aproximada-
arroz y maíz. mente 50 especies de plantas con características de
interés como resistencia a insectos, virus y herbici-
5 .4 . 4 B ombardeo de par tí c u l a s o das. Esto se debe a la disponibilidad de muy bue-
bi ol í s t i ca
nos sistemas de regeneración y de transformación
Este método fue desarrollado por Klein y colabora- para muchos cultivos de importancia económica
dores en 1987. Esta metodología utiliza un dispo- (Tabla 5.1). El carácter con mayor modificación
sitivo que dispara microproyectiles (esferas por ingeniería genética ha sido la resistencia a her-
diminutas de tungsteno o de oro, de 4 mm de diá- bicidas, seguido por la resistencia a insectos y a vi-
metro) recubiertos con el DNA foráneo que se rosis; y los cultivos más utilizados han sido la
quiere introducir en las células. soya, el maíz, la colza y el algodón.
El proceso se basa en la aceleración de las micro- Tabla 5.1 Siembras comerciales con cultivos
transgénicos en 1997. Fuente: James ,1997.
partículas, a través de un tubo en el cual se ha pro-
Cultivo % Caracteres % Países %
ducido vacío, a velocidades tales que permiten su
Soya 40 Resist. herbicidas 55 EE.UU 65
paso a través de la pared y membrana celulares, y
la integración del DNA foráneo al genoma de las Maíz 25 Resist. Insectos 30 China 14
células de los tejidos bombardeados (Figura 5.9).
Tabaco 13 Resist. Virus 15 Argentina 11
De los métodos de transformación directa, el mé-
todo biolístico es el más utilizado. Actualmente se Algodón 11 Otras ≈ 1 Canadá 10
ha transformado un número grande de especies,

Canola 10 Australia <1
muchas pertenecientes al grupo de la gramíneas.
Tomate 1 México <1
Papa 1
Figura 5.9 Diseño del equipo utilizado para la transformación genética de plantas mediante el bombardeo de partículas
o biolísticas. Fuente: Calderón, A. 1990.

Aunque la transferencia de características genéticas Los cultivos transgénicos de primera generación

que dependen de muchos genes (poligénicas), está (resistencia a herbicidas, a insectos y a virus) es-
todavía a nivel de investigación, la transferencia de tán impactando la agricultura, principalmente en
características monogénicas ya son procesos de ruti- países desarrollados. El crecimiento del área cul-
na para muchos cultivos. La rapidez con que se ob- tivada a nivel comercial, con cultivos transgéni-
tienen plantas transformadas con características cos ha sido espectacular en los últimos años: de
deseables es bastante sorprendente, por ejemplo: tres millones de hectáreas en 1990, pasó a 12 mi-
tres meses en arroz, cuatro meses en soya, etc. llones en 1997 y a 30 millones de hectáreas en
1998. De éstas, cinco millones se cultivaran en
La meta es utilizar esta tecnología para el mejora-
América Latina: cuatro en Argentina y una en
miento de características que no podrían ser mani-
México. Los cultivos más impactados han sido la
puladas por los métodos tradicionales (Tabla 5.2).
soya, el maíz, el algodón, la colza y la papa. Ade-
Hay que reconocer que la transformación de plantas
más de la ganancia económica para los agriculto-
ha sido uno de los mayores logros de la biotecnolo-
res por el aumento en las cosechas y el menor uso
gía y las aplicaciones futuras parecen estar limita-
de pesticidas, un beneficio importante del uso de
das sólo a nuestra imaginación.
cultivos transgénicos ha sido en la protección am-
Tabla 5.2 Algunas metas de la ingeniería genética de
plantas. Fuente: Chrispeels y Sadava (1994) biental : En 1997, en México y Argentina, el uso
1. Mejoramiento para el control de plagas y malezas de insumos químicos se redujo entre el 50 al 90%,
• Tolerancia a Herbicidas debido al cultivo comercial de transgénicos con
• Resistencia a virus
Bt resistentes a insectos.
• Resistencia a bacterias
• Resistencia a hongos
A continuación se presentan algunos de los logros
2. Mejoramiento de propiedades agronómicas
• Tolerancia a heladas de la ingeniería genética de plantas en la solución
• Tolerancia al estrés hídrico de algunos problemas que afectan los cultivos
• Tolerancia a la salinidad
modernos como es el ataque de enfermedades y
• Tolerancia a toxicidad por aluminio
3. Mejoramiento de la calidad postcosecha plagas, el control de malezas, el manejo de post-
• Retardar la maduración del fruto cosecha, etc.
• Retardar la senescencia floral
• Tomates con alto contenido de sólidos solubles 5.5.1 Resistencia a herbicidas
• Papas con alto contenido de almidón
• Hortalizas más dulces Los herbicidas son ampliamente utilizados en la
4. Contribuyendo al mejoramiento vegetal
agricultura para minimizar las pérdidas en los cul-
• Esterilidad masculina para la producción de semilla híbrida
5. Mejoramiento de la calidad nutricional tivos debido a la presencia de malezas.
• Semillas con alto contenido de metionina y lisina
• Forrajes ricos en animoácidos sulfurados
Algunos de estos herbicidas actúan inhibiendo
6. Mejoramiento de Compuestos de Uso Industrial ciertos procesos como la fotosíntesis, otros inhi-
• Aceites ben vías biosintéticas por ejemplo de aminoáci-
• Almidón
• Plástico
dos esenciales. Mediante la transgénesis, se
• Enzimas modifica el genoma de la planta para que produz-
• Fármacos ca una acción metabólica que lo proteja de un de-
7. Detoxificación de suelos contaminados
terminado herbicida.

Un herbicida bien conocido es el glifosato (N-fos-

FOSFINOTRICINA
fonometil-glicina). Este herbicida inhibe la enzima
5-enol-piruvil-shikimato-3-fosfato (EPSP) sinta- • Modo de acción
:
sa, bloqueando la vía biosintética de aminoácidos GLUTAMATO
aromáticos. La producción de plantas transgénicas

NH4 L – GLUTAMINA
resistentes a este herbicida se puede conseguir a Glutamato sintasa (GS)
través de dos vías: Inhibición
a .Por la introducción al genoma de un gen de origen FOSFINOTRICINA (PPT)
bacteriano (Aerobacter aerogenes) que codifica para
la enzima EPSP sintasa, que inhibe la acción del
• Producto del GEN BAR:
herbicida.
Fosfinotricina Acetil Transferasa (PAT)
b .Por la introducción al genoma vegetal del gen EPSP
Acetil– CoA
sintasa de origen vegetal bajo el control del promo- Acetil
tor CaMV35s. El resultado es el incremento de 40 Fosfinotricina Fosfinotricina
(Activa) (inactiva)
veces la actividad enzimática de la EPSP sintasa.
En ambos casos la tolerancia al herbicida fue debi- PAT
do a una sobreproducción de la enzima, por la ex- Figura 5.10 Tolerancia a la fosfinotricina.

presión del transgen. Fuente: Adaptado por Roca, W. (1997)
Se obtuvieron plantas transgénicas de tomate y

papa utilizando la primera estrategia y plantas Con este sistema se obtuvo plantas transgénicas re-
transgénicas de petunia, soya, maíz y otras, utili- sistentes al herbicida Basta en arroz y otros culti-
zando la segunda estrategia. vos.
Otro herbicida muy conocido es el Basta (fosfino- 5 . 5 . 2 R e si ste n c i a a i n se c t o s

tricina o PPT), el cual es un análogo del ácido glu-
Las pérdidas en la producción agrícola debido a
támico y actúa inhibiendo la enzima glutamina
enfermedades y plagas es bastante considerable.
sintetasa encargada del metabolismo del amonio
De los insectos plagas en la agricultura los más im-
en la planta. El efecto del herbicida es inhibido por
portantes son los Lepidopteros, siendo el costo por
la enzima fosfinotricina acetiltransferasa, codifica-
su control, sólo los Estados Unidos de 400 millo-
da por el gen "bar" cuyo origen es el hongo Strep-
nes de dólares para el año de 1995. El alto costo
tomyces hygroscopicus (Figura 5.10).
del control químico de los insectos plagas, justifica
Una planta transgénica resistente a este herbicida el desarrollo de plantas transgénicas resistentes, no
se obtiene por la introducción al genoma vegetal sólo para reducir los costos de producción, sino
del gen "bar" bajo el control del promotor también el deterioro del medio ambiente.
CaMV35s, u otros promotores. Se produce altos
Una estrategia clásica para el control de insectos
niveles de la enzima fosfinotricina acetiltransfera-
Lepidopteros ha consistido en el uso de bioinsecti-
sa la cual inhibirá el efecto del herbicida.
cidas basados en cepas de Bacilus thuringiensis
(Bt). El Bt produce una toxina que se liga a recep-
tores específicos de las células epiteliales del intes-

tino medio de la larva, desencadenando una serie Esto impide la liberación del DNA de la partícula
de eventos que conducen a la muerte de la misma. viral de la cepa virulenta.
Para la producción de plantas transgénicas resis- Utilizando esta estrategia se han obtenido plantas
tentes a Lepidopteros, se transfiere al genoma de la transgénicas resistentes a ciertas cepas de virus,
planta genes que codifican para las endotoxinas de mediante la introducción al genoma de la planta
Bt (genes cry). El uso del promotor CaMV35s lo- del gen que codifica para la proteína de la cubierta
gra una alta expresión del gen. Las plantas trans- del virus. Un ejemplo de esta estrategia son las
génicas expresan constitutivamente la toxina, que plantas transgénicas de tabaco con resistencia al
al ser ingerida por las larvas producirá su muerte. virus del mosaico del tabaco (TMV), plantas
transgénicas de tomate y papa resistentes a un am-
Otros genes usados para la producción de plantas
plio espectro de virus, incluyendo el virus del mo-
transgénicas resistentes a Lepidopteros son los
saico de la alfalfa, el virus del mosaico del pepino y
inhibidores de proteinasas (Inhibidores de Tripsina
los virus X y Y de la papa.
y de Quimiotripsina). Estos inhibidores bloquean
la actividad proteolítica de las enzimas digestivas Otra estrategia para inhibir la infección de algunos
de los insectos. Estos genes han sido aislados y virus RNA en las plantas es a través de RNAs saté-
transferidos a tabaco reduciendo significativamen- lites los cuales atenúan los síntomas de la enfer-
te el desarrollo de larvas como Manduca sexta. medad en las plantas infectadas. Los RNAs
Otros genes como las proteínas insecticidas vege- satélites, son secuencias cortas de RNA no necesa-
tativas (ViPs), la colesterol oxidasa, las quitinasas, rias para la propagación de los virus con que están
las peroxidasas, pueden ser utilizados para la ob- asociados, pero son replicadas y encapsidadas con-
tención de resistencia contra los insectos plagas de juntamente con las partículas virales. Utilizando
la agricultura. esta estrategia se obtuvo plantas transgénicas de ta-
baco resistentes al virus del mosaico del pepino
5 .5 .3 Res i s t enci a a vi rus (CMV).
Las enfermedades virales de las plantas constitu-
Una tercera estrategia para reducir la infección vi-
yen un serio problema para la agricultura, ya que
ral en plantas infectadas es mediante la técnica del
estos patógenos disminuyen significativamente el
RNA antisentido. Esta técnica se basa en la pro-
rendimiento de los cultivos.
ducción de un mRNAss (sin sentido) que es com-
Una de las estrategias utilizadas para la protección plementario al mRNAcs (con sentido) formando
de las plantas contra el ataque de virus es la deno- un híbrido de doble cadena que impide la traduc-
minada protección cruzada. Al infectar una plan- ción del mRNAcs (figura 5.11).
ta con una cepa atenuada del virus, la planta
Plantas transgénicas que produzcan mRNAs sin
adquiere resistencia al ataque de la cepa virulenta
sentido de alguna secuencia clave para la propaga-
del mismo virus. Aunque el mecanismo de la pro-
ción del virus, inhibirá su síntesis y por consi-
tección no es muy claro, se cree que se debe a la
guiente no se podrá formar la partícula viral.
sobreproducción de proteína de la cubierta del vi-
rus causada por la infección con la cepa atenuada.

