CAPÍTULO
14
M,crofo1ografía elernón,ca de barrido que muestra la formación de vesículas
cub,enas de clatrina sobre la cara citosólica de la membrana plasmática. (John
~,_,.i,?r wa~hmgton Urnve1s1ty Schoo1 of Medicine)
n el capítulo anterior hemos explorado el modo en que las proteí-
E
nas se etiquetan y translocan a través de las membranas de varios
orgánulos intracelulares que incluyen el retículo endoplasmátic o,
las mitocondrias y los cloroplastos, los peroxisomas y el núcleo. En este
capítulo centraremos nuestra atención en la vía secretora y en los me-
canismos del tránsito vesicular que permiten que las proteínas se secre-
ten desde la célula o lleguen a la membrana plasmática y al lisosoma.
También analizaremos los procesos relacionados de la endocitosis y de
la autofagia que emplean las proteínas de moléculas pequeñas desde el
exterior de la célula o desde el citoplasma hacia el interior del lisosoma
para su degradación.
La vía secretora lleva tanto proteínas solubles como proteínas de
membrana desde el RE hasta su destino final en la superficie celular o
en el lisosoma. Las proteínas entregadas a la membrana plasmática in-
cluyen los receptores de la superficie celular, los transportadore s para la
captación de nutrientes y los canales iónicos que mantienen el equilibrio
iónico y electroquímico adecuado a través de la membrana plasmática.
Estas proteínas de membrana, una vez que han alcanzado la membrana
plasmática, quedan incrustadas en ella. Las proteínas solubles secretadas
también siguen la vía secretora hasta la superficie de la célula, pero, en
lugar de quedar insertadas en la membrana, se liberan hasta el ambiente
acuoso extracelular. Ejemplos de proteínas secretadas son las enzimas
digestivas, las hormonas peptídicas, las proteínas del suero Yel colágeno.
Como se describió en el Capítulo 9, el lisosoma es un orgánulo con un
..__ _____
CONTENIDO
14•1 Técnicas para 629
el estudio de la vía secretora
14•2 Mecanismos
moleculares de formación Y fusión
de las vesículas 634
14 3 640
• Etapas iniciales de la vía secretora
Tráfico, secreción y
endocitosis vesiculares
interior ácido, empleado, generalmente, para degradar proteínas inne-
cesarias y para almacenar moléculas pequeñas como los aminoácidos.
De acuerdo con ello, los tipos de proteínas que llegan a la membrana
del lisosoma incluyen las subunidades de la bomba protónica de clase V
que bombea H• del citosol a la luz ácida del lisosoma, así como los trans-
portadores que liberan moléculas pequeñas almacenadas en el lisosoma
al interior del citoplasma. Las proteínas solubles entregadas por esta vía
incluyen las enzimas digestivas lisosómicas como proteasas, glucosida-
sas, fosfatasas y lipasas.
A diferencia de la vía secretora, que permite que las proteínas sean
dirigidas a la superficie de la célula, la vía endocítica se emplea para
captar sustancias desde la superficie de la célula y hacerlas mover hacia
su interior. La vía endocítica se emplea para ingerir ciertos nutrientes
que son demasiado grandes para ser transportados a través de la mem-
brana plasmática por uno de los mecanismos de transporte analizados
en el Capítulo 11; por ejemplo, la vía endocítica se emplea en la capta-
ción de colesterol transportado en las partículas de LDL y de los áto-
mos de hierro transportados por la proteína transferrina que une hie-
rro; además, puede emplearse para eliminar proteínas receptoras de la
superficie celular como manera de regular negativamente su actividad.
Un principio unificador gobierna todo el movimiento de las pro-
teínas en las vías secretora y endocítica: el transporte de las proteínas
de membrana insolubles de un compartimien to limitado por mem-
brana a otro está mediado por vesículas de transporte que reúnen
14.4 Etapas finales de la vía secretora
646
14.5 Endocitosis mediada por receptor
654
14.6 Direccionamiento de las proteínas de membrana
y materiales citosólicos al lisosoma
661
 S~ec~r:e~
~~ A~N~l~M~A~C~l~Ó~N~G~E~N~E~R~A~L::_:.:_
__0~ '. l.~a:_
ci~ó~n_:d:'.e:..' ro~t_::
s !::p~ ____
e~ín~a'.s:__ _ _ _ __ _ _ __ _ __ _ _ _ _ __ _

FIGURA 14-1 Panorama de las vías

secretora y endocítica de la clasificación
de las proteínas. Vio secretora: la síntesis
de proteínas que llevan una secuencia de
señal RE se completa en el RE rugoso O, y las
Exterior

Citosol
. -----,~ m Secreción (
constitutiva IJ Endocitosis \
Membrana
plasm~

11 Secreción (

e
cadenas polipeptíd1cas recién sintetizadas regulada
se insertan en la membrana del RE o lo atra- (::;;'\ Vesícula
viesan por la luz (Cap 13). Algunas proteínas la\
Vesícula \:::::.,) endocítica
(p. ej., las enzimas del RE o las proteínas ~ secretora
estructurales) permanecen dentro del RE.
Las restantes se empaquetan en vesículas
de transporte fJ que brotan desde el RE y
I n
1,;,1
Clasificación
a los lisosomas )
se fusionan para formar nuevas cisternas
cis-Golgi. Las proteínas residentes del RE mal
clasificadas y las proteínas de las vesículas
de la mem brana que requieren ser reutili-
zadas son recuperadas al RE por vesículas iJ
Red
~(;;\ -. . (;)
\:::!:,/
Vesícula .,g.,
Endosoma
tardío
de transporte
que brota n desde el cis-Golgi y se fusionan
con el RE. Cada cisterna del cis-Golgi, con
su cont enid o proteico, se mueve físicamen-
te desde la cara cis hacia la cara rrans del
'2.
complejo de Golgi fil por un proceso sin
vesículas llamado maduración de la cisterna.
\
Las vesículas d e t ransport e retrógrado 111
mueven las proteínas residentes en el apa ra-
to de Golgi al compartimiento adecuado en t @
~ ---li ~
él. En todas las células, ciertas proteínas so-
Trans-
lubles se mueven a la superficie de la célula Golgi ~
en vesículas de transporte ~ que se secretan
continuamente (secreción constit utiva). En Lisosoma
t
ciertos ti pos celulares, algunas proteínas
solubles son almacenadas en vesículas
secretoras fJ que son liberadas solo después
de que la cél ula recibe una señal neural u
Golgi
medial ----~ _,. ., _ ~® Transporte
hormonal apropiada (secreción regulada). M ad uración de retrógrado desde la
Las proteínas de membrana destinadas a las ciste rnas ta D cisterna de Golgi tardía
los lisosomas y aquel las solubles que son hacia la temprana

- ---~- ~@
Cis- c ¡ ; .
transportadas en vesículas, que brotan Golgi
desde el rrans-Golgi m, se mueven primero
~
al endosoma tardío y, luego, al lisosoma.
Vía endocírica: las proteínas de membrana y
extracelulares solubles captadas en vesículas t
que brotan desde la membrana plasmát ica
Red ~
'\
'11 también pueden moverse al lisosoma vía
el endosoma. cis-Golgi
@
© El
Formación y fusión de las
vesículas del RE hacia el
aparato de Golgi para formar Transporte retrógra? 0 RE
\ el cís-Golgi del aparato de Golg1 al

RE rugoso

a Síntesis p t ·
t ransportero eica sobre
el int .
. ,
·d s·
los ribosomas un 1 0 ' ·8
hac1
cotraducc1onal de las prote1nas E
erior O a través de la membrana del R

628 CAPITULO 14 • Tráfico, secreción y endocitosis vesiculares

las proteínas "ca rga" en vesículas que surgen de las membranas de un
co111partimiento y, luego, entregan estas proteínas ca rga al compar-
timiento siguiente al fusionarse con la membrana de ese comparti-
miento. Es importante destacar que, a medida que las vesículas de
transporte forman brotes desde una m embrana y se fusio nan con la
siguiente, la misma cara de la membrana permanece orientada hacia
el citosol; por lo tanto, una vez que una proteína se ha insertado en la
membrana o en la luz del RE puede ser llevada a lo largo de toda la vía
secretora moviéndose de un orgánulo al siguiente sin ser translocada
a través de otra membrana ni alterar su orientación dentro de ella. De
modo similar, la vía endocítica emplea el tránsito de vesículas para
transportar las proteínas de la membrana plasmática al endosoma y
al lisosoma, y preserva, de esta manera, su orientación en la mem-
brana de estos orgánulos. La Figura 14- 1 muestra las vías secretoras y
endocíticas principales de la célula.
Reducida a sus elementos más simples, la vía secretora opera en
dos etapas. La primera de ellas ocurre en el retículo endoplasmático
rugoso (RE) ( Fig. 14- 1, paso D) . Como se describió en el Capítulo
13, las proteínas solubles y de membrana recién sintetizadas se trans-
locan dentro del RE, donde se pliegan en su conformación adecuada
y se modifican covalentemente por la adición de h idratos de carbono
ligados al N o al O y por puentes disulfuro. Una vez que las proteínas
recién sintetizadas se han plegado adecuadamente y han recibido sus
modificaciones correctas en la luz del RE, avanzan a la segunda etapa
de la vía de secreción y se transportan hacia el aparato de Golgi y a
través de él.
La segunda etapa de la vía secretora puede ser resumida de la si-
guiente manera: en el RE, las proteínas carga son empaquetadas en
vesículas anterógradas ( que se mueven hacia adelante) (Fig. 14- 1,
paso 11). Estas vesículas se fusionan para formar un compartimiento
aplanado, limitado por membrana, conocido como red cis-Golgi o
cisterna cis-Golgi ( una cisterna es un contenedor de agua o de otro
líquido) . Ciertas proteínas, principalmente las proteínas que funcio-
nan en el RE, pueden recuperarse de la cisterna cis-Golgi al RE por
medio de un conjunto distinto de vesículas de transporte retrógradas
(que se mueven hacia atrás) (paso D). De una forma que asemeja una
línea de ensamblaje, una nueva cisterna cis-Golgi con sus proteínas
carga se mueve físicamente de la posición cis (la más cercana al RE) a
la posición trans (la más distante al RE), volviéndose sucesivamente,
en primer Jugar, una cisterna de Golgi medial y, luego, una cisterna
de Golgi trans (paso 11). Este proceso, conocido como maduración de
la cisterna, implica primariamente vesículas de transporte retrógra-
das (paso 11) que mueven enzimas y otras proteínas residentes en el
aparato de Golgi de cisternas tardías a cisternas tempranas de Golgi,
"madurando", por Jo tanto, las cis-Golgi a Golgi medial y las Golgi me-
dial a Golgi trans. A medida que las proteínas que serán secretadas se
mueven a través del aparato de Golgi, pueden recibir modificaciones
adicionales con hidratos de carbono unidos por glucosilo-transfera-
sas que se encuentran albergadas en diferentes compartimientos del
aparato de Golgi.
Las proteínas de la vía secretora pasan, finalmente, a _una red
compleja de membranas y vesículas llamada red trans-Golgi (RTG).
La RTG es un punto de ramificación central en la vía secretora. En
este punto, las proteínas se cargan en diferentes tipos de vesículas y,
por lo tanto, se dirigen a distintos destinos. Dependiendo del tipo de
vesicula en el que se cargue la proteína, esta será transportada a la
membrana plasmática y secretada de inmediato, almacenada para su
liberación posterior o dirigida al lisosoma (pasos r!J-lll). El proceso
por el cual una vesíc ula se mueve hacia la m em brana plasmática y se
fusiona con ella liberan do su conten ido se co noce co mo exocitosis.
En todos los tipos celulares, al m enos algu nas proteínas se secretan
conti nu amente, mientras que ot ras se almacenan dentro de la célula
hasta que una señal de exocitosis provoca su liberació n. Las proteí-
nas secretoras destinadas a los lisosom as son transportadas, primero,
por vesículas desde la red trans-Golgi hasta un compartimiento, lla-
mado habitualmente endosoma tardío; luego, las proteínas se trans-
fieren al lisosoma por fusión directa d el endosoma con la membrana
del lisosoma.
La endocitosis se relaciona mecánicamente con la vía de secreción.
En la vía endocítica, las vesículas brotan hacia el interio r desde la mem-
brana plasmática trayendo hacia el interior de la célula proteínas de
membrana y sus ligandos unidos (véase la Fig. 14- 1, derecha). Después
de internalizarse por endocitosis, algunas proteínas se transportan a
los lisosomas por medio del endosoma tardío, mientras que otras son
recicladas nuevamente a la superficie celular.
En este capítulo analizaremos, primero, las técnicas experimentales
que han contribuido a nuestro conocimiento de la vía secretora y de la
endocitosis. Nos enfocaremos, luego, en los mecanismos generales de la
formación de vesículas de membrana y de su fusión. Después veremos
que, aunque diferentes tipos de vesículas de transpo rte utilizan dife-
rentes conjuntos de proteínas para su fo rmación y su fusión, todas ellas
emplean el mismo mecanismo general para brotar, seleccionar conjun-
tos particulares de moléculas carga y fusionarse con la membrana dia-
na apropiada. En las secciones restantes del capítulo analizaremos los
estadios temprano y tardío de la vía de secreción, incluyendo el modo
en que la especificidad de la selección de los diferentes destinos se logra,
y concluiremos con un debate acerca del modo en que las proteínas se
transportan hacia los lisosomas mediante la vía endocítica.
14.1 Técnicas para el estudio de la vía secretora
La clave para comprender el modo en que se transportan las proteí-
nas a través de los orgánulos de la vía secretora ha sido desarrollar
una descripción básica de la función de las vesículas de transporte.
Muchos componentes requeridos para la formación y la fusión de las
vesículas de transporte se han identificado en la década pasada por la
notable convergencia de los enfoques genético y b ioquímico, que se
describirán en esta sección. Todos los estudios del m ovimiento intra-
celular de proteínas emplean algún método para ensayar el transporte
de una proteína dada desde un compartimiento hacia otro. Comen-
zaremos por describir el modo en que puede hacerse el seguimiento
del transporte intracelular de las proteínas en las células vivas, y con-
sideraremos luego los sistemas genéticos in vitro, que han mostrado
ser útiles para dilucidar la vía secretora.
El transporte de una proteína a través de la vía
secretora puede ser ensayado en las células vivas
Los estudios clásicos de G. Palade y sus colegas en la década de 1960
establecieron inicialmente el orden en el cual se mueven las proteínas
desde un orgánulo hasta el siguiente en la vía secretora. Estos estudios
pioneros mostraron también que las proteínas secretoras nunca se li-
beran al citosol, la primera indicación de que las proteínas transporta-
14.1 Técnicas para el estudio de la vía secretora 629

das siempre están asociadas con algú n tipo de intermediar io limit ado
por membrana. En estos experim entos, que combinaron el ma rcado
de pulso y caza (véase la Fig. J-~O) y la a utorradiogra fía, aminoáci-
dos marcados radiactiva m ente se inyectaron en páncreas d e hámsteres.
En diferentes momentos, después de la in)1ección, los animales fueron
sacrificados y las células pancreáticas fueron fijadas de inmediato con
glutaral, cortadas y so metidas a autorradiog rafía para visualizar la lo-
calización d e las proteínas radiomarcad as. Dado que los aminoácido s
radiactivos se administra ron en un pulso corto, solo aquellas proteínas
sintetizad as inmediatam en te después de la inyecció n estaban marcadas,
formando una cohorte distintiva d e proteínas marcadas cuyo transpor-
te podía ser detectado; además, d ado que las células acinosas pan creá-
ticas son células dedicadas a la secreció n, casi todos los aminoácido s
marcados d e estas células se incorporaro n a proteínas que serían se-
cretadas, lo c ual faci litó la o bservación d e las proteínas transpo rtadas.
Si bien la autorradiog rafía se emplea actualmente en raras oca-
sio nes para localizar proteínas en el interior de las células, estos ex-
perimentos iniciales ilustraron los dos requisitos básicos para c ual-
quier ensayo de transporte intercompa rti mental. En prim er lugar, es
necesario m arcar una cohorte de proteínas en un compartimi ento
inicial d e modo tal que su posterior transferenci a a compartimientos
posteriores pueda ser seguida en el tiempo. En segundo término, es
necesa rio tener un modo de identificar el compartimi ento en el cual
reside una proteína marcada. Aquí describimos dos procedimie ntos
experiment ales modernos para observar el tránsito intracelular d e
una proteína que sería secretada en casi cualquie r tipo celular.
En ambos procedimien tos, un gen que codifica una glucoproteín a de
membrana abundante (la proteína G) del virus d e la estomatitis vesicu-
lada (VSV) se introdujo a un cultivo de células d e mamífero por trans-
fección o, simplement e, infectando las células con el virus. Las células
• esta' n especializad as para la secreción, sintetizan rápi·-
t rata el as, aun s1 no
, G del VSV en el RE com o proteínas de secreció n ce -
d amente Ia pro tema
lular normal. El uso d e un m u tante que codifica una proteína G del vsv
sensible a la temperatura permite a los investigado res activar el transpor-
te posterior de esta proteína o desactivarlo . A la temperatura restrictiva
de 40 ºC, la proteína G del VSV recién sintetizada estará mal_plegada
y, po r ¡0 tanto, q ued ará retenida dentro del RE por los mecanismos de
control de calidad analizad os en el Ca pítulo 13, mientras que a la tem-
peratura permisiva de 32 ºC, la proteína estará plegada correctamen te y
se transportará a través de la vía secretora a la superficie de la célula. Es
importan te considerar que el plegam iento inadecuado d e la pro teína G
d el VSV sensible a la temperatura es reversible; así, si las células que sin -
tetizan la proteína G d el VSV mutante se hacen crecer a 40 ºC y, luego, se
cam bian a 32 ºC, la proteína G mutante de VSV m al plegada que se había
acumulado en el RE vo lverá a plegarse y se transportará normalment e.
Este uso inteligente de una mutación sensible a la temperatura d efine, en
efecto, una cohorte proteica cuyo transporte posterior puede seguirse.
En dos va riaciones de este procedimie nto básico, el transporte de
la pro teína G del VSV es monito rizado mediante técnicas diferentes.
Tanto los estudios que emplearon estos ensayos de seguimiento del
tránsito modernos com o los experimento s iniciales de Palade llegaron
a la misma conclusión: en las células de mamífero, el transporte de una
molécula de proteína m ediado por vesículas desde s u sitio de síntesis en
el RE rugoso hasta su llegada a la membrana plasmática consume entre
treinta y sesenta minutos.
La microscopi a de la proteína G del VSV marcada con PFV Un en-
foque empleado para observar el transporte de la proteína G del VSV
emplea un gen híbrido en el cual el gen del virus se fusiona con un
gen q ue codifica para la proteína fluorescente verde ( PFV), una proteí-

(i) VIDEO: Transport e de la PFV del VSVG a través de la vía secret ora
(b)
(a)
40 min 180 min 20
O min Total

<D
o
~
>
LL 10
Q_

>
V)
> 5
C)

RE Aparato Me mbra n a
de Golgí plasmática 100 200 300 400 500 600
Tiempo (min)

FIGURA EXPERIMENTAL 14-2 El transporte de proteínas a través de la de la VSVG-PFV del RE al aparato d GO I 1 fí

ocurrió en 180 minutos L b rd de 9 Y. 1nalmente, a la superficie celular
vía secretora puede verse mediante la microscopia de fluorescencia
niveles de VSVG-PFVen ei1 ~r l e la escala es de 5 µ m. (b) Gráfica de los .
de las células que producen la proteína de membrana marcada con ret1cu o endoplasmát1co (RE) e 1apara to de Golg1
y la mEcmbrana plasm ' tic- (MP) .
la PFV, Las células cultivadas fueron transfectadas con un gen híbrido que d " e n d iferentes mo mentos d espues .
a la temperatura más ba·a L 1 . . de l paso
codifica la glucoproteína de la membrana del virus VSVG ligada al gen para J · ª c net1ca d e transpon d un organ .
puede reconstruirse a part ir d e un análisis p e e ulo a otro
la proteína fluorescente verde (PFV). Una versión mutante del gen del virus se
descenso en la fluorescencia 10 1 1 or computadora de estos datos. El
usó de modo tal que la proteína híbrida recién sintetizada (VSVG-PFV) q uedaba a que se p rod ce en momentos posteriores .
probablemen te resul te de la 1 u
retenida en el RE a 40 ºC pero se liberaba para el transporte a 32 ºC. (a)
. . .
enta 1nact1vación d e Ia fl uorescencia d e la PFV.
K
Microfotogra fías de fluorescencia de las células justo antes y en dos ocasiones (Tomada de Jenn,fer t ,pp,ncon-xhwa
ft7 Y oret H11\chber
g,
M bo
era hsm Branch. Natlonal lnstituíe of
Child Health and Hum¿m Devt.-!opmenl)
después de haber sido cambiadas a la temperatura más baja. El movimiento

630 CAPITULO 14 • Tráfico, secreción y endocitosis vesiculares

 dese q ue muchas proteína s secretadas que dejan el RE contiene n una
na lluoresce nte natural ( Cap. 9). El gen híbrido se transfecta a células
copia o más del oligosacárido unido a N Man/Gl cNAc\, que es sin-
cultivada s mediante las técnicas descritas en el Capítulo 5. Cuando
la tetizado y unido a las proteína s que serán secretad as en el RE (véase la
tas células que expresan la forma de la proteína híbrida sensible a
temperat ura restrictiv a se Fig. J3- 18). A medida que la proteína se mueve~ través del com~lej_o
temperatura (VSVG-PFV) se hacen crecer a
de Golgi, diferentes enzimas localizadas en las cisternas de Golg1 czs,
acumula la VSVG-PFV en el RE, donde aparece como una red de encaje
medial y trans catalizan una serie ordenad a de reacciones a estas cade-
de membranas cuando se observan las células en un microscopio de
nas centrales de Man 8 (GlcNAc \, según se an_alizará en la ú_Itima sec-
fluorescen cia. Luego, cuando las células se cambian a una temperat ura
ción de este capítulo; por ejemplo, las glucos1dasas que residen espe-
permisiva, puede verse que la VSYG-PFV se mueve primero a las mem-
cíficamente en el compart imiento cis-Golgi secuenci almente cortan
branas del aparato de Golgi que están densame nte concentradas en el
los residuos de manosa del oligosacá rido central para producir una
borde del núcleo y, luego, a la superficie celular (Fig. 14-2a). Al obser-
forma "recortada", la Man 5 (GlcNAc) 2 • Los científicos pueden emplear
var la distribución de la YSVG-PFV en diferentes momento s después
una enzima especializada que escinde hidratos de carbono , conocida
de cambiar las células a temperat ura permisiva, los investigadores han
como endoglucosidasa D, para distingu ir las proteína s glucosiladas
determinado durante cuánto tiempo la YSVG-PFV permanece en cada
que permane cen en el RE de aquellas que han entrado al cis-Golgi: los
orgánulo de la vía de secreción ( Fig. 14-26).
oligosacáridos cís-Golgi específicos recortad os son separado s de las
proteínas por la endoglucosidasa D, mientras que los oligosacáridos
Detección de las modificaciones con oligosacáridos específicos
centrales (no recortad os ) de las proteína s de secreción que se encuen-
en compar timiento s Una segunda manera de seguir el transpor te de
tran dentro del RE son resistentes a la escisión q ue realiza esta enzima
las proteínas que serán secretad as aprovech a las modificaciones de las
(Fig. l4-3a). Dado que una proteína desglucosilada producid a por
cadenas laterales de hidratos de carbono que se produce n en diferen-
la digestión de la endoglucosidasa D se mueve más rápido en un gel
tes etapas de la vía secretora . Para compren der este enfoque, recuér-

(a) RE Cis-Golgi
Recorte de
la manosa
(b) Tiempo a 32 ºC (min) O 5 10 15 20 30 45 60
(RE) resisten te'--
(cis-Golgi) sensible r-
Extracción de glucopro teína

(e)

1,0
-□
(ti
.., (ti
o (1)

Man 8 (GicNAc) 2 Man 5 (GlcNAc )2 .., (ti

0,8
t?~
(1)
(ti o
Tratamie nto con e u
·¡¡¡::,
endoglu cosidasa D 0,6
QC'J
.... o
a. "O
-"'ea,
a, (ti 0,4
"O -
(ti
e
·O a,
Fragmen tación, sensible 'ü:C 0,2
Sin fragmen tación, resistent e u·-
a la endogluc osidasa D
(ti (1)
.._ e
a la endoglu cosidasa D u.. a,
(1)

o
■ - N-acetilg lucosamin a 10 20 30 40 50 60
• - Manosa Tiempo (min)

FIGURA EXPERI M ENTAL 14-3 El transpor te de una glucopro telna

de
membran a del RE al aparato de Golgi puede ser analizado sobre
la
base de su sensibili dad al corte por la endoglucosidasa D. Las células
que expresan una proteína G del VSV sensible a la temperatura (VSVG)
fueron marcadas con un pulso de aminoácidos radiactivos a la temperatura
no permisiva, de modo tal que la proteína marcada se retuvo en el RE. A
tiempos periódicos después del retorno a la temperatura permisiva de 32 ºC.
la VSVG se extrajo de las células y se digirió con la endoglucosidasa D. (a) A
medida que las proteínas se mueven al cis-Golg1 desde el RE, el oligosacárido
central Man,(GlcNAc), es recortado a Man,_ (GlcNAc\ por enzimas que residen
en el compartimiento cis-Golgi La endoglucosidasa D corca cadenas de
proteínas en el RE. (b) Electroforesis en gel SOS de la mezcla de digestión que
resuelve las formas resistente. no escindida (de migración más lenta) y sensible,
escindida (de migración más rá pida) de la VSVG marcada. Como muestra el
electroforet0grama, inicialmente toda la VSVG era resistente a la digestión,
~ero, rnn el tiempo, una mayor fracción fue sensi ble a la digestión, reflejando
Id prore1_na que se transporto del RE al aparato de Golgi y se procesó en
él.
la vsv de movimiento lento
En las celulas control, mantenid as a 40 ºC. solo
resistente a la digestión se detectó después de 60 minutos (no se muestra). (c)
Gráfico de la proporción de VSVG que es sensible a la digestión derivada de los
datos electroforéticos que revela el curso temporal del transporte RE ~ Golgi. o
(De C J Beckersycols .1 937.Ccl/, SO·S23)

oligosacáridos de las proteínas procesada s en el cis-Golgi, pero no de las

14.1 Técnicas para el estudio de la vfa secretora 631

 ' tica )' la pared celular. La mejor estudiada de ellas, 1a
estas proteínas mem brana p IaSnla a y fructos a.
de SDS que la proteína glucosi laJ.1 com:s pondientc, . h'd . disacárido sacarosa a glucos . . . .
rnverta sa, 1 ro 1iza e1 tes se 1dent1 ficaron m1cialr n
pueden distinguirse con rapide z ( l'if!. 1-1-.lh). ,
Un gran numero
de levadu ras mutan , ente
iento de
Este tipo de ensayo puede empkarsc para rastrea r el movim sobre la base de su capacidad para secreta r protem as a una temper atura
nte pulsos
la proteína G del VSV en células infectadas por virus media . 'd d d e hacerlo a otra temperatura más elevada , no
radiactivos. Inmed iatame nte despué s del y su mcapaCJ a ón (sec) se transfieren
de marcaje con amino ácidos .. C do estas mutantes de secreci
,
encon trarán perm1s1va. uan .
as G marca das del VSV aún se ás baJ·a hacia la mas alta acumulan proteínas de
marcado, todas las proteín
resistentes a la des de Ia tempera t ura m, ' , bloqueada por la mutación El an ·¡· .
en el RE, y en el momento de la extracc ión serán . · a 1s1s
pero, con el tiempo , la fracción secreción en el punto de 1a vta la
digestión por la endoglucosid asa D, de estas mutantes identif icó cinco clases (A-E), caracte rizadas por
a la digesti ón aumen tará. Esta
de la glucoproteína extraída sensib le acumulación de proteína en el citosol, el RE rugoso'. p~queñ
as vesículas
de una forma resiste nte a la ternas de Go!gi
conversión de la proteína G del VSV que llevaban proteínas del RE al compl ej~ de Golgi, CJS
a esta enzim a corres ponde al 14· 4 ). La caracterización
cndoglucosidasa D a una forma sensible o vesículas de secreción constitutivas (F,g.
el RE hasta el cis-Go lgi. Nótese
transp orte vesicular de la proteína desde ulterior de las mutantes sec en las diferentes clases ha ayudad
o a elucidar
o de Golgi
que el transporte de la proteína G del VSV del RE al aparat los componentes fundamentales y los mecan ismo~ molecu lares del
s, según fue medid o por el
consume aproximadamente treinta minuto movimiento de las vesículas que analizaremos en secc10 nes posteri ores.
s o de acuerd o con
ensayo basado en el procesamiento de oligosacárido Para determinar el orden de los pasos en la vía, los investi gadore s
PFV (Fig. 4-3c). Se
la microscopia de fluorescencia hecha de la VSVG-
J
o las levadur as
s en modifi cacion es analizaron mutantes dobles sec; por ejemplo, cuand
han desarrollado una diversidad de ensayos basado como en las de
en compa rtimie ntos contienen mutaciones en las funciones de clase D tanto
específicas de los hidratos de carbono que ocurren las cisternas de
la proteína G clase B, se acumulan proteínas en el RE rugoso, no en
tardíos del aparato de Golgi para medir la progresión de bloqueado rnás
Golgi. Dado que las proteínas se acumulan en el paso
del VSV a través de cada etapa del aparato de Golgi. clase B deben
temprano, este hallazgo muestra que las mutaciones de
mutaciones de
actuar en un punto anterior en la vía de secreción que las
las proteínas
la clase D. Estos estudios confirmaron que a medida que
Los muta ntes de levaduras definen etap as secretadas se sintetizan y procesan, se mueven secuencialme
nte: citosol
principales y much os comp onen tes del transporte ➔ RE rugoso ➔ RE a vesícu las de transp orte del aparat o de Golgi ~
ión y, finalm ente, exocito sis.
de las vesículas cisternas de Golgi ➔ vesícul as de secrec
describ en en esta secció n han delinea do los
componentes Los tres métodos que se
La organización general de la vía secretora y muchos de los ra y han contri buido a la identif icación
as son similares pasos principales de la vía secreto
moleculares requeridos para el transporte de las vesícul de vesículas y
, los estudios de muchas de las proteínas responsables de la formación
en todas las células eucariontes. Dada esta conservación de los pasos individ uales de la
confirmar la de su fusión. En la actualidad, cada uno
genéticos con levaduras han resultado de utilidad para y, cada vez más, se emplean
muchas de las vía secretora se estudia en detalle mecánico,
secuencia de pasos de la vía secretora y para identificar ular para estudi ar cada uno
las levaduras ensayos bioquímicos y de genética molec
proteínas que participan en el tránsito vesicular. Si bien n de las moléc ulas proteic as
continuamente de estos pasos en términos de la funció
secretan pocas proteínas en el medio de crecimiento,
espacio entre la individuales.
secretan varias enzimas que permanecen en el estrecho

