CAPITULO 8

BIOTECNOLIGIA ANIMAL
8.1 introducción
En los últimos cuarenta años, se han desarrollado numerosas técnicas para la mejora
de las estirpes animales. La inseminación artificial ha tenido un enorme impacto sobre
la industria láctea. Cada vez son más utilizadas técnicas como la fertilización in vitro, la
clonación de embriones y el trasplante de núcleos. Los progresos biotecnológicos que
más probablemente afectaran a los animales de abasto solo el uso de sustancias
exógenas, elaboradas por ingeniería genética administradas a los animales o
utilizadas en los alimentos procedentes de los genomas animales para producir
animales transgénicos. La tecnología de los animales transgénicos ofrece algunas
ventajas de una manera directa, incluyendo la disponibilidad de proteínas con valor
terapéutico. Esta tecnología también tiene el potencial de proporcionar un método
genético preciso de desarrollar estirpes de animales de abasto resistentes a
enfermedades, así como animales más magros o con tasas de crecimiento más
eficaces
En los últimos veinte años, se han conseguido establecer de manera sistemática
métodos para el mantenimiento y programación de células animales en cultivo.
Concretamente, la capacidad de producir sueros y vacunas a partir de cultivos
celulares de una manera rápida y barata, han supuesto una gran mejora de la salud
pública. Estos valiosos productos denominados biológicos, se encuentran en una gran
expansión, y esta tecnología ha creado una nueva industria para explotar la posibilidad
de cultivos a gran escala. Este capítulo trata de los animales transgénicos y del cultivo
de células animales que pueden ser incluidos en la biotecnología de los alimentos.
8.2 animales transgénicos

La terapia génica, que consiste en la corrección de errores metabólicos de nacimiento

