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Facultad de Estudios Superiores *Zaragoza* Grupo; 24-1

Análisis de Fármacos y Materias Primas II

TÍTULO DEL PROYECTO: ANÁLISIS POR FLUOROMETRÍA DE RIBOFLAVINA

OBJETIVO:

CONTENIDO PÁGINA

Descripción del fundamento de la 2

fluorometría……………………………………………………………

Características estructurales de la molécula para poder analizarla por 2

Fluorometría……………………………………………..

Descripción del método de adición de un estándar en un punto.. 4

Presentación del método propuesto (Datos y cálculos previos del 4

anteproyecto)………………………………………………………..

Descripción del equipo utilizado………………………………….. 5

Presentación de resultados (pesadas, diluciones reales y lecturas) y un 5

breve análisis de ellos (validez, errores, sugerencias) ………….

Conclusiones con respecto a especificaciones (rechazar o no rechazar) 5

……………………………………………………………...

Lista de Referencias consultadas…………………………….. 6

Elaboró Victoria Sarai Revisó Tapia Oswaldo Revisó Daniel Canuto

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Análisis de Fármacos y Materias Primas II

Fundamento de fluorometría
La fluorometría es una técnica analítica utilizada en química y bioquímica para cuantificar la
concentración de compuestos fluorescentes en una muestra. La base de esta técnica se
fundamenta en la propiedad de ciertos compuestos de absorber la luz en una determinada
longitud de onda y emitir luz a una longitud de onda mayor.
Para llevar a cabo la fluorometría, se utiliza un espectrofluorímetro, que es un instrumento
que permite medir de forma precisa la intensidad de la luz emitida por una muestra
fluorescente. El primer paso es excitar la muestra con una luz de una determinada longitud
de onda, conocida como longitud de onda de excitación. Esta luz es absorbida por los
compuestos fluorescentes presentes en la muestra, que luego emiten luz a una longitud de
onda mayor, conocida como longitud de onda de emisión.
La intensidad de la luz emitida es proporcional a la cantidad de compuestos fluorescentes
presentes en la muestra, por lo que se puede utilizar para determinar la concentración de
estos compuestos. Además, la fluorometría ofrece una alta sensibilidad y selectividad, ya
que la mayoría de los compuestos no son fluorescentes y no interfieren en la medición.
La técnica de fluorometría se aplica en diversos campos, como la detección de proteínas,
ácidos nucleicos, enzimas y compuestos orgánicos en muestras biológicas. También se
utiliza en la investigación y desarrollo de nuevos fármacos, análisis de alimentos y análisis
medioambiental.
En resumen, la fluorometría es una técnica analítica muy útil y versátil que se basa en la
propiedad de ciertos compuestos de absorber y emitir luz fluorescente. Permite cuantificar la
concentración de compuestos fluorescentes en una muestra y se utiliza en diversos campos
de investigación y análisis.

Características que tiene riboflavina para poder analizarla por fluorometría.

La riboflavina, también conocida como vitamina B2, es un compuesto que presenta

características inherentes que lo hacen apto para su análisis mediante fluorometría:

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● Fluorescencia: La riboflavina posee la propiedad de ser fluorescente, lo que significa

que puede absorber luz en una determinada longitud de onda y emitirla a una
longitud de onda mayor. Esto es fundamental para poder detectar y medir la
riboflavina mediante el uso de un espectrofluorímetro.
● Alta absorción de luz: La riboflavina tiene una alta capacidad para absorber luz en la
región del espectro ultravioleta-visible. Esto hace que sea fácilmente excitada por
una luz de excitación específica, lo que contribuye a la sensibilidad de la técnica de
fluorometría.
● Estabilidad: La riboflavina es un compuesto estable, lo que facilita su conservación y
análisis en muestras. Además, su estabilidad contribuye a la reproducibilidad y
precisión de los resultados obtenidos mediante fluorometría.
● Especificidad: La riboflavina es selectiva en su absorción y emisión de luz. Esto
significa que su señal de fluorescencia no se ve afectada por la presencia de otros
compuestos o interferencias en la muestra. Esto añade un nivel de especificidad y
confiabilidad a la técnica de fluorometría en el análisis de la riboflavina.
● Sensibilidad: La riboflavina presenta una alta sensibilidad a la excitación lumínica y
una respuesta lineal en relación con su concentración. Esto significa que se puede
utilizar una pequeña cantidad de riboflavina en la muestra y aún así obtener una
señal de fluorescencia detectable y proporcional a su concentración.
● La riboflavina es una vitamina hidrosoluble del complejo B
● La riboflavina tiene una máxima absorbancia a 450 nm y una máxima emisión a 540
nm, por lo que se deben usar estas longitudes de onda para excitar y detectar la
fluorescencia de la riboflavina.
● La riboflavina es sensible a la luz y al calor, por lo que se debe evitar la exposición
prolongada de las soluciones a estas condiciones, ya que pueden provocar su
degradación y disminución de la fluorescencia.
● La riboflavina es afectada por el pH del medio, ya que su forma protonada es más
fluorescente que su forma desprotonada. Por lo tanto, se debe ajustar el pH del
medio a un valor óptimo para maximizar la fluorescencia de la riboflavina. Se ha
reportado que el pH óptimo para la riboflavina es alrededor de 5.5.
● La riboflavina puede estar unida a proteínas o formar complejos con otros
compuestos en las muestras, lo que puede interferir con su fluorescencia. Por lo
tanto, se debe realizar una hidrólisis ácida y una digestión enzimática para liberar la
riboflavina de las proteínas, y una precipitación de proteínas para eliminar los
posibles interferentes.
● La riboflavina tiene una relación lineal entre su concentración y su intensidad de
fluorescencia dentro de un cierto rango, por lo que se puede usar el método de la
curva de calibración para determinar su concentración en las muestras. Sin
embargo, si hay efectos de matriz que afectan la señal fluorescente, se puede usar
el método de adición estándar en un solo punto o el método de adiciones estándar
múltiples para corregir estos efectos.