Clase B Clase C Clase D Clase E

Clase A

. ..
.... ..
o
RE --+- +'-•
.
®
®
@i®
. ® o
~
~
Golgi -~-E S:~ W 00
o o 00
o 0
00

Acumulación Acumulación Acumulación Acumulación Acumulación

Destino Secreción
en el citosol en el RE rugoso en vesículas de en el Goigi en las vesículas
de las normal
transporte del secret oras
proteínas
RE al Golgi
de secreción

Transporte al Formación de Fusión de las Transporte del Transporte de

Función
interior del RE vesículas desde vesículas de Golgi a las las vesículas
defectuosa
el RE rugoso transporte con vesículas secretoras a la
el Golgi secret oras superficie celular
tes sec de las sintetizadas (puntos rojos) cuando las célul as se cambia .
FIGURA EXPERIMENTAL 14-4 Fenotipos de las mutan , 1 n de la temperatura
la vía de secrec ión. Estos permisiva a la temperatura mas e evada no pe • • El ..
levaduras que Identifican cinco etapas de . rmisiva análisis dedlos
.
a la temperatura pueden agruparse en cinco clases. de mutilntes dobles permitió que se determ' inara el d .
mutantes sensibles
das recién 1veanse P Novicket ycols. 1981 _e,,,25 "4 61 . or en secuencia1 e los pasos.
acuerdo con el sitio en que se acumu lan las proteínas por ser secreta . YC A Ka,ser Y R Schekman. 1990, Ce/I 61 :723).

CAPITULO 14 • Tráfico, secreción y endocitosis vesicul

ares
632

¡a)
cis-Go lgi Golgi medial trans-Go lgi
Reacción de la
Células silvestres infectad as
N-acetil glucosam ina
transfera sa 1
con el VSV
Células mutante s
■ = N -acetilgluc osamina
infectadas con el VSV
~ = Manosa
(sin N-acetilg lucosam ina
transfera sa 1)
FIGURA EXPERIMENTAL 14-5 Un ensayo libre de células demuestra
el transporte de proteínas de una cisterna de Golgi a otra. (a) Una
linea mutante de fibroblasto s en cultivo es esencial en este upo de ensayo
En este eJemplo. las células carecen de la enzima N-acetilglucosamina
transferasa 1(paso fJ de la F1g. 14-1 4). En las células silvestres, esta enzima
se localiza en el Golgi medial y modifica los oligosacá ridos unidos a N por la
adición de una N-acetilglucosamina. En las células silvestres infectadas con
VSV, el ollgosacárido que se encuentra en la proteína G viral se modifica a un
oligosacárido complejo típico, según se muestra en el panel rrans-Golgi; sin
embargo, en las células mutantes infectadas la proteína G llega a la superficie
Los ensayos de transp orte libre de células permit en
la disección de los pasos individ uales en el
transporte de vesículas
Los ensayos in vitro sobre transpor te intercom partimen taJ son pode-
rosos enfoques complem entarios a los estudios con mutantes sec de
levaduras para identific ar y analizar los compone ntes celulares respon-
sables del tráfico de vesículas . En una aplicació n de este enfoque, las cé-
lulas mutantes cultivada s carentes de una de las enzimas que modifica n
las cadenas laterales de oligosacá ridos unidas al extremo N-termin al
en el aparato de Golgi se infectan con virus de la estomati tis vesiculad a
(VSV) y se hace un seguimie nto del destino de la proteína G del VSV;
por ejemplo, si las células infectada s carecen de la transfera sa I de la
N-acetilg lucosami na producen cantidad es abundan tes de la proteína G
del VSV, pero no pueden añadir N-acetilg lucosami na a las cadenas de
oligosacáridos en el Golgi medial tal como lo hacen las células silvestres
(Fig. 14-Sa). Cuando las membra nas de Golgi aisladas de estas células
mutantes se mezclan con membra nas celulares del aparato de Golgi de
células silvestres no infectada s, la adición de la N-acetilg lucosami na a
la proteina G del VSV se restablec e ( Fig. 14-Sb). Esta modifica ción es
consecuencia del transpor te vesicular de la N-acetilg lucosami na trans-
ferasa I del Golgi medial de tipo silvestre al Golgi cis aislado de células
mutantes infectada s por el virus. El transpor te intercom partimen tal
exitoso en este sistema libre de células depende de los requerim ientos
típicos de un proceso fisiológic o normal, que incluyen un extracto ci -
tosólico, una fuente de energía química en forma de ATP y de GTP y la
incubación a temperat uras fisiológic as.
Además, en condicio nes apropiad as, una població n uniforme de
vesículas de transpor te que mueven la N-acetilg lucosami na transfera sa
(b)
Golgi aislado de células Proteína G en el Golgi de
silvestre s no infectad as células mutante s infectad as
Adición de la
N-acetil-
glucosam ina
a la proteína G
O = Ga lactosa
♦ = Ácido N-acetilne uramínico
con un ol1gosacándo de alta manosa más simple. que contiene solo dos
residuos de N-acetilglu cosam1na y cinco residuos de manosa. (b) Cuando las
cisternas de Golg1aisladas de las células mutantes infectadas se incuban con
las cisternas de Golg1 de células normales no infectadas, la proteína G del VSV
producida in vitro contiene la N-acetilglucosamina adicional. Esta modificación
es llevada a cabo por la enzima transferasa que es desplazada por las vesículas
de transporte desde las cisternas del Golgi medial tipo silvestre hacia las
cisternas del rn-Golgi mutante de la mezcla de reacción. (Véan,e w E Balch y coi,.
1984. Ce/1 39 405 y 525, w. A Braell y cols. 1984. Ce// 39511 y J E Rothman y T Sollner. 1997, Soence
276 1212)
I del Golgi medial al cis puede purificar se de las m embranas de Golgi
donante de tipo silvestre por centrifug ación. Al examina r las proteína s
enriquec idas en estas vesículas, los científico s han podido identific ar
muchas de las proteínas integrale s de membra na y de las proteína s de
cubierta de vesícula periférica s que son compone ntes estructur ales
de este tipo de vesícula. Más aún, el fracciona miento de los extractos
citosólicos requerido s para el transpor te en las mezclas de reacción
libres de células ha permitid o aislar varias proteínas requerid as pa ra la
formació n de las vesículas de transpor te y de las proteínas necesaria s
para el direccion amiento y la fusió n de las vesículas con las membra nas
aceptoras apropiadas. Ensayos in vitro similares , en diseño general, al
que se muestra en la Figura 14- 5 se han emplead o para estudiar varios
pasos de transpo rte en la vía secretora .
CONCEPTOS CLAVE de la Sección 14.1
Técnicas para el estudio de la vía secreto ra
· Todos los ensayos para seguir el tránsito de proteínas a través de la vía
secretora en las células vivas requieren un modo de marcar una cohorte
de proteínas secretora s y una forma de identifica r los compart imientos
en los que las proteínas marcadas se localizan posterio rmente.
• El marcado en pulso co n aminoác idos radioacti vos puede marcar
de modo específic o una cohorte de proteína s recién sintetiza das en el
RE. Alternati vamente, una proteína mutante sensible a la tempera tura
retenida en el RE debido al plegamie nto incorrect o a tempera tura no
14.1 Técnicas para el estudio de la vía secretora 633
 (a) Formación de ves ícula recubierta
pcrm i~iva será liberada como l lllJ coho rte para el tra nspo rte cuando Proteína que une GTP
las células se desplacen a temperat ura permisiva.

· El transporte de un a protd na marcada con íluo rescencia a lo largo

de la vía secretora puede ser observado po r microscopia (véase la Fig. ~ ~~ ~~~~~nRaE
14 -2). El transporte de una proteína radiornarcada, por lo común, es
seguido mediante modificacio nes covalentes específicas del comparti - Proteína
bP O
Proteína
carga de la
miento a la proteína. carga ~ membrana

• Muchos de los componentes necesa rios para el tránsito de proteínas

soluble ~ ~~ Proteína
intracelulares se identificaron en las levaduras analizando los mutantes ~ ~ l. receptora
sec sensibles a la temperatura, defectuosas para la secreción de proteí-
nas a temperatura no perm isiva ( véase la Fig. 14 --1).
~~ ''''"'''
Proteínas de
· Los ensayos libres de células para el transpo rte intercompartimental Membrana la cubierta
donante Citosol
de pro teínas han permitido la disección bioquímica de los pasos indi-
vid ua les de la vía secretora. Estas reacciones in vitro pueden emplearse
(b) Fusión de la vesícula no cubierta
para producir vesículas de transporte puras y para probar la funci ón
bioquímica de las proteínas de transporte individuales. Citosol Membrana
diana

'o / JL
~
14.2 Mecanismos moleculares de formación
y fusión de las vesículas ) Proteínas
==-O a o~ t-SNARE
Las pequeñas vesículas rodeadas por membrana que transportan
proteínas de un orgánulo a otro son elementos comunes en las vías
secretora y endocítica (véase la Fig. 14- 1). Estas vesículas brotan
desde la membrana de un orgánulo "parental" (donante) y se fusionan
con la membrana de un orgánulo "diana" (de destino). Si bien cada
r Proteína /
v-SNARE
~r
~ Complejo
SNARE
paso de las vías secretora y endocítica emplea un tipo distinto de
FIGURA 14-6 Panorama de la formación de vesículas y de la fusión con
vesícula, los estudios que emplean técnicas genéticas y bioquímicas
una membrana diana. (a) La formación se inicia por el reclutamiento de una
han mostrado que cada uno de los diferentes pasos de transporte pequeña proteína que une GTP a un región de una membrana donante. Los
vesicular es, simplemente, una variación de un tema común. En esta complejos de las proteínas cubiertas en el citosol se unen luego al dominio
sección exploramos los mecanismos básicos subyacentes al brote de las citosólico de las proteínas carga de la membrana, partes de las cuales actúan
vesículas, y a la fusión de todos los tipos de vesículas en común, antes también como receptores que se unen a las proteínas solubles de la luz,
de analizar los detalles propios de cada vía. reclutando, por lo tanto. proteínas carga luminales al interior de la vesícula
en formación. (b) Después de ser liberada y perder su cubierta, la vesícula se
fusiona con su membrana diana, en un proceso que involucra la interacción
El ensamblaje de una cubierta de proteína conduce con proteínas SNARE afin es.
a la formación de vesículas y la selección de
moléculas carga
El brote de vesículas desde sus membranas parentales es impulsado por diana, todas las vesículas de transporte emplean v-SNARE y t-SNARE
la polimerización de complejos de proteínas solubles en la membrana para brotar y fusionarse.
para formar una cubierta vesicular proteinácea (Fig. l4-6a). Las Se han caracterizado tres tipos principales de vesículas cubiertas,
interacciones entre las porciones citosólicas de las proteínas integrales cada ~na ~on -~n tipo d_iferente de cubierta proteica y formada por
de la membrana y la cubierta de las vesículas reúnen las proteínas carga la pohmenzac10n reversible de un conjunto distinto de subunidades
adecuadas en la vesícula en formación; así, la cubierta proporciona la proteicas ( Cuadro 14- 1). Cada tipo de vesícula que recibe su nombre
curvatura a la membrana para formar una vesícula que actúa como de acuerdo co_n las cubiertas proteicas primarias transporta proteínas
filtro para determinar qué proteínas serán admitidas a la vesícula. carga de organulos parentales particulares a orgánulos de destino
La cubierta también es responsable de incluir en la vesícula particulares:
proteínas de fusión conocidas como v-SNARE. Después de que se
·
• Las vesículas COPII transportan proteínas del RE a¡ aparato d e G o 1g1.
completa la formación de una vesícula, la cubierta se desprende,
exponiendo las proteínas v-SNARE de ella. La unión específica para • Las vesículas COPI transportan principalmente prot emas , d' 'ó
en 1recc1 n
.
las v-SNARE en la membrana de la vesícula con las t-SNARE afines en · G 1·h ·
retrógrada, entre las cisternas de Golgi y d esd e e1 czs- ,
. . o g1 ac1a atras,
en d1recc1ón al RE.
la membrana diana a la cual la vesícula se encuentra anclada hace que
las membranas se aproximen íntimamente, permitiendo que las dos •Lasvesículasdeclatrinatransportanproteínasd ¡ b ¡ á ·
. e a mem rana p asm t1ca
bicapas se fusionen ( Fig. 14-6b). Independientemente del orgánulo '
(superficie celular) y la red trans-Golgi a los endosomas tard 10s.

634 CAPITULO 14 • Tráfico, secreción y endocltosis vesiculares

 ínas _ _ _ _ _ ___ __
Vesículas recub iertas involucradas -en -el tráns ito de prote
Cuad ro 14-1 - - - --- GTPasa asoci ada
Proteínas de la cubie rta
Tipo de vesículas Paso de trans porte medi ado
--- ---- Comp lejos Sec23 /Sec24 y Sec 13/ Sarl
RE al cis-Golgi Sec3 1, Secl6
COP II
Coató meros que contie nen siete ARF
cis-Golgi al RE
subun idade s COP difere ntes
COPI cister nas de Golgi tardía s a tempr anas
ARF
Comp lejos da trina+ PA 1
Clatri na y proteí nas adapt adora s' 1r1111s-Golgi a endos oma
ARF
tmns- Golgi a endos oma Clatri na + GGA

Memb rana plasm ática a ARF

Clatri na + comp lejos PA2
endos om a

Golgi a lisoso ma, melan osom a o ARF

Comp lejos PA3
vesículas de las plaqu etas

e clalrina.
subunid ades dislinla s. No se sabe si la cubierla de las vesícula s P;\J con1ien
' Cada lipo de comple jo PA consis1e en cualro

cubie rta polim erizad as

por vesículas emplea memb rana paren tal. Se cree que las proteínas de
Se cree que cada paso del tránsi to media do la forma ción de un brote vesicu lar
rgo, no se ha identi ficado fo rman una red curva que co nduce
cierto tipo de cubie rta vesicular; sin emba rana.
fico para cada tipo de vesícula. que se adhiere a la cara citosó lica de la memb
un compl ejo proteico de cubie rta especí
nas desde el tmns- Golgi hacia la
Las vesículas que mueven las proteí asas
ión const itutiva o regulada, por Un conjunto conservado de prot eína s GTP
memb rana plasm ática duran te la secrec dife rent es
ejemp lo, mues tran tamañ o y morfo logía unifor mes, sugiri endo que interruptoras controla el ensa mbla je de
su forma ción está impul sada por el ensam blaje de una estruc tura de cubiertas vesiculares
res no han identi ficado proteí nas
cubier ta regula r, si bien los invest igado las in vitro con memb ra-
vesícu las. Sobre la base de reacciones de brote de vesícu
de cubie rta específicas que rodee n estas cadas , los científicos han de-
las que se muest ra en nas aislad as y proteí nas de cubie rta purifi
El esque ma gener al de gema ción de las vesícu onent es de cubie rta reque ridos
conoc idos de vesícu las cubiertas. termi nado el conju nto mínim o de comp
la Figura 14-6a se aplica a los tres tipos pales de vesículas. Si bien la
memb ranas aislad as o artificiales y para forma r cada uno de los tres tipos princi
Los exper iment os hecho s con en consi derab lemen te de un
han m ostrad o que la polim erizac ión mayoría de las proteínas de la cubier ta difier
proteí nas de cubie rta purifi cadas las tres vesícu las contie nen una
la cara citosó lica de la memb rana tipo de vesícu la a otro, las cubier tas de
de las proteí nas de cubie rta en como subun idad regula dora
cir la alta curva tura de la memb rana peque ña proteí na q ue une GTP que actúa
paren tal es neces aria para produ (véase la Fig. 14-6a ). Para las
orte de alrede dor de 50 nm de diáme tro. para contro lar el ensam blaje de la cubie rta
típica de una vesícula de transp de unión al GTP se conoc e
s de las reacci ones de brote hechas vesículas COPI y las de datrina, esta proteí na
Las micro fotogr afías electr ónica une GTP -si bien rela-
tran estruc turas que exhib en regiones como proteína ARF. Una proteí na difere nte que
in vitro con frecue ncia mues presen te en la cu-
ciona da con ella-, conoc ida como proteí11a SARl,
está
tal que tienen una cubie rta densa que
discretas de la memb rana paren la SARl son prote ínas
erístic a de una vesícu la comp leta ( Fig. 14- bierta de las vesículas COPI I. Tanto la ARF como
acom paña la curva tura caract ante a la de la RAS, una
das habitu almen te brotes vesicu lares, parec en m onom éricas con una estructura general semej
7). Estas estruc turas, llama las señale s ( véase la Fig.
vez que la cubie rta ha come nzado a proteí na intrac elular clave en la transd ucció n de
ser interm ediari os visibles una la RAS, perten ecen a la
la vesícu la comp leta se despr enda de la 16- 19). Las proteí nas ARF y SAR 1, al igual q ue
polirn erizarse, pero antes de que as que ciclan entre
superfamilia de la GTPasa de proteí nas interr uptor
al GDP y al GTP (véase la Fig. 3-32 para una reseña
las forma s de unión
GTPa sas).
del mecan ismo de las proteí nas " interr uptor as"

lares pued
FIGURA EXPERIMENTAL 14-7 Los brotes vesicu en
• 11 ones de formación in vitro. Cuand o los
v1sua zarse durante las reacci
n con vesículas de RE
compo nentes de ~a cubierta COPII purificada se incuba
(liposo mas). la polimerización
aislada s o c~n ves,culas fosfolipídicas artificiales
la superf icie de la vesícu la induce la
de las prNe1nas de 1~ cubierta sobre
muy curvad os Note. en esta microf otogra fía electrónica
emergencia de brotes
memb rana caract erística
de_una reawo n de formac ión in vitro, la cubierta de
oscura presen te sobre los brotes de la
visible como una capa de proteína
a y rnI1. 1988. Cell 93(212 11
ves1cula (Tomado de K Marsuot 63

de las vesículas 635

14.2 Mecanismos moleculares de formación y fusión
 Se cree que el ciclo de unión al GTP y la hidróli_sis por la ARF y la SAR 1
11 Extremo controlan la in iciación del ensamblaje de la cubierta, como se muestra
N-terminal esquemáticamente, para el ensamblaje de las vesículas COPII , en la Figu .
hidrófobo ra l '-l -8. En p rimer lugar, una proteína de la membrana del RE conocida
com o Sec l 2 cataliza la liberación de GDP desde el SAR l ·GDP Y la unión
de GTP. Este factor d e intercambio gunninn- nucleótido rec ibe e integra, en
aparien cia, múltiples señales aún desconocidas, que incluyen probable-
m ente la presencia de proteínas carga en la m embra~a del RE listas para
su transporte. La unió n del GTP provoca un cambio de confo rmación
en la SAR I que expone su ex-tremo N-terminal hidrófobo, que, ento nces,

Sec23/Sec24 queda inmerso en la b icapa fosfolipídica y ata el SAR l ·G TP a la membra-

,~~
na del RE ( Fig. 14 -8, paso D ). El SAR !-GTP unido a la m embrana con-
duce la polimerización d e los complejos citosólicos de sub unidades de la
COPJI que se encuen tra sobre la m embrana, conduciendo fi nalmente a
la fo rmació n de brotes de vesículas (paso El). Una vez q ue se liberan las

B
Ensamblaje de
la cubierta COPII
\. 0-- 'Q ◊~ vesículas COPII desde la m embran a d onante, la actividad GTPasa de la
SAR I hidroliza el SAR 1-GTP presente en la m embrana de la vesícula a
SAR 1-GDP con la ayuda de una de las subunidades d e la cubierta (paso
D ). Esta hidró lisis desencadena el desensamblaje d e la cub ierta de COPII
(paso ID); así, la SARI acopla un ciclo de u nió n e hidró lisis de GTP a la
form ación y, luego, a la disociación de la cubierta de COPI I.
La proteína ARF transita un ciclo similar de intercam bio de nu-
cleót id os e hidrólisis acoplado al ensam b laje de cubiertas de las vesícu-
las compuestas por COPI o por clatrina y otras proteínas de cubiertas
(complejos PA) que se analizan m ás adelante. Una m odificación proteica
covaJente conocida como anclaje de miristato en el N-terminaJ d e la pro-
11 Hidrólisis del GTP teína ARF ata débilmente el ARF·GDP a la membrana de Golgi. Cuando
el GDP se intercambia por el GTP unido por un factor de intercambio
de nucleótidos unido a la membrana del aparato de Golgi, el cambio de
conformación resultante en la ARF permite que los residuos hidrófobos
pi en su segm ento N-terminal se inserten en la bicapa de la membrana. La
estrecha asociación resultante de ARF·GTP con la membra n a sirve como
fundamento para un ensamblaje adicion al de cubierta.
AJ delinear las similitudes estructurales d e la SAR I y de la ARF
con otras proteínas interruptoras GTPasas pequeñas, los investigado-
res han construido genes que codifican p ara versiones mutantes de las
11 Desensamblaje dos proteínas con efectos predecibles en el trán sito vesicular cuando se
de la cubierta
transfec~an a células cultivadas; por ejemplo, en las células que expre-
san verswnes mutantes de SAR I o de ARF que no pueden hidrolizar el
Vesícula no recubierta GTP, las cubiertas vesiculares se fo rman y se desprenden las vesículas
que brotan. Sin embargo• d ado q ue 1as protemas - mutantes n o pueden
FIGURA 14-8 Modelo del papel de la Sar1 en el ensamblaje y el desencadenar
. . el desensambla¡·e d e la cubierta , tod as Ias su b un1_·d a d es d e
desensamblaje de las cubiertas de COPII. Paso D : la interacción de la la cubierta disponibles quedan
, . • finalmente , ensam bla d as d e ,,orm a per-
Sarl soluble unida a GDP con el factor de intercambio Sec l 2. una proteína manente en ves1culas cubiertas incapaces d e fu swnarse
.
integral de la membrana del RE, cata liza el inte rcambio de GDP por GTP en la . con las m em -
branas . de destmo. La adición d e GTP n o h 1'd ro1iza . bl e, an a, 1ogo a 1as
Sarl. En la forma de la Sarl unida a GTP, su extremo N-terminal hidrófobo se
extiende hacia el exterior desde la superficie de la proteína y ancla la Sarl a reaccwnes de brote . de vesíc u 1as 111
· v itro,
· provoca un b loqu eo similar
la membrana del RE. Paso H: la Sarl unida a la membrana sirve como sitio de d e I d esensam bla¡e de la cubierta L . 1as que se form an en estas
. . · as ves1cu
unió n para el complejo de la proteína de cubierta Sec23/Sec24. Las proteínas reaccwnes . . .tienen cubiertas que nunca se d'1soc1an . , permitiendo
. . que su
carga de la membrana se reclutan en el interio r de la vesícula de brote en compos1c1on y su estructura pu d .
formación, uniéndose a secuencias cortas específicas (señales de clasificación) Las vesículas COPI 'fi e an analizarse con m ayor facilidad.
. pun cadas q ue se muestran en la F1.gur-1 I 4-9 se
en sus regiones citosólicas a sitios del complejo Sec23/Sec24. Algunas
pro d u¡eron en una reacción d e brote de es te tipo. . '
proteínas carga de la membrana actúan, además, como receptores que unen
proteínas solubles en la luz. La cubierta se completa por el ensamblaje de un
segundo tipo de complejo. compuesto por Sec 13 y Sec31 (que no se muestra). Las secuencias diana de las pr t ,
Paso n una vez completa la cubierta de la vesícula, la subunidad Sec23 de la contactos mole emas carga hacen
cu 1ares específico ,
°
cubierta promueve la hidrólisis del GTP por la Sarl _Paso fil la liberació n de la de la cubierta s con 1as protemas
Sarl -GDP desde la membrana de la vesícula provoca el desensamblaje de la
cubierta. (Véase S Sp,,nger y cols.. 1999. Ce/1 97·1• Sl
Para transportar
. vesículas qu e muevan prot , 'fi d
compartimiento al siguiente, los br . emas espec1 cas e un
otes vesiculares deben ser capaces

636 CAPITULO 14 • Tráfico, secreción y endocitosis vesiculares

 FIGURA EXPERIMEN TAL 14-9 Las vesículas cubiertas se acumulan
durante las reacciones de formación in vitro en presencia de un
análogo no hidrolizable de GTP. Cuand o las membranas de Golg, aisladas
se incuban con un extracto rnosól1co que cont iene p ro te,nas de 1a cubierta
COPI, las vesículas se fo rman y bro tan d esd e las m embranas La inclusión
de un an álogo no h1drolizab le d e GTP en la reacción de fo1mac1ón evita el
d esensamblaJe d e la cubierta despues de la liberación de la vesícula. Esta
microfotogra fía muestra las vesículas COPI g eneradas en una rea cción de
este tipo y separad as desde las mem b ranas por centrifug ació n. Las vesículas
cubiert as preparadas de este modo pueden ser analizad as para determ inar sus
com ponentes y p rop iedades. 1cc,,.es,a de L o,c, 1

carga de la memb rana (véase la Fig. 1-1-6a ). La cubierta pol imerizada

60 nm
de discriminar entre proteínas potenciales d e la membrana y proteínas
carga solubles y de aceptar solo aquellas proteínas carga que ava nzarán
al compartimi ento s iguiente, excluyendo las que deberían permanecer
como residentes en el compartim iento donante. Además de esculpir la
curvatura de una membrana donante, la cubierta de la vesícul a funcio-
na como selectora de proteínas específicas en su calidad de proteínas
carga. El mecanismo primario mediante el cual la cubierta de la vesícula
selecciona las moléculas carga es por unión directa a secuencias especí-
ficas o señales de clasificación en la porción citosólica de las proteínas
actúa, de este modo, como una matriz de afi nidad para agrupar las pro-
teínas carga de la membrana seleccionad a en los brotes de vesículas en
fo rmació n. Dado que las proteínas sol ubles que se encuentran dentro
de la luz de los orgánulos pa ren tales no pueden contactar la cubierta
de fo rma directa, req uieren un tipo diferente de señal de clasificació n.
Las proteí nas luminales solubles con frecuencia co ntienen lo que puede
pensarse como se11ales de clasificación /11111inales que se unen a los domi-
nios luminales de ciertas proteínas carga de la m embrana que actúan
como recepto res para las proteínas ca rga lum inales. Las propiedade s de
va rias seri ales de clasificación conocidas en las proteínas solubles y de
la membrana se resumen en el Cuad ro 14-2. En secciones posteriores,
describimos el papel de estas señales con m ayo r detalle.

específicas
Cuadro 14-2 Señales de clasificación conocidas que dirigen las proteínas a vesículas de transporte
Vesículas que incorporan
Proteínas con señal Receptor de la señal proteínas q ue llevan señales
Secuencia señal*

SEÑALES DE CLASIFICA CIÓN LUMINAL

Proteínas solubles residentes en el RE Receptor KDEL en la membrana COPI
Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL)
cis-Golgi

Enzimas lisosómicas solubles después del Receptor M6P en la membrana Clatrina/PAI

Manosa 6-fosfato (M6P)
procesamie nto en el cis-Golgi trans-Golgi

Enzimas lisosómicas secretadas Receptor M6P en la membrana Clatrina/PA 2

plasmática

SEÑALES DE CLASIFICA CIÓN CITOPLAS MATICA

Proteínas de membrana residentes en el RE Subunidade s a y 13 COPI COPI
Lys-Lys-X-X (KKXX)
Proteínas de m embrana residentes en el RE Subunidades a y 13 COPI COPI
Diarginina (X-Arg-Arg-X)

Proteínas carga residentes en el .RE Subunidad Sec24 COPII COPII

Diacldica (p. ej., Asp-X-Glu )
Recepto r de LDL en la membrana Complejo PA2 Clatrina/PA2
Asn-Pro-X-Tyr (NPXY)
plasmática

Proteínas de membrana en el trans-Golgi PAl (subunidad µl) Clatrina/PAl

'Iyr-X-X-el> (YXX<I>)

Proteínas de la membrana plasmática PA2 (subunidad µ 2) C latrina/PA2

Proteínas de la membrana plasmá~ica Complejos PA2 Clatrina/PA2

t ~~Leu (LL)

•x = cualquier aminoácido; <1> = aminoácido hidrófobo. Las abreviatu ras de una sola letra de los aminoácidos están entre paréntesis.

