protocolo normalizado de trabajo

MICROBIOLOGÍA

22 DE MARZO DE 2024
yeniffer Hurtado
Gestión de muestras
CONTENIDO
1.INTRODUCCIÓN.......................................................................................................................................2
MEDIO DE CULTIVO:...............................................................................................................................2
TIPOS DE MEDIO DE CULTIVO.................................................................................................................2
MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS..........................................................................................................2
2.OBJETIVOS................................................................................................................................................9
3.ÁMBITO................................................................................................................................................... 9
4.DEFINICIONES..........................................................................................................................................9
5.PROCEDIMIENTO.....................................................................................................................................9
MATERIAL para la preparación de medios de cultivo............................................................................9
MATERIAL PARA EL EMPLACADO.........................................................................................................10
PROCEDIMIENTO..................................................................................................................................10
preparación del medio de cultivo líquido..........................................................................................10
preparación del medio de cultivo sólido...........................................................................................11
6.Cálculos..................................................................................................................................................11
PREPARACIONES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO....................................................................................11
7.RESULTADOS..........................................................................................................................................12
Placa con medio de cultivo mac conkey................................................................................................12
placa con medio de cultivo cled agar....................................................................................................13
Placa con medio dultivo de Manitol salado...........................................................................................13
8.ANEXOS..................................................................................................................................................13
9.OBSERVACIONES...................................................................................................................................13
10.BIBLIOGRAFÍA......................................................................................................................................13
1.INTRODUCCIÓN
MEDIO DE CULTIVO: Los medios de cultivo son herramientas fundamentales en
microbiología y biotecnología, proporcionando un entorno óptimo para el crecimiento
y la reproducción de microorganismos. Estos medios pueden ser tanto naturales como
sintéticos, diseñados específicamente para favorecer el crecimiento de ciertos
microorganismos o para propósitos particulares de investigación.

TIPOS DE MEDIO DE CULTIVO

SÓLIDOS:

- AGAR- AGAR: Es uno de los más utilizados

- AGAR NUTRITIVO: es un medio general que se utiliza para el crecimiento para
una gran variedad de microorganismos.
- MEDIOS SELECTIVOS: inhiben algunos microorganismos, pero favorecen otros
- MEDIOS DIFERENCIALES: Permiten distinguir entre diferentes tipos de
microorganismos basándose en características como la capacidad de fermentar
carbohidratos o producir ciertos pigmentos.

LÍQUIDOS:

- CALDOS NUTRITIVOS: utilizadas para el crecimiento de microorganismos en

suspensión.
- CALDOS DE ENRIQUECIMIENTO: Contienen nutrientes adicionales para
favorecer el crecimiento de microorganismos que requieren condiciones
especiales.

MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS

MC CONKEY: se utiliza para el
aislamiento de bacilos Gram
negativos de fácil desarrollo,
aerobios y anaerobios
facultativos a partir de muestras
clínicas, aguas y alimentos.
Todas las especies de la familia
Enterobacteriaceae desarrollan
en el mismo.

- Incubación En aerobiosis,
a 33-37 ºC durante 18-48
horas

INGREDIENTES:

PEPTONA DE CARNE Es un componente común en muchos

medios de cultivo utilizados en
microbiología y biotecnología. Se elabora
a partir de carne animal y contiene una
mezcla de productos de la digestión
enzimática de proteínas, incluyendo
péptidos y aminoácidos.
PEPTONA DE GELATINA es un derivado proteico utilizado en
microbiología y biotecnología como
fuente de nutrientes en medios de
cultivo.
TRIPTEÍNA es un hidrolizado de caseína, una
proteína que se encuentra en la leche. Se
produce mediante digestión enzimática
de caseína, La triptona se utiliza como
fuente de nutrientes en medios de
cultivo bacterianos y es rica en
aminoácidos esenciales como triptófano,
tirosina y fenilalanina, que son
importantes para el crecimiento
microbiano
LACTOSA la lactosa se emplea como fuente de
carbono y energía para el crecimiento de
ciertos microorganismos, especialmente
bacterias.
MEZCLA DE SALES BILIARES es una combinación de sales biliares que
se utiliza en microbiología y
biotecnología, especialmente en medios
de cultivo selectivos y diferenciales
ROJO NEUTRO es un indicador de pH que cambia de
 color en función de la acidez del medio
CRISTAL VIOLETA indicador

CLED AGAR: Medio indicado

para el procesamiento de
urocultivos. Es utilizado para el
aislamiento, recuento e
identificación presuntiva de
microorganismos, pues permite
el desarrollo de la mayoría de los
patógenos urinarios.