mediante la inserción de genes normales en el organismo enfermo, se ha aplicado con
éxito en numerosos sistemas animales. Las mismas técnicas que se utilizan en la
terapia genética pueden aplicarse en sofisticados programas de mejora animal para
introducir características nuevas o ya existentes más rápidamente que lo que era
posible con el cruzamiento tradicional. En el cruzamiento animal, los objetivos son la
modificación de las células somáticas o germinales por manipulación genética in vitro
o transgénesis, el objetivo es producir animales con cambios heredables en su
genotipo que permita que los beneficios de la manipulación genética observados en
los parentales pasen a su descendencia. Desde el punto de vista económico,
actualmente el interés se centra en la modificación de los animales de abasto,
incluidos la fertilidad, la tasa de crecimiento, el rendimiento en la producción están
regulados por hormonas de naturaleza proteica. Ya se han clonado los genes que
codifican algunas de estas hormonas ofreciendo una oportunidad para manipular la
fisiología de los animales abasto.
La transferencia genética en su mayoría se realiza por micro inyección en óvulos
recientemente fecundados o en embriones en sus primeros estadios de desarrollo;
pero otros procedimientos pueden ser más adecuados en el futuro, como la más
transferencia genética por electroporación o la mediada por esperma, por ejemplo,
para conseguir un ratón transgénico, se estirpan quirúrgicamente los óvulos de una
hembra adulta y se fertiliza con esperma en un tubo de ensayo. Un plástico
recombinante que contiene un gen nuevo modificado se implanta en una madre
hospedadora. Cualquiera que sea el método empleado para producir animales
transgénicos, no existen control alguno sobre el lugar en el que el DNA donante se
integrar en el genoma receptor. Una de las principales limitaciones es la falta de
conocimiento sobre que genes controlan los distintos procesos fisiológicos y sobre
cómo son regulados en las distintas fases del desarrollo y en los tejidos específicos.
Cuando se transforman microorganismos, los transformantes que resultan crecen en
los tiempos de duplicación de menos de 2 horas. En toda una jornada de trabajo solo
se pueden realizar entre 5 y 10 microinyecciones en óvulos en óvulos fecundados de
ratón y sin embargo, no todos ellos necesariamente expresaran el gen foráneo.
Mientras que los ratones transgénicos tienen interés como herramientas
experimentales, la técnica que tiene aplicarse a los animales de abasto si se quiere
obtener algún beneficio económico. El trabajo con los animales de abasto mayor
tamaño es mucho difícil que los ratones porque las vacas y las cerdas no reproducen
tantos óvulos y la reimplantación de los embriones manipulados es más complicada.
Aunque desde el punto de vista científico los productos alimenticios procedentes de
los animales de abasto resultantes de las nuevas tecnológicas se consideran seguros,
la introducción de estos productos en el mercado norteamericano requiere la
aceptación por parte de la FDA respeto de los niveles que se consideran seguros de
residuos farmacéuticos o toxicológicamente activos. Mc Evoy et al (1992) revisan las
nuevas tecnológicas, como la clonación de embriones o el trasplante de núcleos y sus
hipotéticos efectos sobre el medio ambiente, sobre la diversidad genética, la
producción animal y los beneficios para el consumidor.
Aunque se perciben inmediatamente los beneficios que el uso de la transferencia
génica puede tener sobre la modificación de los caracteres productivos de los
animales de abasto, probablemente la mayor contribución a la industria alimentaria
este en la obtención de animales más resistentes a enfermedades y parásitos, o en la
mejora de la digestión de piensos o en la producción de proteínas nuevas o
modificadas para la industria médica o alimentaria. Ejemplo más evidente es la leche
producida por vacas tratadas con somatotrapina bovina recombinante (rBST). La
hormona proteica somatotrapina se produce en la glándula pituitaria del hombre y de
todo los animales abasto. En estados unidos, las empresas Eli Lilly y Monsanto han
desarrollado BST recombinante producida por microorganismos modificados
genéticamente. Las vacas inyectadas con rBST producen más leche, y esta leche
conteniendo rBST comenzó a comercializarse en 1994. Aunque la leche producida con
ayuda de la hormona fue declarada segura por las agencias gubernamentales,
muchos consumidores la consideran un riesgo sanitario (stnholm y waggomer, 1992;
loyd-evans, 1994). Aproximadamente el 90% de la población adulta es intolerante a la
lactosa (mala absorción), de modo que la leche de animales transgénicos que
produjeron lactasa (galactosidasa) en la glándula mamaria podría contener una
menor cantidad de lactosa. Por otro lado, podría reducirse el contenido en la lactosa
de la leche disrumpiendo el gen dela lactoalbúmina, que es esencial para la síntesis de
lactosa o utilizando mecanismos de RNA antisentido (Mercier, 1986). Para producir
leche bajo contenido graso, la transferencia y expresión del gen para la 12-desaturasa,
de origen vegetal, podría reducir el contenido de lípidos en la leche cerca de un 30%
de los ácidos grasos hacia formas poliinsaturadas (Ganon et al., 1990).