Mecanismos moleculares de brotación y fusión de las vesículas 63 7

 (b) Complejo SNARE
(a) Vesícula de
transpor te

VAMP

Anclaje de Rab • GTP

FIGURA 14-1 o Modelo de anclaje y fusión de las vesículas de trans-
la vesícula
porte con sus membranas diana. {a) Las proteínas q_ue se muestran en este
ejemplo participan en la fusión de vesículas de secrec,on con la mem?rana
plasmática, pero proteínas similares median todos _los eventos de fu~1on de las
vesículas. Paso H una proteína Rab unida por medio de un ancla l,p,d,ca a una
vesícula de secreción está ligada a un complejo de proteína efectora sobre la
/ Sintaxina membrana plasmática, anclándose, por lo tanto, a la vesícula de transporte so-
---- SNAP-25 bre la membrana diana apropiada. Paso fl una proteína v-SNARE (en este caso,
VAMP) interactúa con los dominios C11osólicos de las t-SNARE afines (en este
caso, s1ntax1na y SNAP-25). Los comple¡os muy estables de espiral enrollada
Membran a SNARE que se forman mantienen la vesícula cerca de la membrana diana. Paso
diana n la fusión de las dos membranas inmedia tamente sigue a la formación de
Ensamb laje de los
complej os SNARE
1n ira
Efector Rab
los complejos SNARE, pero no se sabe con premión cómo ocurre esto. Paso E
: después de la fusión de la membrana, la SNF, en conjunción con la proteína
a -SNAP, se une a los complejos SNARE. La hidrólisis del ATP catalizado por NSF
,mpulsa luego la disociación de los complejos SNARE, liberando las proteínas
SNARE para otro ocio de fusión de las vesículas. También en ese momento, la
Rab-GTP se hidroliza a Rab-GDP y se disocia del efector Rab (no se muestra). (b)
El complejo SNARE. Numerosas ,nteracoones no covalentes entre las cuatro
Comple jo hélices o largas, dos de las SNAP-25 y una de la sintaxina y una de la VAMP
SNARE '-- estabilizan la estructura de espiral enrollada. (Véanse J E Rothman y T Sollne,, 1997,
tomada d e Y A Chen y R H
Soence 276 1212. y W We1s y R ScheHer. 1998. Narure 395 328 la parre (b) es
Scheller, 200 1, Nor Rev Mol Ce// B,ol 2/2198)

Fusión de la J11
membra na

NSF ~
conforma ción en la Rab que le permite interactu ar con una proteína
de superficie sobre una vesícula de transpor te en particula r e inser-
a-SNAP ~ ta su ancla isopreno ide en la membran a de la vesícula. Una vez que
Rab·GTP está atada a la superficie de la vesícula, se cree que interac-
Complej o /
cis-SNA RE túa con una de varias p ro teínas diferentes, conocida s como efecto res
ATP Rab, unidas a la membran a diana. La unión del Rab·GTP a la diana
ADP + P¡ Rab mantiene fij a la vesícula sobre una m embrana diana adec uada
Desensa mblaje de
los complej os SNARE
f.11 ( Fig. 14- 1O, paso D ). Después de que ocurre la fusió n de la vesícula,
el GTP unido a la proteína Rab se hidroliza a GDP, desencad enando
la liberació n de Rab·GDP, que, luego, puede sufrir o tro ciclo de inter-

~~
cambio, unión e hidrólisis GDP-GT P.
Varias_líneas de evidencia apoyan el comprom iso de proteínas
Rab especificas en los eventos de fusión de las vesic u Jas; por e¡emp • ¡o,
el gen de las levad uras SEC4 cod ifica una prote' R b ¡ J d
ma a , y as eva uras
que expresan las proteínas mutantes Sec4 acumula n ves1cu · ¡as seere-
,
toras mcapaces , de fusionars e con la membran ¡ , · (
a p asmat1ca mutantes
Las GTPasas Rab contro lan el anclaje ,, ,
de clase E de. la f-1g. 14 -4 ). En las células d e mam1,er o, 1a p rotema
de las vesículas en las membr anas diana RabS se loca liza en las vesículas endocíti' cas co noc1'd as tam 1en como b' ,

Un segundo conjunto de proteínas pequeñas que unen GTP, conoci- endosom as temprano s. Estas vesículas no cub'1er tas se riorman a partir ·
, ,
.
de ves1culas cubiertas con clatrina inmed 1a 1am ente espués de que d
das com o proteínas Rab, participa en el direccion amiento de las vesí-
b rotan d e Ia mem b rana plasmát' d
culas a la membran a diana adecuada. Al igual que la SAR I y la ARF, . ..,.) tea urante la endocito sis (véase la
F,g. 14 - 1, paso u . La fusión de lo d
las proteína s Rab pertenece n a la superfam ilia GTPasa de proteínas , , s en osomas tempran os entre sí en
sistemas libres de células requiere la .
interrupt oras. Las proteínas Rab contiene n también un ancla isopre- de RabS GTP 1 . p resencia de RabS, y la adición
.
noide que les permite unirse a la membran a de la vesícula. La con - ¡
Y
¡1
d él
a os estratos libres e e u1as acelera la velocidad
sionan ent , U , ,
versión de Rab·GDP citosólica a Rab·GTP catalizad a por un facto r de a a cua as vesículas se fu
re s1. na pr~tem a larga, es~1-
ralada, conocida como EEA I
in tercambio especifico de guanina -nucleóti do induce un cambio de ( ear/y endosom e ant,gen ¡ ),que reside

638 CAPITULO 14 • Tráfico, secreción y endocitosís vesiculares

en la membrana del endosoma temprano, funciona como el efector
de RabS. En este caso, se cree que el RabS·GTP que se encuentra so-
bre una vesícula endocítica se une de forma específica al EEA l de la
membrana de otra vesícula endocítica, estableciendo las bases para la
fusión de ambas vesículas.
Un tipo distinto de efector Rab parece funcionar para cada tipo
de vesícula de la vía secretora. Siguen pendientes muchas preguntas
acerca del modo en que las proteínas Rab se dirigen a la membrana
correcta y de la manera en que se forman complejos específicos entre
las diferentes proteínas Rab y sus proteínas efectoras correspondientes.
Conjuntos apareados de proteínas SNARE median
la fusión de las vesículas con las membranas diana
Como se señaló previamente, poco después de que las vesículas se
desprenden de la membrana donante, la cubierta de la vesícula se
desagrega para dejar al descubierto la proteína específica de la mem-
brana de la vesícula, una v-SNARE (véase la Fig. 14-6b). De modo si-
milar, cada tipo de membrana diana de una célula contiene proteínas
de membrana t-SNARE que interactúan de modo específico con las
v-SNARE. Después de la fijación mediante Rab de una vesícula sobre
su membrana diana (de destino ), la interacción de las SNARE afines
mantiene las dos membranas suficientemente cerca como para que
puedan fusionarse.
Uno de los ejemplos mejor comprendidos de fusión mediada
por SNARE ocurre durante la exocitosis de las proteínas secretadas
(véase la Fig. 14- 10, pasos II yD). En este caso, la v-SNARE conocida
como VAMP (vehicle-associated membrane protein, proteína asociada
a la membrana de la vesícula) se incorpora a las vesículas secretoras
a medida que estas brotan de la red trans-Golgi. Las t-SNARE son
la sintaxina, una proteína integral de la membrana plasmática, y la
SNAP-25, que está unida a la membrana plasmática mediante un ancla
lipídica hidrófoba en medio de la proteína. La región citosólica de
cada una de las tres proteínas SNARE contiene un secuencia héptada
repetida que permite que cuatro hélices a (una de la VAMP, una de la
sintaxina y dos de la SNAP-25) se enrollen, la una alrededor de la otra,
para formar un haz de cuatro hélices (Fig. 14-1 0b ). La estabilidad
inusual de este complejo de SNARE que forma un haz es conferida
por la configuración de los residuos de aminoácidos hidrófobos y
cargados en la repetición de la héptada. Los aminoácidos hidrófobos se
encuentran enterrados en el núcleo central del haz y los aminoácidos
de carga opuesta están alineados para construir interacciones
electroestáticas favorables entre las hélices; a medida que se forman
los haces de cuatro hélices, las membranas de las vesículas y efectora
se acercan y quedan en aposición por los dominios transmembrana
de la VAMP y la sintaxina incrustadas dentro de las membranas.
Los experimentos in vitro han mostrado que cuando los
liposomas que contienen VAMP purificadas se incuban con otros
liposomas que contienen sintaxina y SNAP-25, las dos clases de
membrana se fusionan, si bien lentamente. Este hallazgo constituye
una fuerte evidencia de que la íntima aposición de las membranas
que resulta de la formación de los complejos SNARE es suficiente
para lograr la fusión de estas. La fusión de una vesícula y la
membrana diana ocurre con más rapidez y mayor eficiencia en la
célula que en los experimentos hechos con liposomas, en los cuales
la fusión está catalizada solo por las proteínas SNARE. La explicación
probable de esta diferencia es que, en la célula, están implicadas en
el direccionamiento de las vesículas a la membrana correcta otras
proteínas, tales como las Rab y sus efectoras.
Las levaduras, al igual que todas las células eucariontes, expresan
más de veinte proteínas v-SNARE y t-SNARE relacionadas diferentes.
Los análisis de los mutantes de levaduras defectuosas en algunos de
los genes SNARE han identificado eventos específicos de fusión de
membrana en los cuales participa cada proteína SNARE. Para todos
los eventos de fusión que se han examinado, las SNARE forman com-
plejos que constituyen haces de cuatro hélices similares a los comple-
jos VAMP/sintaxina/SNAP-25 que median la fusión de vesículas se-
cretoras con la membrana plasmática; sin embargo, en otros eventos
de fusi ón (p. ej., la fusión de las vesículas COPII con la red cis-Golgi ),
cada proteína SNARE participante contribuye solo con una hélice a
al haz (a diferencia de la SNAP-25, que contribuye con dos hélices);
en estos casos, los complejos SNARE comprenden una molécula v-
SNARE y tres moléculas t-SNARE.
Empleando el ensayo de fusión de liposomas in vítro, los inves-
tigadores han puesto a prueba la capacidad de varías combinacio-
nes individuales de proteínas v-SNARE y t-SNARE para mediar la
fusión de las membranas donante y diana. De la gran cantidad de
combinaciones probadas, solo un pequeño número pudo mediar de
manera eficiente la fusión. En grado notable, las combinaciones fun-
cionales de v-SNARE y t-SNARE revelaron en estos experimentos in
vitro correspondientes a las interacciones reales de proteínas SNARE
que median los eventos de fusión conocidos en las levaduras; así,
junto con la especificidad de la interacción entre las proteínas Rab
y Rab efectoras, la especificidad de la interacción entre las proteínas
SNARE puede dar cuenta de la mayor parte de la especificidad de la
fusión entre un tipo de vesícula en particular y su membrana diana,
aunque no de toda.
La disociación de los complejos SNARE después
de la fusión de la membrana es impulsada por la
hidrólisis del ATP
Después de que una vesícula y su membrana efectora se han fusio-
nado, los complejos SNARE deben disociarse para que las proteí-
nas SNARE individuales estén disponibles para eventos de fusión
adicionales. Dada la estabilidad de los complejos SNARE que se
mantienen juntos por numerosas interaccio nes intermoleculares 110
covalentes, su disociación depende de proteínas adicionales y del
ingreso de energía.
La primera pista de que la disociación de los complejos SNARE
requería la asistencia de otras proteínas provino de reacciones de
transporte in vitro en las que faltaban ciertas proteínas cítosólicas.
La acumulación observada de vesículas en estas reacciones indicó
que ellas podían formarse pero eran incapaces de fusionarse con una
membrana diana; finalmente se encontró que dos p t ·
. ro emas, d es1g-
·
nadas NSF y a -SNAP, eran necesarias para que procediera la fu '6
de las. vesículas en la reacción de transporte 1·n v·t L f · , dsi In
• 1 ro. a unc1on e a
N~F rn vivo puede ser selectivamente bloqueada por la N-etilmalei-
m1da _( NEM), una sustancia química que reacciona con un grupo-SH
esencial de la NSF (NEM-sensitive factor, factor sensible a NEM).
Las mutantes de levaduras tamb'1en · han contribuido
· · a nuestra
comprensión de la función de las SNARE. Entre la clase de las le-
vadu_ras C, los mutantes sec son cepas que carecen de Secl8 o Secl 7
funcionales, las contrapartidas en las levaduras del NSF y la a-SNAP
Mecanismos moleculares de brotación y fusión de las vesículas 639
de los mamíferos, respectivamente. Cuando esta clase de mutantes • Cada v-SNARE en una membrana de una vesícula se une de modo
C se ubica a temperatur a no permisiva se acumulan las ves[culas de específico a un complejo de proteínas t-SNARE afines en la membrana
transporte RE haci a Golgi; cuando las células se cambian a una tem- diana, induciendo Ja fusión de ambas membranas . Después de que se
peratura más baja permisiva, las vesículas acumulada s son capaces de ha completado la fusión, el complejo SNARE se desen~ambl.a en ~na
fusionarse con el cis-Golgi. reacción dependiente del ATP mediada por otras protemas c1tosóhcas
Posteriorm ente a los estudios bioquímico s y genéticos iniciales (véase la Fig. 14-10).
que identificaron el NSF y el o.-SNAP se desarrollar on estudios
de transporte in vitro más sofisticados. Empleando estos ensayos
nuevos, los investigadores han mostrado que las proteínas NSF y
o.-SNAP no son necesarias para la fusión real de las membranas , sino
que se requieren para regenerar las proteínas SNARE libres. El NSF,
un hexámero de subunidade s idénticas, se asocia con un complejo 14.3 Etapas iniciales de la vía secretora
SNARE con ayuda de la o.-SNAP (soluble NSF attachment protein,
En esta sección, miraremos con mayor detalle el tránsito vesicular
proteína de unión soluble al NSF). Luego, el NSF unido hidroliza
entre el RE y el aparato de Golgi y parte de la evidencia que da sos-
ATP, liberando energía suficiente para disociar el complejo SNARE
tén al mecanismo general analizado en la sección previa. Recuerde
(Fig. 1~- 1O, paso 11). Evidentem ente, los defectos en la fusión de las
que el transporte anterógrado desde el RE hacia el Golgi, el primer
vesículas observados en los ensayos de fusión previos in vitro y en las
paso de tránsito de la vesícula en la vía de secreción, está mediado
levaduras mutantes después de la pérdida de la Secl 7 o la Secl8 eran
por las vesículas COPII. Estas contienen proteínas recién sintetiza-
consecuencia de que las proteínas SNARE libres rápidamen te fueran
das, destinadas para el aparato de Golgi, la superficie celular o los
secuestradas en complejos SNARE no disociados y, por lo tanto, no
estuvieran disponibles para mediar la fusión de las membranas . lisosomas, como así también componen tes vesiculares tales como
las v-SNARE necesarias para dirigir las vesículas a la membrana del
cís-Golgi. La adecuada clasificación de las proteínas entre el RE y el
aparato de Golgi también requiere el transporte retrógrado (inverso)
del cis-Golgi al RE, mediado por las vesículas COPI (Fig. 14-11 ). Este
transporte de vesículas retrógrado sirve para recuperar las proteínas
CONCEPTOS CLAVE de la Sección 14.2 v-SNARE y la propia membrana en el RE y para proporcion ar el
material necesario para ciclos adicionales de gemación de vesículas
Mecanis mos molecula res de la formació n desde el RE. El transporte retrógrado mediado por COPI también
y fusión de las vesículas recupera proteínas residentes en el RE mal clasificadas desde el cis-
Golgi para corregir estos errores en la clasificación.
• Las tres vesículas de transporte bien caracterizadas -COPI, COPII y
Analizamos en esta sección, además, el proceso por el cual las pro-
vesículas de clatrina- se distinguen por las proteínas que forman sus
teínas correctamente entregadas al aparato de Golgi avanzan a través de
cubiertas y las rutas de transporte que median (véase el Cuad ro 14-1).
compartimientos sucesivos de este de la red cis a la trans. Este proceso,
• Todos los tipos de vesículas cubiertas se forman por la polimerización conocido como maduración de las cisternas, implica el brote y la fusión
de proteínas de cubierta citosólicas sobre la membrana donante (pa- de vesículas de transporte retrógrado más que anterógrad o.
rental) para formar brotes vesiculares que, finalmente, se desprenden
de la membrana para liberar una vesícula completa. Poco después de
la liberación de la vesícula, la cubierta se desprende, exponiendo las Las vesículas COPII median el transpo rte del RE
proteínas necesarias para la fusión con la membrana diana (véase la al aparato de Golgi
Fig. 14-6).
Las vesículas COPII fueron reconocidas 1·n1·c·a1 1 men t e cuan o se
d
• Pequeñas proteínas que unen GTP (ARF o Sarl ) que pertenecen a la células de membranas del RE de levaduras
incubaron extractos libres de
superfamilia de la GTPasa controlan la polimerización de las proteínas , Jas que se
con análogos del GTP no hidrolizable y ci·tosol. Las ves1cu
de la cubierta, el paso inicial en la formación de las vesículas (véase la ·
formaron
. a partir de las membranas del RE teni' an una cu 1erta d'1stmta,
b.
Fig. 14-8). Después de que las vesículas se liberan desde la membrana de las vesículas COPI pero com t ,
seme¡ante a las
. , pues a por protemas
donante, la hidrólisis del GTP unido a ARF o Sarl desencadena el des- .
·
diferentes, designadas proteínas COPII • Las 1eva d uras con mutac10nes
ensamblaje de las cubiertas de las vesículas.
en los genes para las proteínas COPII son mutan tes sec d e eIase B y
• Señales de clasificación específicas en la membrana y en las proteínas acumulan proteínas en el RE rugoso (véase la Fig. 14-4). El análisis de
luminales de los orgánulos donantes interactúan con las proteínas de la estas mutantes ha revelado un con¡·unto d e protemas , •
. necesanas para
cubierta durante la formación de las vesículas, reclutando así proteínas la formación de las.vesículas COPII , q ue me • 1uyeron Ias proteínas que
carga a estas vesículas (véase el Cuadro 14-2). comprenden la cubierta de las vesículas COPII.
Como se describió previamente , la ,,,0 rmac1. 6n d e 1as ves1cu , as
• Un segundo conjunto de proteínas que unen GTP, las proteínas Rab, 1
COPII se desencaden a cuando la SecJ2 , un e,actor de mtercamb1
. .
0 de
regula la fijación de las vesículas a la membrana diana correcta. Cada . .
. . .
guamna-nucleóttdo en la membrana d 1
Rab parece unirse a un Rab efector específico asociado con la mem- del GTP por el GDP .d e RE, catahza el mtercamb10
. .
um o en la SARI · 61 .
brana diana. induce la unión de la SARI a la citos ica. Este mtercamb10
. membrana del RE, seguida de la unión
de un comple¡o de proteínas Sec23 S
Y ec24 (véase la Fig. 14 -8). El

640 CAPITULO 14 • Tráfico, secreción y endocitosis vesiculares

 Red
cis- Sec23 Vesícula de
Golgi la membran a

~(( ~
Par SNA

IJ .1.. -
~
~
•i -
· \ ~~ _;.IJ
11 ' \a Sec24 - ---v
Segment o

0~ #"'~~~;·'
transmem branal
de proteína carga
copu lº
Vesícula l',• -
t-
~ Proteína
dela FIGURA 14-12 Estructura tridimensi onal del complejo ternario

D\
', _ que comprend e las proteínas de la cubierta COPII, Sec23 y Sec24 y
cubierta
l!I Sarl •GTP. En etapas iniciales durante la formación d e la cubierta COPII, los
complej os Sec23 (anaranjado)/Sec24 (verde) son reclutados a la membrana
del RE por la Sar 1 (rojo) en su estado unido a GTP. Para formar un complejo
Proteína
ternario estable en solución para estudios estructurales se emplea el análogo
SNARE
I m no hidrolizable de GTP GppNHp. Una proteína carga de la membrana del
RE puede ser reclutada a las vesículas COPII por la interacción de una señal
r SNARE
tripeptídica diacídica (púrpura) en el dominio citosólico de la proteína carga
RE con Sec24. La posición probable de la membrana de la vesícula COPII y del
rugoso segmento transmembrana de la proteína carga están indicada en la fig ura. El
segmen to N-terminal de la Sar 1 que se une a la membrana no se muestra. (Véase
X. 81y cols, 2002, Naru,e 419·27 l. 1n1eracci6n con pépt1do. cortesía de J Goldberg)
\
Receptor de la membran a

FIGURA 14-11 Tránsito de proteínas mediado por vesículas entre el RE y
el cis-Golgi. Pasos 0-ll el transporte hacia adelante (anterógrado) es mediado
por las vesículas COPII, que se forman por la polimerizac ión de los complejos
proteicos de cubierta COPII solu bles (verde) sobre la m embrana del RE. Las
v-SNARE (anaranjado) y otra s proteínas carga (azul) en la membrana del RE se
incorporan a la vesícula al interactuar con las proteínas cubiertas. Las proteínas
la
carga solubles (magenta) se reclutan al unirse a los receptores apropiados en
en formación. La disociación de la cubierta recicla
membrana de las vesículas
complejos de cubierta libres y expone las proteínas v-SNARE sobre la superficie
de la vesícula. Después de que la vesícula no cubierta se une a la membrana
cis-Golgi en el proceso mediado po r la Rab. el apareamien to entre las v-SNARE
expuestas y las t-SNARE afines en la membrana del aparato de Golgi permite
la fusión de las vesículas. liberando el contenido al compartim iento cis-Golgi
(véase la Fig 14- JO). Pasos 19-lli el transporte inverso (retrógrado ) mediado
por las vesículas cu biertas con proteínas COPI (púrpura) recicla la bicapa de la
membrana y ciertas proteínas com o las v-SNARE y las proteínas residentes del
RE mal asignad as (que no se muestran ) del cis-Golgi al RE. Todas las proteínas
SNARE se muestran en anaranjado. aunque las v-SNARE y las t-SNARE son
proteínas distintas.
complejo ternario resultante , formado entre SAR l ·GTP, Sec23 y Sec24,
se muestra en la Figura 14-12 . Después de que se forma este complejo
sobre la membran a del RE, un segundo complejo, constituid o por
proteínas Sec ¡ 3 y Sec31, se une para completar la estructura de la
cubierta. Las proteínas Secl3 y Sec31 puras pueden ensamblar se
espontáne amente en redes con forma de jaula. Se piensa que la
Sec!J y la Sec3 l forman el andamiaje estructural para las vesículas
COPI!. Finalment e, una proteína fibrosa grande, llamada Secl6, que
se une a la superficie citosólica del RE, interactúa con la SARl ·GTP
y los complejos Secl3/31 y Sec23/24 y actúa para organizar las otras
proteínas de la cubierta, aumentan do la eficiencia de la polimeriz ación
de esta. De forma semejante a la Sec13/31, la clatrina también tiene
la capacidad de autoensam blarse en una estructura del tipo de una
cubierta, como se analizará en la Sección 14-4 .
Ciertas proteínas integrales de la membran a del RE son recluta-
das específica mente en las vesículas COPII para ser transport adas al
aparato de Golgi. Los segmento s citosólicos de muchas de estas pro-
teínas contienen una señal de clasificació n diácida (los residuos clave
de esta sec uencia son Asp-X-Gl u, o DXE, en el código de una letra;
véase el Cuad ro 1,1-2 ). Esta señal de clasificación se une a la subuni-
dad Sec24 del COPII y resulta esenc ial para la exportaci ón selectiva
de ciertas proteínas de membran a desde el RE (véase la Fig. 14- 12 ).
Act ualmente se realizan estudios bioquímicos y genéticos para iden-
ti ficar señales adicion ales que ayudan a dirigir las proteínas carga de
las membrana s al interior de las vesículas COPll. Otros estudios en
desarrollo buscan determina r de qué manera las proteínas carga so-
lubles son selectivam ente cargadas a las vesículas COPII. Si bien las
vesículas COPII purificada s de las levaduras mostraron contener una
proteína d e membran a que un e el factor soluble a de apareamie nto,
los receptores de otras proteínas ca rga solubles, como la invertasa,
aún se desconoce n.
~ La enfor'.11e?ad hereditaria fibrosis quística se caracteriza por un
M desequ1hbno en el transporte iónico del cloro y el sodio en las
células epiteliales del pulmón, lo cual lleva a la acumulaci ón de liquido