- Incubación: En
aerobiosis, a 35-37 °C,
durante 18-48 horas.

Ingredientes:

L-CISITNA Actúa como una fuente importante de

azufre en el cultivo celular
AZUL DE BROMOTIMOL Es un indicador de pH que cambia de
color en respuesta a los cambios en la
acidez del medio. Puede ayudar a
detectar la producción de ácido como
resultado de la fermentación de la
lactosa por ciertos microorganismos.
AGUA PURIFICADA …..

SS AGAR: Medio de cultivo

selectivo y diferencial utilizado
para el aislamiento de
Salmonella spp. y de algunas
especies de Shigella spp. a
partir de heces, alimentos y
otros materiales en los cuales
se sospeche su presencia.

- Incubación: En
aerobiosis a 33-37 °C
durante 18-24 horas.

Ingredientes:
 PLURIPEPTONA Mezcla en partes iguales de hidrolizado
de caseína y peptona de carne, adecuada
por su elevado poder nutritivo para la
preparación de medios de cultivo
apropiados para el desarrollo de
microorganismos nutricionalmente
exigentes.
CITRATO DE SODIO el fosfato monoamónico es la única
fuente de nitrógeno y el citrato de sodio
es la única fuente de carbono. Ambos
componentes son necesarios para el
desarrollo bacteria
TIOSULFATO DE SODIO neutraliza los compuestos oxidantes
VERDE BRILLANTE actúa como inhibidor de bacterias Gram
positivas y de la mayoría de bacterias
Gram negativas diferentes a Salmonella
spp.
ROJO NEUTRO colorante de contraste en tinciones
Manitol salado agar: Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el
aislamiento y diferenciación
de estafilococos a partir de
diversas muestras.

- Incubación: En
aerobiosis, a 33-37 °C
durante 18-24 hs. Si a
las 24 horas las placas
presentan resultado
negativo, incubar
otras 24 horas.

INGREDIENTES:

EXTRACTO DE CARNE se utiliza como materia prima para

fermentaciones
MANITOL actúa como fuente de carbono para las
bacterias y es fermentado por ciertas
especies.
ROJO DE FENOL se utiliza para medir el pH.

EMB: utilizado para el

aislamiento selectivo de bacilos
Gram negativos de rápido
desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las
especies de la familia Enterobacteriaceae.

- Incubación: En aerobiosis, a 33-37 °C durante 18-24 horas

Ingredientes:

FOSFATO DIPOTÁSICO ayudan a mantener el pH del medio y

actúan como reguladores de la acidez.
AZUL DE METILENO Y EOSINA La eosina inhibe el crecimiento de
bacterias grampositivas, mientras que el
azul de metileno actúa como un
inhibidor parcial de las bacterias
gramnegativas.
CETRIMIDE AGAR BASE: Medio
utilizado para el aislamiento
selectivo de Pseudomonas
eruginosa y de otras especies del
género.

- Incubación: En aerobiosis,
a 33-37 °C durante 24-48
horas.

Ingredientes:

PEPTONA DE GELATINA es utilizada en medios de cultivo para el

estudio de microrganismos poco
exigentes. También es utilizada en
estudios de fermentación.
CLORURO DE MAGNESIO estabilizar los nucleótidos, regular el pH
y servir como suplemento iónico para el
crecimiento bacteriano.
SULFATO DE POTASIO es uno de los fertilizantes esenciales para
el cultivo de las plantas puesto que está
libre de cloro.
CETRAMIDA es un surfactante catiónico que tiene
propiedades antibacterianas y selectivas
contra muchas especies bacterianas,
pero permite el crecimiento de
Pseudomonas spp., especialmente
Pseudomonas eruginosa.
AGAR BIGGY: un medio para el aislamiento y diferenciación de levaduras del género
Cándida.

- Incubar a 25 + 2°C de 24 a 72 horas (3 a 5 días en caso de ser necesario).

Ingredientes:

CITRATO DE AMONIO Y BISMUTO inhibidores del desarrollo bacteriano.

SULFITO DE SODIO se utiliza como conservante en la
industria alimentaria para prevenir el
crecimiento de bacterias y hongos en
alimentos.
DEXTROSA detección y enumeración de hongos
GLICINA (no encontrado)
EXTRACTO DE LEVADURA El extracto de levadura está preparado y
estandarizado para uso bacteriológico y
cultivos celulares y es un excelente
estimulador del crecimiento bacteriano.
AGAR BACTERIOLOGICO agente gelificante en la preparación de
medios de cultivo y en otras aplicaciones
rutinarias de microbiología.
Hektoen Entérico agar:
Medio de cultivo
selectivo y diferencial
utilizado para el
aislamiento de
Salmonella spp. y Shigella
spp. a partir de heces y
alimentos.