8.3 cultivo de células animales

En sus orígenes, el cultivo a gran escala de células animales se desarrolló para la
producción de virus animales como vacunas. En 1962, se logró cultivar células de
riñón de cría de hámster en suspensión y se han utilizado industrialmente con
capacidades de hasta 10.000 L. como las células de la mayoría de los animales son
aptas para el cultivo in vitro, se espera que la demanda mundial en 1990 de 280
millones de animales de experimentación se vaya reproduciendo conforme se vayan
desarrollando los cultivos de células animales. Más recientes el objetivo ha sido la
producción de proteínas humanas con valor terapéutico, como son hormonas,
linfoquinasas, enzimas, anticuerpos e interferones. Del mismo modo que con el cultivo
de células vegetales, el cultivo de células animales se ocupa del estudio de partes de
órganos, tejidos células individuales in vitrio.
8.3.1 obtención de líneas celulares
El cultivo de células animales comienza con la disociación del fragmento de tejido en
sus células componentes mediante un tratamiento con tripsina o con compuestos
quelantes. Las células animales son dos tipos: células dependientes de anclaje, que
requieren una superficie para crecer como por ejemplo los fibroblastos humanos; y las
células HeLa (una línea celular tumoral) o los hibridomas. Independientemente de la
línea celular, todos los cultivos de células animales requieren un suministro adecuado
de oxígeno, un mantenimiento moderado del pH, una fuente de energía y carbono
(normalmente la glucosa) y la adición de aminoácidos, metales traza, factores de
crecimiento específicos, y hormonas.
8.3.1.1 células anclaje-dependientes
La suspensión de células animales se coloca en botellas de fondo plano de vidrio o de
plástico que contienen el medio de cultivo líquido. Tras un periodo de latencia, las
células se adhieren a la superficie del avance y comienzan a divertirse por mitosis.
Este tipo de cultivo, procedente de un tejido diferenciado, se denomina cultivo
primario. En el fondo de la botella se forma una capa continua de células, denominada
monocapa. Este cultivo de células primario pueden recuperarse del envase mediante
una digestión con tripsina o con la adición del agente quelante ácido
etilendiaminotetraacetico (EDTA). Estas células pueden utilizarse para inocular cultivos
secundarios por subcultivo en medio fresco hasta conseguir una elevada densidad
celular. El termino línea celular se aplica a las generaciones obtenidas tras el primer
subcultivo. Cepa o estirpe son términos que se aplican solo cuando, mediante la
clonación o selección, se han obtenido células con propiedades específicas y estables.
Las estirpes celulares no tienen una vida indefinida y se dividen solo un número finito
de veces antes de morir. Normalmente las células humanas se dividen unas 50-100
veces antes de morir. Utilizando técnicas convencionales, suele ser posible obtener
densidades celulares cercanas al millón de células por mililitro. Por ejemplo, de una
botella con 500 cm2se pueden obtener únicamente 3 x 107 células, ya que la superficie
de crecimiento es solo una pequeña fracción del volumen total de la botella. Además,
la variabilidad en los cultivos celulares obtenidos a partir de una serie de botellas hace
prácticamente imposible controlar la cinética celular y modificar el medio de
crecimiento.
se ha sugerido muchos métodos para resolver el problema que presentan las células
anclaje-dependientes de la baja proporción entre la superficie disponible para el
crecimiento y el volumen total entre estas están las esferas microportadoras de
dextrano, el propagador múltiple, las películas espirales y las bolsas de plástico. La
metodología preferida para los sistemas a gran escala es un sistema microportador,
pues permite una manipulación fácil y adecuada y proporciona una solución al
problema de la limitada transferencia de oxígeno.
8.3.1.2 células en suspensión

Las células HeLa, los linfocitos y otras muchas líneas celulares tumorales no necesitan
una superficie para crecer y pueden cultivarse en fermentadores similares a los
utilizados para las bacterias. Sin embargo, las células de mamífero carecen de pared
celular y se dañan fácilmente con las fuerzas de cizalla. Por lo tanto, se han
desarrollado técnicas nuevas para evitar estrés por cizalla. La principal modificación
respecto del sistema tradicional de agitadores es la introducción de burbujas de aire
desde el fondo del tanque. Este sistema se ha escoltado hasta los 8.000 L para la
producción comercial de virus aftoso a partir de células BHK o a partir de una línea
celular diferente procedente de hámster (IFFA-3). Además hoy en día se produce -
interferón a partir de la línea linfoblastoide de Namalwa. El sistema puede modificarse
en países tecnológicamente menos desarrollados para la reproducción de vacunas.
Las células también pueden proteger mediante la creación de paredes celulares
artificiales mediante la encapsulación de las células en alginato calcio. Actualmente se
utilizan la encapsulación para producir células de hibridoma y sus productos.
8.3.2 líneas celulares continuas