5 .5 . 4 R es i s t enci a a hong o s pueden ser hidrolizados por las enzimas glucana-

Las pérdidas económicas de los cultivos debido al sas y quitinasas, respectivamente. Sin embargo, la
ataque de hongos patógenos es alta y la aplicación quitina de algunas especies de hongos puede ser
química es la vía clásica usada para el control de algo diferente a la de otras especies, por lo que una
estos patógenos. quitinasa en particular puede ser efectiva contra
una especie de hongo pero no necesariamente con-
Una estrategia transgénica empleada para produ-
tra otra especie.
cir plantas resistentes al ataque de hongos patóge-
nos es la introducción al genoma de la planta genes Por esta razón las plantas transgénicas con genes
que codifiquen para enzimas que degraden la pared de quitinasa serán resistentes sólo a aquellas espe-
celular del hongo. La pared celular del hongo con- cies de hongos cuya pared celular sea degradada
siste de dos polímeros: el glucan y la quitina que con la quitinasa específica.
mRNA Traducción
VIA NORMAL
Transcripción
Gen que será

controlado
ATGATC Producto Proteico
TACTAG
Transcripción
VIA CONTROLADA
m RNA
+
AUGAUC (A)N-3
Formación del RNA de
doble cadena que
inhibe la expresión
genética a nivel de la
1
3 -(A)N UACUAG
traducción del mensaje
genético
RNA de antisentido
(micRNA)
Transcripción
Gen que codifica
para el micRNA
GATCAT
CTAGTA
Figura 5.11 Mecanismo de la inhibición de la expresión genética mediante la técnica del RNA antisentido. Fuente:
Calderón y colaboradores, 1991.

5 .5 .5 R egul aci ón de l a madu r a c i ó n d e y la ACC oxidasa que cataliza la formación de eti-

frut os leno a partir de ACC.
La maduración de los frutos esta asociada con
La estrategia transgénica utilizada para retardar la
cambios fisiológicos como el ablandamiento, la
maduración del fruto es bloquear la actividad de la
conversión de almidón en azúcar, la pérdida de clo-
enzima ACC sintasa, utilizando la estrategia de
rofila, la síntesis de pigmentos rojos y la síntesis de
RNA antisentido.
compuestos aromáticos. Todos estos procesos es-
tán regulados por la fitohormona etileno. En la Las plantas transgénicas expresan una versión in-
biosíntesis del etileno (Figura 5.12) hay dos enzi- vertida del gen ACC sintasa, produciendo un RNA
mas claves que al ser bloqueadas se producirá su sin sentido que forma un híbrido con el mRNA con
inhibición. Estas son: la ACC sintasa que catali- sentido de la ACC sintasa, lo cual bloquea la tra-
za la formación del ácido 1-aminociclopropano-1- ducción (Figura 5.8). Esta técnica fue aplicada
carboxilico (ACC) a partir de S-adenosilmetionina con éxito en tomate donde se observó una gran re-
ducción en la síntesis de etileno y como conse-
cuencia un retardo en la maduración del fruto.
METIONINA
S – ADENOSILMETIONINA
ACC SINTASA
ÁCIDO 1 – AMINO – CICLOPROPANO – 1 CARBOXÍLICO
ACC OXIDASA
C2H4
Percepción por receptor de C 2H4
Señales
Degrada ción de Producción de

Estimula la Producción de
síntesis de la pared celular carotenoides sabores y aromas
etileno pigmentados volátiles
ACC Sintasa Celulasa Fitoenosintasa

Y ACC oxidasa Poligalacturonasa Desaturasa etc.
pectinesterasa
Figura 5.12 Regulación genética de la maduración del fruto del tomate. Fuente: Hobson y Grierson, 1993

5 .6 E j er ci ci o 5. 1 T r ans f o rm a c i ó n Un bioensayo.
genét i ca de pl ant as
Un método inmunológico.
Objetivos
Un método molecular.
• Desarrollar el concepto de transformación ge-
nética de plantas. • Presentar por escrito sus respuestas.
• Identifiar métodos que permitan detectar la pre- • Motive una discusión con base en las respues-
sencia y la expresión de un transgen en un culti- tas dadas.
vo transgénico. • Proporcione información de retorno, suminis-
Orientaciones para el instructor trando a los participantes las respuestas de este
ejercicio.
El siguiente ejercicio busca que los participantes
Recursos necesarios
realicen un análisis sobre posibles metodologías
• Papelógrafo, papel, marcadores.
que se pueden utilizar para diferenciar plantas
transgénicas de plantas no transgénicas en materia- • Cuatro mesas medianas y un sitio de trabajo.
les de una misma especie. • ocho plantas de tomate en materas o bolsas de
plástico.
Con este ejercicio se busca que los participantes fi-
• Fotocopias con las instrucciones e información
jen el concepto de transformación genética de de retorno para los participantes.
plantas y sus aplicaciones.
Tiempo estimado : 60 minutos.
trucciones: Con la información suministrada en la sección 5 y
• Suministre orientación general sobre los objeti- a través de la identificación de métodos biológicos,
vos del ejercicio. inmunológicos y moleculares para evaluar la inte-
• Ubique cuatro mesas en el sitio de trabajo. gración y expresión de genes en materiales trans-
• Colocar en cada mesa dos plantas de tomate ro- génicos, los participantes deberán construir el
tuladas A y B respectivamente. concepto de transformación genética de plantas.
• Conforme cuatro grupos de trabajo. Ubique • Conformen cuatro grupos de trabajo de acuer-
cada grupo en cada una de las mesas. do con las instrucciones dadas por el Instructor.
En cada grupo los participantes deben responder • Nombre un relator por grupo, el cual presentará
en plenaria las respuestas dadas por el grupo.
las siguientes preguntas:
• Presentar por escrito las respuestas a las si-
La planta A es transgénica, con un gen que le con- guientes preguntas:
fiere resistencia al cogollero (Tuta absoluta), y la
La planta A es transgénica, con un gen que le con-
planta B, es una planta no transgénica.
fiere resistencia al cogollero (Tuta absoluta), y la
a. ¿Las plantas A y B son fenotípicamente diferentes?
planta B, es una planta no transgénica.
Explique.
a. ¿Las plantas A y B son fenotípicamente diferentes?
b. ¿Las plantas A y B son genotípicamente diferentes?
Explique.
Explique.
b. ¿Las plantas A y B son genotípicamente diferentes?
c. Cómo podría diferenciar las plantas A y B utilizando:
Explique.

c. Cómo podría diferenciar las plantas A y B utilizan- detectar in situ o a través de una electroforesis de pro-
do: teínas de un extracto crudo foliar de las plantas A y B.
Un bioensayo. Después de una autorradiografía se presentará una "se-
ñal" en el extracto crudo de proteínas de la planta A, in-
Un método inmunológico.
dicando la presencia del producto del transgen.
Un método molecular.
Un método molecular
• Al final el instructor les proporcionará la infor-
mación de retorno de las respuestas a las pre- Mediante extracciones de DNA genómico de las plan-
guntas planteadas en este ejercicio. tas A y B. Se preparan filtros (Southernblots) con las
Tiempo sugerido: 60 minutos. digestiones de estos DNAs con una enzima de restric-
ción. Los filtros son hibridizados con una "sonda"
Respuestas a las preguntas realizadas en este construída con el transgen incorporado en la planta
ejercicio. transgénica. Después de una autorradiografía sólo en el
La planta A es transgénica, con un gen que le con- DNA de la planta A se presentará una "mancha" (ban-
fiere resistencia al cogollero (Tuta absoluta), y la da) indicacdo la presencia del transgen en la planta A.
planta B, es una planta no transgénica. Esta "señal" no se presentará en el DNA de la planta B.
Para la pregunta a B i b l i o g r a fí a
No son diferentes fenotípicamente. Lo único que tiene B e i j e r s be r ge n, A ., H ooyka a s , P .J . 1993. The Vi r ul ence
S ys t e m of A gr oba c t e r i um t ume f a c i e ns. En: Nest er , E.
diferente la planta A es el transgen que le confiere resis- W ., V e r na , D . P . S . ( e ds .) . A dva nc es i n M ol ecul ar
G e ne t i c s of P l a nt - M i c r obe I nt e r a ct i ons. Kl uwer
tencia al cogollero (Tuta absoluta). La diferencia es fi- A c a de mi c P ubl i s he r s . T he N e t he r l a nd s. P. 37- 49.
siológica no morfológica. C a l de r ón, A . 1990. T é c ni c a s bá s i c a s de I ngeni er í a
G e né t i c a e n P l a nt a s . E n: J a r a mi l l o, J., Agudel o, O.
Para la pregunta b ( e ds .) . L a N ue va B i ot e c nol ogí a , F undam ent os, Usos y
P e r s pe c t i va s . S e m i na r i o r e a l i z a do e n I CA en M ayo
Sí son genotípicamente diferentes. El genoma de la 15- 26 de 1989. I C A , P a l mi r a , C ol ombi a. p. 177- 191.
C a l de r ón, A ., R oc a , W . M . y J a yne s , J . 1991. I ngeni er í a
planta A presenta un gen adicional, que es el transgen G e né t i c a y C ul t i vo de T e j i dos . E n : Roca, W . ,
que le confiere resistencia al cogollero, el cual no está M r ogi ns ki , L . A . ( e ds .) . C ul t i vo de Tej i dos en l a
A gr i c ul t ur a , F unda me nt os y Apl i caci ones.
presente en el genoma de la planta B. P ubl i c a c i ón C I A T N o. 151. C I A T , C a li , Col om bi a. p.
733- 753.
Para la pregunta c C hr i s pe e l s , M . J ., S a da va , D . E . 1994. P l ant , Genes, and
A gr i c ul t ur e . J one s a nd B a r t l e t P ubl isher s. Bost on.
Un bioensayo U S A . 478 p.
I nt e r na t i ona l S e r vi c e f or t he A c qui s i t i on o f Agr i - Bi ot ech
Infestando las plantas A y B con larvas del cogollero. A ppl i c a t i ons ( I S A A A ) . 1997.
Las plantas sobrevivientes o menos afectadas serán J a me s , C . 1997. G l oba l S t a t us O f T r a ns ge nic cr ops i n 1997.
plantas A (transgénicas). Las plantas afectadas por el I s a a B r i e f s N o 5. I S A A A . I t ha c a , N .Y.
cogollero serán plantas B. L i nds e y, K ., y J one s , M . G . K . 1992. B i ot e c nol ogí a Veget al

A gr í c ol a . E di t or i a l A c r i bi a , S .A . Z a r agoza, España.
276 p.
Un método inmunológico
W a t s on, J .D ., G i l ma n, M ., W i t kow s ki , J . , y Zol l er , M .
Si se tienen anticuerpos contra el producto génico (toxi- 1992. R e c om bi na nt D N A . A s hor t Cour se. Second
e di t i on. S c i e nt i f i c A m e r i c a n B ooks . W . H. Fr eem an
na) marcados con el radioisótopo yodo 125, es posible a nd C ompa ny. N e w Y or k. U S A . 626 p.