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Método adición de un estándar en un solo punto.

El método de adición de un estándar en un solo punto en fluorometría es una técnica que se
utiliza para corregir los efectos de matriz que pueden afectar a la medición de la
fluorescencia de una muestra. La matriz es el conjunto de componentes de la muestra que
no son el analito de interés, y que pueden interferir con la señal fluorescente al absorber la
radiación incidente o emitida, o al provocar una emisión secundaria o un apagamiento
(quenching) de la fluorescencia. Estos efectos pueden hacer que la señal medida no sea
proporcional a la concentración del analito, y por lo tanto, que no se pueda aplicar el método
de la curva de calibración.
El método de adición de un estándar en un solo punto consiste en añadir una cantidad
conocida del analito a la muestra, y medir la señal fluorescente resultante. Luego, se
compara esta señal con la que se obtiene al medir una solución estándar del analito con la
misma concentración que la suma de la concentración original de la muestra y la cantidad
añadida. Si ambas señales son iguales, significa que no hay efectos de matriz, y se puede
determinar la concentración original de la muestra por diferencia. Si las señales son
diferentes, significa que hay efectos de matriz, y se puede calcular un factor de corrección
que relacione la señal medida con la concentración real del analito.
El método de adición de un estándar en un solo punto tiene algunas ventajas y desventajas.
Entre las ventajas, se puede mencionar que es un método rápido y sencillo, que requiere
poca cantidad de muestra y estándar, y que permite eliminar los efectos de matriz sin
necesidad de conocer su naturaleza o magnitud. Entre las desventajas, se puede mencionar
que es un método menos preciso que el método de adiciones estándar múltiples, que
requiere más puntos experimentales y una regresión lineal, y que permite estimar el error
asociado a los efectos de matriz.

Método propuesto
Material:
● 4 matraces aforados de 10 mL
● 2 matraces aforados de 25 mL
● 1 pipeta volumétrica de 3 mL
● 3 pipetas volumétricas de 1 mL
● Mortero con pistilo
● Gotero
● Tabletas de Multivitamínicos con 2.5 mg de Riboflavina por tableta: MARBETE
Se utilizó método de adición estándar
● Dilución de Estándar:
( 10.41 𝑚𝑔
.025 𝐿 )( .003 𝐿
.025 𝐿 )( .001 𝐿
.01 𝐿 ) = 4. 99 𝑝𝑝𝑚
● Dilución de Muestra:
( 2 𝑚𝑔
.01 𝐿 )( .001 𝐿
.01 𝐿 )( .001 𝐿
.01 𝐿 ) = 2 𝑝𝑝𝑚

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Equipo utilizado
Espectrofluorómetro
Celdas de vidrio
NB 440
SC535
Resultados y análisis de resultados
● Pesada STD: 10.4 mg
● Pesada de 3 tabletas: 668.8 mg el cual tiene 7.5 mg de Riboflavina
● Pesada Muestra: 178.2 mg el cual tiene 1.99 mg
● Dilución real de Estándar:
( 10.41 𝑚𝑔
.025 𝐿 )( .003 𝐿
.025 𝐿 )( .001 𝐿
.01 𝐿 ) = 4. 99 𝑝𝑝𝑚
● Dilución real de Muestra:
( 1.99 𝑚𝑔
.01 𝐿 )( .001 𝐿
.01 𝐿 )( .001 𝐿
.01 𝐿 ) = 1. 99 𝑝𝑝𝑚
Respuesta de Muestra: 024
Respuesta de Muestra + STD: 037
𝐹𝑥 𝐹𝑥+𝑠𝑡𝑑
𝐶𝑥
= 𝐶𝑥𝑉𝑥 + 𝐶𝑠𝑡𝑑𝑉𝑠𝑡𝑑
𝑉𝑥 +𝑉𝑠𝑡𝑑
024 037
𝐶𝑥
= 𝐶𝑥(5 𝑚𝐿) + (4999 µ𝑔/𝑚𝐿)(2 𝑚𝐿) = 690.64 𝜇g / mL
2 𝑚𝐿 + 5 𝑚𝐿
.690 mg de Riboflavina en 178.2 mg de tableta
1 tableta tiene un peso de 222.9 mg
178.2 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑜𝑙𝑣𝑜 𝑑𝑒 𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒𝑡𝑎−−−−−− .69064 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑅𝑖𝑏𝑜𝑓𝑙𝑎𝑣𝑖𝑛𝑎
228. 9 𝑚𝑔 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒 1 𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒𝑡𝑎−−−−−− 𝑥= .8638 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑅𝑖𝑏𝑜𝑓𝑙𝑎𝑣𝑖𝑛𝑎
2.5 mg por tableta marcado en el MARBETE y se encontró .8638 por tableta
Se encontró 34.55 % de Riboflavina por tableta
Conclusiones
Los resultados marcan que se tiene una concentración menor del compuesto activo que se
analizó, por esto se rechaza por solo contener .8638 mg de Riboflavina por tableta