- Incubación: En
aerobiosis, a 33-
37 ºC durante 18
a 24 horas. Se
logra una mejor
diferenciación
entre especies de
Salmonella y
Shigella al incubar
las placas durante
48 horas.

Ingredientes:
 PROTEOSA PEPTONA Una fuente de nutrientes nitrogenados y
aminoácidos que proporciona nutrientes
para el crecimiento bacteriano.
SALES BILIARES el propósito de inhibir el crecimiento de
ciertas bacterias y favorecer el
crecimiento de otras.
SALICINA como un agente antimicrobiano y
promotor del crecimiento para ciertas
bacterias, especialmente en medios de
cultivo selectivos.
TIOSULFATO DE SODIO Se utiliza como fuente de azufre en la
producción de sulfuro de hidrógeno por
algunas bacterias.
CITRATO DE HIERRO Y AMONIO su función principal es identificar y
diferenciar ciertas bacterias
AZUL DE BROMOTIMOL indicador de pH que puede cambiar de
color a amarillo cuando el pH es ácido.
FUCSINA ÁCIDA Colorante acídico

2.OBJETIVOS

 Elaborar un PNT
 Elaborar adecuadamente la preparación de los medios de cultivo.
 Conocer los medios de cultivos tratados.
 Identificar microrganismos, bacterias, hongos...etc.
 Conocer el procedimiento adecuado para cada medio de cultivo y que se puede
sembrar.
 Saber sembrar y En placar correctamente.
 Saber hacer los cálculos necesarios.
 Saber e identificar las fuentes de contaminación.

3.ÁMBITO
Este PNT se va a realizar para que los trabajadores conozcan los procedimientos
adecuados.

SE realiza porque debemos conocer todos los procedimientos, pasos de la

preparación de medios de cultivos.

Este PNT esta realizado por YENIFFER HURTADO RODRIGUEZ.

4.DEFINICIONES
PNT: protocolo normalizado de trabajo.

Microorganismos: Organismo que solo puede verse bajo un microscopio. Los

microorganismos incluyen las bacterias, los protozoos, las algas y los hongos. Aunque
los virus no se consideran organismos vivos, a veces se clasifican como
microorganismos

Medio de cultivo: conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros

componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos.

Siembra: introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio

adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y
multiplicación

5.PROCEDIMIENTO

MATERIAL PARA LA PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

MATRAZ ERLENMEYER 250 ML IMÁN
10 TUBOS DE ENSAYO AGITADOR MAGNÉTICO
TAPONES PARA LOS TUBOS DE ENSAYO BALANZA
GRADILLA ESPÁTULA
PAPEL DE FILTRO FRIGORÍFICO
HISOPOS ESTUFA
AGUA DESTILADA MEDIOS DE CULTIVO
MEDIOS DE CULTIVO:

- CALDO KAA (ENTEROCOCOS)

- H20 PECTONA (PARA CUALQUIER MUESTRA)
- OF (BACTERIAS ANAERÓBICAS O AERÓBICAS)
- VERDE BRILLANTE (SALMONELA: ALIMENTOS, HECES…)
- ESTUAR (MEDIO DE CULTIVO YA PREPARARADO)
- CALDO NUTRITIVO (PARA CUALQUIER MUESTRA)

MATERIAL PARA EL EMPLACADO

MATRAZ EARLENMEYER 250ML CON EL ASA DE INOCULACIÓN

MEDIO DE CULTIVO
PLACA CALEFACTORA GRADILLA CON LOS TUBOS
10 PLACAS ESTUFA
 AGUA DESTILADA PAPEL DE FILTRO
PROCEDIMIENTO

PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO LÍQUIDO

1. Nos lavamos las manos y nos colocamos los EPIS (guantes, bata, mascarilla.etc)
adecuados para evitar fuentes de contaminación y asegurar nuestra salud.
2. Leemos el PNT (protocolo normalizado de trabajo).
3. Preparamos el material adecuado.