110
Transformación Genética de Plantas
Construcción
Genética Transformación
Bombardeo de genética vía Agrobacterium
partículas o biolísticas
Explante
Explante o protoplastos CO - cultivo
medio de selección
Prueba de Ensayos
Pruebas
transgénesis agronómicos y de
genéticas
bioseguridad
Mejoramiento
Mercado
convencional

CEDAF
CEDAF
Objetivos

• Conocer los fundamentos de la
transformación genética de plantas.
• Conocer los dos métodos más

utilizados para transformar plantas.
111
112
¿Qué es la transformación
genética de plantas?
Es la introduc ción de genes modificados

(genes quiméricos) al interior de las
células vegetales utilizando un método
apropiado.
El gen introducido es incorporado

de manera estable al genoma vegetal.

CEDAF
CEDAF
¿Qué es la transformación
genética de plantas?

• Es la introducción de genes modificados (genes quiméricos) al
genoma de las células vegetales, utilizando un método apropiado (vía
Agrobacterium o mediante el bombardeo de partículas o biolística).
• El gen introducido debe incorporarse de manera estable al genoma de la

célula vegetal y ésta debe regenerar una planta normal que exprese el
transgen.
113
114
¿Por qué transformar plantas?
• Las plantas proporcionan el 90% de las

colonias y el 80% de las proteínas que
consumimos en nuestras dietas.
• Muchas características de interés

agronómico, presentes en espacies no
re lacionadas, no pueden ser
transformadas por mejoramiento convencional.

CEDAF
CEDAF
La Ingeniería Genética y la
transformación genética
de plantas
• Superan las barreras de cruzabilidad

permitiendo la transferencia de genes de interés.
• Permiten un mejoramiento dirigido

(transferencia de uno o pocos genes).
• Reducen significativamente el tiempo en la

producción de nuevas variedades.
• Reducen significativamente el costo de la

producción agrícola.
• Contribuyen a la protección del medio

ambiente, por la disminución en el uso de agroquímicos.
115

Pe r s p e c t i v a s f u t u r a s d e l a
Biotecnología Vegetal
Sección 6

Sección 6 . Perspe c t i v as fu t u r as de l a B i ot e c n ol ogí a V eg et a l
Tabla de Contenido
Estructura de la Sección . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
Preguntas orientadoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
6.1 Relaciones institucionales y la biotecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
6.2 Costo - beneficio de la biotecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
6.3 Propiedad intelectual y comercialización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
6.4 Producción de alimentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125
6.5 Ejercicio 6.1 Perspectivas futuras de la Biotecnología Vegetal . . . . . . . . . . . . . 125
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
Originales para trasparencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127

Perspectivas Futuras de La Biotecnología Vegetal
Bioseguridad Costo / Beneficio de la Propiedad Intelectual

Biotecnología
• Patentes
• Ensayos de Riesgo
Objetivos

• Conocer algunos factores que se consideran podrían ser causa de riesgo por la introducción de cultivos
transgénicos al campo.
• Entender por que los cultivos transgénicos son seguros.
Preguntas orientadoras
1. ¿Sabían ustedes que en un futuro no muy lejano muchos de los productos como fármacos, vitaminas, vacunas
hormonas, etc., van a ser producidos en plantas las cuales serán utilizadas como bioreactores?
2. ¿Algunos de los participantes nos puede decir que es bioseguridad en biotecnología?
3. ¿Ustedes piensan que los cultivos transgénicos representan un riesgo para la salud humana, el medio ambiente
o la biodiversidad?

In tro d u c ci ón de nuestra alimentación y economía. También es

No cabe duda de que estamos entrando al siglo de importante el estudio de la regulación de la expre-
la biotecnología. El mapeo y secuenciación de ge- sión génica durante el desarrollo de la planta para
nomas está en rápida transición hacia la genómica saber en que momento se pueden "activar" o "de-
funcional. Esta se refiere al uso de la información sactivar" genes, en el sitio apropiado de la planta y
de la genómica estructural para identificar funcio- en el tiempo preciso. Con este conocimiento es po-
nes y secuencias que permitan descubrir y clonar sible modificar algunos procesos de desarrollo de
fragmentos de DNA grandes en cromosomas arti- las plantas tales como: floración, la formación de
ficiales de bacterias (BAC). Por otro lado, cada vez semilla, el tiempo de formación del fruto, etc.
es más factible las transformaciones oligogénicas, Además es posible manipular los procesos de for-
abriendo así paso a las modificaciones de caracte- mación gamética para la obtención de plantas an-
res complejos (QTLs) de plantas. Debido al in- droestériles cuando se desee, o alterar los factores
menso volumen de información y de datos que se de la incompatibilidad para lograr la fertilización
generan en los estudios genómicos, se han diseña- entre especies no relacionadas.
do sistemas electrónicos de manejo y comparación Los efectos de genes indeseables podrán ser con-
de datos para la masificasión de las operaciones trolados mediante la técnica de RNA antisentido
genómicas. Así, se produce una convergencia en- como en el caso del bloqueo de la biosíntesis del
tre la biología y la computación, lo que se ha deno- etileno para retardar la maduración de los frutos.
minado "bioinformática". De igual manera, la A mediano-largo plazo, la biotecnología ofrece he-
física y la mecánica se han unido para dar paso al rramientas para un mejor manejo de la agricultura,
uso de la "robótica" en biotecnología. con el componente de sostenibilidad. Entre las
Actualmente se han logrado avances con plantas aplicaciones más notables se encuentran:
modelo. Una de estas plantas es la Arabidopsis, 1. La reducción de insumos químicos, por medio de la
que es la planta floral con genoma más pequeño. generación de biopesticidas, contribuyendo a estra-
La secuenciación del genoma de Arabidopsis tegias de control biológico.
avanza a una tasa de 200 genes por mes. Una vez se 2. El mejoramiento de sistemas biológicos naturales,
tenga descifrado todo el genoma de Arabidopsis como la fijación biológica de nitrógeno, el aumento
(año 2001), se tendrá un catálogo completo de to- de la eficiencia del reciclaje de nutrientes en la ri-
dos los genes que participan en todo el ciclo de zosfera y el desarrollo de variedades tolerantes a
problemas de suelo como toxicidad por aluminio,
vida de una planta superior. La secuenciación del
deficiencia de fósforo y azufre, tolerancia a sequía y
genoma del arroz también avanza rápidamente. salinidad.
En la actualidad se dispone de un buen número de 3. Reforestación, mediante la multiplicación masiva de
vectores para la transferencia de genes foráneos a plantas para la siembra.
la plantas. Los genes transferidos se integran al ge- 4. Recuperación de aguas y suelos contaminados, por
noma de la planta donde se expresan y son hereda- medio de la bioremediación (por microorganis-
dos de una generación a otra. Aunque en este mos).
momento no es posible la transferencia de genes a
Considerando sólo a la bioingeniería estamos pa-
todos los cultivos de importancia económica, mu-
sando por una rápida evolución de los productos
cha de la investigación está encaminada en encon-
generados, por ejemplo:
trar vectores apropiados para la transformación
genética de dichos cultivos. 1. Entre 1995 - 2001 : Rasgos agronómicos como resis-
tencias a insectos, virus y herbicidas.
Existe una gran prioridad por la identificación de
2. 2002 - 2005 : Rasgos de calidad de alimentos: aceites
genes de importancia agronómica y/o económica vegetales, carbohidratos (almidón, azúcares)
para ser introducidos a los cultivos que son la base

3. 2006 - 2010 : modificación de la arquitectura y pro- nes oficiales de salud, alimentos, y ambientales, de
cesos fisiológicos de la planta (fotosíntesis). varios países crearon regulaciones para evaluar po-
4. 2011 - 2020: modificaciones para usar a plantas sibles riesgos de plantas transgénicas, sobretodo al
como bioreactores para producir productos de alto realizar ensayos de campo.
valor agregado: fármacos, vitaminas, vacunas, etc.
La transformación genética de plantas ofrecen un 6.1.2 Evaluación de riesgo
gran potencial para la producción de productos de La evaluación de riesgo de las plantas transgénicas
importancia para la salud y la economía como: no se realiza porque éstas sean intrínsecamente pe-
factores sanguíneos, hormonas de crecimiento, ligrosas o riesgosas para la salud, el ambiente, o la
neuropeptidos, biopolímeros, etc. De igual mane- biodiversidad. La razón fundamental para esta
ra, muchos otros productos de la industria de ali- evaluación reside en la poca experiencia que tene-
mentos y farmacéutica podrán ser obtenidos a más mos en el manejo de las plantas y alimentos trans-
bajo costo. génicos. Por el contrario la ingeniería genética, en
Ahora que reconocemos que tales perspectivas son contraste al mejoramiento comercial, aumenta
posibles en un futuro muy cercano, es importante grandemente el factor precisión a lo referente a la
conocer las implicaciones económicas, sociales y composición genética que se usa en la transferen-
medio ambientales de la biotecnología vegetal en cia a nivel de secuencias específicas del gen de in-
los países desarrollados y en los países en desarro- terés, el promotor, las secuencias de iniciación y
llo. terminación de la lectura y los marcadores de se-
lección. A mayor precisión, debemos esperar ma-
6 .1 R el aci ones i ns t i t uci o n a l e s y l a yor predictibilidad del resultado de la
B i ot ecnol ogí a recombinación genética mediante transformación,
en contraste a la recombinación que se obtiene en
La biotecnología moderna ofrece gran potencial
el mejoramiento comercial.
para alterar, controlar y monitorear la genética de
las plantas. Este poder tecnológico puede impactar Mientras que la evaluación de riesgo es un paso
directa e indirectamente en la agricultura, el co- científico estratégico, el manejo del riesgo es insti-
mercio, el medio ambiente y la biodiversidad. tucional y depende de cada país. La experiencia
Como consecuencia se han generado preocupacio- ganada indica que la evaluación debe estar basada
nes biológicas y socioeconómicas en la sociedad, en la naturaleza del organismo y el ambiente al que
lo que se ha traducido en regulaciones de la investi- se introduce y el transgen en cuestión, y el grado de
gación y desarrollo de la biotecnología. familiaridad que se tiene para cada factor.
Entre los posibles factores a considerar en la eva-
6 .1 . 1 B i os eguri dad luación de riesgo de la introducción de cultivos
Este término se refiere a las políticas y mecanis- transgénicos al campo, se encuentra:
mos que se establecen para prevenir posibles ries- a. Flujo de transgenes a parentales silvestres,
gos de la tecnología del DNA recombinante y de la b. Toxicidad del transgen para humanos y mamíferos,
transformación genética de plantas en la salud, el c. Adquisición de caracteres de maleza,
medio ambiente y la biodiversidad. d. Efectos alergénicos de la planta / alimento transgé-
En 1975, apenas tres años después del descubri- nico,
miento de la tecnología del DNA recombinante, e. Creación de nuevos patógenos por efecto del trans-
los científicos se autoimpusieron regulaciones gen (por ejemplo, virus),
para seguir prácticas seguras en la investigación f. Flujo del transgen a microorganismos del suelo, etc.
genética molecular. Posteriormente las institucio-