Referencias consultadas
I. Principio y aplicaciones de la fluorimetría - Ciencia y Datos.
https://cienciaydatos.org/ciencia/principio-y-aplicaciones-de-la-fluorimetria/.
II. Espectrometría de fluorescencia.
https://www.espectrometria.com/espectrometra_de_fluorescencia.
III. Fluorometer - Wikipedia. https://en.wikipedia.org/wiki/Fluorometer.

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IV. La protección radiológica y la fluoroscopia | OIEA.

https://www.iaea.org/es/recursos/proteccion-radiologica-de-los-pacientes/profesionales-de-la-
salud/radiodiagnostico/fluoroscopia.
V. Adición estándar _ AcademiaLab. https://academia-lab.com/enciclopedia/adicion-estandar/.
VI. Manual de Laboratorio de Análisis de Fármacos y Materias Primas II - UNAM.
https://www.zaragoza.unam.mx/wp-content/Portal2015/Licenciaturas/qfb/manuales/13Manual
_Analisis_Farmacos_MateriasPrimas2.pdf.
VII. Efecto matriz en medidas analíticas: método de las adiciones estándar.
https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/182774/Martinez%20-%20Efecto%20matriz%20
en%20medidas%20analiticas%20metodo%20de%20las%20adiciones%20estandar.pdf?sequ
ence=1.
VIII. METODO DE CALIBRACION DE ADICIONES ESTANDAR.
https://www.clubensayos.com/Ciencia/METODO-DE-CALIBRACION-DE-ADICIONES-ESTAN
DAR/4583631.html.
IX. CUANTIFICACIÓN DE RIBOFLAVINA (VITAMINA B2) EN PRODUCTOS LÁCTEOS POR
HPLC. https://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0717-75182009000200005.
X. DETERMINACI CUANTITATIVA DE LA RIBOFLAVINA POR FLUOROMETR A.
https://www.buenastareas.com/ensayos/Determinaci-Cuantitativa-De-La-Riboflavina-Por/743
18344.html.
XI. RIBOFLAVINA - unizar.es. http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/vitamins/riboflavina.html.
XII. Determinación cuantitativa de la riboflavina - Prácticas o problemas. Disponible en:
https://www.clubensayos.com/Ciencia/Determinaci%C3%B3n-cuantitativa-de-la-riboflavina/27
54049.html.
XIII. CUANTIFICACIÓN DE RIBOFLAVINA (VITAMINA B2) EN PRODUCTOS LÁCTEOS POR
HPLC. https://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0717-75182009000200005.
XIV. DETERMINACI CUANTITATIVA DE LA RIBOFLAVINA POR FLUOROMETR A.
https://www.buenastareas.com/ensayos/Determinaci-Cuantitativa-De-La-Riboflavina-Por/743
18344.html.
XV. RIBOFLAVINA - unizar.es. http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/vitamins/riboflavina.html.
XVI. Determinación cuantitativa de la riboflavina - Prácticas o problemas ....
https://www.clubensayos.com/Ciencia/Determinaci%C3%B3n-cuantitativa-de-la-riboflavina/27
54049.html.
XVII. COLORIMETRÍA: ANÁLISIS ESPECTROFOTOMÉTRICO DE LA RIBOFLAVINA
INTRODUCCION.
https://q=procedimiento+con+las+diluciones+para+analizar+riboflavina+por+fluorometr%c3%
ada.
XVIII. DETERMINACIÓN FLUOROMÉTRICA DE RIBOFLAVINA (VITAMINA B2).
https://prezi.com/fqgj8ddos3jk/determinacion-fluorometrica-de-riboflavina-vitamina-b2/.
XIX. CUANTIFICACIÓN DE RIBOFLAVINA (VITAMINA B2) EN PRODUCTOS LÁCTEOS POR
HPLC. https://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0717-75182009000200005.
XX. COLORIMETRÍA: ANÁLISIS ESPECTROFOTOMÉTRICO DE LA RIBOFLAVINA
INTRODUCCION. https://bioquibi.webs.ull.es/practicas/2.pdf
XXI.

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