14.3 Etapas iniciales de la vía secretora 641


y la dificultad para respirar. La fibrosis quística es provocada por
mutaciones en una proteína conocida como C FTI{, sinteti zada como
proteína integral de la membrana en el RE y transportada al aparato de
Golgi antes de se r enviada a las membranas plasmáticas de las células
epiteliales, donde fun cio na como canal de cloro. Recientemente, los
investigadores han mostrado que la proteína CFTR contiene una señal
de clasificación diácida que se une a la subunidad Sec24 de la cubierta
COPII y es necesaria para el transporte de la proteína CFTR al exterior
del RE. La mutación C FTR más común es la eliminación de una
fenilanalina en la posició n 508 de la secuencia de la proteína (conocida
como 6FS08). Esta mutación evita el transporte normal de la CFTR a
la membrana plasmática al bloquear su empaquetamient o en las
vesículas CO PII que brotan del RE. Si bien la mutación 6F508 no se
encuentra en la cercanía de la señal de clasificación diácida, puede
cambiar la conformación de la porción citosólica de la CFTR de modo
tal que la señal diácida sea incapaz de unirse a la Sec24. Resulta
interesante que una CFTR plegada con esta mutación aún sea funcional
como canal de cloro normal. Sin embargo, nunca llega a la membrana;
este estado de enfermedad, por lo tanto, está provocado por la ausencia
del canal y no porque este sea defectuoso. ■
Los experimentos descritos previamente, en los cuales el tránsito
de VSVG-PFV en las células cultivadas de mamífero se monitoriza
por microscopia de fluorescencia (véase la Fig. 14-2), proveyeron
información acerca de los intermediarios en el transporte desde el RE
hacia el aparato de Golgi. En algunas células pudieron verse pequeñas
vesículas fluorescentes que contenían VSVG-PFV formándose desde el
RE, moviéndose menos de 1 µm y, luego, fusionándose directamente
con el cis-Golgi. En otras células, en las que el RE estaba localizado
a varios micrómetros de distancia del complejo de Golgi, se vieron
varias vesículas derivadas del RE fusionarse entre sí poco después
de formadas, constituyendo lo que se conoce como compartimiento
intermediario desde el RE hacia el aparato de Golgi o red cis-Golgi. Estas
estructuras de mayor tamaño luego fueron transportadas a lo largo
de los microtúbulos hasta el cis-Golgi, en gran medida en el modo
en que las vesículas de las células nerviosas se transportan desde el
soma celular, donde se forman, a lo largo del axón hasta la terminal
axónica (véase el Cap. 18). Los microtúbulos funcionan como las "vías
de ferrocarril" que permiten que estos agregados grandes de vesículas
de transporte se muevan largas distancias hasta su destino en el cis-
Golgi. En el momento en que se forma el compartimiento RE hacia el
aparato de Golgi intermedio, algunas vesículas COPl brotan desde él,
reciclando algunas proteínas nuevamente al RE.
Las vesículas COPI median el transporte retrógrado
entre el aparato de Golgi y desde este hacia el RE
Las vesículas COPI fueron descubiertas cuando las fracciones aisladas
de Golgi se incubaron en una solución que contenía citosol y un análogo
no hidrolizable de GTP (véase la Fig. 14-9). El análisis posterior de estas
vesículas mostró que la cubierta está formada por complejos citosólicos
grandes, llamados coatómeros, compuestos de siete subunidades
polipeptídicas. Las levaduras que contienen mutaciones sensibles a la
temperatura en las proteínas COPI acumulan proteínas en el RE rugoso
en la temperatura no permisiva y, por lo tanto, se categorizan como
mutantes secde clase B (véase la Fig. 14-4). Si bien el descubrimiento de
estos mutantes sugirió inicialmente que las vesículas COPI median el
642 CAPITULO 14 • Tráfico, secreción y endocitosis vesiculares
.
E hacia el aparat o de Golgi, experi mentos, poste r1ores
transporte d eI R . .
nción prmopal es el transporte retrogrado entre
mostraron que su f u . . . .
. d e I apara to de Golg1 y desde el c1s-Golg1 hacia el R.E rugos
1as cisternas 0
, F. derecha). Dado que las mutantes COPJ no pu eden
( vease 1a 1g. 1·1- 11,
nuevamente hacia el R.E
rec1c• 1ar 1as pro 1e1•nas , clave de la membrana
rugoso,e1 RE se
vacía gradualmente de las . que le pertenecen,
proteínas
necesa rias para la función de las vesículas
ta1es como 1as v- SNARE
COPII; finalmente, tiende a detenerse la formación de vesículas desde
el RE rugoso; las proteínas de secreción continúan si:n~o sintetizadas
del RE, la caractenst1Ca que define
pero se acumu Jan e n el interior
las mutantes sec de clase C. La capacidad general de las mutantes sec
implicadas en el funcionamiento de las vesículas COPI o COPII de
bloquear finalmente tos transportes anterógrado y retrógrado ilustra
la interdependencia fundamental de estos dos pro~esos de_transporte.
Como se analizó en el Capít ulo 13, el RE contiene vanas proteínas
solubles dedicadas al plegamiento y a la modificación de proteínas se-
cretoras recién si ntetizadas; entre ellas se incluyen la chaperona BiP y
la enzima proteína disulfuro isomerasa, necesarias para que el RE des-
empeñe sus funciones. Si bien las proteínas luminales residentes en el
RE de este tipo no son específicamente seleccionadas por las vesícu-
las COPII, su abundancia hace que sean continuamente cargadas de
forma pasiva a vesículas destinadas hacia el cis-Golgi. El transporte de
estas proteínas solubles nuevamente hacia el RE, mediado por vesículas
COPI, evita su desaparición final.
La mayoría de las proteínas residentes solubles del RE llevan una
secuencia Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL, en el código de una letra ) en su
extremo C-terminal (véase el Cuadro 14-2). Varios experimentos
demostraron que esta señal de clasificación KDEL es condición nece-
saria y suficiente para que una proteína que la detenta se localice en
el RE; por ejemplo, cuando una proteína mutante isomerasa disul-
furo que carece de estos cuatro residuos es sintetizada en fibroblas-
tos en cultivo, la proteína se secreta. Aún más, si una proteína que
normalmente se secreta se ve alterada de modo tal que contiene la
señal KDEL en su extremo C-terminal, la proteína se localizará en el
RE. La señal KDEL de clasificación es reconocida y se une al recep-
tor KDEL, una proteína integral de la membrana que se encuentra
primariamente en pequeñas vesículas de transporte que viajan entre
el RE Y el cis-Golgi y que están presentes en el retículo cis-Golgi.
Además, las proteínas residentes solubles del RE que llevan la señal
KDEL tienen cadenas de oligosacáridos con modificaciones cataliza·
da_s por _e nzimas presentes solo en la red cis-Golgi O en el cis-Golgi;
as1, en cierto momento, estas proteínas deben abandonar el RE y ser
transportadas al menos hasta la red cis-Golgi. Estos hallazgos indi-
ca_n que el receptor KDEL actúa principalmente para recuperar pro-
temas solubles que contienen la señal de clasificación KDEL que ha
escapado a la red cis-Golgi y para regresadas al RE (Fig. 14- 13). El
r~ceptor KDEL se une más estrechamente a su ligando a pH bajo, y se
piensa que el receptor es capaz de unir péptidos KDEL en el cis-Golgi
~ero no de l'.berarlos en el RE porque el pH del aparato de Golgi es
ligeramente mferior al del RE.
El receptor KDEL y otras protemas ,
de membrana transportadas
nuevamente al RE desde el d
aparato e Golgi contienen una secuen-
. L
cia ys-Lys-X-X en el extremo d I
e segmento C-terminal que enfrenta
. (
e1 c1toso1 véase el Cuadro 14- 2 ) · Esta señal de clasificación KKXX que
s~ une a un_complejo de las subunidades a y 13 del COPI (dos de las
siete subumdades polip tíd.icas del coatómero COPI) es condición
. . ep
necesaria y suficiente para i
, C ncorporar las proteínas de membrana a
las ves1cu1as OPI para el t
ransporte retrógrado al RE. Los mutantes
@ VIDEO: Recep tor de tránsito KDE L

FIGURA 14-13 Papel del receptor KDEL en la recuperación de las

Concentración proteínas luminales residentes del RE desde el aparato de Golgi. Las

e~
alta de H' Pr!lteina
(pH bajo) unión residente proteínas luminales del RE, especialmente aquellas presentes en grandes
del péptido del RE mal \,.../- Péptido KDEL cantidades. pueden incorporarse pasivamente a las vesículas COPII y ser
clas1f1cada transportadas al aparato de Golgi (pasos D y fJJ. Muchas proteínas de este tipo
Red , . -ic:I llevan una secuencia KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) C-terminal (rojo) que les permite
cís-Golg J)""' ser recuperadas. El receptor KDEL. localizado principalmente en la red cis-Golgi
Receptor '-\ J y tanto en las vesículas COPII como en las COPI, une proteínas que llevan la
señal de clasilícación KDELy las regresa al RE (pasos 11 y fil. Este sistema de
fJ ~ 4iii~

Vesícula de~
r KDEL

Cubla
recuperación evita el vaciamiento de las proteínas luminales del RE como las
necesarias para el plegamiento adecuado de proteínas de secreción recién
sintetizadas. La alínidad de unión del receptor KDEL es muy sensible al pH.
transporte~
RE hacia
Golgi
1 \,...1
\'
~ C0PI
La pequeña diferencia ent re el pH del RE y el del aparato de Golgi favorece la
unión de las proteínas que tienen KDEL al receptor en las vesículas derivadas
-.,., a.;;; ~'I ~=~~~eracio"· .-!!
n□
!!lit~ del aparato de Golgi y su liberación en el RE. (AdaptadodeJ Semenza ycols , 1990,Cell
~- ~
t
proteínas
que llevan
KDEL hacia '-\
\'
L ,,.¡
J 61 1] 49)

Q \ el RE ~--~

C,b;erta ~~\.,./ ~ / fJ
RE rugoso~ _____
_,_IJ J COPII permanecen ensambladas el tiempo suficiente para que el
Concentración
baja de W
(pH alto),
liberación
del péptido
de levaduras sensibles a la temperatura que carecen de COPI ex o de
COPI ~ no solo son incapaces de unir la señal KKXX, sino que son,
también, incapaces de recuperar las proteínas que tienen esta señal re-
trotransportándolas al RE, lo que indica que las vesículas COPI median
el transporte retrógrado del aparato de Golgi al RE.
Una segunda señal de clasificación que dirigirá las proteínas a las
vesículas COPI y, por lo tanto, permitirá el reciclado desde el aparato de
Golgi hacia el RE es la secuencia diarginina. A diferencia de la señal de
clasificación KKXX, que debe estar localizada en el C-terminal de una
proteína orientado hacia el citoplasma, la señal de clasificación diargi-
nina puede residir en cualquier segmento de una proteína de membra-
na que esté en la cara citoplasmática de esta.
La partición de las proteínas entre el RE y el complejo de Gol-
gi es un proceso muy dinámico, que depende de las vesículas COP!l
(anterógradas) tanto como de las COPI (retrógradas), en el que cada
tipo de vesícula es responsable del reciclado de los componentes ne-
cesarios para el funcionamien to del otro tipo. La organización de este
proceso de partición hace surgir un interrogante interesante: ¿cómo
las vesículas usan preferentemente las v-SNARE -que especificarán
la fusión con la membrana diana correcta- en lugar de las v-SNARE
-que están siendo recicladas y tendrán especificidad por fusionarse
con la membrana donante- ?
Esta pregunta básica concerniente a la partición correcta de
la membrana ha sido respondida recientemente por las vesículas
COPII. Después de que se forman, las proteínas de la cubierta de
complejo Sec23/Sec24 interactúe con un factor de unión específico
adherido a la membrana del cis-Golgi. Las vesículas que se descu-
bren para exponer las v-SNARE se completan solo después de que
la vesícula COPII ya está íntimamente asociada con la membrana
del cis-Golgi y las v-SNARE de COPII se encuentran en la posición
correcta para formar complejos con sus t-SNARE afines. Si bien las
vesículas COPII también llevan proteínas v-SNARE específicas de
COPI que son recicladas nuevamente al cis-Golgi, estas proteínas
v-SNARE de COPI incluidas en las vesículas COPII nunca tienen la
oportunidad de formar complejos SNARE con proteínas t-SNARE
afines localizadas en el RE.
El transporte anterógrad o a través del aparato
de Golgi ocurre por maduración de las cisternas
El complejo de Golgi está organizado en tres o cuatro subcomparti-
mientos, dispuestos con frecuencia como un conjunto apilado de sacos
aplanados llamados cisternas. Los subcompartimientos del aparato de
Golgi difieren entre sí de acuerdo con las enzimas que contienen. La
mayoría de las enzimas son glucosidasas y glucosilo-transferasas im-
plicadas en la modificación de los hidratos de carbono unidos por el
N o el O a las proteínas secretadas durante su tránsito en el aparato de
Golgi. En su totalidad, el complejo de Golgi opera como una línea de
ensamblaje en la que las proteínas se mueven en secuencia a través del
complejo, sirviendo las cadenas de hidratos de carbono modificadas
en un compartimiento como sustratos para las enzimas modificadoras
del compartimiento siguiente (véase la Fig. 14-14 para una secuencia
representativa de los pasos de modificación).
Durante mucho tiempo se pensó que el complejo de Golgi era un
conjunto esencialmente estático de compartimientos con pequeñas ve-
sículas de transporte que llevaban las proteínas secretadas hacia ade-
lante, desde el Golgi cis hasta el Golgi medial y desde el Golgi medial
hasta el Golgi trans. De hecho, la microscopia electrónica muestra que
muchas pequeñas vesículas asociadas con el complejo de Golgi parecen

14.3 Etapas iniciales de la vla secretora 643

 •1

FIGURA 14-14 Procesamient o de las cadenas de ollgosacáridos ligadas

al N-terminal en las glucoproteína s dentro de las cisternas del cis-
Golgi, el Golgi medial y el trans-Golgi en las células de los vertebrados.
Las enzimas q ue catalizan cada paso se localizan en los compartimient os
indicados. Después de la eliminación de tres residuos d e m anosa en el cis-
Golgi (paso O}, la proteína se mueve por maduración de las cisterna s al Golgi
medial. Aquí, tres residuos de N-aceulglucosamina (GlcNAc) se añaden (pasos
--+
m
UDP-o ºi
--+
CMP➔

lfJ y ~ - se eliminan dos residuos más de manosa (paso lJ) y se añade una única
fucosa (paso i;'j). El p rocesamiento se completa en el trans-Golgi por la adición
de tres residuos de galactosa (paso l'i!l y, fina lmente, por la unión de un residuo
i
de ácido N-acetilneuramínico a cada uno d e los residuos de galactosa (paso
D). Transferasas específicas añaden azúcares al oligosacárido, uno a la vez, a
El 11
partir de precursores de nucleótidos del azúcar importad os desde el citosol. - fl ➔ XJ ___. ---+
Esta vía representa los eventos de procesamiento del aparato de Golgi para
una glucoproteína de mamífero típico. Las variaciones en la estructura de los
UDP-<11 _j_
o ligosacáridos unidos al N pueden resultar a partir d e diferencias en los pasos
de procesamiento en el aparato de Golgi. (Véase R. Kornfeld y s Kornfeld, J98S.Ann Rev
8,ochem. 45:63 1)

r
mover proteínas de un compartimien to de Golgi al otro ( Fig. l4- l 5);
sin embargo, actualmente se sabe que estas vesículas median el trans-
porte retrógrado recuperando enzimas del RE o del aparato de Golgi de
un compartimien to posterior y transportándolas a un compartimiento
Man 5 (GlcNAc) 2
previo en la vía secretora; así, el aparato de Golgi parece tener una orga- Man 8 (GlcNAc) 2
nización muy dinámica, formando continuament e vesículas de trans-
porte aunque solamente en dirección retrógrada. Para ver los efectos
que este transporte retrógrado tiene en la organización del aparato de
Golgi i
Golgi consideremos el efecto neto del compartimiento de Golgi medial
a medida que las enzimas del Golgi trans se mueven desde el Golgi
O Vesícula de transporte
desde el RE
■ = N -acetilglucosa mina
medial mientras que las enzimas del Golgi medial son transportadas al =
• = Manosa o Galactosa
cis-Golgi. En este proceso, el Golgi medial adquiere enzimas del trans- to.= Fucosa ♦ = Ácido N-acetilneura mínico

@ VIDEO: Modelo tridimensio nal de un complejo de Golgi

FIGURA EXPERIMENTAL 14-15 Microfotografü1

electrónica del complejo de Golgi en una célula
exocrina pancreática que revela las vesículas
de transporte secretoras y retrógradas. Puede Vesícula secretora
verse una vesícula secretora grande formándose en formación
desde la red rrans-Golgi. Los elementos del RE
rugoso se encuentran en la parte inferior izquierda
de esta microfotografía. Adyacentes al RE rugoso se
encuentran los elementos de transición desde los
cuales parecen estar brotando protuberancias de
elementos de transición lisos. Estos brotes forman
~rf'.[4[\-:f; ;~~~~~~ ~ tra;.'ª
me 1
} Cisternas
de Golgi
las pequeñas vesículas que transportan las proteínas cis
de secreción del RE rugoso al complejo de Golg i.
lnterdispersas entre las cisternas del complejo de Red cis-Golgi
Golgi se encuentran otras vesículas pequeñas,
q ue ahora se sabe que funcionan en el transporte Vesículas de transporte
retrógrado y no en el anterógrado. (Cortesia de G Paladel RE hacia Golgi
Protuberancia l isa

Elementos de transición

L0,5 µ m

644 CAPITULO 14 • Tráfico, secreción y endocitosis vesiculares

 10.21 12.00 12 54

10.21 12.00 12 54

de la imagen. En
FIGURA EXPERIMENTAL 14-16 Proteinas de fusión marcadas con cisterna de Golg1 aislada solo mediante procesam iento digital
se localiza en las cisternas aisladas; luego, solo
en p rimer término. solo la Vrg4-PFV
fluorescencia demuestran la maduración de las cisternas de Golgi de un breve lapso en
a de Golgi la Sec7-DsR ed se localiza en la cisterna aislada, después
una levadura viva. Las levaduras que expresan la proteína tempran nto es
expresan la el cual ambas se colocalizaron en este compa rtimiento . Este experime
vrg4 se fusiona ron a la PFV (fluoresc encia verde) y aquellas que d e las cisternas , que
encia roJa) y se una demosrración directa de la hipóresis de madurac ión
proreína rardía de Golgi Sec7 se fusiona ron a la DsRed (fluoresc un proceso de
de imágene s muestra que la composi ción de las cisternas individuales sigue
mue5lfan por microsco pia invertida de epifluore scencia. La serie s del aparato
damente con intervalo s de un minuto, madurac ión caracreri zado por la pérdida de proteínas temprana
de la parte superior. tomadas aproxima 2006. Narure
de cisternas de Golgi que en un moment o se encuentr an de Golgi y la ganancia de p roreinas rardias de este. (De Losev y cols.,
mue5lfa un conJunto
muestra una 441 1002)
marcadas con la Vrg4 o la Sec7. La serie de imágene s inferiores

con
sin embargo, a lo largo del tiempo, una cisterna individu al marcad a
Golgi mientras pierde enzimas del Golgi medial en el cis-Golgi, y así, progresi va de esta y la
la proteína cis-Golg i puede mostrar la pérdida
progresivamente, se transfor ma en un nuevo compar timiento trans- lgi. Esta conduct a es exactam ente
los adquisición de la proteína trans-Go
Golgi. De este modo, las proteína s carga de secreción modific an
ial adecuad o sin moverse de la predicha por el modelo de madura ción de las cisternas, en el cual
hidratos de carbono en el orden secuenc las
rado. la compos ición de una cisterna individu al cambia a medida que
una cisterna a otra por transpo rte vesicular anteróg de Golgi se mueven de los compar ti-
proteína s residentes en el aparato
La primera evidencia de que el transpo rte hacia adelante de las s iniciales .
mientos posteriores a los compar timiento
proteínas carga del cis-Golgi al trans-Golgi ocurre por un mecanis mo
de Si bien la mayor parte del tránsito de las proteína s parece moverse
progresivo de este tipo, llamado maduración de las cisternas, provino de
de las escamas de a través del complej o de Golgi por un mecanis mo de madura ción
un cuidados o análisis microsc ópico sobre la síntesis que al menos una parte de las vesícula s de
ensamb lan, en el la cisterna, hay evidenc ia de
las algas. Estas glucopr oteínas de la pared celular se
transpo rte COPI que se despren den de las membra nas de Golgi con-
electrón ico. Al
cis-Golgi, en grandes complej os visibles al microsc opio en
se tienen proteína s carga -más que enzimas de Golgi- y se mueven
igual que otras proteína s secretor as, las escamas recién sintetiza das rada -más que retrógra da-.
de un tamaño dirección anteróg
mueven desde el cis hacia el trans-Golgi, pero pueden ser
veinte veces mayor que el de las vesículas de transpo rte habitual es que
en
brotan desde las cisterna s del aparato de Golgi. De forma semejan te,
en
la síntesis de colágeno por los fibroblastos, con frecuencia se forman
la luz del cis-Golgi grandes agregad os del precurs or procolá geno (véase CONCEPTOS CLAVE de la Sección 14.3
la Fig. 20-24). Los agregad os de procolá geno son demasia do grandes
para ser incorpo rados a pequeña s vesículas de transpo rte, y los investi- Etapas tempr anas de la vía secret ora
gadores nunca encontr arán agregad os de este tipo en ellas. Estas obser- · Las vesículas COPII transpo rtan proteína s del RE rugoso al cis-Golg
i;
vaciones muestra n que el movimi ento hacia adelante de estas Y, quizás, las vesícula s COPI transpo rtan proteína s en la direcció n inversa (véase
de todas las proteína s secretad as desde un compar timiento de Golgi la Fig. 14-11).
hacia el otro 110 ocurre vía vesículas pequeña s. pe-
Una demostr ación particul armente elegante de la madura ción de · Las cubierta s COPII compre nden tres compon entes: la proteína
ec24 y un complej o
las cisternas en las levadur as saca partido de marcas fluorescentes
de queña que une GTP Sarl, un complej o Sec23/S
diferentes colores para obtener imágene s de dos proteína s de Golgi di- Sec 13/Sec3 I .
-
ferentes simultán eamente . La Figura 14-l 6 muestra cómo se compor • Los compon entes de la cubierta COPII se unen a proteína s carga
de
tan en la misma levadur a una proteína resident e del cis-Golg i, marcada de clasifica ción de
la membra na que contien en una señal diacídic a o
con una proteína fluorescente verde, y una proteína trans-Golgi, mar- otro tipo en sus regiones citosólicas (véase la Fig. 14- 12). Las proteína
s
cada con una proteína fluoresc ente roja. En cualqui er momen to, cada carga solubles probabl emente sean dirigida s a las vesícula s COPII por
cisterna del aparato de Golgi parece tener una diferent e identida
d de
, crs- · Go 1g1. o la unión a un receptor proteico de la membra na.
compartimiento, en el sentido de que contien en la protema
· trans-Golgi, pero solo en raras ocasion
la prOtetna · es contien· en am bas;

14.3 Etapas iniciales de la vía secretora 64 5

 .
. ientos . . ·ales de Golgi mantiene niveles su"-
1n1c1 11-
· Muchas proteinas residentes en el RE solubles contienen la señal tardíos a los compartim d' fi . doras de los hidrato s de carbono
de · s mo I ca en
clasificació n KDEL. La unión de esta secuencia de recuperación a cientes de estas enzima . Finalm ente, las proteínas carga ad
una • • funciona 1es.
protclna específica recepto ra en la membrana cis-Golgi recluta proteí- sus compart1m1entos red trans-Golgi, el compartimiente.
das llegan a Ia
nas del RE mal clasificadas en las vesícula s COPI retrógradas (véase cuadamente procesa G .. Uí son clasificadas en uno entre varioso
la , d' 1d I rato de o1g1, a
1-ig. 14 -13). mas 1sta e apa , ser enviadas a su destino final. En esta
• d·c
tipos 11eren tes de ves1cu1as para •
• Las proteín as de membrana necesarias para formar las vesículas CO- sección analiza.
mos 1os d'feren
1 tes tipos de vesículas que brotan de 1a
. . mos que segregan 1as protem ,
PJJ pueden ser recuperadas del cis-Golgi por las vesículas COPI. Una red tra11s-Golg1, los mecam s as carga entre
de
las sei1alcs de clasificación que dirige las proteínas de membrana a procesa miento que ocurre n en etapas tar-
las ellos y los eventos c1ave en e1 , l
,
vesículas COPI es una secuencia KKXX, que se une a las subunidades días de la v1a secretora. Los distintos tipos _
de ves1cu as que brotan del
de la cubierta COPI. Una señal de clasificación diarginina distintiv
a 1rans-G olg1. se resumen en laFiour o
a \4-1 / .
opera por un mecanismo similar.
• Las vesículas COPI también llevan proteínas Golgi residentes de com-
partimi entos tardíos a compartimientos tempranos en el apilamiento Las vesículas cubiertas con clatrina
de Golgi. o proteínas adaptadoras median .
· Las proteína s solubles y de membrana avanzan a través del comple
el transporte desde el trans -Golg,
jo
de Golgi por maduración de las cisternas, un proceso de transpo Las vesículas mejor caracterizadas que brotan de la red trans-G
rte olgi
anterógrado que depende de enzimas residentes en el aparato de Golgi (RTG) tienen una cubiert a de dos capas: una capa externa, compue
sta
que se mueven por transporte vesicular COPI en dirección retrógra de la proteína fibrosa clatrina, y una capa interna, compuesta de
da. com-
plejos de proteí1111 adaptadora ( PA ). Las moléculas de da trina purifica-
das que tienen una forma de tres extremidades se llaman trisque/i
ones
(del griego, por 'tres patas'; Fig. 14-1 Sa). Cada extremidad contiene
una
14.4 Etapas finales de la vía secretora cadena pesada de datrina ( 180 000 PM) y una cadena liviana ( ~35
000-
40 000 PM). Los trisqueliones se polimerizan para formar una red
A medida que las proteínas carga se mueven del cis-Golgi al trans-Golgi po-
ligonal con una curvatura intrínseca (Fig. 14- ISb). Cuando la clatrina
por maduración de las cisternas, sufren modificaciones en sus cadenas
se polimeriza sobre una membrana donante, lo hace asociándose
de oligosacáridos por acción de las enzimas residentes en el aparato con
de complejos PA, que llenan el espacio entre la red de clatrina y la mem-
Golgi. El tránsito retrógrado de vesículas COPI de los compartimient
os brana. Cada complejo PA (340 000 PM) contiene una copia de
cada

FIGURA 14-1 7 Tránsito de vesícula s desde la

red trans-Golgi mediad a por vesícula s. Las 1- 1
vesículas COPI (púrpura) median el transporte
retrógrad o dentro del aparato de Golgi (D). Las Membr ana
proteína s que funcionan en la luz o en la membrana plasmá tica
del lisosoma son transpor tadas desde la red
rrans-Golgi vía vesículas cubiertas con clatrina
(rojo) (11); después de perder la cubierta, estas
vesículas se fu sionan con los endosomas tardíos
que entregan su contenid o al lisosoma. La cubierta
de la mayoría de las vesículas de clatrina contiene
proteína s adicionales (complejos AP que no están
indicados aquí). Algunas vesículas de trans·Go lg1
que llevan carga destinad a al lisosoma se fusionan
El
,n-~.- o-r '\
~.,,, \,_ _/
con el lisosoma directamente (fJ), evitando pasar Endosoma
por el endosoma. Estas vesículas están cubiertas con tardío
un tipo de complejo PA (azul); se desconoce si las
vesículas contiene n, además, clatrina. Las proteína s
de la cubierta que rodean las vesículas de secreción
a
__..
constitutivas (E) y reguladas (ll!) aún no se han
caracteri zado; estas vesículas llevan las proteínas
secretadas y las proteínas de membrana de la red
rrans-Golgi a la superficie de la célula. 1
- \a Lisosoma

e trans-0 01; -~-- -

?.., +-{O) ■ = Clatrina
■ = Complejo PA
■ = COPI

646 CAPITULO 14 • Tráfico, secreció n y endocítosis vesiculares

@ VI DEO: Nac im iento de una cub ierta de clatrina

FIGURA 14-18 Estructura de las cubiertas de clatrina. (a) Una molécula

de rlarr,n;,, 11,m,idJ r_11·,'lu,.l1on, esta compuesta de t1e1 cadenas pesadas y
(a) Estructura de trisquelión (b)
.
' ,,.;. ..... .
, .• '\ .•a :~ :;:,.
. ~· . ' .
trci c,1clen~1 l1<Jera~ Tiene una curvatura intrínseca debido a la curva de las ,{\,. .
caden,,\ pcs.icJ,,s (IJJ Las cub1cr1,11 de clatr1na se formaron in vitro al mezclar
Cadena . '.:;
las cadr-n.1s P''\JUiJS y liger,1s purificadas de la clatr1na con los complejos PA2
en ausencia de membranas. Las microfotografías crioelectrónicas de más de
s:¿
dena ligera
' ~

n
.,:,.,_, ~- i-f
•'
1 000 p,,n1r ulas en barril de clat11na hexagonales ensambladas se analizaron
-
~,;;..~ ·~-.. . ·.. : ·· •c._
por proccsam1cn1 0 d191tal de imágenes para generar una representació n ;,,.. .
...,i . .
estructural promedio. La imagen procesada muestra solamente las cadenas
pesadas de la cla tnna en una estructura compuesta por 36 trisqueliones. Tres
trisquel1 one1 represenrat1vos están resaltados en rojo, amarillo y verde. Parte de
los complejos PA2 empaquetados en el interior de la jaula de clatrina también
son visibles en esta representación (V~a,;,:, B P,1hvaee yC, rayne. 1998. Ce// 95 44J L,, pano
lb!. ,ornada dr ro1 1n y col!i. 20()4, Narure 432 S73)
J Sitio de unión
para el ensamblaje 4,
de partículas
·i
·-,,;.