Algunas células se alteran a través de los ciclos de subcultivo tomando una morfología
diferente creciendo más deprisa, y adquiriendo la habilidad para dar comienzo a una
línea celular continua. Se dice que tales líneas celulares están transformadas, y
generalmente son neoplásicas, esto es, que produce cáncer si trasplantan en animales
sensibles. Las líneas celulares transformadas también pueden obtenerse de cultivos
celulares primarios normales infectándolos con virus oncogénicos o tratándolas con
compuesto carcinogénicos. Las líneas celulares continuas se caracterizan por permitir
un cultivo ilimitado in vitro (Fig.8.1).
El cultivo continuo es un método práctico y útil de producir células o para obtener
información de esas células. Sin embargo, la producción a gran escala de cultivos
continuos presenta problemas nuevos y todavía no se ha instaurado de forma
comercial. La tabla 8.1 resume algunas de esas dificultades.
8.4 aplicaciones
Los cultivos de células animales proporcionan un amplio abanico de productos de
interés comercial, entre los que se incluyen inmunorreguladores, anticuerpos, factores
de crecimiento polipeptidicos, enzimas, y hormonas. Ya se han utilizado en la
producción de vacunas víricas, de activadores del plasminógeno (enzimas que facilitan
la destrucción de los coágulos sanguíneos), interferón, anticuerpos monoclonales, y
antígenos específicos de tumor (para kits de diagnósticos).
Otra posible aplicación de las células cultivos es la evaluación de nuevos fármacos y
toxico químicos. En conjugación con los modelos animales convencionales, las células
cultivadas podrían reducir tiempo y coste, así como el número de animales de
experimentación necesarios para los ensayos para los ensayos clínicos. Se conocen
varias proteínas humanas con cantidad terapéutica difíciles de conseguir. Se pueden
utilizar líneas de células animales para sintetizar estas proteínas como son los
interferones (), las interleuquinas el activador de plasminógeno, la
acetilcolinesterasa y la uroquinasa. No obstante, tales cultivos celulares producen
pequeñas cantidades de estas proteínas. Una solución al problema de los bajos
rendimientos es producir la proteína en bacterias utilizando la tecnología del DNA
recombinante. De hecho, las células animales son más adecuadas que los sistemas
bacterianos porque muchas proteínas animales sufren modificaciones
postraduccionales como por ejemplo glicosilación para la proteína se procese
correctamente y se a secretada al medio de cultivo. No obstante, existen problemas
relacionados con la baja tasa de crecimiento, la baja densidad celular y un bajo
rendimiento de producto. Si el cultivo de las células animales es la única ruta posible
para obtener células neoplásicas transformadas susperproducen una determinada
proteína como nuestra tabla 8.2.