A continuación haremos una breve descripción de plantas transgénicas que en situaciones típicas
los posibles riesgos más importantes: de infección viral.
a. Flujo de transgenes a otros cultivos. Cultivos como • La proteína del virus producida por el cultivo
el maíz, trigo, fríjol, etc. han experimentado durante
transgénico podría combinarse con virus natu-
el curso de su evolución, hibridizaciones con sus
parientes silvestres más cercanos. Dado que esos rales y producir cepas más virulentas. Mientras
cultivos son altamente domesticados, es poco posi- que esto puede ser teóricamente posible, el rie-
ble que un solo trasngen, o unos pocos transgenes, go es demasiado bajo.
sean capaces de convertirlos en malezas pernicio- • Genes virales diferentes a los genes de la capa
sas. Se estima que el carácter maleza depende de proteica. Los genes que codifican por RNAs y
por lo menos de la acción conjunta de 6 - 7 genes. no proteínas pero que confieren resistencia,
En el caso de cultivos semidomesticados, el análisis
científicamente no presentan riesgo. Otros ge-
debería ser más cuidadoso.
nes virales que decrecen la infección de un vi-
b. Flujo de genes a plantas silvestres. Cuando los culti- rus pero que aumenta la de otro, deberán ser
vos transgénicos crecen muy próximos a parientes
mutados para poder recibir aprobación.
silvestres cercanos, es posible que ocurra la transfe-
rencia del transgen por hibridización. En algunos d. Efecto de bioinsecticidas transgénicos en objetivos
casos, el efecto podría ser un aumento de la agresi- no intencionales. Las plantas transgénicas Bt son
vidad de la maleza, o la adquisición del razgo o ca- las más relevantes. Las proteínas Bt son altamente
rácter, conferido por el transgen, por parte del específicas en su efecto tóxico, a nivel del grupo de
silvestre. La evaluación del riesgo debe incluir el insectos, (por ejemplo: lepidopteros) y de su "blan-
análisis caso por caso del flujo de genes y su posible co", en el tracto digestivo de la larva. Algunas de
efecto o impacto en los silvestres y/ o malezas. esas proteínas han mostrado efecto negativo en los
insectos benéficos. Se ha demostrado también que
c. Plantas transgénicas conteniendo secuencias de vi- las proteínas Bt se digieren rápidamente en el tracto
rus. Algunas de las preocupaciones expresadas in-
humano, por lo que no sería un riesgo para la salud
cluyen:
humana.
• Las proteínas virales podrían desencadenar e. Adquisición de resistencia por el insecto plaga. Esta
reacciones alérgicas si se encuentran en los ali- es una gran preocupación sobre todo referida al caso
mentos. Dado que muchos alimentos se consu- de los genes Bt. Hay dos estrategias que se siguen
men estando infectados por virus sin efectos para minimizar esta posibilidad :
deletéreos en humanos, esta preocupación se 1. La siembra de cultivos transgénicos intercalados con
está descartando. no transgénicos en forma de mosaico, de tal manera
• Plantas resistentes a virus, pueden tener venta- que ofrecen plantas "refugio" para los insectos sus-
ja competitiva en el campo, y ser fuente de ge- ceptibles y así bajar la presión.
nes que se transfieren a malezas. Como se 2. Desarrollar construcciones genéticas conteniendo
discutió arriba, debe ser evaluado caso por dos o mas genes Bt con sitios de acción diferentes
caso. (receptores diferentes) en las membranas del intesti-
no medio de las larvas del insecto. Estudios realiza-
• Pueden crearse nuevos virus por recombina- dos han mostrado que la resistencia adquirida por el
ción entre el transgen y el virus que infectan si- insecto en condiciones artificiales es recesiva, lo
multáneamente la planta. Se conoce que cual indica que se requerirá doble copia del alelo re-
muchas plantas son infectadas simultáneamen- cesivo para ser efectiva. Las plantas refugio son una
te con virus múltiples. Sin embargo, en pocos estrategia para retardar la resistencia del insecto a
casos se ha confirmado la recombinación gené- las toxinas de Bt.
tica entre virus diferentes. Pero no hay eviden- f. Flujo de transgenes a microorganismos. Muy poco
cia que la recombinación sea más frecuente en se conoce sobre este tema, lo cual hace difícil la
evaluación de este riesgo potencial. Se sabe que las

bacterias del suelo pueden obtener DNA de su am- cola. Dos preguntas pueden hacerse en relación a
biente y que el DNA puede permanecer adherido a este tema:
partículas del suelo, pero esta posibilidad es poco 1. El transgen incorporado cumplirá una función im-
probable. Cualquier riesgo potencial se elimina ha- portante en el área geográfica escogida? Algunas
ciendo construcciones que no pueden ser usadas por evidencias demuestran que los genes utilizados
las bacterias, por ejemplo, construcciones conte- para el control de una plaga en un país temperado,
niendo intrones. Es aún menos probable la transfe- no funciona en un país tropical. Por ejemplo, para el
rencia de DNA a hongos del suelo, dado que es logro de la resistencia al virus del anillado de la pa-
mucho más difícil. paya vía transformación genética, las construccio-
g. Efectos sobre la biodiversidad. Se refiere principal- nes tuvieron que ser diseñadas con cepas locales del
mente a dos casos: virus. Un caso similar se presentó con el control de
larvas de ciertos lepidopteros del algodón.
1. Flujo de transgenes de cultivos transgénicos a male-
zas o silvestres emparentados. Como se discutió También se debe tener en cuenta el sistema agríco-
arriba, este posible riesgo debe ser evaluado caso la de la región. Por ejemplo, mientras que en cier-
por caso, dependiendo de la cercanía taxonómica, tos países temperados el agricultor adquiere la
cercanía del cultivo a sitios de variabilidad nativa, semilla híbrida cada año, en algunos países tropi-
grado de polinización cruzada, duración de vida del
cales sólo lo hacen cada tres años. Una resistencia
polen después de la dehiscencia, sincronización de
la floración, presencia de insectos u otro tipo de vec- transgénica perderá su valor en un porcentaje con-
tores, etc. siderable de la semilla híbrida después del segun-
do y tercer año. Esto amerita una mayor inversión
Es importante tomar en cuenta que este tema es
de recursos para encontrar genes mas apropiados y
más relevante en los trópicos que en áreas tempe-
un sistema más eficiente de distribución de la se-
radas. En el trópico, la biodiversidad es mucho
milla acorde con el lugar.
mayor y los cultivos son continuos, debido a que
no se presentan las cuatro estaciones que ocurren 2. ¿Por cuánto tiempo el transgen continuará sirvien-
do?. Este tema se refiere a la posibilidad de adapta-
en las áreas temperadas.
ción de insectos, patógenos, y malezas a los
2. Erosión genética. La preocupación va dirigida al he- pesticidas y a las variedades que contienen el trans-
cho de que las variedades transgénicas reemplaza- gen. Este punto ya se discutió arriba en relación al
rían a las variedades utilizadas por el agricultor, caso de genes Bt. Lo importante de las estrategias
disminuyendo de esta forma la biodiversidad. Aun- actuales es lograr la disminución de los insectos re-
que esto es teóricamente posible, en la práctica se sistentes mediante métodos y técnicas de manejo del
espera que las variedades transgénicas sean cultiva- cultivo y de la plaga. Es necesario recordar que la
das principalmente en áreas de agricultura comer- variedad transgénica por si sola muchas veces no es
cial, donde tradicionalmente se cultivan las la solución, sino que es un componente importante
variedades mejoradas y material transgénico. Lo para ser integrado en sistemas de manejo del cultivo
importante es incentivar a los agricultores para la y de la plaga.
conservación in situ de la biodiversidad.
La Tabla 6.1 muestra el aumento significativo de
6 .2 C os t o - benef i ci o de l a ensayos de campo con plantas transgénica y el área
B i ot ecnol ogí a sembrada comercialmente con cultivos transgéni-
cos tanto en países desarrollados como en desarro-
Toda tecnología nueva debe ser evaluada en térmi- llo. Se estima que para el año 2006, el 60% de los
nos de sus beneficios y costos. Algunos de los productos derivados de soya y el 80% de los del
problemas que se presentaron hace 30 años con la maíz tendrán su origen en cultivos transgénicos a
llamada Revolución Verde, deberán ser enfrenta- nivel global.
dos una vez más en el caso de biotecnología agrí-

Tabla 6.1 Número de ensayos de campo con plantas transgénicas y áreas sembradas con cultivos transgénicos
comerciales. Fuente: James, C. (1998).
Número de ensayos de campo (evaluación de bioseguridad)
Periodo No. de países No. de cultivos No. de caracteres Total número de ensayos
1986 - 95 34 56 6 15,000
1996 - 97 45 60 10 10,000
Total 1986 - 1997 45 60 10 25,000
Area con cultivos comerciales transgénicos (millones de hectáreas)
1996 1997 1998
TOTAL 3 13 30 (*) (**)

* EE.UU. (70%), Canadá (15%), Otros (15%)
** Países en Desarrollo: Argentina (4 millones hectáreas), México (1 millón hectáreas
6 .3 Pro p i edad i nt el ect ual y Una forma de asegurar el acceso a la tecnología y a

c o m er ci al i z aci ón productos para su comercialización ha sido a tra-
Desde sus inicios en 1973 - 75 la biotecnología lla- vés de arreglos de propiedad intelectual. A parte
mó la atención por su potencial de comercializa- del clásico registro de variedades para asegurar el
ción. Lo interesante es que aún los experimentos derecho de obtentor (UPOV), la biotecnología ha
más básicos de laboratorio rápidamente encuen- generado una ola de patentamiento de genes, se-
tran un camino hacia la productividad y comercia- cuencias, mapas genómicos, sondas, tecnologías,
lización. Numerosas compañías de biotecnología y otros procesos. En países como EE.UU., sólo
han sido creadas, sobre todo en los países desarro- hasta ahora fue posible el patentamiento de plantas
llados. La mayoría de estas compañías tenían ob- transgénicas. Se estima que cada mes se registran
jetivos más tecnológicos que comerciales. Las entre 50 - 100 nuevas patentes en biotecnología a
exitosas compañías pequeñas fueron rápidamente nivel global.
adquiridas por multinacionales dedicadas a la co-
mercialización de semillas y/o agroquímicos. En 6 . 3 . 1 P a te n te s
otros casos, estas pequeñas compañías recibían ju- Entre 1992 - 96 , el 35% de todas las patentes ha-
gosos contratos de las multinacionales para la ela- bían sido registradas en EE.UU., y un porcentaje
boración de productos o procesos específicos. Los igual en el Japón. Seguido se encuentran Europa
últimos años han sido testigos de asociaciones, ad- (18%), Rusia (6%), y el resto del mundo (6%), con
quisiciones, fusiones y compras de muchas de es- China y Corea como las más importantes.
tas compañías biotecnológicas por parte de La carrera de patentamiento y otras formas de pro-
multinacionales de semillas, agroquímicos y fár- tección de la propiedad intelectual ha traído consi-
macos. La motivación más importante de estos go cambios importantes en las estrategias de
procesos ha sido la conquista y colonización del investigación, sobre todo en biotecnología: Por
mercado mundial de los productos biotecnológi- ejemplo, antes de iniciar un trabajo de transforma-
cos, sobre todo el de semillas y fármacos. Para te- ción genética, es necesario determinar el número
ner una idea de la importancia económica de la de patentes y derechos distintos que existen en los
industria biotecnológica, vale la pena mencionar diferentes países al igual que de los procesos del
que en 1998 el monto total de estas transaciones a plan de investigación. Es necesario llegar a arre-
nivel global fue de 8 mil millones de dólares. glos con los dueños de las patentes para obtener la

libertad de operación necesaria. Otro aspecto es el 6 . 5 E j e rc i c i o 6 . 1 P e r s p e c t i v a s f u t u r a s