~ --.\ ~
..
..(. .·· :.
'

':~ --~
. ,:,
4tr

una de las 4 subunidades proteicas adaptadoras distintas. Una asocia-
ción específica entre el dominio globular en el extremo de cada cade-
na pesada de clatrina en un trisquelión y una subunidad del complejo
PA promueven el coensa mblaje de los trisqueliones de clatrina con los
complejos PA como suma a la estabilidad de la cubierta completa de
la vesícula.
Al unirse a la cara citosólica de las proteínas de la membrana, las
proteínas adaptadoras determinan qué proteínas ca rga serán especí-
ficamente incluidas (o se excluirán) de una vesícula de transporte en
gemación. Se conocen tres complejos PA distintos (PAi , PA2, PA3),
cada uno con cuatro subunidade s de proteínas diferentes, si bien re-
lacionadas. Recientemen te, un segundo tipo general de proteína adap-
tadora, conocida como GGA, mostró contener en un polipéptido de
70 000 PM tanto elementos de clatrina como de unión a la carga, se-
mejantes a los que están presentes en los complejos heterotetram éricos
PA de mucho mayor tamaño. Se ha encontrado que vesículas que con-
tienen cada tipo de complejo adaptador PA o GGA median pasos de
transporte específicos (véase el Cuadro 14-l ). Todas las vesículas cuyas
cubiertas contienen uno de estos complejos utilizan ARF para iniciar el
ensamblaje de la cubierta sobre la m embrana donante. Como se ana-
lizó previamente, la ARF inicia también el ensamblaje de las cubiertas
COPI. Las características adicionales de los factores de membrana o
proteicos que determinan qué tipo de cubierta se ensamblará después
de la unión de ARF no se comprenden completame nte en la actualidad.
Las vesículas que brotan desde la red trans-Golgi en su camino al
lisosoma por medio del endosoma tardío (véase la Fig. 14 - 17, paso D)
tienen cubiertas de clatrina asociadas con PAi o con GGA. Tanto PAi
como GGA se unen al dominio citosólico de las proteínas carga en la
membrana donante. Las proteínas de membrana que contienen una
secuencia Tyr-X-X-<I>, en la que X es un aminoácido y <I> es un ami-
noácido hidrófobo, se reclutan en vesículas clatrina/PAI que brotan de
la red trans-Golgi. Esta señal de clasificación YXX<I> interactúa con una
de las subunidades PAi de la cubierta de la vesícula. Como analiza-
remos en la siguiente sección, las vesículas con cubierta clatrina/PA2
que brotan de la membrana plasmática durante la endocitosis también
pueden reconocer la señal de clasificación YXX<I>. Las vesículas cubier-
.tas con proteínas GGA y clatrina se unen a las moléculas carga con un
tipo diferente de secuencia de clasificación . Las seiiales de clasificación
citosólicas que se unen específicame nte a la proteína adaptadora GGA
incluyen Asp-X- Leu-Leu y Asp-Phe-Gly-X-<I> (en las que X y <1> se defi-
nen como previamente ).
Algunas vesículas que brotan desde la red trans-Golgi tienen cu-
biertas compuestas por el complejo PA3. Aunque el complejo PA3 con-
tiene un sitio de unión para clatrina si milar a los complejos PAi y PA2,
no queda claro si la clatrina es necesaria para el funcionami ento de las
vesículas que contienen PA3, dado que las versiones mutantes de PA3
que carecen del sitio de unión a clatrina parecen ser funcionales. Las
vesículas cubiertas por PA3 median el tráfico al lisosoma, pero parecen
evitar el endosoma tardío y se fusionan directament e con la membrana
del lisosoma (véase la Fig. 14 - 17, paso ID). En cierto tipo de células,
estas vesículas PA3 median el transporte proteico a compartimi en tos
de almacenami ento especializados y relacionados con el lisosoma; por
ejemplo, la PA3 es necesaria para la entrega de proteínas a los melano-
somas que contienen el pigmento negro melanina de las células de la
piel y a las vesículas de almacenami ento de las plaquetas en los mega-
cariocitos, células grandes que se fragmentan en docenas de plaquetas.
Los ratones con mutaciones en cualquiera de las dos diferentes subu-
nidades de la PA3 no solo tienen una pigmentació n anormal en la piel,
si no que también presentan trastornos de sangrado. Esto último ocurre
porque las roturas en los vasos sanguíneos no pueden ser reparadas
sin las plaquetas que contienen vesículas de almacenami ento normales.
Se requiere dinamina para que las vesículas
de clatrina se desprend an
Un paso fundamenta l en la formación de una vesícula de transporte
que aún no hemos considerado es el modo en que el brote de la vesí-
cula se desprende de la membrana donante. En el caso de las vesículas
de clatrina/PA cubiertas, una proteína citosólica llamada dinamina es
esencial para la liberación de vesículas completas. En las etapas finales
de la formación del brote, la dinamina se polimeriza alrededor de la
porción del cuello y, luego, hidroliza GTP. Se cree que la energía deri-
vada de esta hidrólisis impulsa un cambio de conformació n en la di-
namina que estira el cuello de la vesícula hasta que esta se desprende

14.4 Etapas finales de la vía secretora 647

 Cara exoplasmática
Cara citosólica
Proteína
Cubierta _ carga
de clatrina soluble
fibrosa
Proteína receptora
carga integral integral
Vesícula cubierta con clatrina
FIGURA 14-19 Modelo de la liberación de las vesículas cubiertas con
clatrina/AP para su liberación mediada por dina mina. Después de que
se forma un brote de una vesícula, la dinamina se polimeríza al rededor de
su cuello. Por un mecanismo que aún no se comprende bien, la hidrólisis de
GTP catalizada por dinamina conduce a la liberación de la vesícula desde la
membrana donante. Note que las proteínas de la membrana en la membrana
donante se incorporan a las vesículas interactuando con los complejos PA de la
cubierta. (Adaptado de K. Takel y cols.. 1995, Narure 374·186)
( Fig. 14-19). Resulta notable que las vesículas COPI y COPII parecen
desprenderse de las membranas donantes sin el auxilio de una GTPasa
como la dinamina. Los experimentos de gemación in vitro sugieren
que la dimerización de proteínas ARF impulsa el desprendimiento de
las vesículas COPI, pero el mecanismo no se comprende,
La incubación de los extractos celulares con un derivado no hidro-
lizable de GTP proporciona una evidencia notable de la importancia
de la dinamina en el desprendimiento de las vesículas de clatrina/PA2
durante la endocitosis. Este tratamiento conduce a la acumulación de
brotes de vesículas cubiertas con clatrina, con cuellos excesivamente
largos, rodeados por una dinamina po limérica, que no se desprenden
( Fig. 14-20), De modo similar, las células que expresan formas mutan-
tes de dinamina que no pueden unir GTP no forman vesículas cubier-
tas de clatrina y, en lugar de ello, se acumulan brotes de vesículas de
cuellos alargados rodeadas con una dinamina polimerizada,
Como ocurre con las vesículas COPI y COPII, las vesículas de cla-
trina/PA pierden normalmente su cubierta poco después de su forma-
ción. Se cree que la Hsc70 citosólica, una proteína chaperona consti-
tutiva presente en todas las células eucariontes, emplea energía deri-
vada de la hidrólisis del ATP para impulsar la despolimerización de la
cubierta de clatrina en los trisqueliones. La pérdida de la cubierta no
solo libera los trisqueliones para volver a emplearse en la formación de
vesículas adicionales, sino que también expone las v-SNARE para em-
648 CAPITULO 14 • Tráfico, secreción y endocltosis vesiculares
- . , .... ,,_ .
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FIGURA EXPERIMENTAL 14-20 La hidrólisis del GTP por la dinamina
es necesaria para el desprendimiento de las vesículas cubiertas de
clatrina en extractos libres de célula. Un preparado de terminales nerviosas
sometido a endocítosis extensa fue lisado por tratamiento con agua destilada
e incubado con GTP-y-S, un derivado no hidrolizable del GTP. Después de
cortarla, la preparación fue tratada con un anticuerpo antidinamina marcado
con oro y visualizada en el microscopio electrónico. Esta imagen, que muestra
un brote de clatrina AP de cuello alargado con dinamina polimerizada
rodeándolo, prueba que pueden formarse brotes en ausencia de hidrólisis de
GTP pero que las vesículas no pueden desprenderse. La polimerización extensa
de la dinamina que ocurre en presencia del GTP-y -S probablemente no ocurra
durante el proceso de formación normal. (De K. Takel y cols.. 1995, Narure 374:186: co~esía
de Pietro De Camill1)
plearlas en la fusión con membranas diana. Se piensa que los cambios
de conformación que ocurren cuando las ARF pasan del estado unido
a GTP a aquel unido a GDP son los que regulan el tiempo de despoli-
merización de la cubierta de clatrina. Aún no se comprende el modo en
que la acción de la Hsc70 podría estar acoplada a la acción de la ARF.
Los residuos de manosa-6-fosfato dirigen proteínas
solubles a los lisosomas
Como hemos visto, muchas de las señales de clasificación que dirigen
el tránsito de las proteínas carga en la vía de secreción son secuencias
cortas de aminoácido en la proteína diana. Por el contrario, la señal
de clasificación que dirige las enzimas lisosómicas solubles de la red
trans-Golgi al endosoma tardío es un residuo de hidrato de carbono,
la manosa_-6-fos[ª'.º. (M6P), que se forma en el cis-Golgi. La adición y el
procesam1ent? m1c1al de uno o más precursores de oligosacárido pre-
formad~s, unidos a N en el RE rugoso, son los mismos para las enzimas
hsosóm1cas que para las proteínas de membrana y secretadas, Jo que
resulta_en cad_e nas con un núcleo Man (GlcNAc) (véase la Fi . 13-18),
En el czs-Golg1 los oligosaca' 'd 'd
8 2
g d
. .' n os uni os al N presentes en la mayoría e
las enzimas hs?sómicas sufren una secuencia de reacción de dos pasos
que genera residuos M6P ( Fig J 4 2 1) La d ' - d 'd M6P las
· - . a 1c16 n e res1 uos a
cadenas de oligosacáridos de 1 , . . · ,
as enzunas 11sosóm1cas solubles evita que
e~t~s proteínas sufran reacciones de procesamiento adicional caracte-
nst1cas de las proteínas secretadas y de membrana (véase la Fig. 14-14).
Como se muestra en Ja F' . ·
. . igura 14-22, la segregación de las enz1·
mas hsosóm1cas que llev IM
an a 6 P con respecto a las proteínas se·
 ~~
$ ~... ..~
~
~
UDP·
GlcNAc
JO?J ,.

Fosfotr ansfera sa GlcNAc

UMP l ·\
Sitio catalíti co Sitio de
1
sj('.;.,
de recono cimien to
recono cimien to
6-fosfa to (M6P) contiene n secuencias (en rojo) reconocidas y unidas por esta enzima,
FIGURA 14-21 Formac ión de los residuos de manosa
las enzima s soluble s hacia los lisosom as. Los residuos M6P los grupos GlcNAc fosforilados se añaden específic amente a las enzimas
que dirigen da
por acción lisosómicas. Paso l!'l después de la liberación de una proteína modifica
que dirigen las proteína s a los lisosoma s se generan en el cis-Golgi sa, una fosfodiesterasa elimina el grupo GlcNAc, dejando
en él. Paso D: una N-acetilglucosam ina (GlcNAc ) desde la fosfotran sfera
de dos enzimas resident es lisosómi ca. A B. Cantor Y cols..
carbono un grupo de manosa fosforilada en la enzima (Véanse
fosfotransferasa transfiere un grupo GlcNAc fosforilado al átomo de
cas 1992,J. Biol. Chem. 26713349. y S.Kornfeld, 1987. FASEBJ 1.462).
6 de uno o más residuos de manosa . Dado que solo las enzimas lisosómi

y compo -
Allí, los o más en zimas lisosóm icas. Como resulta do, glucolí pidos
cretadas y de membr anas se produc e en la red trans-G olgi. normal mente se degrad arían
to se unen a los re- nentes extrace lulares no digerid os, que
receptores transm embran ales para manosa -6-fosfa icas, se acumu lan dentro de estos
as de modo muy por acción de las enzima s lisosóm
siduos M6P de las proteín as destina das a los lisosom Los pacient es con enferm eda-
/PA I que contien en el o rgán ulos como grande s inclusi ones.
estrecho y específico. Las vesícul as de clatrina pueden tener una diversi dad de
despren den luego de la des de almace namien to lisosóm ico
receptor M6P y unen enzima s lisosóm icas se icas y n eurológ icas, depend iendo del
fusiona n anom alías de d esarrollo fisiológ
red trans-Golgi, pierden sus cubiert as y, posteri orment e, se edad de
smos que se describ ieron tipo y la graved ad del defecto de almace namien to. La enferm
con el endoso ma tardío median te mecani te grave de enferm edad de almace -
pueden unir M6P al pH células I es un tipo particu larmen
previamente. Dado que los recepto res M6P cual faltan múltipl es enzima s en los liso-
olgi pero no a un pH infe- namien to lisosóm ico en el
ligeram ente ácido ( ~ 6,5) de la red trans-G N-acet il-
los endo- somas. Las células de los individ uos afectad os carecen de la
rior a 6, las enzima s lisosóm icas unidas se liberan dentro de a necesar ia para la formac ión de los re-
de 5,0-5,5 . Adicio nalmen te, glucosa mina fosfotra nsferas
somas tardíos que tienen un pH interno lisosóm icas en el cis-Gol gi (véase la Fig.
endoso mas tardíos ha- siduos M6P de las enzima s
una fosfatas a que se encuen tra dentro de los de
La compar ación bioquím ica de las enzima s lisosóm icas
enzima s 14-21 ).
bitualm ente elimina el fosfato d e los residuo s M6P de las ad de la
nueva unión del recepto r M6P que individ uos normal es con las de estos pacient es con en fermed
lisosómicas, evitand o cualqu ier ato como
pH present e en los endoso mas. La célula I llevó al descub rimient o inicial de la manosa -6-fosf
podría ocurrir a pesar del bajo de cla-
los endoso mas tardíos recicla el recepto r la señal de clasificación lisosóm ica. La ausenc ia de esta señal
gemación de vesículas desde los pacient es con
trans-G olgi o, en ocasion es, a la superfi cie sificación M6P hace que las enzima s lisosóm icas en
M6P nuevam ente a la red radas para
n con célula t se secrete n en lugar de ser seleccio nadas y secuest
celular. Finalm ente, los endoso mas tardíos maduro s se fusiona
s lisosóm icas a su destino final. el interio r de los lisoso mas.
los lisosomas entrega ndo las enzima enfer-
la red Cuando se hacen crecer fibrobla stos de los pacient es con
La clasificación de las enzima s lisosóm icas solubles en e enzima s lisosóm icas con
pasos D-111) compar te muchas de las medad de célula ten un medio que contien
trans-Golgi (Fig. 14-22, as adquie ren un conten ido casi
entre el RE y el cis-Gol gi mediad o por las residuo s de M6P, las células enferm
características del tránsito o indica
como normal de enzima s lisosóm icas intrace lulares . Este hallazg
vesículas COPII y COPI. Primer o, la manosa -6-fosfato actúa estas células contien e recepto res
l de una que la membr ana plasmá tica de
una señal de clasificación al interac tuar con el domini o lumina las enzima s lisosóm icas fosfor ila-
los recepto res para M6P que pueden interna lizar
proteína recepto ra en la membr ana donant e. Segundo, r. Este
se incorpo ran das extrace lulares m ediante endoci tosis mediad a por recepto
sumerg idos en la membr ana con los ligando s unidos mucho s recepto res de la superfi cie celular
clatrina proceso, empleado por
a las vesículas apropia das -en este caso, GGA o vesículas de do con
cubiert a de la vesícula . para interna lizar proteín as o partículas en la célula, es analiza
que contien en PAi- al interac tuar con la sección . Se sabe ahora que, aun en las células
fusiona n solame nte con un detalle en la sigu iente
Tercero , estas vesículas de transpo rte se res M6P son transpo rtados a la membr a-
resultad o normales, alguno s recepto
orgánulo específi co -en este caso, el endoso ma tardío- como secreta n
E específi cos y los t-SNAR E. Y, na plasm ática y algunas enzim as lisosóm icas fosforil adas se
de las interacciones entre los v-SNAR radas
transpo rte intrace lular se reciclan despué s (véase la Fig. 14-22 ). Las enzima s secreta das p ueden ser recupe
finalmente, los receptores de as. Así,
. por endocit osis mediad a por recepto r y dirigid as a los lisosom
de disociarse de sus ligando s unidos la clasi-
esta vía recuper a cualqui er enzima lisosóm ica que escape de
fi cación habitua l por la M6P.
El estudio de las enfer meda des de almac enam iento
Los hepato ci tos de los pacient es con enferm edad de células 1
lisosómico reveló comp onent es centra les de la vía contien en un comple me nto norm al de enzim as lisosóm
icas y no
de clasificación lisosómica contien en inclusio nes, aun cuando estas células son defectu osas en

=-
Un grupo de enferm edades genétic as llamad as enferm edades
almacen amiento lisos6mico son ca usadas por la ausenc ia de
de
una
la fosfor ilació n de la manosa. Este hallazg o implica
toci tos (el tipo celular m ás a bundan te en el hígado )
que los
emplea
hepa-
n una

14.4 Etapas finales de la vía secretora 649

 Exterior
e: Receptor
M6P

ÚWe
Membrana plasmática

Citosol Brote
cubierto
de clatrina Vesícula
Endocitosis cubierta con
mediada clatrina
por receptor

Reciclado del D 11

(l)
receptor M6P
Vesícula
endocítica
no cubierta

Secreción
constitutiva

risquel iones
de clatrina

\~
,_ s.,;
Complejo PA

J;
fZI
®~ Vesícula
11
Endosoma
tardío
(bajo pH)

de transporte
~~ no cubierta

Red J Vesícula cubierta

trans- Saco de clatrina
Golgi recubierto
de clatrina

FIGURA 14-22 Tránsito de enzimas lisosómicas solubles desde la red
trans-Golgi y la superficie celular hacia los llsosomas. Las enzimas
lisosómicas recién sintetizadas producidas en el RE adquieren residuos de
manosa 6-fosfato (M6P) en el cis-Golgi (véase la Fig. 14· 2 1). Por simplicidad
se muestra solo una cadena de ol igosacárido fosforilada, aunque las enzimas
lisosómicas típicamente tienen muchas cadenas de este tipo. En la red rrans·
Golgi, las proteínas que llevan la señal de clasificación M6P. por lo tanto, se
dirigen a las vesíc;ulas con clatrina/PA 1 (paso D). Las vesículas liberadas, rodeadas
de cubierta, se despolimerizan rápidamente (paso D) y las vesículas de transporte
descubiertas se fusionan con los endosomas tardíos (paso 11). Después de que
las enzimas fosforiladas se disocian de los receptores M6P y se desfosforilan,
los endosomas tardíos se fusionan con un lisosoma (paso Note que lasrm.
proteínas de la cubierta y los receptores M6P se reciclan (pasos rn) y my
algunos_receptores son entregados a la superfi cie celular (paso l,'JJ. Las enzimas
lisosóm1cas fosfonladas ocasionalmente son clasificadas desde el trans-Golgi
hacia la superficie de la célula y secretadas. Estas enzimas secretadas pueden
ser recuperadas mediame endocitosis mediada por receptor (pasos [11-1;)), un
proceso que se _ aseme¡a al tránsito de enzim as lisosómicas desde la red trans·
Golg1hacia los l1 sosomas (Vé G • R
. · anse Gllffiths Y col, . 1988. Ce//. 52 329; S. Kornfeld, 1992,Ann. "'·
B,ochem. 61.307.yG. GoffithsyJ.Gruenberg 1991 d C
· , 7ren , e1l. 810/ l ·S)

650 CAPITULO 14 • Tráfico, secreción y endocitosis vesiculares


1m,1> li,us úm icas.
ticar IJ s ~n7
" -' ,nde r,·11 d1L' ll lL' , k la ,\1 6 1' ¡>Jr ,1 da\i
up c' r.tr en o tro, tipo,
1.1 dl' n tJ ' iJ , 4 uc· tJ m bién r u~Jl'
1J nJ tu r,1k
,dular,·, , , e: dnco noCl'. ■
s-Golgi pue de
La agregación de pro teín as en el tran
pro teín as en
funcionar para la clasificación de las
vesículas de secreción regu lada s
del ca pítul o, toda s las célu-
Com o sr ha ,cnal ado en la intro ducc ió n
ciert as prote ínas, en un pro-
las cuca riota s secre tan cont inua men te
itutiva. Las células secre -
ceso llamado, pnr lo com ún, secreción const
otras prote ínas en vesículas,
toras especiali zada s tamb ién alma cena n
dispa rada s por un estím ulo
y las secretan solam ente cuan do son
ada ocur re en las células
específico; un ejem plo de tal secreción regul
tizad a en vesí-
p del páncreas, que alma cena n insul ina recién sinte en respu esta
tan la insul ina
culas de secre ción espe cializ ada y secre
uíne a (véase la f'ig. 16-38 ). Estas
a un incre ment o en la gluco sa sang
simu ltáne amen te dos tipos dife-
y otras células secre toras utili zan
ínas desd e la red 1ra11s-Golgi
rente s de vesículas para mov er las prote
ulas de trans porte regulad o, con
hacia la superficie celul ar: las vesíc
ulas secre toras , y las vesíc u-
frecuencia llama das, simp leme nte, vesíc
tamb ién vesíc ulas secre toras
las de trans porte no regu lado, llam adas
constitutivas.
las prote ínas reguladas,
Un meca nism o com ún pare ce clasificar
adre noco rtico trópi ca), la in-
tan diversas com o la ACT H (hor mon a
secre ción regul adas. La evi-
sulina y el trips inóg eno, en vesíc ulas de
iene de expe rime ntos en los
dencia de un meca nism o com ún prov
an te para indu cir la sínte sis
cuales se usan técni cas de DNA reco mbin
tumo res hipo fisar ios que ya
de insul ina y trips inóg eno en célul as de
alme nte no expr esan insul ina
sintetizaban ACT H. En ellas, que norm
gan a las mism as vesíc ulas
o trips inóg eno, las tres prote ínas se segre
s cuan do una horm ona se
de secreción regu ladas y se secre tan junta
ias y prov oca un incre men-
une a un recep tor en las célul as hipo fisar
Si bien estas tres prote ínas no com parte n
to en el Ca' + citos ólico .
podr ían servi r como una
secuencias idént icas de amin oáci dos, que
a carac terís tica en com ún
secuencia de clasi ficac ión, debe n tene r ciert
ulas de secre ción regul ada.
que señala su inco rpor ació n en las vesíc
la clasificación a la vía re-
La evide ncia morf ológ ica sugie re que
n selec tiva de las prote ínas;
gulada está cont rolad a por la segre gació
s de esta vía -las que recié n han
por ejem plo, las vesíc ulas inma dura
n agreg ados difus os de pro-
brota do de la red trans-Golgi- cont iene
pio elect rónic o. Estos agreg ados
teínas secre tadas visib les al micr osco
en proc eso de gema ción , lo
tamb ién están prese ntes en las vesíc ulas
s a las vesíc ulas secre toria s
cual indic a que las prote ínas desti nada
antes de su inco rpora ción a
reguladas se agreg an de form a selec tiva
las vesículas.
vesículas secre toras de las
Otro s estud ios han mos trado que las
cont ienen tres prote ínas, la
células de secre ción de los mam ífero s
secretogranina 11, que, en
cromogranina A, la cromogranina B y la
las incu ba en las cond icion es
conju nto, form an agre gado s cuan do se
están prese ntes en la red
iónicas (pH 6,5 y Ca'+ 1 mM) que, se cree,
a pH neut ro, prese nte en
trans-Golgi ; tales agre gado s no se form an
ínas secre tadas regu ladas
el RE. La agreg ación selec tiva de las prote
nina B o la secre togra nina
junto con la crom ogra nina A, la crom ogra
de estas prote ínas en las vesículas de
11 sería la base de la clasi ficac ión
tadas que no se asoc ian con
secreción regu lada. Las prote ínas secre
agreg ados sería n clasificadas en ve-
estas prote ínas y, así, no form an
desc arte.
sículas de trans porte no regu ladas , por
a pro ces ami ento
Algunas pro teín as son som etid as
el trans-Golgi
pro teol ítico después de aba ndo nar
a s (p. ej. , la horm o na de c r~-
Para algu nas pro teí nas por se r sec retad
bran a de los virus ( p. ej. , la
c imie nto J r c ierta s pro teína s d e mem
gluco prote ína de l VSV ), la eli m inac ió
n de la sec uenc ia N-te r m inal
a escis ió n prote o litica co -
del RE desd e la cade na nacie nte es la únic
tido en una espe cie acti-
nocida nece saria para conver tir el po lipép
barg o, algu nas prote ínas de
va mad ura (véas e la rig. 13 -f>); sin em
mem bran a y muc has prote ínas solub les
secre tada s se sinte tiza n en
princi pio com o prec urso res inactivos,
de vida rela tivam ente larga ,
llam ados proproteínas, qu e requ i eren
procesam iento prote o lí tico
as m adur as. Ejem plo de
adi cio nal para gene rar las prote ínas activ
p roteí n as que sufre n tal procesam iento
son las enzi mas lisos ó m icas
solub les, much as prote ínas de mem bran
a -com o la hem aglu tinin a
de la gri pe ( HA )- )' pro teína s secre tadas
com o la albu mina séric a, la
eam iento a de las levad uras .
insul ina, el gluca gó n y el fa c to r de apar
En gene ral , la conv ersió n p roteo lít ica
de una prop roteí na a la pro-
desp ués de que la prop roteí n a
teína mad ura co rresp o ndie nte ocur re
ha sido clasi ficad a en la red trans-Gol gi a las vesíc ulas apro piad as.
En el caso de las enzim as lisosó mica s solub les, las prop roteí nas
son llama das proenzimas y son selecciona
das por el recep tor M6P
como enzim as inact ivas catalítica ment e.
En el endo soma tardí o o li-
prote olític a que gene ra un
sosom a, un a proe nzim a sufre una escis ión
polip éptid o más pequ eño pero co n activ
idad enzim ática . El retar do
en la activación de las proe nzim as lisos
ómic as hasta que llega n al li-
sosom a evita que estas digie ran macr omo
lécul as en comp artim iento s
previ os de la vía secre tora.
Las vesículas mad uras que lleva n prote ínas
secre tadas a la supe r-
ficie celul ar se form an norm alme nte por
la fusió n de varia s vesíc ulas
La escis ión prote olític a de
inma dura s que cont ienen prop roteí nas.
las prop roteí nas como la proin sulin a se
prod uce en las vesíc ulas des-
pués de que estas se han aleja do de la
red trans-Golgi (Fig. 14-2 3).
Las prop roteí nas de la mayo ría de las prote
ínas secre tadas cons titu-
solam ente una vez en un si-
tivam ente (p. ej. , albú mina ) se escin den
noci mien to dibá sica tal com o
tio C-te rmin al a una secu encia de reco
Arg-Arg o Lys-A rg ( Fig. 14-24 a). El proc
esam iento prote olítico de
gene ralm ente conl leva es-
las prote ínas cuya secre ción está regu lada
cisiones adici onale s. En el caso de la proin
sulin a, múlt iples corte s de
la cade na polip eptíd ica dan com o resul
tado la cade na EN- term inal
ura, que están unid as por
y la cade na AC-t ermi nal de la insul ina mad
al, que se p ierde y, post erior -
puen tes disul furo, y el pépt ido C centr
ment e, se degr ada ( Fig. 14-24 b) .
El logro de ident ifica r las prote asas respo
nsab les de este proc esa-
mien to en las prote ínas secre tadas prov
ino del análi sis de las levad u-
célul as muta ntes sinte ti-
ras con una muta ción en el gen KEX 2. Estas
ento a, pero no podí an pro-
zaron el prec urso r del facto r de apar eami
iona l y, así, eran incap aces
cesarlo prote olític amen te a la form a func
sto (véas e la Fig. 16-23) . El
de apare arse con las células del tipo opue
asa que corta el prec urso r
gen silvestre KEX 2 codifica una endo prote
resid uos Arg- Arg y Lys-A rg.
del facto r a en el sitio C-te rmin al a los
endo prote asas hom ólog as a
Los mam ífero s cont ienen una fami lia de
s corta n una cade na prote ica
la KEX2 de las levad uras, toda s las cuale
Arg- Arg O Lys-Arg. Una, lla-
en el lado C-te rmin al de una secu encia
célul as de mam ífero y proc esa
mad a furina , se encu entra en toda s las
por la vía cont inua ; por el
las prote ínas, com o albú mina , secre tadas
están prese ntes solo en las cé-
cont rario , las endoproteasas PC2 y PC3
enzim as se local izan en las
lulas que exhi ben secre ció n regu lada; estas
14.4 Etapas finales de la vía secretora 651
 FIGURA EXPERIMENTAL 14-23 Fragm
proin sulina en vesícu las
red trans-Golgi. Los cortes
secre toras
seriad os de
entac ión prote olítica de la
despu
la
celula secretora de insulina se tiñeron con (a)
reconoce /a proins ulina pero no la insulin
reconoce /a insulin a pero no la proins
és de su gema ción desde la
región del aparato de Golg1 de una

a,
ulina.
o
Los
un anticuerpo mono clonal que
(b) un anticu erpo diferente que
anticu erpos que se uniero n
ea·
•
(a) Antic u erpo proin sulin a
.. •
~

a partícu las de oro electro opacas aparecen

como manc has oscuras en estas i
(véa se la F1g. 9-29). La s vesícu las de secrec ión
microfotografías elecrronicas
las que brotan desde el
inmaduras (puntas de flechas negras) Y las vesícu
anticu erpo contra proins ulina pero no
rrons-Go lgi (flechas) se tiñen con el
contra insulin a. Estas vesícu las con tienen agreg ados difusos
con el anticu erpo
proteínas secre tada s reg uladas .
de proteína que incluyen proinsulina y otras
de flecha s blanca s) se tiñen con el anticuerpo
Las vesículas maduras (puntas
pero no con el anticu erpo contra la proinsu lina, y tienen una zona
antiinsulina
que las vesículas que han brotado
central densa de insulin a casi cristalina. Dado
ión inmad uras contie nen proins ul ina (no insulina), la
y las vesículas de secrec
insulin a deber á ocurrir dentro de
conversión proreolítica de la proinsu lina a la
o desde la red trons-G olgi. El inserto
estas vesículas después de que han brotad
la secret ora rica en proins ulina rodea da por una cubierta
(a) muestra una vesícu
Ce//. 49:865. coriesía de L Orci)
pro teica (línea pun teada). (De L Oro y cols. 1987.