8.4.1 desarrollo de líneas celulares animales

En los años sesenta ocurrió un gran avance en el campo de las células modificadas
genéticamente, pues se demostró la viabilidad de un producto de fusión entre una
célula humana y una de ratón. Kohler y Milstein (1975) produjeron una línea celular
funcionada linfocito-mieloma que conservaba si viabilidad y excretada moléculas de
antibiótico. Esta tecnología del hidridoma más tarde fue desarrollada para producir
anticuerpos monoclonales (MAs). La creciente demanda de anticuerpos monoclonales
en aplicaciones tales como reactivos para diagnóstico, análisis de imagen de tumores,
inmovilización. Además del método de función de células animales para producir
líneas celulares modificadas genéticamente, existen otras muchas técnicas de
producción de nuevas líneas celulares de la producción de proteínas, y algunas han
logrado aplicarse de manera comercial. Tabla 8.3 enumera algunas proteínas que
probablemente serán producidas por células animales genéticamente modificadas en
algunos casos los niveles de expresión son demasiado bajos para tener interés
comercial, pero sin duda este problema quedara solucionado en el futuro.
Se pueden emplear numerosos sistemas de vectores para transformar células
animales. Tanto los vectores basados en el virus 40 de simio (SV 40) como los
basados en el polioma se han utilizado como vectores líticos en células. No obstante,
el DNA desnudo, presentando en forma de precipitado de fosfato cálcico, es un
método popular de transfeccion, especialmente acoplado a genes que pueden actuar
como marcadores selectivos, y en presencia de una DNA portador, que incrementa la
eficiencia del proceso. Los vectores se unen a la superficie celular y son ingeridos por
endocitosis. Los métodos directos de transferencia mediana por DNA suponen la
microinyeccion en el núcleo de una célula somática o de un cigoto. La rápida tasa de
crecimiento de las bacterias en medios sencillos y baratos es una ventaja nada
desdeñable en la economía de la producción a gran escala. Sin embargo, el tamaño y
complejidad de algunas proteínas de mamífero suponen graves dificultades de
glicosilación, metilación y acilacion. Estas modificaciones a menudo son necesarias
para la función de cuerpos de inclusión que se formaban en las bacterias
recombinantes (por ej., en E. coli), el aparato de golgi delos eucariotas permite la
secreción de proteínas en el medio de cultivo, lo que facilita la recuperación del
producto. Esta es la razón de la considerable atención que se ha prestado a la
ingeniería genética de las células animales como medio de producción de algunos
compuestos biológicos complejos.
8.4.1.1 anticuerpoes monoclonales
Uno delos compuestos producidos por las células animales que atrae una atención
cada vez más importante son los anticuerpos monoclonales producidos por los
linfocitos B (células plasmáticas). Se trata de un anticuerpo específico producido por
una célula B normal de corta vida activada por antígeno que ha sido inmortalizada al
hibridarla con una célula de mieloma (transformación neoplásica). Estas células
hibridas (hibridomas) retienen la capacidad de la célula B de secretar anticuerpos, y la
capacidad de la célula de mieloma de crecer de manera indefinida. Cuando se
comparan con los antisueros policlonales convencionales, que derivan de muchas y
contienen anticuerpos heterogéneos, los anticuerpos monoclonales derivan de una
única célula que produce un único tipo de anticuerpo contra un solo determinante
antigénico. En la figura 8.2 se muestra el procedimiento de preparación de líneas
celulares hibridoma.
El primer paso consiste en el aislamiento de los linfocitos B del bazo de
animales (normalmente ratones) que han sido inyectados con el antígeno de
interés. Cuando el título es alto se estirpa el bazo. Los linfocitos B se fusionan
con células de mieloma (que son células tumorales derivadas de linfocitos
malignos) mediante la incubación de la mezcla con polietiléngicol. Las células
lavadas con medio liquido nuevo son una mezcla de hibridomas, células de
mieloma no fusionadas y linfocitos no fusionados, la frecuencia de fusión es
muy baja, alrededor de una célula de hibridoma por casa mil células no
fusionadas. Los linfocitos B terminan por morir in vitro, y para seleccionar
contra las células de mieloma, se utilizan líneas defectivas en la hipoxantina
fosforiboxiltransferasa (HPRT) o en timina quinasa (TK). Las estirpes de
deficientes en HPRT o TK son incapaces de utilizar la hipoxantina o la timidina,
respectivamente; y por tanto han de sintetizar los nucleótidos de novo, estas
rutas son sensibles ala aminopteriana (A). Por lo tanto la adición de
aminopterina en presencia de hipoxantina y timidina destruye las células
originales de mieloma y selecciona los hibridos que han recibido el gen HPRT
(o TK) de las células del bazo.
Los hibridos se clonan de manera de que cada uno de los pocillos de una placa
de microtitulacion recibe uno o unos pocos clones, y después los hibridos se
analizan para el anticuerpo de interés. Los clones positivos se subclonan por
dilución y redistribución den nuevas placas de microtitulacion, y se caracterizan
los nuevos clones. El medio hipoxantina-timidina es inhibitorio para las células
HPRT- pero permite el crecimiento de las células HPRT+. No obstante el
rendimiento de anticuerpos monoclonales in vitro a menudo es bajo (unos 5-
10ug/L). Una solución es crecer las células de hibridoma a una densidad
celular elevada en o sin la presencia de microportadores. De este modo se han
obtenido niveles de 10 -1.000mg/. Hoy en día el cultivo a gran escala en
fermentadores de ascenso de burbujas de hasta 1.000L es una realidad
comercial, pudiendo alcanzar producciones de 50 mg/L. utilizando la tecnología
de la micro encapsulación, se produce entre 100-1.000 mg/L lo que hace
económicamente viable de la producción de anticuerpos monoclonales.
Un modo alternativo de obtener una elevada concentración de anticuerpos es
crecer el hibridoma en líquido ascítico (como suspensiones de células
tumorales en el interior de la cavidad peritoneal de una especie isogénica).