que se refiere a las patentes que confieren derecho de la Biotecnología Vegetal
sobre toda la estructura genética de la variedad, Objetivos
sobre todos los genes que se aíslen y aún aquellas
que confieren derechos genéticos sobre una meto- • Elaborar el concepto de bioseguridad.
dología y su aplicación. Sin embargo, ya existen • Identificar algunos factores que deben ser consi-
casos de revisión por parte del poder judicial de derados en la evaluación de riesgo cuando los
aquellas patentes genéricas. El desafío que presen- cultivos transgénicos son introducidos al campo.
ta el patentamiento en biotecnología es promover Orientaciones para el instructor
la innovación a través de la incentivación del inno- Con este ejercicio se pretende que los participantes
vador y evitando monopolios, para facilitar inno- asimilen el concepto de bioseguridad a través de la
vaciones futuras. Para lograr este objetivo, el identificación de algunos factores que deben ser
Estado debe cumplir un papel importante evitando considerados en la evaluación de riesgo debido a la
la propiedad intelectual de procesos fundamenta- introducción de cultivos transgénicos al campo.
les, permitiendo solamente la propiedad intelec-
tual de procesos y productos finales, con el fin de
incentivar la innovación futura. El aumento sus-
trucciones:
tancial de la inversión en fitomejoramiento y bio-
tecnología depende mucho de las campañas • Suministre información general sobre los objeti-
promocionales que motiven la cooperación entre el vos del ejercicio.
sector público y privado. • Ubique cuatro mesas en el sitio de trabajo.
• Colocar en cada mesa, una planta de tomate.
6 .4 P r oducci ón de al i m en t o s
• Conforme cuatro grupos de trabajo y ubique
La seguridad alimentaria depende del desarrollo cada grupo en cada una de las mesas.
social, económico y tecnológico de un país o re-
• En cada grupo de trabajo los participantes deben
gión. Por lo tanto, el papel de la biotecnología, así
identificar factores que ellos consideren deben
como el de otras tecnologías de punta, debe ser vi-
ser tenidos en cuenta en la evaluación de riesgo
sualizado en el contexto de dicha realidad. Es ne-
cuando cultivos transgénicos de tomate son in-
cesario tener en cuenta la posición del país en el troducidos al campo.
contexto de la economía regional y global, el desa-
rrollo de su exportación/importación de productos • Elaborar una lista de los factores que fueron con-
agrícolas, la importancia de la pequeña, mediana y siderados para la evaluación de riesgo en culti-
grande agricultura en la economía del país, la capa- vos transgénicos de tomate.
cidad de investigación y el potencial tecnológico • Motive una discusión con base a las respuestas
de este, la existencia de instituciones y normas/re- dadas.
gulaciones para estimular el desarrollo tecnológi- • Proporcionar la información de retorno, con la
co. De esta forma, países con una tecnología fuerte lista de algunos factores que deben ser conside-
pueden utilizar la biotecnología para aumentar su rados para la evaluación de riesgo para el cultivo
agricultura hacia la diversificación de productos, si transgénico de este ejercicio.
es un país buen agroexportador, o pueden aumen- Recursos necesarios
tar su agricultura hacia la autosuficiencia, si se tra-
ta de un país agro importador. • Papelógrafo, papel, marcadores.
• Cuatro mesas medianas y un sitio de trabajo.

• Cuatro plantas de tomate en materas o bolsas de B i b l i o g r a fí a

plástico. J a me s , C . 1998. G l oba l R e vi e w of Com m er ci al i zed
T r a ns ge ni c C r ops . 1998. I S A A A B r i e fs No 8. I SAAA
• Fotocopia de las instrucciones e información de I t ha c a , N .Y .
retorno. P e r s l e y, G . J ., G i ddi ngs , L . V ., a nd J um a, C. 1992.
B i os a f e t y: T he S a f e A ppl i c a t i on of B iot echnol ogy i n
Tiempo sugerido: 60 minutos. A gr i c ul t ur e a nd t he E nvi r onme nt . The W or l d
B a nk/ I nt e r na t i ona l S e r vi c e f or N a t i onal Agr i cul t ur al
Instrucciones para el participante R e s e a r c h ( i s na r ) .
Los participantes tendrán la oportunidad de cons- K r a t t i ge r , A . F ., a nd R os e ma r i n, A . ( e ds .) . 1 994. Bi osaf er y
truir el concepto de bioseguridad de acuerdo a la in- f or S us t a i na bl e A gr i c ul t ur e : S ha r i ng Bi ot echnol ogy
R e gul a t or y E xpe r i e nc e s of t he W e s t er n Hem i spher e
formación suministrada en la Sección 6 y mediante I nt e r na t i ona l S e r vi c e f or t he A c qui si t i on of Agr i -
la identificación de algunos factores que deben ser bi ot e c h A ppl i c a t i ons ( I S A A A ) : I t ha c a and St ockhol m
E nvi r onme nt I ns t i t ut e ( S E I ) . S t oc kh ol m . Sweden.
considerados para la evaluación de riesgo cuando se 278 p.
liberan al campo plantas transgénicas de tomate.
Instrucciones
• Conformen cuatro grupos de trabajo de acuerdo
a las instrucciones dadas por el instructor.
• Nombren un relator por grupo, el cual presentará
en plenaria los resultados obtenidos por el gru-
po.
• Realizar un listado de los factores que ustedes
piensen deben ser considerados en la evaluación
de riesgo cuando cultivos transgénicos de toma-
te son introducidos al campo.
• Al final del ejercicio, el instructor le proporcio-
nará la información de retorno.
Cultivo transgénico Factores de riesgo en la evaluación

Tomate 1 Flujo del transgen a parientes silvestres.
2 Toxicidad del transgen para la salud humana y animal.
3 Efectos alergénicos de la planta transgénica usada como alimento.
4 Flujo del transgen a microorganismos.
5 Flujo de polen (vectores), viabilidad del polen.

Ori g i n a l e s pa r a t r a sp a r e nc i a s

128
Perspectivas Futuras de La Biotecnología Vegetal
Bioseguridad Costo / Beneficio de la Propiedad Intelectual

Biotecnología
• Patentes
• Ensayos de Riesgo

CEDAF
CEDAF
Objetivos

•
Conocer algunos factores que se consideran podrían ser causa de riesgo
por la introducción de cultivos transgénicos al campo.
•
Entender por que los cultivos transgénicos son seguros.
129
130
¿Qué es biodiversidad?
Son las políticas y mecanismos que se establecen para prevenir posibles

riesgos de la tecnología del DNA recombinante y de la transformación genética
de plantas en la salud, el medio ambiente y la biodiversidad.

CEDAF
CEDAF

¿Por qué se realiza la evaluación de riesgo?
• Se realiza, no , porque las plantas transgénicas sean

peligrosas o riesgosas para la salud, el ambiente o la biodiversidad.
• Se realiza para ganar experiencia en el manejo de este tipo de cultivos.
131
132
Evaluación de algunos factores de riesgo
• Flujo de genes de cultivos transgénicos a otros cultivos.

• Flujo de genes de cultivos transgénicos a malezas.
• Flujo de genes de cultivos transgénicos a plantas silvestres.
• Efecto de bioinsecticidas transgénicos con objetivos no intencionados.
• Desarrollo de resistencia del insecto plaga al bioinsecticida del transgen.
• Flujo de genes a microorganismos.
• Erosión genética.

CEDAF
Anexos

Anexos
Anexo 1. Evaluación final de conocimientos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
Anexo 2. Evaluación final de conocimientos - Información de retorno . . . . . . . . . . 138
Anexo 3. Evaluación del evento de capacitación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142
Anexo 4. Evaluación del desempeño del instructor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144
Anexo 5. Evaluación de los materiales de capacitación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145
Anexo 6. La Biotecnología Vegetal en la República Dominicana . . . . . . . . . . . . . . 146
Anexo 7. Glosario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149

Anexo 1. Evaluación final de conocimientos
1. Defina en forma amplia el concepto de biotecnología.
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
2. En el siguiente cuadro colocar las principales diferencias entre biotecnología de primera, segunda y tercera genera-
ción.
Biotecnología Características
De primera generación
De segunda generación
De tercera generación
3. ¿Qué eventos claves permitieron el desarrollo de la biotecnología vegetal?
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
4. La totipotencia es la capacidad que tienen las células somáticas vegetales de regenerar una planta completa cuando
son cultivadas en medios y condiciones adecuados. Explique como fue demostrado este fenómeno.
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
5. En el cultivo in vitro de células, tejidos y órganos vegetales generalmente se siguen cuatro pasos fundamentales. Expli-
que cuales son.
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
6. La aplicación del cultivo de tejidos vegetales se da básicamente en tres áreas. Explique cuáles son.
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________

7. ¿Qué es la ingeniaría genética?
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
8. ¿Cuáles son las cuatro etapas básicas para la clonación de genes?
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
9. Escriba el dogma central de la biología
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
10. Defina que es un gen.
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
11. ¿Qué entiende usted por genoma?
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
12. ¿Qué estrategias se utilizan para el estudio de la variabilidad genética de una especie?
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
13. ¿Qué propiedades deben reunir un marcador molecular para que sea útil?
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________

14. ¿Cuáles son los usos más importantes de los marcadores moleculares en el mejoramiento genético de plantas?
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
15. ¿Qué es una planta transgénica?
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
16. Si usted esta interesado en transformar tomate (especie dicotiledonea), ¿ que sistema de transformación eligiría? Ex-
plique.
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
17. En la siguiente tabla presente tres ejemplos de cultivos transgénicos, indicando el tipo de gen introducido y la función
de este gen en el cultivo transgénico.
Cultivo transgénico Gen introducido Características del cultivo transgénico

1
2
3
18. ¿Qué es bioseguridad?
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
19. Un tomate transgénico al cual se le ha introducido el gen Bt para conferirle resistencia a un insecto plaga, será noci-
vo para la salud humana? Explique su respuesta.
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________

Anexo 2. Evaluación final de conocimientos - Información de retorno
A continuación se presentan posibles respuesta a las preguntas formuladas en la evaluación final de cono-
cimientos, estas pueden ser ampliadas por el instructor.
Respuestas
Para la pregunta 1
Biotecnología es la aplicación de los principios científicos y de ingeniería para el procesamiento de mate-
riales por medio de agentes biológicos con el objetivo de producir bienes y servicios, en donde los agentes
biológicos se refieren principalmente a microorganismos, células de animales y plantas, enzimas y mate-
rial genético aislado y clonado.
Para la pregunta 2
Biotecnología Características
De primera generación · Se basó en la fermentación como proceso básico para la producción de
bebidas, alimentos y combustibles.
· Practica esencialmente empírica y en pequeña escala.
·Había poco conocimiento científico y de ingeniería.
De segunda generación · Usa el conocimiento científico y de ingeniería.
· Procesos a escala industrial.
· Procesos basados en aplicación integrado de microbiología, bioquímica e
ingeniería química.
· Incluye: uso de fermentadores para la producción de fármacos, combustibles
y alimentos y procesamiento de desechos.
· También incluye: la técnica de inmovilización de enzimas y técnicas de cultivo
de tejidos vegetales y animales.
De tercera generación · También llamada: “Nueva biotecnología”.
· Se inicia con el descubrimiento del DNA recombinante.
· Se basa en la biología molecular.
· Dio origen a las empresas biotecnológicas que explotan la ingeniería genética
para “cortar” y “confeccionar” genes que son colocados en microorganismos
para que “fabriquen por encargo” productos químicos y farmacéuticos de
interés.
Para la pregunta 3
Los eventos claves que permitieron el desarrollo de la biotecnología vegetal fueron:
a. El desarrollo de cultivo in vitro.
b. El descubrimiento de DNA recombinante.
c. El desarrollo de los marcadores moleculares y el desarrollo de los sistemas de transformación genética de
plantas.