olíticamente los precur-

vesículas secretoras reguladas y cortan prote
.
so res de muchas horm onas en si tios específicos

bran a
Varias vías clasifican las prot eína s de mem (b) Antic uerpo de insul ina
las
a la regi ón apic al o baso lateral de las célu
r .

pola riza das

liales polar izada s está
La mem bra na plasmática de las cél ulas epite
apica l y el basol atera l; las uniones es -
dividida en dos dominios, el
miento de proteínas
trechas localizada s entre ambos evitan el movi
ellos (véas e la Fig. 20-10 ). Hay
de la mem brana plasmática entre
n que dirige n las proteínas de
vario s mecanismos de clasificació
nio apica l o basol ateral de las
mem brana recién sintetizada s al domi
pu ede ser seleccionad a por
célula s epiteliales, y cualquier proteína
do de esta clasif icació n, y de
más de un mecanismo. Como resulta
dentr o de la membrana
la restricción al movimiento de proteínas
se encue ntran diferentes
plasmática debido a las uniones estrechas,
l o basol atera l. Esta lo -
conjuntos de proteínas en los dom inios apica
de trans porte es crítica
calización preferencial de cierta s proteínas
s impo rtante s como la
para una diversidad de func iones fisio lógica
ino y la acidif icació n de
absorción de nutrientes desde la luz del intest
11-3 1).
la luz del estómago (véanse las Figs. 11 -30 y
cos y de fr accio nami ento celular indic an
Los estudios micro scópi
s apical o basolateral
que las proteínas destinadas a las membrana
s a las mem branas de la red del
se transportan inicialmente junta
ínas desti nada s a la membrana
trans -Golgi . En ciertos casos , las prote
las de trans porte, que bro -
apical se selecc ionan en sus propias vesícu
en hacia la región apical,
tan de la red trans -Gol gi y, luego , se muev 0,5 µm _j
brana basolateral se
mientras que las proteínas destinadas a la mem
regió n baso lateral. Los
seleccionan a sus vesículas que se mueven a la
e por sus constitu-
diferentes tipos de vesículas pueden distinguirs
ínas Rab y v-SNA R E,
yentes proteicos, que inclu yen diferentes prote . . .
mem brana plasm ática Esta clasifi cació n basol a tera1-ap,ca .
qu e, apa rentemente, las dirigen al dominio de -¡ ¡ . ) ha sido mve~t 1gada. en la~
, la agreg a ción de las prote ínas desti - ce u as caninas de riñón Mad. m-Da ·
adecu ado. En este meca nismo inglés) una] ' d , rby (MD C K , por ~us siglas en1
e a medida que las t ¡·1 ¡
nada s a la mem brana apical o basolateral ocurr , mea
F. 9 4 ) E 1 ce)ula ,
e ce 1ulas e
pi e ª es polarizadas en cu lti vo ( véase a
tipos partic ulare s de vesículas que ig. - · n as s MDC K · fi
proteínas ca rga se in co rporan a . 10 ectadas con el viru \ de )a grire, Jo,
vi rus de la
brotan desde la red tra ns-Go lgi. progenie geman sol0 d es d e la mem brana apical , mirntr.1 1

itosis vesiculares
652 CAPITULO 14 • Tráfico , secreción y endoc
 (a) Proteín as secreta da s co nstitutiva s
FIGURA 14-24 Procesamiento proteolitico de las proproteinas en
Proalbúmi na las vfas de secreción constitutiva y regulada. El procesamiento de la

NH/ i Arg Arg f lcoo-

proal búmina y la proinsulina es tlpico de las vlas constitutiva y regulada,

! Endoproteasa de furi na
respectivamente. Las endoproteasas que fu ncionan en este procesamiento
cortan en el lado ( -termina l de dos aminoácidos consecutivos. (a) La
endoproteasa furina actúa sobre los precursores de las proteínas secretadas
constitutivas. (b) Dos endoproteasas, PC2 y PC3, actúan sobre los precu rsores
~-_A_lb_ú_m_in_a_ __JI coo- de la s proteínas secretadas reguladas. El procesam iento final de muchas
proteínas de este tipo está catalizado por una carboxi peptidasa que quita
secuencialmente dos residuos de aminoácidos básicos en el extremo
(b) Proteínas secretadas reguladas (-termina l de un polipéptido. (Véase D. Steiner y cols.. 1992,J. Blof Chem 267 23435)
Proinsulina
s s
s s
NH/ B Arg Arg e A coo- que en las células infectadas con el virus de la estomatitis vesiculada
(VSV, por sus siglas en inglés), los virus de la progenie brotan solo
s-s
Endoproteasa PC3 ~ Endoproteasa PC2 desde la membrana basolateral. Esta diferencia ocurre porque la

!---. 1 e Lys Arg 1

glucoproteína HA del virus de la gripe se transporta desde el complejo
de Golgi exclusivamente a la membrana apical y la proteína G del
VSV se transporta solamente a la membrana basolateral (Fig. 14-25 ).
s s
s Aún más, cuando el gen que codifica la proteína HA se introduce a
1 células no infectadas por técnicas de DNA recombinante, toda la HA
NH 3+ 1 B ~ Arg Arg 1 ~coo- expresada se acumula en la membrana apical, lo que indica que la
t
Carboxipeptidasa s-s señal de clasificación reside en la glucoproteína HA en sí y no en otras
proteínas del virus producidas durante la infección viral.

~
Entre las proteínas celulares que sufren una clasificación similar
1Arg 11Arg 1 apical-basolateral en el aparato de Golgi están aquellas con un ancla
de membrana glucosilfosfatidilinositol (GPI). En las células MDCK,
s s y en la mayoría de otros tipos de células epiteliales, las proteínas
s
~
1 1 ancladas GPI se dirigen a la membrana apical. En las membranas,
B Insulina las proteínas ancladas GPI se agrupan en balsas de lípidos que son
s-s ricas en esfingolípidos (véase el Cap. 10). Este hallazgo sugiere que
las balsas de lípidos se localizan en la membrana apical junto con
proteínas que, preferencialmente, los dividen en muchas células; sin
embargo, el ancla GPI no es una señal de clasificación apical en todas

Gluco proteína HA del virus de la gripe

Glucoproteína G VSV

Clasificación
apical directa FIGURA 14-25 Clasificación de las proteínas destinadas

rs•
para las membranas apical y basolateral de las células
polarizadas. Cuando las cél ulas MDCK cultivadas se
~ Clasificación
infectan simu ltánea mente con el VSVy el virus de la gripe,
o basolateral Ancla GPI la gluco proteína G del VSV (en púrp ura) aparece solo en la
membrana basolate ra l, mientras que las gl uco proteína HA de
;- ......_ ~'J la gripe (verde) aparece solo en la membra na apical Algunas
proteínas cel ulares (circulo anara njado), especialmente
aq uellas con un anc la GPI, se clasifican de manera similar
J~Endoc; ,• ;s ~ -_~,~~s-Golgi di rectamente a la membrana apical. y otras, a la membrana
-.

,....tJ
}~ ¡ •t)__.
'()-~
Transcitosis
C"'-1
~
~ Proteína apical
basolateral (no se muestra) por medio de vesícula s de
transporte especificas que brotan de la red rrans-Golg i.
En ciertas célu las polarizadas, algunas proteínas apicales
Saco Recicla~.g"°'\ y basolaterales son transportadas juntas a la superficie
recu bierto " ·V .'7· _n _ _ _ _1
de clatrin a ' " " ' - - -~ ---==-u-n"'io Memb ra na basolateral; las proteínas apica les (óvalo amarillo) se mueven
pl asm ática luego de manera selectiva, por endocitosis y transc1tosis, a la
Me mbrana
basol ____ _ __ __ _estrech
ate ral plasmática _ _ _a_ _ __ a ica l membrana apical. (De K S1mons yA wand,nger-Ne11. 1990 Celf 62 20 7 v K
Mostovycols. 1992.J. Cell 810/ 116 577)

14,4 Etapas fi nales de la vía secretora 653

 . das .1 los li sosomas se mod ifi can e
l.,, ,<'1 11 1.,, 1,l,1,m , .,d.,,: <' l1 1. 1, ,dul. 1, , k l.1 111·,,id c,. p, ,i· ,·jc1111'lo. l.,, .
, l.as ,·111in1,1s su u ·
- 1 bks dest ina
'd
, e f (
de 111 anosa 6-1 0s ato M6P ) en
n ti
,e
l'h'k111 .,, .u1 , l.1d.i,. l;l'I diri!,!l'll ., l., 111,·111h1.1 11.1 1,.," 1l.11c'r.tl. O1r.,,, . "
n,-(,olg1 . 1 05
d,\ll l 1o mu, ltii1ks res u >l11·
,l,stiu l.i, dt• 1.,:- ,,n,Lid.,, ,;1'1. " ,, 11 ,·nci.,, 1111 u11i,·.1.,. h.111 si,l,1 id <·1 1 (:1d,•11,1s di.: oli gos,1dri dos.
titi,·.hl.ts ,·<'""' 11t·,·,·,.,ri.,,, , uti,il'11l<', ,,.,r.,di rit~ir l.,s pr,1t l' t11a, .ti . I· n,.:mb ra na de la red tra ns-Golgi un
· · · . 1 , ,1 1,, •,,I ,t<·r ti 1·11 lu~.,r Je rll.1s, c.1•d,1 pnlld11 ,1 dr . ,• lcM6Pc1c,1 . tr,
, 1\llllllll<' ,lpl\. ,l < , • ' • ' ' • • • • Los n:ccp1 01es (. 'd . M6 P y dirigen su tran sferencia,
llll'lllbr.iu.i !'lll'<k ,·,, 11 1<'11<· r multipk, S<'tl,dt·s ,k , l:1s tl1c.1(1ú t1 , cu:1! - 11 los res1 uos º 1t>1
µrotd na s que evan . ·cc i,to res y sus proteí nas ligando se d.
yui rr.i Jt· 1,1, ,u.iks 1,u,·,k diri~irl., .ti dnminiLl dt: me111br:111a plas - ·d ' . ion de 1os ri.: . . ,_
(•ndosomas ta, ios, e ,c·c h n al Go lg1o a la membrana pi
uu ti,·.i .1<lt·, ii.1<!,,. 1 ,1 i,k111iti,·.1,·i<\t1 ,k t'S ta s se úales complejas y de - ptores se rt i , as.
sacian; luego, 1os rece . ·o n entregadas a los lisosomas (vé•
1,1, l'''<' tcin. 1, de l.1 ,ubicrt.1 d,· l:1 ,·,.:s ll:tt la que las recon ocen es inves- • lisosómICas s ase
múti ca y las enw n as
tig.1,L1 .,du,dnn· nl<' p.1r.1 1111.1 d i,·..:rsidad de pro te( nas dist int as qu e la Fig. 14-22 ).
S<~ ,dct',·i,, 11 .1 11 .1 ,l<1111ini,1s de mt·mb ra n:1s t'speclfü:os en las cél ul as . ladas se concent ran )' almacenan e
, d secreo ón regu n
q ,it t'li .1ks p11 l.1ri1,1,l,1s. • Las proternas e na señal neural u hormonal para 1
ara esperar u a
()1r,1 111c,-;111is11w p:1r.1 sdt·c,io na r pro teí nas apica les y basolate- vesíc ulas secretoras P'. , oteínas den tro de la red trans-Golg·
r.ik,, 1a111hien il11str.1do ,' n la Fi~ur.1 14- 25 , opera en los hepatocitos . · · L eaac1on de 1as pr 1
exoc1tos1s. a agr o
- . papel en Ia clasificación de las proteínas secreta ·
L,s 111c111 br.111:1s baso latera k s de los hep,1tocitos enfrentan la sangre puede desemµen ai un
\úlll lll <h'Urre en las (..llulas ep itelia les del intestino) , y las membra - das a la vía regulada.
n.1s .1pi,.tles tap izan los canales intercel ulares µe qut'Ii os a los cual es d a través de la vía secretora sufren cor-
se srcrt'ta l:1 b ilis. En los ht'p,1tocitos, las pro teína s aµicale s y basola- • Muchas proteínas transporta as ul d ,
. 1Golgi que dan como res ta o proteinas
tt' r,1!t·s rec it'n sinte tiz,1Lb s primero se tra nsportan en wsículas desde tes proteolíticos posteriores ª . d .,
. al te puede ocurnr la ma uraoon proteolí-
l.1 rt'd r-r,111.--Go lgi a la regi ón baso latt'ra l y se in corµoran a la s mem- maduras activas. Gener men ' G 1· 1
. , JI roteínas de la red trans- o g1 a a superfi.
br.rnas pl.ism.i ticas por exoci tosis (µ. ej ., la fusi ón d e la membrana de tica en ves1culas que evan P .
cie celular en el endosoma tardío o en el lisosoma.
b ws k ula .1 b membrana plas m:ítica ). Desde allí , las pro teínas baso-
later:iles y api, aks son endoc itadas en las mismas vesículas, pero sus , ¡ ·t 1· les polarizadas las proteínas de la membrana
· En las ce 1u as epi e ia '
.:amin os diwrgen. Las prote ínas basolaterales endocitadas se dirigen · d I d · ·os apical o basolateral de la membrana plasmá-
destma as a os omm1
a ,·..,skulas de transpo rte que las reciclan a la membrana basolateral. · son c1as1'fi ca d as en )a red trans-Golgi a diferentes vesículas de trans-
t.Jca
Por el contrario, las proteí nas endocitadas destinad as a la membrana , ¡a F'1g. 14 - 25 ) . El ancla GPI es la única señal de clasificación
porte (vease
ap ical son clasi ficadas a vesículas de transp orte que se mueven a tra- apical-basolateral identificada hasta el momento.
vt's de la cél ula y se fu sion an con la membrana apica l en un proceso
llamado transcitosis. Este proceso también se emplea para mover • En los hepatocitos y algunas otras células polarizadas, todas las pro-
materiaks e>.". tracelulares de un lado de un epitelio a otro. Incluso teínas de la membrana plasmática se dirigen primero a la membra-
en las cél ulas epitel iales com o las MDCK, en las cuales ocurre una na basolateral. Las proteínas destinadas a la región apical luego son
selecc ión de pro teínas apical-b asolateral en el aparato de Golgi, la endocitadas y se mueven a través de la célula a la membrana apical
transcitosis pued e proporcion ar una función de edición por la cual (transcitosis) .
una proteína apical seleccion ada de modo incorrecto a la membrana
basol ateral podría someterse a endocitosis )', luego, ser entregada co-
rre( tamente ,1 la membra na ap ical.

14.S Endocitosis mediada por receptor

En las secciones previas hemos explorado las principales vías por

CONCEPTOS CLAVE de la Sección 14.4 las cuales las proteínas solubles y las secretadas de membra na sin -
tetizadas en el RE rugoso son entregadas a la superficie cel ula r o
Etapas final es de la vía secretora a otros destinos . Las células también pueden internalizar materia -
l~s de su entorno y clasificarlos a destinos particulares . Unos pocos
• La red trt1115-Go lgi (RTG ) es un punto de ramificación central en la vía tipos celulares (p. ej ., los macrófagos) pueden to ma r una ba cteria
secretora en el que b s µro teínas solubles por secretarse, las proteínas
comp~eta )' otras partículas grandes por fagocitos is , un proceso no
li sosómic.1s ~- algun as µroteínas de la membrana celular destinadas a selectivo mediado por act·ma en e1 cua1 ext en siones
· d e la membra-
las membrnn,1s baso lateral o apical se segregan en diferentes vesículas
na plasmática envuelven el material inge r ido fo rmando vesícu las
de tn nspo rtt'.
grandes llamadas fagosomas ( véase la Fi g. 17 - l 9 ). Po r el contrario,
todas las células eucar 10
· t ·
as contmu am ent e es tán co m promet i ª
·d s
• l\ lucb.1s ws iculas que bro t,m de la red tm11s-Golgi, así como las vesí-
en la endo citosis ' un pro ceso en e1 cual una p eq ueüa re 0 10n · , de 1'·1
culas endo cíticas, lleva n un a cubierta compues ta de complejos de PA 0
membrana plasmática se· ·
mvagma para forma r una vesícula ro ea
d da
( proteína adaptadora) y clatrina (vé:ise la Fig. l ~ - l 8 ).
po r membrana ~on un di ámet ro aproxim ado de 0,05-0,1 µm de di;í-
• El desprendimiento de las ves ícu las cubiertas con clatr ina requ iere metro. En u na for m a de end · · ¡ . . • t·in
_ o c1tos1s, Jamada pmoc1tos1s, se cap •
dimunina , que fo rma un collar alrededo r dd cu ello del brote de la vesí- pequenas 00 otas de líquido • . ¡ . . · Jto
ext1ace ular y cu alquier m ateria l d1sue
cula e hidro liza el GTP ( véase la Fig. l -~- 19). en él de fo rm a no es pec 1'fi E . . • ·1
ica. n esta secc ión, n uestro obJet 1vo, si i
emb argo, es la endocitos· d' .,
IS me 1ada por recep tor, en la cual un w

654 CAPÍTULO 14 • Tráfico, secreción y endocitosis vesic ul ares

 super-
te a un cap ta ción de liga ndos extracel ul a res se internal izan d esd e la
ceptor específi co de la supe rfici e celul ar se u ne es t rec h amen son seleccio nadas
de la ficie de la célul a durante la endoci to sis y, luego,
ligand o m acromo l ecular extracel ular que reconoc e; la región la célula d e form a simi-
to r-liga ndo se y reciclad as nu eva mente a la supe rficie de
membra na plasm á tica q ue contien e e l complej o recep membra na plasmá tica y
en un a ves ícula de lar al recicl ad o d e los receptor es M6P a la
invagina luego y se despren de , transfor m á nd ose
cual se inte rnal iza un li gando está
el trans-G olgi. La velocida d a la
transpor te. e en la su-
limitada por la cantida d de su recept o r corresp ondient
Entre las macrom olécul as co mun es que inte rnalizan las células
.
de los vertebr ados por endocit osis mediad a por recepto r se encuen- perficie celu lar.
de
eínas Los sacos de clatrina / PA2 co n stituyen hasta el 2 p or c iento
tran las partíc ulas qu e contien en colester ol, llamada s lipoprot fibrobla stos. ~e
trans - la superfic ie de las células, tales como hepatoc itos y
de baja densida d (LD L, p or s u s siglas en inglés); la proteína
liga ndos interna lizados en estos sacos y ves 1-
rina ; muchas hormon as proteica s (p. han observa do muchos
portado ra de hierro transfer en_la e ndo -
por culas que se piensa qu e funcion an como interme diarios
ej. , insuli n a), y ciertas glucopr oteín as. La en docitosi s mediada s urndos a los
s recubier - citosis de la mayoría (a unque no de todos) los ligando
receptor de tales ligando s e n general oc urre vía vesícula
ep tores
vesíc ulas en un proceso similar al empaqu eta- recepto res de la superfic ie celular (Fig. 14 -26 ) . Alguno s rec_
tas de clatrina /PA2 y clatnna a un
o están agrupad os so bre invagin aciones recubi ertas con_
mi ento de las enzimas li sosó micas por la unión d e manosa 6-fosfat nte en
dijo pre- en ausencia de un ligando ; otros recepto res difund en libreme
(M6P ) en la red trans-G olgi (véase la Fig. 14-22 ). Como se
la m embr ana plasmát ica pero sufren un cambio de con-
e el plano de
viament e, algunos recepto res M6P se encuent ran sobre la s uperfici el
an en la endocit osis m ediada por rece ptor de las formaci ón cuando se unen al ligando , d e modo tal que cuando
celular y particip rto
general, complej o recepto r-ligand o difunde al interior de un saco recubie
enzimas lisosó micas que se secretan de forma erró nea . En dos o más tipos de
na que operan en la con clatrina , queda retenido allí. Se pueden ver
las proteína s rece ptoras integral es de la membra

(a) (b)

Ferritina -LDL 0,2 µ.m Ferritina -LDL

Invagin ación cubierta con clatrina
(d)
(c)

FIGURA EXPERIMENTAL 14-26 Las etapas iniciales de la endocito

sis la microscopia a inte rvalos periódicos. (a) Un hoyo recubier to q ue muestra
de
mediada por recepto r de las partículas de lipoprot eínas de
baja la cubierta de clatrina e n su superficie interior (c1tosol1ca) poco después
LDL, apa renteme nte
densida d (LDL) se revelan median te microscopia electrón
ica. Los haber elevado la tempe rat ura . (b) Un hoyo que contiene
ar una vesícula cubierta. (c) Una ves ícula
fibro blastos humanos cultivados se incubaro n en un medio que contenía cerrándose so bre si mismo para form
las
partículas de LDL uni das de fo rm a covalente a la proteína electrode nsa
con cubie rta que contiene part íc ul as de LDL marcad as con fer riti na. (d) Partícu
temp rano 6
hier ro ferri t1na; cada pequ eña partíc ul a de hierro de la fer ritina se ve como de LDL marcadas con femtina en la super fic ie lisa de un endosom a
minu tos des pués de haber comenza do la 1nte rnal1zació n eta s fotog rvfr,1110n
n rorte" J
un pu nr o peq ueño en e l microsco pio electrónico. Las células se incubaro
un irse a su re cepto r y cofs No iure 27 9 6l'J Co py<1rJht 1910.
1r,1c,almenre a 4 ºC, a esa te m peratura, la LDL puede de R Anderson Permpreso con autorrzac,ón de J Goldste,n
LDL no s, ,r c,, 232
pero no se prod uce la 1nternalizació n. Después de lavar el exceso de
Goldsro,n. J98é, l•l l
Macmrllan Journals l,mrted Véase también M S Bro wn v J
0