Papel de filtro Reactivos

Agua destilada Agitador magnético
imán Placa de Petri
Asa de siembra Estufa de laboratorio
Rotulador para el etiquetado Balanza
Tubo de ensayo Hisopo

4. Hacemos los cálculos necesarios para la disolución.

5. Al sembrar tomamos el mango y lo llevamos al tubo de ensayo, luego de
recolectar la muestra, tomamos la placa de Petri y llevamos el mango por
encima de la base, con cuidado y lentamente, para que no se rompa la
muestra.
6. El proceso consiste en incubar a 37°C en el horno durante 24-48 horas y dejar
reposar durante una semana.
7. Leemos e interpretamos los resultados utilizando la tabla de calidad de cada
ambiente para ver qué obtuvimos, si el ambiente y el color de la muestra son
correctos.
8. Por último, es muy importante la limpieza, cuando terminemos de mirar las
placas de Petri las tiramos al contenedor negro, en el contenedor negro
también tiramos los soportes que usamos para colocar la muestra.
9. Desinfectamos la superficie donde hemos trabajado.

PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO SÓLIDO.

1. Nos lavamos las manos y nos colocamos los EPIS (guantes, bata, mascarilla.etc)
adecuados para evitar fuentes de contaminación y asegurar nuestra salud.
2. Leemos el PNT (protocolo normalizado de trabajo).
3. Preparamos el material adecuado

Papel de filtro Reactivos

Agua destilada Agitador magnético
imán Placa de Petri
Asa de siembra Estufa de laboratorio
 Rotulador para el etiquetado Balanza
Tubo de ensayo Hisopo
4. Lo preparamos para meterlo en la autoclave para esterilizar los caldos, se
procede a meterlos en la autoclave a 120ºC, una vez que termina la autoclave y
nos metemos en la cabina de flujo laminar que está a 60ºC.
5. Lo metemos en la Placas de Petri y procedemos a la siembra, cogemos el asa y
lo introducimos dentro del tubo de ensayo, una vez que hemos recogido la
muestra, cogemos la placa de Petri y pasamos el asa por encima del medio, con
cuidado.
6. Incubamos en estufa a 37ºC que es la temperatura ambiente durante 24 – 48
horas, pero nosotros lo dejamos una semana.
7. . Leemos los resultados que hemos obtenido y lo interpretamos.
8. Por último, es muy importante la limpieza, cuando terminemos de mirar las
placas de Petri las tiramos al contenedor negro, en el contenedor negro
también tiramos los soportes que usamos para colocar la muestra.
9. Desinfectamos la superficie donde hemos trabajado.

6.CÁLCULOS

PREPARACIONES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

CALDO KAA

150 ml de agua echamos al matraz

1OOML 33g
4.95 g del medio de cultivo
150ML x
13ml del medio de cultivo preparado en
X= 150 x 33/1000= 4,95 g
cada tubo de ensayo

Mac conkey

5g de medio de cultivo en 100 ml de agua

1000ml ------- 50g

100ml ------- x

X= 100 x 50/1000= 5g

Cled Agar

3,61 g de medio de cultivo en 100 ml de agua

1000 ml -------- 36,1 g

100ml ------ x

X= 100 x 36,1 / 1000 = 3,61 g

7.RESULTADOS

PLACA CON MEDIO DE CULTIVO MAC CONKEY

En esta placa se ha sembrado

muestras de un lavabo
En esta placa se han observado:
Escheria coli (es una bacteria que
vive en el intestino) klebsiella
psemunie (bacteria en el digestivo
de pacientes sanos)
Este medio a cambiado de color
(era rosa) y sus bacterias se
muestran son de color rosado
rojizo.

PLACA CON MEDIO DE CULTIVO CLED AGAR

En esta placa se ha sembrado orina de perro.

En esta placa se observan: Escheria coli que
sus colonias se muestran de color amarillo,
Proteus vulgaris (Es un patógeno
oportunista y puede producir cistitis)
Enterococcus faecalis (las colonias se
presentan incoloro azul, esta bacteria
causan infecciones en seres humanos)
Staphylococcus aereus (ocasionan
infecciones de la piel, se presentan en la
placa en colonias de color amarillo).

PLACA CON MEDIO DULTIVO DE MANITOL SALADO

En esta placa se ha sembrado muestras

de un piercing, mucosa bucal y un
maniquí de auxiliar de enfermería.
En el piercing las colonias se presentan
transparentes y aparece la Cándida que
es una bacteria oportunista del cuerpo.
En la mucosa bucal presenta hongos
 por contaminación y en el maniquí la colonia se presenta de color amarillo y
presenta el staphilococcus aureus.

8.ANEXOS

9.OBSERVACIONES

10.BIBLIOGRAFÍA