Para la pregunta 4
La totipotencia de las células somáticas vegetales fue demostrada por Steward y colaboradores en 1958
quienes describieron el desarrollo de una planta de zanahoria a partir de células somáticas del floema de la
raíz de zanahoria.
Para la pregunta 5
Para cultivar in vitro células, tejidos y órganos vegetales se deben seguir los siguientes pasos:
a. Seleccionar y separar de la planta el explante que se desea cultivar.
b. Desinfectar el explante.
c. Sembrar el explante en un medio de cultivo apropiado.
d. Cultivar el explante en condiciones ambientales controladas.
Para la pregunta 6
La aplicación del cultivo de tejidos vegetales se da básicamente en tres áreas:
a. La micropropagación.
b. La contribución del cultivo in vitro en el mejoramiento vegetal.
c. La producción de metabolitos secundarios.
Para la pregunta 7
La ingeniería genética, es el térmico más utilizado para referirse al conjunto de técnicas involucradas en la
manipulación del material genético (DNA y RNA), y está basada en la tecnología del DNA recombinante.
La tecnología del DNA recombinante básicamente consiste en aislar segmentos específicos de DNA (ge-
nes) e introducirlos en vectores especiales (plásmidos) para formar moléculas de DNA recombinante.
Para la pregunta 8
Las cuatro etapas básicas para la clonación de genes son:
a. Generación de fragmentos de DNA.
b. Unión de los fragmentos a un vector molecular.
c. Introducción del vector a una célula hospedante, para la amplificación.
d. Selección de una secuencia específica.
Para la pregunta 9

Transcripción
Reversa

Para la pregunta 10
Un gen es un segmento de DNA que presenta una secuencia específica de pares de bases el cual contiene
información para una característica genética del individuo.
Para la pregunta 11
Genoma es el contenido genético total de un organismo. En las plantas el genoma está constituido por el
contenido genético nuclear y organelar (mitocondrias y cloroplastos). Sin embargo, el término genoma
casi siempre se utiliza para referirse a la información genética presente sólo en el genoma nuclear.
Para la pregunta 12
La variabilidad genética de una especie puede ser detectada de diferentes maneras:
a. Usando marcadores morfológicos y marcadores bioquímicos (isoenzimas) que son productos de la expresión de
los genes y
b. Usando marcadores moleculares, que permiten detectar diferencias entre individuos directamente a nivel de las
secuencias del DNA de su genoma.
Para la pregunta 13
Para que un marcador molecular sea útil debe reunir las siguientes propiedades:
a. Que sea altamente polimórfico, es decir, que permita diferenciar claramente, dos individuos.
b. Que sea codominante, para poder discriminar un individuo homocigoto de un heterocigoto.
c. Que esté distribuido a través del genoma.
d. Que no presente efecto pleiotrópico, es decir, que no afecte más de una característica.
e. Que sea de fácil y rápida ejecución.
f. Que tenga alta reproducibilidad.
Para la pregunta 14
Los usos más importantes de los marcadores moleculares en el mejoramiento genético de plantas son:
a. En la evaluación de germoplasma:
b. Caracterización y análisis de la variabilidad genética, identificación de acervos genéticos y de parentales para el
mejoramiento genético.
c. En mapeo de genes cualitativos y cuantitativos (QTLs).
d. En estrategias de fitomejoramiento:
e. Selección asistida por marcadores moleculares, identificación y transferencia de QTLs de germoplasma
silvestre.
f. Mejoramiento asistido por marcadores moleculares.
g. Clonación de genes con base a mapas genéticos.
Para la pregunta 15
Una planta transgénica es una planta a la cual se le ha introducido un gen modificado (un gen quimérico),
utilizando un método apropiado de transformación: mediante: ya sea , vía Agrobacterium tumefaciens o

mediante el bombardeo de partículas o biolística. El gen introducido es integrado en forma estable en el

genoma de la planta; es expresado y heredado de una generación a otra.
Para la pregunta 16
Las especies dicotiledóneas como tomate son susceptibles a varias cepas de Agrobacterium tumefaciens.
Plásmidos Ti modificados de estas cepas pueden ser utilizados como vectores para transformar este culti-
vo y en la práctica ésta es la vía elegida para transformar tomate.
Para la pregunta 17
Cultivo transgénico Gen introducido Características del cultivo

transgénico
1 Soya EPSP Sintasa Resistencia al herbicida
glifosato
2 Tomate ACC Sintasa Antisentido Retarda la maduración del
fruto
3 Tabaco Proteína de la cubierta o Resistencia al virus del
cápsula del virus TMV mosaico del tabaco (TMV)
Para la pregunta 18
Bioseguridad: Se refiere a las políticas y mecanismos que se establecen para prevenir posibles riesgos de
la tecnología del DNA recombinante y de la transformación genética de plantas en la salud, el medio am-
biente y la biodiversidad. Las instituciones oficiales de salud, alimento y ambiental de varios países, han
creado regulaciones para evaluar posibles riesgos de las plantas transgénicas, sobre todo al realizar ensa-
yos de campo.
Para la pregunta 19
Un tomate transgénico al que se le ha introducido el gen Bt de Bacillus thuringiensis expresa una delta-
endotoxina que es altamente específica en su efecto tóxico sólo contra insectos lepidópteros. Se ha de-
mostrado que estas toxinas no actúan en insectos benéficos y son digeridas en el tracto digestivo de los hu-
manos, por lo que no representa ningún riesgo consumir tomate transgénico con Bt.

Anexo 3. Evaluación del evento de capacitación
Apreciado participante:
Deseamos conocer sus opiniones sobre las actividades realizadas el día de hoy. No necesita firmar este
formulario; de la sinceridad en sus respuestas depende en gran parte el mejoramiento de esta actividad.
La evaluación incluye dos componentes:
a) La escala 0 a 3 sirve para que usted asigne un valor a cada uno de los aspectos que se evalúan:
0 = Malo, inadecuado
1 = Regular, deficiente
2 = Bueno, aceptable
3 = Muy bueno, altamente satisfactorio

b) Debajo de cada pregunta hay un espacio para comentarios de acuerdo con el puntaje asignado.
Refiérase a los aspectos positivos y negativos y deje en blanco los aspectos que no aplican en el caso
de las actividades realizadas el día de hoy.
1.0 Evalúe el (los) objetivo (s) que se esperaba lograr el día de hoy.
1.1 ¿Correspondió o correspondieron a las necesidades 0 1 2 3
institucionales y personales y las expectativas que usted traía?
Comentarios:
__________________________________________________________________________________
¿Cree que se logró o se lograron los objetivos propuestos? 0 1 2 3
Comentarios:
__________________________________________________________________________________
2.0 Evalúel as estrategias metodológicas empleadas:

2.1 Exposiciones de los instructores 0 1 2 3
2.2 Trabajos de grupo 0 1 2 3
2.3 Cantidad y calidad de los materiales entregados 0 1 2 3
2.4 Ejercicios realizados en el sitio del evento 0 1 2 3
2.5 Prácticas de campo 0 1 2 3
2.6 El tiempo dedicado a las diferentes actividades 0 1 2 3
Comentarios:
__________________________________________________________________________________

3.0 Evalúe la coordinación de las actividades

3.1 Información preliminar recibida por los participantes 0 1 2 3
3.2 Cumplimiento del horario de esta actividad 0 1 2 3
3.3 Manera en que se dirigieron las actividades 0 1 2 3
3.4 Apoyo logístico disponible (espacios, equipos, etc.) 0 1 2 3
3.5 Alojamiento (en caso de que aplique) 0 1 2 3
3.6 Alimentación (en caso de que aplique) 0 1 2 3
Comentarios:
__________________________________________________________________________________
4.0 Evalúe la aplicabilidad (utilidad) de lo aprendido en su 0 1 2 3

trabajo actual o futuro.
Comentarios:
__________________________________________________________________________________
5.0 ¿Qué actividades realizará en el corto plazo en su institución para aplicar o transferir lo aprendido
en este día?
__________________________________________________________________________________
6.0 ¿Estaría interesado en que esta capacitación se llevara a cabo en su institución? ¿En qué forma?
__________________________________________________________________________________
¡Gracias por sus respuestas y comentarios!

Anexo 4. Evaluación del desempeño del instructor
Fecha:______________________________
Nombre del Instructor:_________________________________________________
Temas desarrollados:___________________________________________________
Instrucciones
Marque con una (X) el número que corresponda según lo que haya apreciado del instructor en el
desarrollo de los temas.
La escala evaluativa es la siguiente: 4= Muy bien 3= Bien 2= Regular 1= Mal
Exprese con sinceridad sus opiniones, no requiere firmar, los resultados serán utilizados para el
mejoramiento en próximos eventos.
1.Organización y claridad del instructor
a. Presentó los objetivos de la actividad 4 3 2 1
b. Explicó la metodología a seguir 4 3 2 1
c. Tuvo claridad en las explicaciones 4 3 2 1
d. Presentó ayudas didácticas que permitieran la comprensión 4 3 2 1
e. Los contenidos facilitaron el aprendizaje 4 3 2 1
2. Dominio del tema

a. Mostró seguridad en su exposición 4 3 2 1
b. Respondió las preguntas a satisfacción 4 3 2 1
c. Relacionó la teoría con la práctica 4 3 2 1
d. Presentó ejemplos para ilustrar temas 4 3 2 1
3. Interacción del grupo

a.Inspiró confianza al grupo 4 3 2 1
b. Demostró interés en el aprendizaje de los alumnos 4 3 2 1
c. Formuló preguntas a los participantes 4 3 2 1
d. Escuchó con atención a los participantes 4 3 2 1
e. Proporcionó información de retorno 4 3 2 1
4. Dirección de las prácticas

a. Las prácticas estuvieron orientadas hacia los objetivos propuestos 4 3 2 1
b. Eligió los sitios adecuados para su realización 4 3 2 1
c. Evaluó la sesión práctica 4 3 2 1
d.Proporcionó información de retorno 4 3 2 1

Anexo 5. Evaluación de los materiales de capacitación
La evaluación del material puede hacerse con la participación de:

• Expertos en el contenido (científicos, investigadores)
• Expertos en comunicación
• Técnicos, facilitadores de procesos, profesores, etc.
• Productores, agricultores, miembros de organizaciones comunitarias, etc.
• Para este efecto, los evaluadores pueden usar un formato como el siguiente:
Calidad del Contenido Si No
La información que se presenta es técnicamente válida en el contexto en que se utiliza
El contenido está dividido en segmentos que siguen un proceso claro y ordenado
El contenido se presenta objetivamente, es decir respetando principios y métodos válidos
El contenido es adecuado para el nivel de la audiencia (ver usuarios de la Guía)
El contenido está actualizado desde el punto de vista científico-técnico
Calidad de la Producción Si No
La calidad de la impresión es excelente
Las imágenes (dibujos, gráficas, cuadros) son claras
Las ilustraciones apoyan el mensaje escrito
Los iconos están bien seleccionados (de acuerdo con el significado del texto)
La distribución de la información (diagramación) en cada página es adecuada
Los dibujos y fotografías reflejan bien situaciones reales
Hay una buena correspondencia entre imágenes y textos
Calidad instruccional Si No
Los objetivos están claramente establecidos
El material favorece la participación de la audiencia en la capacitación
La relación objetivos-contenidos es excelente: el contenido refleja lo que se propone en los
objetivos
El material facilita los procesos de enseñanza y aprendizaje
Los ejercicios y prácticas son novedosos
Los ejercicios y prácticas ayudan en la comprensión de los temas.

Anexo 6. La Biotecnología Vegetal en la República Dominicana
Por: Bienvenido Cabral E., Ph.D.