a las c~lulas, estas se calenta ro n a 37 ºC y, lue go, se pre pararo n para

un,da

14.5 End ocitosis mediada por receptor 655

 li gando s unidos al receptor, como LDL y tra nsferrina en el mis mo
hoyo recubierto o vesícula .
Las células captan lípidos de la sangre en form a
de complejos lipoproteicos grandes bien definidos
Los lípidos absorb idos de la dieta en los intestinos o almacenados
en el tejido adiposo pueden di stribuirse a las células a través del
organismo. Para fa cil itar la transferen cia masiva de los lípidos entre
las cél ulas, los an imales desarrollaron un a fo rma eficiente de em -
paquetar los cientos a miles de moléculas de lípidos en acarreado-
res hidrosolubles macrom oleculares , llamados lipoproteínas, que
las células pueden captar de la circulación com o un conjunto. Una
partícula de lipoproteína tiene una cubierta compuesta por proteí-
nas ( apolipoproteínas) y una monocapa fosfolipídica que contiene
colesterol. La cubierta es anfipática porque su superficie externa
es hidrófila, lo cual hace que estas partículas sean hidrosolubles,
y su superficie interna es hidrófoba. Adyacente a la superficie in-
tern a hidrófob a de la cubierta hay un núcleo de lípidos neutros
que con tien en principalmente esteres de colesterilo, triglicéridos o
ambos. Las lipoproteínas de los mamíferos caen en diferentes clases
definidas por sus diferentes densidades de flotación. La clase que
consideraremos aqu í es la de las lipoproteínas de baja densidad
(LDL, por sus siglas en inglés) . Una partícula de LDL típica, dibu-
jada en la Figura 14-27, es una esfera de 20-25 nm de diámetro. La
cub ierta externa anfipática está compuesta por una monocapa de
fosfolí pido y una molécula única de una proteína grande conocida
~ Fosfolípido '\!>-:,::-- -- Superficie
polar
~ Colesterol no
'iesterificado
'
Ester de
col esterilo
Apolipoproteína B
LDL
FIGURA 14-27 M odelo de lipoproteína de baja densidad (LDL). Esta Ylas
otras clases de li poproteínas tienen la misma estructura general: una cubierta
anti pática compuesta por una monocapa fosfol ipídica (no una bicapa),
colesterol y proteína y un núcleo hidrófobo compuesto principalmente
por esteres de colesterilo o triglicéridos, o ambos, con cantidades menores
de otros lípidos neutros (p. ej., algunas vitaminas). Este modelo de LDLse
basa en métodos de microscopía electrónica y otros de ti po biofísico de
baja resolución. La LDL resulta única en el sentido de que contiene solo una
única molécula de un tipo de apolipoproteína (apoB) que parece envolverse
alrededor del exterior de la partícula como una banda de proteína. Las
otras lipoproteínas contienen múlti ples molécu las de apolipoproteína, con
frecuenc ia de diferentes tipos. (Adaptado de M K11eg er, 1995. en E. Haber. ed , Moleculor
Cord,ovo,culor Med1c,ne, Sc,em,hc Ame11can Med,o ne. pp 31 -4 7).
656 CAPITU LO 14 • Tráfico, secreción y endocitosis vesiculares
co mo apoB -JOO; el núcleo de la pa rtíc ula está emp aqu etado con el
colesterol en for ma de esteres de colesterilo.
Se han empleado dos en foques exper imen tales generales Para
estudiar cómo las part ícu las de LD L entran a las célu las. El prirner
método emplea LDL marcado med iant~ la ~nió n covalente de 111¡ a
las cadenas laterales de los residuos de ttrosma de la apoB-100 de las
superficies de las partículas de LDL. Después de que las células cu[.
tivadas se incuban durante varias horas con la LDL marcada es posi-
ble determin ar cuánta LDL está unida a las superficies de las células,
cuánta se ha internalizado y cuánto del compon ente apoB -100 de la
LDL ha sido degradado por la hidrólisis enzimática a aminoácidos
individuales. La degradación de la apoB-100 puede ser detectada
por la liberación de la i2s1-tirosina al medio de cultivo. La Figura
14-28 muestra el curso temporal de los eventos en el procesamiento
celular de LDL mediada por receptor, determinado por experimen -
tos de pulso y caza con una concentración fija de LDL marcada con
125 1. Estos experimentos demostraron con claridad el orden de los
eventos: unión de LDL a la superficie ➔ internalización ➔ degra-
dación. El segundo enfoque implica el etiquetado de partículas de
LDL con una marca electrodensa que puede ser detectada mediante
microscopia electrónica. Estos estudios pueden revelar los detalles
del modo en que las partículas de LDL se unen primero a la superfi -
cie de las células en invaginaciones endocitícas con clatrina y, luego,
permanecen asociadas con los hoyos recubiertos a medida que se in-
vaginan y brotan para formar vesículas cubiertas para, finalmente,
ser transportadas a los endosomas (véase la Fig. 14-26 ).
12
lnternalización
10
rou
Cll
8 Deg radac ión
:e.
O)
e: 6
...J
o
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4
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------~
o~-=--=::---=~-....l..-_L__ _L__ __¡'J..(_
1
_j¡_
O 1O 20 30 40 50 60 120
Tiempo a 37 ºC (min)
FIGURA EXPERIMENTAL 14-28 El experimento de pul so y caza
demuestra relaciones precursor-producto en la captación celular de
LDL. Los fibroblastos normales cultivados de la piel se incubaron en un medio
121
que contenía 1-LDL durante dos horas a 4 ºC (el pulso). Después de que el
125
exceso de 1-LDLno unido a las células se lavó, las células se incubaron a
37 ºC durante las cantidades de tiempo indicado en ausencia de LDL externa
(la caza). Las ca ntidades de 1151-LDL unida a la superficie internalizada y
degradada (h1drol1zada) fue ron medidas. La unión (pero no la internal ización
ni la hidról isis) de la LDL apoB-1 00 ocu rre durante el pulso a 4 ºC Los datos
muestran la desapa rición_muy rápida de la 125 1-LDL de la superfic ie a med ida
que se 1nternaliza despues de que las célu las se han ca lentado para permitir
los movimientos de la membrana. Después de un período de pausa de 15-20
minutos com ienza la deg radación lisosómica de la 1111-LDL interna lizada. (vease
M S Brown y J. L. Goldstein. 1976, Ce//. 9:663).
Los receptores de las lipoproteínas de baja
densidad y otros ligandos contienen señales de
clasificación que los marcan para la endocitosis
La clave para comprender el modo en que las partículas de LDL se
unen a la superficie celular y, luego, son captadas al interior de ve-
sículas endocíticas provino del descubrimiento del receptor de LDL
(LDLR, por sus siglas en inglés). El receptor de LDL es una glucopro -
teína de 839 residuos con un segmento integral de membrana único;
tiene un segmento citosólico C-terminal corto y un segmento exo-
plasmático N-terminal largo que contiene el dominio que une LDL.
Siete repeticiones ricas en cistcina forman el dominio de un ión al
ligando que interactúa con la molécula apoB-100 en una partfcula de
LDL. La Figu rn 1'1-29 muestra el modo en que las prot<.:inas del recep-
tor de LDL facilitan la internalización de las partículas de LDL po r la
endocitosis mediada po r receptor. Después de que las partíc ul as de
LDL internalizadas llegan a los lisosomas, las proteasas lisosómicas
hidrolizan sus apolipoprotefnas de superficie y las esterasas de co-
lesterilo lisosómicas hidrolizan sus esteres de colesterilo centrales. El
colesterol no esterificado, entonces, es libre de abandona r el lisosoma,
y puede ser usado según se necesite por la célula en la síntesis de las
membranas de varios derivados del colesterol.

Partícula de LDL Monocapa de fosfolípidos

/ Proteína apoB
\ ------ A pH neutro, el brazo de un ió n
al ligan do está libre para unirse
Recept or de LDL a otra partfcula de LDL

Membrana plasmática

Comp lejo
PA2

Vesícula
cubierta

Endosoma
temprano
Endo,oma ta,dio i
Lisosoma
pH 5,0
Aminoácidos

Colesterol

FIGURA 14-29 Vía endocítica para la internalización de la lipoproteína la vesícula endocítica no cubierta (el endosoma temprano) se fusiona con el
de baja densidad (LDL). Paso O: los rece ptores de LDL de la super_fic1e cel ular endosoma tardío. El pHacídico de este compartimiento provoca un cambio
. apo 8 embebida en la capa externa . de .fosfolip1
, dos de
1 de conformación en el receptor de LDL que lleva a la liberación de la partícula
se unen a una prote1na
las partículas de LDL. La interacción entre la seña l de clas1 ficac1on NPXY en a de LDL unida. Paso C: el endosoma tardío se fu siona con el lisosoma y las
cola citosól1ca del receptor de LDLY e IcompleJ·o P .
A2 incorpora .., el complejo
h proteínas y los lípidos de la partlcula de LDL libre se degradan a sus partes
· d ·t·
receptor-ligando a la s ves1culas en oo ica s en formación
. · Paso a : 1os oyos constituyentes por enzimas del lisosoma. Paso 0 : el rece ptor de LDL recicla la
(o brotes) cubiertos de clatrina contienen compleJos _receptor-LDL y s_e superficie celular, donde, al pH neutro del medio externo, el receptor sufre un
desprenden med iante los mismos mecanismos mediados por d1nam1 na que se cambio de conformación de tal modo que puede unir otra partícula de LDL.
emplean para formar las vesículas de clatrina/PA 1 en la red rrans-Golg1 (véase (Véanse M S Brown y J L Goldsteln, 1986, Sclence 232·34. y G Rudenko y cols . 2002, Soence 298 135 31

la Fi g ¡ 4. 19). Paso u después de que se desprende la cubierta de la veslcula,

14.5 Endocitosis mediada por receptor 65 7

 i'ia lan la endocitosis . Entre las p roteínas
~ El descubrimiento del recepto~ de LDL y la c~ mpren sión del cova 1entem en te qu e Se ' . . a;1,
U modo en que funciona prov1111eron del est udio d e cé lulas de . d , 1 s clatrina/PA2, va n as contienen domini os
cia as con ves1 cu a . qul
pacientes con hipercolesterolemia fami liar (HF), una enfe rm edad ' fi un en a la ubic u iti n a, y se h a h 1potetizado
espec1 1camente se . . . qut
hereditaria marcada p or el colesterol LDL plasmático eleva do y que . das a vesículas med ,an la mcor poraC1 ón sel
estas proteinas asocia ec.
. d , d
act ualmente se sabe está causada por mutacion es en el gen LDLR. ttva e protem as e m emb rana ubicu itinadas .
en vesículas end .
. oc1 .
En pacientes que tienen una copia normal y un a defect uosa del gen . d 'b i'rá más ad elan te, la etiq ueta de ub1cu itina
t1cas. Co mo se escn . . tn
LDLR (heterocigotos), el colesterol LDL de la sang re está aumenta - , d b n a endo citadas tamb ién es recon ocida en ,,
protem as e m em ra , . _ . ~na
do aproximadamente al doble . En aquellos que tienen los dos genes . vi'a endoo t!Ca y desempena una función .
etapa posterior en 1a . . tn
LDLR defectuosos (homocigotos ), los n iveles de colesterol están in - 'n as al intenor d el hsosoma donde se degradan
entregar estas pro t e1
crem entados entre cuatro y seis veces con resp ecto a lo normal. Los
heterocigotos H F desarrollan , por lo común , enfermedad cardiovas-
cular aproxim ada men te d iez años antes que las personas normales, El pH ácido de los endosomas tardíos pro~oca
y los homocigotos mueren d e fo rma habitual por ataques cardíacos la disociación de la mayoría de los compleJos
antes de com pleta r la tercera década de vida.
Un a diversidad de mutaciones en el gen que codifica el receptor
receptor-ligando
de LDL p uede provocar h ipercolesterolemia familiar. Algunas mu- La velocidad global de la internal ización endo cítica de la membrana
taciones im p iden la síntesis de la proteína LDLR; otras impiden el plasmática es bastante elevada : lo s fib roblastos cultiva~os regular-
plegam iento adecuado de la proteína receptora en el RE, llevando a mente internalizan el SO % de sus proteínas de superficie y fosfolí -
su degradación prematura ( Cap. 13 ); otras mutaciones disminuyen pidos por hora . La mayoría de los receptores de la superficie celu-
la capacid ad del receptor de LDL para unirse a esta estrechamente. lar que sufren endocitosis depositarán repetidamente sus ligandos
Un grupo particularmente informativo de receptores mutantes se dentro de la célula y, luego, los reciclarán a la membrana plasm át i-
exp resa en la superficie celular y une la LDL normalmente, pero ca nuevamente para mediar la internalización de las moléculas de
n o puede mediar la internalización de la lipoproteína unida. En in- ligando. Por ejemplo, el receptor de LDL completa un ciclo hacia
dividuos con este tipo de defecto, los receptores de la membrana adentro y hacia afuera de la célula cada 10-20 minutos, con un total
plasmática para otros ligandos se internalizan con normalidad, pero de varios cientos de viajes en su espectro de vida de 20 horas .
el receptor de LDL mutante no se recluta en el interior de los hoyos Los complejos internalizados receptor-ligando comúnmente
cubiertos. El análisis de este receptor mutante y de otros receptores siguen la vía que se muestra para el receptor M6P en la Figu ra 14-
d e LDL mutantes generados experimentalmente y expresados en fi- 22 y para el receptor de LDL en la Figura 14- 29. Los receptores
b roblastos identificó un motivo de cuatro residuos en el segmento de la superficie celular endocitados típicamente se disocian de sus
citosólico del receptor que resulta crucial para su internalización: ligandos dentro de los endosomas tardíos que se ven como vesí-
Asn-Pro-X- Tyr, donde X puede ser cualquier aminoácido. La señal culas esféricas con membranas ramificadas tubulares localizados a
de clasificación N PX Y se acopla al complejo PA2 , uniendo la cubier- unos pocos micrómetros de la superficie celular. Los experimentos
ta d e clat rina/ PA2 al segmento citosólico del receptor LDL en los originales que definieron las vesículas de clasificación del endo-
h oyos recub iertos . Una mutación en cualquiera de los residuos con- soma tardío utilizaron el receptor de la asialoglucoproteína . Esta
servados de la señal N PXY abolirá la capacidad del receptor de LDL proteína específica del hígado media la unión y la intern alización
de ser inco rporado a los hoyo s recubiertos . de las glucoproteínas anormales, cuyos oligosacáridos terminan
Un pequeño número de individuos que exhiben los síntomas habi- en galactosa en lugar de terminar en ácido siálico normal; de allí,
tuales asociados con la hipercolesterolemia familiar producen recepto- el nombre asialoglucoproteína. La m icroscopia electrón ica de las
res de LDL normales. En estos individuos, el gen que codifica la subuni- células _hepáticas perfundidas con asialoglucoproteína revelan qu e
dad proteica PA2 que une la señal de clasificación NPXY es defectuoso; 5-1 O mm u tos después de la internalización las moléculas del ligan-
en consecuencia, los receptores de LDL no se incorporan a las vesícu- do se encuentran en la luz de los endosomas tardíos mientras qu<'
las clatrina/PA2 y la endocitosis de las partículas de LDL se encuentra las extensiones. de la memb rana t u b u 1ar son n·eas en ' recep tores 1·
comprometida. El análisis de los pacientes con este trastorno genético
en raras ocasiones contienen ligando . Estos hallazgo s indica n que
destaca la importancia de las proteínas adaptadoras en el tránsito de el endosoma tardío es el , l
organu o en el cual los receptores V ¡os
proteín as mediado por las vesículas de clatrina. ■ ligandos se desacoplan . '
La disociación de los ¡ · •
comp e¡os recepto r-ligando en los en
d
°·
somas tardíos ocurre no solo en la vía endo cítica sino también en IJ
Los estud ios de mutaciones han mostrado que otros recep-
entrega de las enzimas liso só micas solubles por medio de la vía se-
tores de la superficie celular pueden ser dirigidos a formar hoyos cretora (véase la Fig 14 22 ) c
de clatri na/PA2 por una señal de clasificación YXXF. Recuerde, de · - · orno se an al izó en el Cap ítul o 11 , 1as
membranas de los endos d' .
n uestro anális is previo, que esta misma señal de clasificación recluta o rn as tar 10s y de los lisosomas contienen
bombas protónicas de el y ,
proteín as de la membrana a vesículas de clatrina/PAl que brotan ase qu e actuan concertadament e con ¡os
canales de Cl· p ara a ·d 1·r·
de la red trans-G olgi, uniéndose a una subunidad de PAl (véase el ci icar 1a lu z de las vesícu las (véase la fi-·~
11 - 14 ). La mayoría d e lo •
Cuad ro 14 -2). Todas estas observaciones indican que YXXF es una s receptores , 111 cl uyendo el receptor M 6P')
1
os receptores de la superfi cie celul ar para las partícu las de LDL )' la
señal exten sam ente usada para clasific ar proteínas d e la me mbrana asial oglucop ro teín a u .
y d irigirlas a las vesículas cubiertas con clatrina. . ' nen sus 1igan d os estrechamente a pH ne utro
p ero los liberan si el pH d ·
En algunas proteínas de la superfic ie celular, sin embargo, hay esciende a 6,0 o por deb ajo d e este vaJor.
El en dosom a tardío es la ·
otras secuenc ias (p. ej., Leu -Leu) o moléculas de ub icu itin a liga das . l' pnm era vesícu la enco nt rada po r los corn ·
1
p eJos igando -rece ptor cuyo pH lum inal es s ufi cien tem ente ,\ cid o

658 CAPÍTULO 14 • Tráfico, sec reción y endocitosis vesiculares

 (b)
(a) Pa rtícu la de
Superficie cel ular [pH "' 71 Endosoma [pH '= 5) LDL libe rad a
Brazo de unión
al ligando (R 1-R7) Este res 1
~ de colesterol

--
Dominio Partícul a La superficie del
Receptor dominio p impulsor
de LDL p impulsor f - Monocapa de LDL
~ fosfolipídica se carga positiva mente
Señalde y, luego, se un e al
cla s ificac ió n Proteína apo B
brazo que une a l
NPXY
lig an do

Brazo que une

FIGURA 14-30 Modelo para la unión dependient e de pH de las
al ligando
partículas de LDL por el receptor de LDL. Diagrama esquemático de un
receptor de LDLa pH neutro en la superficie celular (a) y a pH acídico en el /
interior del endosoma tard ío (b). (a) En la superficie celu lar, la apoB- 1oo de
la superficie de una partícula de LDL se une estrechamen te al receptor. De Do minio p
las siete repeticiones (R l -R7) del brazo que une al liga ndo, R4 y RS parecen impu lso r
ser las más críticas para la unión de LDL. (b, arribo) Dent ro del endosoma,
los residuos de histidina con dom in io impulsor~ del receptor de LDL se
protonan. El impulsor cargado positivamente puede uni rse con alta afinidad
al brazo que une al ligando que contiene residuos con carga negativa, lo que
provoca la liberación de la partícula de LDL. (b, abajo) Densidad electrónica
experimental y modelos de trazas de C0 de la región extracelular del receptor
de LDL a pH 5,3 basados en el aná lisis de cristalografías de rayos X. En esta
conformación ocurren exten sas interacciones hidrofóbicas y iónicas entre el
impulsor ~ y las repeticiones R4 y RS. (La parte [bJ, tom ada de G Rudenko y cols . 2002,
Soence 298:23 53).

ferrotransferrina. Todas las células de mamífero contienen recepto-

para promover la disociació n de la mayoría de los receptores endo-
citados de sus ligandos estrechame nte unidos.
El mecanism o por el cual el receptor de LDL libera las partículas
de LDL un idas ahora se comprende en detalle (Fi g. 14- 30). A un pH
endosómico de 5,0-5,5, los residuos de histidina en una región co-
nocida como el dominio ~-propulso r del receptor se protonan, for-
mando un sitio q ue puede unirse con alta afinidad a las repeticiones
negativamente cargadas del dominio que une LDL. Esta interacción
intramolecu lar secuestra las repeticion es en una conformaci ón que
no puede unirse si multáneam ente a la apoB-100, provocando así la
liberación de la partícula de LDL unida.
res de transferrina en la superficie celular que unen con avidez fe-
rrotransferr ina a pH neutro, después de lo cual la ferrotran sfer rina
unida al receptor sufre endocitosis . Al igual que los component es de
una partícula de LDL, los dos átomos de Fe + unidos perman ecen en
3
la célula, pero la parte de apotransfer rina del ligando no se disoc ia
del receptor en el endosoma tardío y, a los poco s minutos de haber
sido endocitada, la apotransfer rina vuelve a la superficie celular y se
secreta desde la célula.
Como se muestra en la Figura 14-31 , la explicación para la con -
ducta del complejo transferrin a- receptor-li ga ndo radica en la cap a-
cidad única de la apotransfer rina para perm anecer unid a al recepto r
de transferrina a bajo pH (5,0-5,5) de los endosomas tard íos. A pH
menor de 6,0, los dos átomos de Fe • unidos se di socian de la ferro-
1

La vía endocític a entrega hierro a las células transferrina y se reducen a Fe • mediante un mecanismo de scon oci-
2

sin disociar el complejo receptor -transfer rina do y, luego, se exportan al citosol por un transportad or endosó m ico
en los endosom as específico para los iones metálicos divalentes. El complej o rcceptor-
apotransfer rina que permanece después de la disociaci ón de los áto-
La vía endocí tica que implica el receptor de transferrina y su
mos de hierro se recicla nueva men te a la superfi cie celul ar. Aunque
ligando difiere de la vía de la LDL en que el complejo receptor-
la apotransfer rina se une estrechame n te a su receptor a un p H de 5,0
ligando no se disocia en los endosomas tardíos; sin embargo, los
o 6,0, no se une a pH neutro. Así , la apot ransferrina unida se d isoc ia
cambios en el pH ta mbién median la clasificación de los receptores
del receptor de transferrina cuando las vesíc ulas que recicl an se fu -
Ylos ligandos en la vía de la transferrin a que funciona para entregar
sionan con la membran a pla smática y el complejo receptor- ligando
hierro a las células.
encuentra el pH neutro del líquid o inters ti cial ex tracelu lar o medio
Una glucoproteí n a principal de la sangre, la transferrina , trans-
de cultivo. El receptor reciclado está libre entonces para unirse a
po rta el hierro a todas las células del tej ido desde el híga do (el prin-
otra molécula de ferro transferrina , y la apotransfer rina liberad a es
cipal sitio de almacenam iento de hierro en el organismo) y desde
ll evada por el torrente sanguíneo hacia el hígado o el intes tino pa r.1
el intestin o (el sitio de absorció n de hierro ). La forma sin hierro,
ser recargada co n hi erro.
ªPot ran sferrina, une dos iones Fe 3+ muy estrechame nte para fo rm ar

14.5 Endocitosis mediada por receptor 6 59

 ~ D m
Fer rotransferri na { e3; ) ~ La apot ransferrina
se recic la a la
Exterior supe rfi cie cel ular
(pH 7}
Receptor de
transferrina ')(-

Complejo adaptador - -- •- •
Clatrina

'--5'" J
..,
:--- Clatrina
\

m
La apotransf errin a
se disocia desde
el recepto r a
pH neutro

Apotran sferrin a
El pH bajo provoca la
liberación de Fe 3• desde el
ligando; este permanece
unido al receptor Endosoma tardío

FIGURA 14-31 Ciclo de la transferri na, operativo en todas las células

de mamífero en crecimient o. Paso O: el dímero de transferrina que lleva
dos átomos de Fei+ unidos, llamado ferrotransferrina, se une al receptor
de transferrina de la superficie celular. Paso H interacción entre la cola
del receptor de tran sferri na y el complejo adaptador PA2 que incorpora
el complejo receptor-ligando a las vesículas endociticas cubiertas de
clatrina. Pasos ~ y l'iJ: la cubierta de la vesícula se desprende y las vesículas
endocíticas se fus ionan con la membrana del endosoma. El Fei+ se libera
desde el complejo receptor-ferrotransferrina en el compa rtimiento acídico del
endosoma tard ío. Paso H la proteína apot ransferrina permanece unida a su
receptor a este pHy reciclan la superficie celu lar juntos. Paso t'iJ: el pH neutro
del medio externo provoca la liberación de la apotransferrina sin hierro. (Véase A
Ciechanover y cols., 1983, J. Biol. Chem. 258:9681 ).

CONCEPTOS CLAVE de la Sección 14.5
Endocitosis mediad a por recepto r
• Algunos ligandos extracelulares que se unen a receptores específicos
de la superficie celular son internalizados, junto con sus receptores,
en vesículas cubiertas de clatrina, cuyas cubiertas contienen, además,
complejos PA2 (véase la Fig. 14-26).
• Las señales de clasificación del dominio citosólico de los receptores
de la superficie celular los dirigen a hoyos recubierto s con clatrina/PA2
para su internalización. Las señales conocidas incluyen las secuencias
Asn-Pro-X-Tyr, Tyr-X-X-<I> y Leu-Leu (véase el Cuadro 14-2).
• La vía endocítica entrega algunos ligandos (p. ej., partículas de LDL) a
los lisoso~as, donde son degradado s. Las vesículas de transporte desde
la superficie celular se fusionan primero con los endosomas tardíos,
que posteriorm ente se fusionan con el lisosoma.
'. ~a mayoría de los complejos receptor-ligando se disocian en el medio
aCido del endosoma tardío; los receptores se reciclan a la membrana
plasmática , mientras que los ligandos son destinados a los lisosomas
(véase la Fig. 14-29).
• El hierro es importado al interior de las células mediante una vía en-
docítica en la cual los iones Fei. son liberados desde la ferrotransferrina
del endosoma tardío. El complejo receptor-a potransferrina recicla a la

660 CAPITULO 14 • Tráfico, secreción y endocitosis vesiculares


superficie celular, don de se disocia liberando tanto el recep tor corno la
apotransferrina para volver a ser utilizada.
14.6 Direccio namient o de las proteínas de
membra na y material es citosólicos al lisosoma
La pr incipal fu nción de los lisosornas es degradar el material extra-
cel ular captado por la célula y los component es intracelulares en
ciertas condicio nes. Los materiales que tienen que degradarse debe-
rán ser entregados a la luz del lisosoma, donde residen las distintas
enzimas que part icip an en la degradació n. Corno ya se analizó, ]os Ji-
gandos endocitado s (p. ej ., las partículas de LDL), que se disocian de
sus receptores en el endosoma tardío, posteriorm ente entran a la luz
del lisosoma cuando la membrana del endosoma tardío se fusiona
con la membrana del lisosoma (véase la Fig. 14 -29 ). De modo si mi-
lar, los fagosomas que llevan bacterias u otro material sólido pueden
fusionarse con los lisosomas, liberando su contenido en la luz para
la degradació n .
Es evidente d e qué modo el mecanismo de tránsito general de
las vesículas analizado en este capítulo puede ser empleado para en-
tregar el conten id o lum inal de un orgánulo endosómico a la luz del
lisoso m a para su degradació n ; sin embargo, las proteínas de la mem-
bra na en tregadas al lisosoma por el proceso de tránsito vesicular tí-
pico q ue hemos analizado en este capítulo deberían ser entregadas fi-
nalmente a la m embrana del lisosoma. Entonces, ¿cómo se degradan
las proteínas en el lisosoma? Como veremos en esta sección, la célula
tie ne dos vías especializad as distintas para entregar materiales a la
luz del lisosoma a fin de que sean degradados : una para las proteínas
de la mem bran a, y otra , para los materiales citosólicos. La primera
vía, emplead a para degradar las proteínas de membrana endocitadas ,
emplea u n tipo inusual de vesícula que brota a la luz del endosoma, a
fin de prod ucir un endosoma multivesicu lado. La segunda vía, cono-
cida como autofagia, implica la formación de novo de un orgánulo
con doble m embrana, conocido como autofagosom a, que envuelve
material citosólico como proteínas solubles, citosólicas o, en ocasio -
nes, orgánulos como los peroxisoma s o las mitocondri as . Ambas vías
llevan a la fu sión del endosoma multivesicu lado o del autofagosor na
con el lisosoma , depositand o el contenido de estos orgánulos en la
luz lisosó m ica para su degradació n .
Los endosom as multives iculados segregan
proteína s de membra na destinadas a la membran a
lisosómica desde las proteína s destinadas a la
degradación lisosómica
, · ómi·cas , tales como las bombas protónicas de la clase
1,sos
Las pro temas
V y los transportad ores de aminoácidos, pueden llevar a cabo, sus fun-
ciones y permanecer en ]a membrana del hsosom a, donde esta~ prote-
gidas de la degradación por las hidrolasas de la luz. Estas protemas son
entregadas a la membrana del lisosoma por vesículas de trans~o:te qu e
brotan de la red trans-Golgi por los mismos mecamsmos bas1cos de
ribieron en secciones previas. Por el contrario,
mem b rana que se desc
14.6 Direccionami ento de las proteínas de memb ra na y materiales citosólicos al lisosoma
las proteínas de memb rana endocitadas , tales corno los rece ptores
proteicos que de ben ser degradados, son transferidas en su totalidad
al interio r del lisosoma por un sistem a de entrega especial izado. La
degradación en los lisosomas de los receptores de la superficie celu -
lar para las moléculas de señ alizació n extracel ular es un mecanismo
común para controlar la sensi bil idad de las célu las a tales señales
(Cap. 15). Los receptores que se dañan tam bién está n eti q ue tados
para la degradación en los lisosomas.
La evidencia temprana de que las membranas pueden se r entre -
gadas a la luz de los compartimi entos provino de m icrofotografías
electrónicas que mostraban vesículas de membrana y fragm entos de
ellas dentro de los endosomas y los lisosomas . Experiment os parale-
los hechos en levaduras revelaron que las proteínas receptoras endo-
citadas dirigidas a la vacuola (el organismo de la levadura equivalen -
te al lisosoma ) estaban asociadas primariame nte con los fragmento s
de membrana y pequeñas vesículas del interior de la vacuola más que
con la membrana de la superficie vacuolar.
Estas observaciones sugieren que las proteínas de membrana en-
docitadas pueden ser incorporada s a vesículas especializadas que se
forman en la membrana del endosoma (Fig. 14-32 ). Aunque estas
vesículas son de tamaño y de aspecto similares a los de las de trans-
porte, difieren topológicam ente. Las vesículas de transporte brotan
hacia afuera desde la superficie de un orgánulo donante hacia el ci-
tosol , mientras que las vesículas del interior del endosoma brotan
hacia adentro desde la superficie hacia la luz (alejándose del citosol ).
Los endosomas maduros que contienen numerosas vesículas en su
interior habitualme nte se llaman endosomas ( o cuerpos ) multivesicu-
lados. La membrana de superficie de un endosoma multivesicu lado
se fusiona con la membrana de un lisosoma, entregando , por lo tan-
to, sus vesículas internas y las proteínas de membrana que contienen
al interior del lisosoma para la degradación . Así, la clasificación de
las proteínas en la membrana del endosoma determina cuáles per-
manecerán en la superficie del lisosoma (p. ej. , bombas y transporta-
dores) y cuáles se incorporará n a las vesículas internas y, finalmente ,
se degradarán en los lisosomas.
Muchas de las proteínas requeridas para la gemación hacia aden-
tro de la membrana del endosoma fueron identificada s inicialment e
por mutaciones de las levaduras que bloqueaban la entrega de las
proteínas de la membrana al interior de la vacuola. Más de diez pro -
teínas de "gemación" de este tipo fueron identificada s en las leva -
duras, la mayoría de ellas con similitudes significativa s con relación
a las proteínas de mamífero, que evidenteme nte desempeña ban la
misma función en ellos. El modelo actual de gemació n endosómica
para formar endosomas multivesiculados en las células de mamí -
fero se basa primariame nte en estudios hechos en levad uras ( Fig.
14-33). La mayoría de las proteínas carga que entran al endosom a
multivesicu lado están etiquetadas con ubicu it ina. Las prote ínas ca r-
ga destinadas a ingresar al endosoma multivesiculado, po r lo gene-
ral , reciben su etiqueta de ubicuit ina en la membrana plasmática, la
RTG o la membrana del endosoma. Ya hemos visto el modo en que
el etiquetado con ubicuit ina puede servir como una se ña l para la
degradación de proteínas mal plegadas del RE o del aparato de Golgi
por acción del proteasoma (véanse los Caps. 3 y 13). Cuando se em-
plea com o una señal para la degradación proteasómic a, la etiqueta
de ubicu itina habit ualmente consiste en una cadena de moléculas
de ubic uitina unidas covalentem ente (po li ubicuitina) , mientras que
la ubicuitina empleada para etiquetar proteínas para su entrada al
endosoma multivesic ulado, por lo general, toma la forma de una
661
 M em brana plasmát ica