Para: Centro para el Desarrollo Agropecuario y Forestal (CEDAF)
Un análisis del programa agropecuario de la República Dominicana muestra que las oportunidades ofre-
cidas por la Biotecnología Vegetal al país son obviamente prometedoras.
Según datos del Plan Nacional de Alimentación y Nutrición (PLANAN), publicado en Santo Domingo,
D. N., por la Secretaría de Estado de Agricultura (SEA), en enero de 1998, la agropecuaria dominicana te-
nía el potencial de proveer más de una tercera parte de divisas por concepto de exportación y bienes, y más
del 60% de los alimentos del consumo interno.
Los principales cultivos de exportación continúan siendo la caña de azúcar, el café, el cacao y el tabaco,
los que ocupan más del 50% del volumen de las explotaciones; por otro lado, las pequeñas y medianas fin-
cas proporcionan al país su seguridad alimentaria, siendo los principales cultivos café, cacao, arroz, taba-
co, musáceas, habichuelas, así como también en algunas áreas de hortalizas, papas, raíces.
Los problemas fitosanitarios afectan considerablemente la producción de los cultivos en la República
Dominicana. El ataque de plagas, enfermedades fungosas, bacterianas y las causadas por virus, reducen
sustancialmente la producción siendo esto un peligro para la seguridad alimentaria de los dominicanos.
Además, hay que destacar que en la mayoría de los casos se emplean variedades tradicionales con muy
bajos niveles de productividad y resistencia a los factores antes mencionados. Tal es el caso de la Broca y
la Roya en el café, las Sigatokas amarilla y negras en las musáceas, el ácaro y la Pyricularia en el arroz y
las virosis en los cultivos de tabaco, habichuelas y raíces comestibles Por otra parte, es oportuno recono-
cer que la baja productividad de la agricultura dominicana está asociada en gran medida con problemas
climáticos y de suelos, siendo particularmente importantes las sequías, las cuales ocasionan daños consi-
derables en los cultivos.
En la solución de estos problemas debe jugar un papel la política que se adopte de generación y transfe-
rencia de tecnología, la cual debe considerar la reorganización del sistema de investigación, validación y
transferencia de tecnología, enfatizando la investigación en rubros que integran la canasta familiar en el
mercado local, tales como plátano, arroz, habichuela y otros cultivos competitivos en el mercado interna-
cional.
El rol y el aporte de la Biotecnología Vegetal al desarrollo de este proceso son prioritarios, sobre todo en
los actuales tiempos cuando se demanda una mayor productividad y competitividad de la agricultura do-
minicana, ante los procesos de apertura y las nuevas reglas del mercado internacional.
Dado que en el mejoramiento genético convencional los ciclos de cultivo son amplios y se requieren de
grandes extensiones de terreno para su evaluación, es necesario incorporar técnicas como las de cultivo in

vitro e ingeniería genética, para reducir el tiempo y el espacio necesarios para la obtención de mejores va-
riedades.
Como sabemos, la Biotecnología Vegetal ofrece la posibilidad de producir variedades más tolerantes a
condiciones desfavorables que teóricamente permitirían ampliar la superficie cultivable, elevar los rendi-
mientos y disminuir las pérdidas producidas por enfermedades, plagas y estrés. Sin embargo, de la teoría
a la práctica existe un camino muy largo y con muchos obstáculos. El desarrollo de la Biotecnología Ve-
getal en la República Dominicana requiere de un mayor apoyo que permita incrementar la infraestructura
material y humana; y disponer de financiamiento seguro y adecuado.
En términos generales, podemos considerar que el país tiene en la actualidad un potencial para desarrollar
y explotar la Biotecnología Vegetal. En el país existen cinco laboratorios que trabajan con técnicas de
biotecnológicas. En la mayoría de éstos sus actividades se restringen al cultivo de tejidos con énfasis en la
micropropagación vegetativa comercial y, prácticamente, no se han dado los pasos para aprovechar otras
aplicaciones y técnicas para al mejoramiento genético vegetal. Tampoco se han explorado a profundidad
otras oportunidades como son la producción de metabolitos secundarios muy demandados por la industria
farmacéutica y la perfumería, entre otros.
Por otro lado, ninguno de los laboratorios existentes cuentan con la infraestructura y equipos necesarios
para la implementación de la tecnología del DNA recombinante, las técnicas de los marcadores molecula-
res y la transformación genética de plantas.
Sin embargo hay que reconocer que en el área de cultivo de tejidos ya contamos con algunos avances. En
el Laboratorio Nacional de Biotecnología Vegetal de la SEA, se han desarrollado técnicas avanzadas de
reproducción mediante el sistema de vitro, que han contribuido a la producción de plantas de mayor sani-
dad y a disminuir los costos en la producción.
Este laboratorio aporta al país cerca de algunos 600,000 plantas/año, principalmente de plátanos y papas,
que son cultivos en los cuales se concentra la demanda de los productores. Las necesidades de material
de siembra para estos cultivos no son abastecidas, ya que ésta se sitúa por los dos millones de plantas por
año. Otras especies multiplicadas son: yuca, ñame, piña, algunos vegetales y café. El laboratorio desarro-
lla varios trabajos de interés como son los de multiplicación de variedades de café tolerantes a Roya, nue-
vas variedades de ajo adaptadas a zonas bajas, rescate de germoplasma de piña, producción de material
de propagación de fresas, entre otros. En el cultivo de café se ensayan técnicas de embriogénesis somáti-
ca, lo que representa una gran perspectiva.
El país dispone de uno de los laboratorios de Biotecnología Vegetal más grandes del área del Caribe (Luo-
ma Vitrolab), el cual, según el nivel de demanda, ha logrado producir cerca de 5 millones de plántulas de
musáceas por año.
En este laboratorio privado se han aplicado las técnicas de cultivos de tejidos para la multiplicación de un
gran número de cultivos alimenticios así como especies forestales, frutales y ornamentales y, más aún,
han logrado realizar la regeneración de las plantas no sólo mediante el cultivo de meristemos, sino tam-

bién vía organogénesis y embriogénesis somática. Además, han practicado el cultivo de sus suspensiones
celulares.
Este laboratorio cuenta con un alto potencial investigativo y productivo, pero en la actualidad sólo se de-
dica exclusivamente a la micropropagación clonal de plantas de especies ornamentales, como orquídeas,
crisantemos, éster, gladiolos, anthurium, lilium, claveles, rosas y otros. Según sus directivos le resulta im-
posible competir con los costos de producción del laboratorio estatal en la multiplicación de otros rubros.
Existe otro laboratorio privado en el país que se dedica exclusivamente a la producción en gran escala de
orquídeas para la exportación. Los que pertenecen al Instituto Superior de Agricultura (ISA) y a la Uni-
versidad Autónoma de Santo Domingo (UASD) realizan tareas de micropropagación de plantas en menor
escala y no son empleados a plenitud en las funciones de investigación y enseñanza como es de esperar.
Esto quizá ocurre porque todavía en el país no existe ningún pregrado o postgrado en el área de agrobio-
tecnología. Tan solo ahora una universidad del país, el Instituto Superior de Agricultura (ISA), ha tomado
la iniciativa de incluir en el pensum de las carreras de Ingeniería Agronómica e Ingeniería en Manejo de
Recursos Naturales la asignatura biotecnología vegetal. Por otra parte, el Comité Interinstitucional del
Programa de Postgrados Tecnológicos de las Américas, en coordinación con el INDOTEC y el CEDAF,
ha discutido la posibilidad de un proyecto de postgrado en biotecnología. Uno de los problemas que en-
frentará este proyecto podría ser el de la insuficiencia de recursos humanos locales en esta área. En la ac-
tualidad existen en el país solamente tres especialistas en Biotecnología Vegetal que poseen grado
científico de Ph.D., dos con el grado de M.Sc. y un número muy reducido de técnicos con cursos realiza-
dos en esta área.
No obstante esto último, debemos insistir que las investigaciones en esta importante área científico-técni-
ca sólo se manifestarán cuando tengan la prioridad y el apoyo de los sectores vinculados a la administra-
ción del desarrollo agropecuario nacional, tanto privado como estatal; de lo contrario, el potencial de la
biotecnología vegetal permanecerá latente en la República Dominicana.

Anexo 7. Glosario
Ácido nucleico:
Polímero de nucleotidos (ver DNA y RNA).
Aminoácido
Unidades estructurales que forman las proteínas. Se encuentran unidos en una secuencia ordenada, lo que
determina la estructura primaria, secundaria, y terciaria de la proteína.
Anteras
Parte masculina de una flor, en la cual se produce el polen. Porción del estambre que contiene el polen or-
dinariamente bilocular.
Antibiótico
Sustancia producido por un organismo viviente que es tóxica para otros organismos.
Anticodón
Triplete de nucleótidos en la molécula del RNA de transferencia (tRNA) que es complementario con el
codón en el RNA mensajero. (mRNA), durante la síntesis de proteínas.
Autorradiografía
Técnica que permite la detección de moléculas marcadas radioactivamente, al superponer la muestra con
una película fotográfica.
Bacterias
Grupo de microorganismos unicelulares procariontes, es decir, sin membrana nuclear ni organelos defini-
dos.
Bacteriófago
También llamado fago. Son virus que infectan células bacterianas provocando normalmente su lisis y ob-
teniéndose una nueva progenie de virus. Algunos, como el fago lambda son muy utilizados en experimen-
tos de DNA recombinante.
Base nitrogenada
Molécula orgánica de naturaleza purínica o pirimidínica que forma parte de los ácidos nucleicos. Princi-
palmente son cinco: adenina, guanina, timina, citosina y uracilo. Esta última se encuentra sólo en el RNA.
Beta-Galactosidasa
Enzima que cataliza la hidrólisis de la lactosa en glucosa y galactosa.

Biotecnología
Conjunto de procesos industriales y de tecnologías, que implican el uso de sistemas biológicos. Algunos
de estos procesos utilizan microorganismos manipulados genéticamente (ingeniería genética).
Callo
Conjunto de células vegetales provenientes de una sola célula vegetal inicial.
Cápside
Cubierta proteica externa de un virus. Posee una estructura altamente regular, que encierra el ácido nu-
cleico del virus.
Célula
Unidad fundamental de la vida; el organismo más pequeño capaz de reproducción independiente.
Clon
En general, grupo de organismos genéticamente idénticos debido a que han sido producidos por algún
tipo de reproducción asexual. Población de células que desciende de una sola célula madre.
Clonaje
Originalmente se refería al proceso por el cual se obtiene un grupo de células idénticas de una sola célula
(clón). El término se ha extendido al proceso de obtener muchas copias de un gen a partir de una sola co-
pia.
Cloroplasto
Organelo presente en las células vegetales, donde se produce la fotosíntesis.
Código genético
Relación entre la secuencia de nucleótidos en el DNA o el RNA y la secuencia de aminoácidos de una pro-
teína. Cada triplete o conjunto de tres nucleótidos en el ácido nucleico determina un aminoácido específi-
co. Por tanto, según la composición y frecuencia de nucleótidos, se obtendrán diferentes composiciones y
frecuencias de aminoácidos, es decir, diferentes proteínas.
Codón
Secuencia de tres nucleótidos en el mRNA, que codifica un aminoácido o la terminación de una cadena
polipeptídica.
Colonia
Grupo de células contiguas, normalmente derivadas de una misma célula original, que crecen en una su-
perficie sólida.

Crecimiento
Incremento en la masa (peso seco y/o tamaño) de un organismo que acompaña los procesos de desarrollo,
diferenciación y morfogénesis. El crecimiento usualmente involucra división y expansión celular.
Cromosoma
Estructura compuesta por ácidos nucleicos, en la que se encuentran los genes dispuestos en orden lineal.
Su número es variable según la especie de que se trate, pero siempre es constante en una especie dada.
Cultivo celular
Crecimiento in vitro de células aisladas de organismos pluricélulares, animales o vegetales.
Cultivo en suspensión
Cultivo de células, tejidos u órganos sumergidos en un medio nutritivo líquido que requiere agitación.
Delección
Pérdida de un segmento de DNA. Puede variar desde solamente un nucleótido hasta un conjunto de ge-
nes.
DNA (ácido desoxirribonucleico)
Es la forma molecular en la que se guarda y transmite la información biológica hereditaria.
Desoxirribonucleótido
Se obtiene al unirse un grupo fosfato a la pentosa de un desoxirribunucleósido.
Diferenciación
Fase de crecimiento durante la cual las células no especializadas se especializan en funciones particulares
(por ejemplo, el meristemo).
Dogma central
La relación entre DNA, RNA y proteína. El DNA sirve como molde tanto para su autorreplicación como
para la síntesis del RNA. El RNA, a su vez es el molde de la síntesis de proteína.
Endonucleasa
Enzima que produce cortes internos en el DNA.
Enzima
Proteína funcional que cataliza una reacción química específica, pero sin intervenir en ella. Es un catali-
zador biológico. Es específico, es decir, es un catalizador solo de una reacción o de un tipo de reacciones.

Enzimas de restricción
Son endonucleasas capaces de reconocer y cortar móleculas de DNA de doble cadena en sitios específicos
y que intervienen en el sistema de restricción-modificación del DNA de algunas bacterias.
Embriogénesis
Capacidad de las plantas con flores para producir embriones. No se reduce el desarrollo del huevo fertili-
zado, sino que también puede ser inducido en cultivo de tejidos vegetales. (Embriogénesis somática).
Escherichia coli
Bacteria del intestino humano. Durante muchos años fue el único hospedero utilizado en los experimen-
tos de ingeniería genética.
Exón
Secuencia de bases del DNA eucarióptico que se transcribe a mRNA y que codifica una proteína.
Expresión genética
Síntesis de proteína a partir de un gen determinado (gen expresado), mediante transcripción y traducción.
Extremos cohesivos
Cortes "escalanados" en el DNA de doble cadena, dando lugar a terminales de cadena sencilla comple-
mentarios entre sí. Permiten la circularización de la molécula de DNA de doble cadena.
Fenotipo
Conjunto de características visibles de un organismo como consecuencia de la interacción del genotipo y
del medio ambiente.
Fermentación
Proceso de transformación, mediante enzimas o microorganismos. Se utiliza a escala industrial para la
obtención de productos como alcoholes, ácidos orgánicos, etc.
Gen 1.
Unidad básica de la herencia. 2. Secuencia de DNA que codifica una proteína específica.
Genoma
Conjunto cromosómico básico de un organismo. La suma total de sus genes.
Genotipo
Dotación genética de un organismo.

Haploide
Designa a cualquier núcleo célula u organismo que posee un juego simple de cromosomas impares. Nú-
mero n o número reducido de cromosomas típico de la mayoría de los gametofitos.
Heterocigoto
Designa a un núcleo, célula u organismo diploide que contiene dos alelos diferentes por cada gen.
Híbrido
Producto de dos padres genéticamente diferentes. Primera generación de la descendencia de una cruza en-
tre dos individuos que difieren en uno o más genes. Progenie de una cruza entre especies del mismo géne-
ro o de géneros distintos.
In vitro
Designa a los procesos biológicos o a las investigaciones que se realizan fuera de los organismos vivos,
tradicionalmente en tubos de ensayo.
Información genética
La información contenida en la secuencia de nucleótidos del DNA o RNA.
Ingeniería genética
Tecnología usada a nivel de laboratorio para alterar el aparato heriditario de una célula viva, de forma que
pueda producir más o diferentes productos o desarrollar funciones diferentes. Estas células, manipuladas
genéticamente, pueden utilizarse en la producción industrial.
Inserción
Mutación producida al intercalar una o varias bases nitrogenadas en la secuencia de una cadena de DNA.
Intrón
Secuencia de bases presentes en el DNA que aunque se transcribe no aparece en el mRNA final.
Nucleótido
Unidad fundamental de los ácidos nucleicos. Consta de una de las bases nitrogenadas unida a un grupo
pentosa-fosfato.
mRNA (RNA mensajero)
RNA formado a partir del DNA y que sirve como molde para la síntesis de proteínas.
Marcador genético
Mutación genética con un efecto observable sobre el organismo, lo que permite localizar su posición den-
tro del cromosoma y seguir su transmisión.

Mapa genético
Colocación ordenada de los genes en un cromosoma, según se deduce de los experimentos de recombina-
ción genética.
Medio nutritivo
Medio de cultivo empleado para iniciar, desarrollar o enraizar diferentes inóculos; está formulado con
macro y micronutrientes azúcar y reguladores de crecimiento.
Meristemo apical
Meristemo que se encuentra en el ápice de un brote o raíz.
Mutación
Cambio en la cantidad o estructura del DNA en los cromosomas, pudiendo ser génica o cromosómica.
Una mutación génica consiste en el cambio de un gen de una forma alélica a otra; los cambios cromosómi-
cos consisten en duplicaciones, inversiones, intercambios, etc.
Organogénesis
Formación de órganos (la caulogénesis es la iniciación de brotes y la rizogénesis es la iniciación de raí-
ces).
Plásmido
Material heridatario extracromosómico. Es una molécula de DNA circular con replicación independiente.
Gracias a su pequeño tamaño y simplicidad se usan frecuentemente en experimentos con DNA recombi-
nante, sectores de DNA extraños y como vectores para la inserción de estos DNAs extraños en otros orga-
nismos.
Polinucleótido
Secuencia lineal de nucleótidos.
Promotor
Región del DNA a la que se une la enzima RNA polimerasa para iniciar la transcripción.
Primordio
Grupo de células destinado a transformarse en una estructura particular, como lo es el primordio foliar,
que va a dar origen a las hojas.
Proliferación
Crecimiento por multiplicación rápida de nuevas células.
Proteína
Polímero lineal de aminoácidos. Las proteínas son el producto de la expresión genética.

rRNA (RNA ribosómico)

RNA componente de los ribozomas. Distinto del mRNA y tRNA. Su función es la de mantener la unión
entre el mRNA y el tRNA durante la síntesis de proteínas.
Recombinación
Proceso de intercambio de material genético.
Recombinante
Célula o clón de células resultante de una recombinación.
Replicación del DNA
Mecanismo por el cual se producen copias exactas de un DNA que se toma como molde. Este mecanismo
implica la separación de las dos cadenas de DNA y la construcción a partir de cada una de ellas, de una
nueva cadena complementaria, mediante el apareamiento de bases.
RNA (ácido ribonucleíco)
Polímero de ribonucleótidos. En sus tres formas de mRNA, tRNA y rRNA, transforma el mensaje conte-
nido en el DNA en una secuencia de aminoácidos, es decir, en proteínas.
Subcultivo
Transferencia del inóculo a medio fresco.
tRNA (RNA de transferencia)
RNA capaz de combinarse con un aminoácido específico. Cada especie de tRNA tiene un triplete de nu-
cleótidos (anticodón) que interacciona con un triplete complementario (codón) en el mRNA.
Totipotencialidad
Es el fenómeno por el cual las células somáticas provenientes de diferentes partes de la planta, dadas las
condiciones apropiadas, pueden desarrollarse en una planta completa.
Traducción
Síntesis de una proteína, cuya secuencia de aminoácidos esta especificada por los tripletes de nucleótidos
del mRNA.
Transcripción
Síntesis del RNA a partir de un DNA molde, basándose en la complementariedad de bases.
Transcriptasa inversa
Enzima capaz de catalizar la síntesis de DNA a partir de RNA. Sólo se ha encontrado en los retrovirus.

Transformación genética
Mecanismo por el que se introduce un fragmento de DNA en el interior de una célula. Gracias a este nue-
vo fragmento la célula receptora puede adquirir nuevas funciones.
Vector genético
Vehículo para la transmisión de un fragmento de DNA de una célula a otra. En genética molecular, los
vectores más utilizados son plásmidos y virus, que pueden llevar un DNA extraño a una célula receptora u
hospedante.
Virus
Agente, de menor tamaño que una bacteria, que causa enfermedades infecciosas y que necesita una célula
intacta para su replicación. Contiene DNA o RNA como material hereditario, rodeado por una cubierta
proteica.
Yema (botón)
Pequeño abultamiento en el tallo de una planta; da origen a una rama, a una flor o a varias hojas.

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Teléfono (809) 544-0616 / Fax: (809) 544-4727

Sitio Web: http://www.cedaf.org.do

Correo Electrónico: cedaf@cedaf.org.do

Hecho el depósito que prevé la ley 418. Impreso en la República Dominicana.

1. Biotecnología 2.Cultivo de Tejido 3. Marcadores Moleculares 4. Genética de Plantas 5. Perspectivas Futuras.

Octubre del 2000

Santo Domingo, República Dominicana

William M. Roca / Hernando Ramírez

Sección 1 Una Introducción a la Biotecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

Sección 2 Cultivo de Tejidos Vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

William M. Roca / Hernando Ramírez

Sección 3 Tecnología del DNA Recombinante. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

Sección 4 Marcadores Moleculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

William M. Roca / Hernando Ramírez

Sección 5 Transformación Genética de Plantas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

Sección 6 Perspectivas Futuras de la Biotecnología Vegetal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117

William M. Roca / Hernando Ramírez

Anexo 1. Evaluación final de conocimientos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135

William M. Roca / Hernando Ramírez

William M. Roca / Hernando Ramírez i

ii William M. Roca / Hernando Ramírez

La agricultura moderna se basa en la utilización de variedades mejoradas (generalmente híbridos) en

William M. Roca / Hernando Ramírez iii

La biotecnología vegetal comprende una serie de técnicas que incluyen:

El objetivo de este módulo, Introducción a la Biotecnología Vegetal, es presentar a los participantes, en

iv William M. Roca / Hernando Ramírez

1. Elabore una definición de lo que usted considera es biotecnología.

William M. Roca / Hernando Ramírez v

vi William M. Roca / Hernando Ramírez

• Presentar a los participantes los principios básicos de la biotecnología vegetal en la obtención de

• Conocer los conceptos básicos de la biotecnología en general.

• Entender los principios básicos de las técnicas de cultivo de tejidos vegetales.

• Conocer los fundamentos de la tecnología del DNA recombinante.

• Entender los principios básicos de los marcadores moleculares.

• Conocer los fundamentos de la transformación genética de plantas.

• Entender los conceptos de bioseguridad, propiedad intelectual y patentes.

William M. Roca / Hernando Ramírez vii

Est r u c tura general

Marc ado re s y Mapas

Clona ción y modifica ción

Marc ado re s y Mapas Mo le c ular

P la nta s Tra ns gé nica s

• Marc ado re s Cultivo de

Ens ayo s de Evaluac ió n

viii William M. Roca / Hernando Ramírez

William M. Roca / Hernando Ramírez ix

Marcadores y Mapas Molecular

William M. Roca / Hernando Ramírez

William M. Roca / Hernando Ramírez

- Una introducción a la biotecnología

- Cultivos de tejidos vegetales

- Tecnología del DNA recombinante

- Transformación genética de plantas

- Perspectivas futuras de la Biotecnología vegetal

William M. Roca / Hernando Ramírez

William M. Roca / Hernando Ramírez 1

Sección 1 . Una In t r odu c c i ón a l a B i ot e c n ol ogí a

1.1 ¿Qué es la Biotecnología? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.2 Breve Historia de la Biotecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.3 La Nueva Biotecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4