~om ata,d ío

)
Golgi

~- ) Endoso ma tardío/c uerpo

Lisosom a

multive siculado

FIGURA 14-32 Entrega de las proteínas de la membrana plasmát

ica al
interior del lisosoma para su degradación. Los endosomas tem
pranos
que llevan las proteínas endocitadas de la membrana plasmática (azul)
y las
vesícula s que llevan las proteína s li sosómicas de membrana (verde)
de la red
rrans-Go lg i se fusionan con el endosoma tardío transfirien do sus proteínas
de membrana a la membrana endosómica (pasos O y EJ). Las proteínas
que
deben degrada rse, como las que provienen del endosoma tempra
no, se
incorpor an a las vesícul as que brotan en el interior del endosom a tardío,
formando, fina lmente, un endosom a multivesiculado que contiene
muchas
vesículas internas de este tipo (paso O). La fu sión directa de un endosom
a
multivesiculado con un lisosoma libera las vesícu las internas a la luz
del
lisosoma, donde pueden degradar se (paso f)) . Dado que las bom bas
protónicas y otras proteínas de la membrana del lisosoma normalm
ente
no se incorporan a las vesículas endosómicas internas, son entregad
as a la
membrana del lisosoma y protegidas de la degradación. (Véanse F. Reggion
y D. J.
Klionsky. 2002. Eukaryot. Ce/1 1.11, y D. J. Katzkmann y cols.. 2002, Nature
Rev. Mol. Ce//. Biol. 3:893)

m olécula simple (monou bicuitin a). En la mem brana del end osoma,
una proteín a periféri ca de la membra na etiqueta da con ubicui
tin a,
conocid a como Hrs, facilita el reclutam iento de un conjunt o d e
tres
com plejos proteico s distinto s a la membra na. Los ESCRT( endosom
al
sorting complexes required fo r transpor t, com pl ejos de clasifi cac ión
endosóm ica requerid os para el transpo rte) incl uyen la pro teína
que
une ub icu itina TsglOl. Las proteína s ESCRT asociadas a la mem
bra -
na actúa n para impul sa r la gem ació n d e las vesícula s dirigida s hacia
el interio r del endosom a, así como para ubicar las proteína s carga
mono ub icuitin ad as específicas dentro de las vesícula s en gemació
n.
Fin alm ente, las p roteínas ESCRT se despren den de la vesícula ,
libe-
rándola, junto con las proteín as carga específi cas que contiene
, en
el endosom a. Una ATPasa conocid a como Vps4 emplea la energía
de la h idrólisis del ATP para desensa mblar las proteín as del ESCRT,

Citosol

C .
<1 "')\
V
Q Comple jo de

o desensambl aje ESCRT

FIGURA 14-33 Modelo del mecanismo para la

formación de endosomas multivesiculados. En
la formación de los endosomas, la Hrs ubicuitinada
sobre la membrana del endosoma dirige la carga de
Prote ína Hrs
\
ensam b~;:~e§~~Tr

Ubicui tina

"'~ ~□□ ~
<&> D
1 □□ rc;J
~ ADP +P,

ATP

~\\/~
proteínas carga específicas de la membra na (azul)
al interior de los brotes de vesículas y, luego, recluta
proteínas ESCRT a la membrana (paso D). Nótese
que tanto la Hrs como las proteínas ca rga rec lutadas
están etiquetadas con ubicuitin a. Después de que Proteínas carga
el conjunto de complejos ESCRT unidos media la Luz del /
compleción y el desprend imiento de las vesícu las endoso m a Vesícu la
que brotan hacia el interior (paso EJJ, estas se end osó mica
desensa mblan por acción de la ATPasa Vps4 y vuelven
al c1tosol (paso O). Véase el texto para un análisis.
!Adaptado de O Pornillos y cols., 2002, Trends Ce// 810I 12 S69)

662 CAPITULO 14 • Tráfico, secreció n y endoc itosis vesiculares

liberándolas del citosol para otro ciclo de gem ación. En el evento de
fusión que desprende una vesícula endosómica completa, las pro-
teínas del ESCRT y la Vps4 puede n funci onar como las SNARE y las
NSE respectivamente, en el proceso de fusió n de la membrana típico
analizado previamente (véase la Fig. 14- 10).
Los retrovirus brotan de la membrana plasmática
por un proceso similar a la formación de
endosomas multivesiculados
Las vesículas que brotan al interior de los endosomas tienen una to-
pología similar a la de las partículas de virus con cubierta que brotan
desde la membrana plasmática de las células infectadas por virus. Más
aún, experimentos recientes demuestran que es necesario un conjun-
to común de proteínas para ambos tipos de eventos de gemación de
membrana. De hecho, los dos procesos son tan similares entre sí en sus
detalles mecánicos como para sugerir que los virus con envoltura han
desarrollado mecanismos para reclutar proteínas celulares empleadas
en el brote endosórnico interno para sus propios propósitos.
El virus de la inmu nodeficie ncia h umana (VI H ) es un retro-
virus con cub ie rta que brota desde la membrana plasmát ica de las
l.
células in fectadas en un pro ceso impu lsado por la proteína Gag, el
co mponente estructural principal de las partículas virales comple -
tas. La prote ína Gag se une a la membrana plasmát ica de una célula
infectada y aproximadamente 4 000 moléculas de Gag se polime-
rizan en una cubierta esférica , produc iendo una estructura que se
asemeja a un brote de una vesícula que sobresale hacia el exterior
desde la membrana plasmática. Estudios de mutación hechos con
el VIH han revelado que el segmento N -terminal de la proteína
Gag es necesario para la asociación con la membrana plasmática,
mientras que el segmento C-terminal se necesita para el despren -
dimiento de las partículas de VIH completas; por ejemplo, si se
remueve la porción del genoma viral que codifica para el extremo
C-terminal de la Gag, los brotes de VIH se formarán en las células
infec tadas pero no se desprenderán y, por lo tanto, no se liberarán
partíc ulas nuevas del virus .
La primera in dicación de que la gemación del VIH emplea la
misma maquinari a mol ecular que la gemación de las vesículas en

'!> ARCHIVO DE AUDIO (INGLÉS): Gemación del VIH desde la membrana plasmática
FIGURA 14-34 Mecanismo de la gemación (a) VIH
del VIH desde la membrana plasmática. Las Envoltura de l VIH Partíc ul a de l núc leo
proteínas necesarias para la forma ción de los

~~a ~~
endosomas multivesiculados son explotadas por el
VIH para la formación del virus desde la membrana
plasmática. (a) La formación de las partículas del VIH
desde las células infectadas por este virus ocurre
:::~:'"'"
~•i---~__.□□f ~ºº~
mediante un mecanismo semejante al que se
muestra en la Figura 14-33, empleando la proteína
codificada por el vi ru s Gag y las ESCRT y Vps4
celulares (pasos 0-il). La Gag ubicuiti nada cercana
a una partícu la en gemación func iona como la Hrs.
M
:::::•pla
Véase el texto pa ra un análisis. (b) En las células
Prote ín a ' \ Ub icu itina ~ ~
IJ ~ ATP
silvestres infectadas con el VIH, las partículas del virus
brotan desde la membrana plasmática y se liberan
Gag del VIH
(l.)\ o Vps4
A DP + P1
rápidamente al espacio extracelular. (c) En las células
que carecen de la proteína ESCRT funcional Tsg 101,
la proteína Gag vi ra l forma estructuras densas
EnsamblaJ
de ESCRT
V
o ~
Desensamblaje
de ESCRT

viroides. pero no se puede completa r la gemac ión

de estas estructuras de la membrana plasmática Y
se ac umulan cadenas de brotes virales incompletos
(b) (c)
unidos a la membrana plasmática. (Wes Sundqu ,st .

p
Un, vers,dad de Urah l

14.6 Direccionamiento de las proteínas de membran a y materiales citosólicos al lisosoma 663

 , ¡ t ro (p· eJ·., una. mitocondria) fo
c1toso l o un orgánu o en e . ' rrnando
los endosomas provino de la observaci ón de qu e la Tsglül, una ,r. una ves ícula autofág1ca (F1g. 14 -35). La rn
proteína ESCRT, se une al extremo C-termin al de la proteina Gag. un auto1 agosoma 0 ern
na vesícula autofágica puede fusionarse c ·
Hallazgos ulteriores han estableci do cl ara mente el para lelismo en el b rana externa d e U . . on el
. do una vesícula grande limitada por una b·1capa
mecanismo entre ambos procesos; por ejemplo, la Gag se ubicuitin a l1sosoma entregan .
. le al interior. del hsosoma. De forma sirni'lar a
como parte del proceso de gemación del virus, y en las células con d e mem b rana s1mp
o el contemdo. de los endosomas multives·icu.
mutaciones en la Tsg l0I o la Vps4 se acumulan brotes del virus 1o que ocurre cuan d
isosoma ]as hpasas y. las proteasas dentro d
VIH , pero no pueden desprenderse de la membrana (Fig. 14-34 ). 1ad os se entregan al l ' . el
. d d a' n la vesícula autofág1ca y su . contenido a sus
Má s aún , cuando un segmento de la proteína Hrs celular se aña- l1sosoma egra ar
ulares · Las permeasas de ammoácidos en 1a
de a la proteína Gag trun cada po r la construcción del gen híbrido componentes mo 1ec
. roa permitirán luego el transporte de los arn·1.
apropiado se restablecen las adecuadas gemación y liberación de las mem b rana d e111soso
al citosol para ser usados en la síntes·1s
partículas virales. Tomados en conjunto, estos resultados indican noao 1 res nu evamente
, 'd os l'b
que la proteína Gag mimetiza la función de la Hrs, redirigiendo las de nuevas proteínas. , , .
proteínas ESCRT a la membrana plasmática, donde pueden funcio- Al estudiar mutantes defectuosos en la v1a autofag1ca, los cien.
nar en la gemación de las partículas virales. tíficos han identificado otros procesos distintos del reciclado de los
Otros retrovirus con envoltura, como el virus de la leucemia componentes celulares durante la inanición que ta~b'.én dependen
murina y el del sarcoma de Rous, también demostraron necesitar de la autofagia. Los experimentos desarrollados, prmc1palmente, en
complejos ESCRT para su gemación, si bien cada virus parece haber moscas del género Drosophila y en raton~s mostrar~n ~ue la autofa.
desarrollado un mecanismo algo distinto para reclutar los comple- gia participa en un tipo de control de calidad que ehm1~a orgánulos
jos ESCRT en el sitio de gemación viral. que han dejado de funcionar adecuadamente. En particular, la vía
autofágica puede marcar para la destrucción mitocondrias disfun-
La vía autofágica entrega proteínas del citosol cionales que han perdido su integridad y ya no tienen un gradiente
electroquímico a través de su membrana interna. En ciertos tipos
u orgánulos enteros a los lisosomas
celulares, las bacterias patógenas y los virus que se multiplican en el
Cuando las células se encuentran en condiciones de tensión, tales citosol de las células huésped pueden ser dirigidos a la vía autofági-
como la falta de alimento, tienen la capacidad de reciclar macro- ca a fin de ser destruidos en el lisosoma como parte de un mecanis-
moléculas para emplearlas como nutrientes en un proceso de de- mo de defensa del huésped contra la infección.
gradación lisosómica conocido como autofagia ("comerse a sí mis- Para cada uno de estos procesos, y en todos los organismos euca-
mo"). La vía autofágica implica la formación de una estructura de riontes, la vía autofágica ocurre en tres pasos básicos. Aunque los me-
copa con doble membrana aplastada que envuelve una región del canismos subyacentes para cada uno de estos pasos se comprenden

~
Mitocondria Atg12
~ y
~~
Vías autofágicas

(g/
Atg5,Atg16

Vesícula AtgB
autofágica
D

FIGURA 14-35 La vía autofágica. La vía autofágica permite que las (paso D). La fusión de la membrana externa con la membrana de un lisosorna
proteínas citosólicas y los orgánulos sean entregados al interior del lisosoma libera una vesícula con una sola capa y su contenido al interior del lisosoma
pa ra su degradación. En la vía autofágica se forma una estructura con form a . de la degradac1·on · de os componentes proteicos y
. , . f1) Después
(paso 1

de copa alrededor de porciones del citosol (a /a derecha) o un orgánulo lip1d1cos por h1drolasas al interior del lisosoma, los am inoácidos li berados
como una mitocondria, según se muestra aqu í (a /a izquierda) . La adición son tr_ansportados a través de la mem brana del lisosoma al citosol. Entre las
contin ua de mem brana fina lmente conduce a la fo rmación de una vesícula prote1nas que se sabe que participan en la vía autofágica se incluye la Atg8,
de autofagosoma que envuelve su contenido con dos membranas completas que forma una estructura de cu bierta alrededor deI autofagosoma.

664 CAPITULO 14 • Tráfico, secreción y endocitosis vesiculares

 ismos
escasamente, se pi ensa que está n relac ionado s con los mecan
básicos para el transpo rte de vesícul as analiza dos en este capítul o. CONCEPTOS CLAVE de la Sección 14.6

vesícula au- Direc ciona mient o de las prote ínas de memb rana
Nucleación de vesícula s autofágicas Se cree que una
rofágica se origi na a_part ir d e un fr agm ento de un orgánu lo
rodead o y mater iales citosólicos al lisosoma
sido difícil de rastrear degrada-
de membr ana . El origen de esta m emb rana ha • Las proteín as de la membr ana endocit adas desti nadas a la
ocen proteín as integra les de la membr ana -las radas a vesícula s qu e brotan al interior
porque no se con ción en el lisosoma son incorpo
servi r para identif icar el origen de esta mem b rana- mas multive siculad os que contien en muchas
cuales podrían del endosoma. Los endoso
ica . en-
que res ulten necesar ias para la formac ión de la vesícula autofág de estas vesículas interna s pueden fusiona rse con el lisosom a para
Est udios hechos en levadu ras han mostra do que alg unos mutant es de este (véase la Fig. 14-32 ).
tregar las vesículas al interior
tránsito en el aparato de Golgi tambié n tienen
defectu osos en el median
ica • Algunos de estos compon entes celulares (p. ej., ESCRT) que
defecw s en la autofagia , lo cual sugiere que la vesícula autofág micas se emplea n en la
nto del aparato de Golgi. La au - el brote hacia dentro de las membr anas endosó
deriva 1moal~ ente d_e un_ fragme cubiert a, tales como el
inanici ón parece ser un proceso ' fi
1co genación y el despren dimien to de los virus con
tofag1a mduc1d a por ., . no espec1 células infectad as por los
ndo los VIH, desde la membr ana plasmática de las
en el cual una porc10 n cualqu iera del citopla sma, incluye
por un autofag osoma . En estas situacio nes, virus (véanse las Figs. 14-33 y 14-34 ).
orgán ulos, es envuel ta
ej., una
el sitio de la nucleac ión probab lement e sea azaroso . En casos en los · Una porción del citoplasma de un orgánu lo comple to (p.
a y ser,
cuales los orgánu lo s d efectuo sos son envuelt os por el autofag osoma mitoco ndria) puede estar envuelta en una membr ana aplanad
superfi cie membr ana.
deberá haber algún tipo de señal o sitio de unión sobre la finalmente, incorpo rada a una vesícula autofágica de doble
el conteni -
del orgánu lo para dirigir la nucleac ión de la vesícul a autofág ica. La fusión de la membr ana externa con el lisosoma entrega
ción (véase la Fig.
do envuelto al interior del lisosoma para su degrada
La nueva
Crecimiento y compl eción de la vesícula autofá gica 14-35).
para
membr ana debe ser entrega da a la membr ana del autofag osoma
lo en forma de copa crezca . Este crecim iento proba-
que este orgánu
rte con la
blemen te ocurra por la fusión de las vesículas de transpo
es de
membr ana del autofag osoma . En rastreo s genétic os en mutant
levadu ras defectu osas en la autofag ia se han identifi cado
alreded or Perspectivas para el futur o
autofag o-
de trein ta proteín as que partici pan en la formac ión de los tada en
la Fi gura La inform ación bioquím ica, genétic a y estruct ural presen
somas; u na de estas prote ínas es la Atg8, que se muestr a en s una compre nsión básica
se une a la este capítul o muestr a que ahora tenemo
14-35 y está ligada al lípido fosfatid iletano lamina y, así , as fluye de un compa rtimien -
ión de la del modo en que el tránsito de proteín
!amela citoplasmátic a de la vesícul a autofág ica . La asociac a otro. Nuestr a compre nsión de
en capa- to celular limitad o por membr ana
Atg8 con una vesíc ula de membr ana parece ser el paso clave sobre la
ento. estos proceso s provino en gran medida de experim entos
citar la ves ícula para fusiona rse con el autofag osoma en crecimi vesícul as de transpo rte. Estos estudio s
osoma función de varios tipos de
La fu sión d e las vesícul as que contien en Atg8 con el autofag de mucho s compo nentes vesicu-
, Atg5 y han conduc ido a la identifi cación
implica la fo rmació n de un ensamb le citosóli co de Atgl2 conjun to
conjun to lados y al descub rimient o del modo en que ellos operan en
Atgl 6. La Atg 12 es d e estruct ura similar a la ubicuit ina, y un de vesícul as para incorp orar el conjun -
ina es para conduc ir la gemaci ón
de pro te ínas relac io nadas a las enzima s qu e conjug an ubicuit desde el orgánu lo donant e y, luego,
te un to correct o de molécu las carga
respons able de la unión covalen te de la Atgl2 a la Atg5 median vesícul a comple ta con la membr ana de
covalen tement e la ubicuit ina para mediar la fusión de una
proceso sim ilar al emplea do para unir
dímero covalen tement e un orgánu lo diana.
a una proteín a d iana (véase la Fig. 3- 29 ). El er
la Atgl6 para formar un A pesar de estos avances, todavía queda mucho por aprend
unido Atg l 2-Atg5 se co ensamb la luego con ra y endocí tica. Por
acerca de etapas import antes de las vías secreto
osomas
comple jo p olimér ico localiz ado con el sitio de los autofag cubiert as
smo descon ocido, ejempl o, aún ignoram os qué tipo de proteín as forman las
en crecim iento. Se cree que, median te un mecani secreci ón que bro tan
de las vesículas regulad as o constit utivas de la
la fusión con las vesícul as que
este com plejo citosól ico lleva a cabo desde la red trans-Golgi . En el mismo sentido , ignora mos qu é carac -
contien en Atg8 en un autofag o soma con forma de copa. determ ina si b rotará
terístic a de la membr ana del aparato de Golgi
a cubie rt a de cla -
de ella una vesícula cubiert a COPI o una vesícul
El direc ci onam iento de la vesícu la autofá gica y su fusión Se cree a ARF a la mem -
e un trina/P A. En ambos casos, la unión de una proteín
que la mem b ra n a externa del autofag osoma comple to contien brana del aparato de Golgi parece iniciar la gemaci ó n de
la vesícula .
ana del
conjun to d e p ro teín as qu e dirigen la fusión con la membr Aún más, los tipos de señales de las p ro teínas carga qu
e p ueden
rado ser
lisosom a. Dos p roteí nas d e unión a la vesícul a han demost etiquet arlas para ser empaq uetada s en vesícu las d e secrec ió n aún
a, pero
necesa r ias para Ja fu si ó n del autofag osoma con el lisosom no se han definid o. Otro proceso desco ncer tante es la
fo rmació n
o las proteín a s SNARE corresp ondien tes. La
no se ha n id en tificad de vesículas que brotan desde el citosol , tales como las qu
e entran
a con el lisoso ma ocurre despué s de que la
fusi ón del autofag o so m a lo s endoso mas m ulti ves icu lado s. Si bien algun as de las prote ín as
m b rana po r escis ión p ro teolític a, y este
Atg8 se ha libera d o de la me que part icipa n en la fo rm ació n de estas vesícul a s endosó m icas " in-
la vesícul a autofág ica ha fo r-
paso de proteól isis o cu r re so lo cuando ternas " se conoce n , no sabemo s q ué es lo que determ ina su fo rma
de do ble m embran a sellado . Así ,
mado co mpleta m ente u n siste ma o q ué tipo de proceso hace que se despre ndan de la membr
a na do -
s de fu sió n y evitar la
la proteín a Atg8 pa rece enm ascara r p roteína nante . De forma si m ilar, el o rigen y el crecim ie nto de la membr ana
fu , ión premat ura d el a utofago so m a co n el lisosom a.

Per spect ivas para el futuro 665

 V'

de la vesícu la autofágica se comprend en tambi é n escasa m en te. En e l 2. El brote de la s vesí cul as está aso ciado con las proteínas de cubi erta.
futuro , estos y otros pasos esca samente co mprendidos del tránsito ¿Cu::\ I es el pape l de las pro tdnas de cubi e rta en el brote de las vesí-
,
de vesículas deberían po der anali zarse a través del uso de la mis- cu 1as . ¿0 e q u é 111 0 do se reclutan las proteí na s de la cubierta.
en la
s
ma co mbi nació n poderosa de m étodos bioquímicos y gené ticos qu e , Q
mem b ran as . ¿ u I é t'pos de moléculas es probable qu e sean incluido
s
han delin eado las partes o perativas de las vesícu las d e COPI, COPII o exc l u1'd os d e 1as ves1'cul as recién formadas ? ¿Cuál es el ejem plo rne .
. .d d
y clatrin a/ PA . JOr co noc1 o e una p roteí n a que probablemen te esté implicada en la
Ade m ás de comprender los m eca nismos básicos que dirigen el liberació n de las vesículas?
tránsito de las proteín as carga en las vías secretora y endocítica , un . d I s ce'lulas con la droga brefeldina A (BFA) tiene
3. El tratamiento e a
objetivo central de la investigació n en esta área es definir todas las
e1 etecto e quitar 1a cu bierta, a las membranas d el apara to de Golgi,
e d •
señales que dirigen las proteínas a locacio nes intracelulares especí- a célula en la cual la gran m ayo rí a de las
d an d o como resu ltado Un
ficas . Aunque un núm ero de secuencias de este tipo se conoce (véase , d l ato d e Golgi se encuentra en el RE. ¿Qué inferencias
protemas e apar .
el Cuadro 14-2 ), ape nas h emos comenzado a compilar un catálogo . d e esta observación con relación a los pa peles de
pue d e h acer a par t 1r .
de estas señales de d ireccionamien to y del contexto en el cual se las proteínas d e la cubierta , además de la promooó n de la f~rmación
leen . El objetivo último será deducir, comenzando por la secuencia de vesículas? Prediga qué tipo de mutación en la Arfl podna tener el
de codificació n primaria de un gen dado cualquiera, el patrón de
mismo efecto que trata r las células con la BFA.
trá nsito y la localización intracelular del producto génico proteico .
4. La microinyecció n de un anticuerpo conocido co mo EAGE que
Nuestra capacidad d e extraer completamen te la información bioló-
reacciona con la región de la " bisagra" de la subunidad ~ de la COPl
gica de la secuencia s genómicas será comprendida solamente cu an -
provoca acumulación de las enzimas del aparato de Golgi en las ve-
do tengamos la capacidad de leer la información del tránsito desde
sículas de transporte e inhibe el transpo rte anterógrado de vesículas
las secuencias primarias de las proteínas .
recién sintetizadas desde el RE hacia la membrana plasmática. ¿Qué
efecto tiene el anticuerpo sobre la actividad COPI? Explique los re-
sultados .
S. La especificidad en la fusión entre las vesículas implica dos proce-
Palabras clave sos discretos y secuenciales. Describa el primero de los dos procesos
y su regulación por las proteínas interruptoras GTPasa . ¿Qué efecto
sobre el tamaño de los endosomas tempranos podría resulta r de la
complejos PA manosa 6-fosfato (M6P) 648 sobreexpresió n de una forma mutante de la Rab5 que está fijada en el
(proteína adaptadora) 646 endosomas estado unido a GTP?
transportador anterógrado 640 multivesiculad os 661 6. Secl8 es un gen de las levaduras que codifica NSF. Es una clase de
proteína ARF 635 proteínas Rab 638 mutante C en la vía secretora de las levaduras. ¿Cuál es el papel mecá-
autofagia 661 endocitosis mediada nico de la NSF en el tránsito de la membrana? Según lo indica su geno-
maduración d e la cisterna 629 por receptor 655 tipo de la clase C, ¿por qué una mutación NSF produce acumulación
clatrina 634 secreción regulada 651 de vesículas en la que parece haber solo una etapa de la vía secretora?
secreción constitutiva 651 transporte retrógrado 640
7. ¿Qué característica de la síntesis del procolágeno evidenció precoz-
COPI 634 mutantes sec 632
mente el modelo de maduración de las cisternas de Golgi?
COPII 634 vía secretora 627
dinamina 64 7 señales de clasificación 637 8. Las señales de clasificación que causan el transporte retrógrado
vía endocítica 627 transcitosis 654 de una proteína en la vía secretora se conocen en ocasiones como
red trans-Golgi (RTG) 629 secuencias
. de recuperació
. n · Haga una list a d I d · los co-
proteínas ESCRT 000 e os os eJemp
noodos de secuencias de recuperación para 1
endosoma tardío 629 vesíc ulas de transporte 627 pro emas so u es y d~
t , bl ,
lipoproteína t-SNARE 634 membran a del RE . ¿De qué m an era la presencia de una secuenc ia de
v-SNARE 634 recuperación en una proteína soluble del RE 1
de baja densidad (LDL) 656 ·, d d resu ta en su recu per:1·
oon es e e1 comple¡·o cis G 0 1 ·, D .
- g1. escriba el m o d o en que el con ·
cepto de una secuencia d e rec •ó
. uperac1 n es esencial para el modelo de
maduración de la cisterna .

Revisión de los conceptos 9. Los complejos de prote'111 d

d. ª ª aptadora de la clatrina (PA ) se unen
irecbt~m~nte a la cara citosólica de las proteí n as de la mem brJn :1 Y
l. Los estudios de Palade y sus colegas usaron el marcado de pulso tam 1en mterac túan con la el t •
y caza de aminoácidos radiactivamen te marcados y de autorradio-
. ª nna. ¿C uales , . ·
son los cu atro com ple¡os
proteicos adaptadores conocid , ·Q , . ¡
.
grafía para visualizar la localización de las proteínas recién sintetiza- PA3 sugiere que 1a clatrina es os. ¿ ue observació
,
n co n respecto a a
.
u na protema accesor ia a una cubierta
das en las células acinosas pancreáticas. Estos experimentos iniciales centra1compuesta de proteínas ad
ap ta d oras?
proporcionaro n información muy valiosa acerca de la síntesis pro- 10. La enfermed ad de las cél l·
, .
te ica y el transporte interco mpart im ental. Los nuevos métodos han . u as I es un e¡emplo cl ásico de u n defecto
hum ano heredado en el direcc ·1 nd. . .
reemplazado estos enfoques in ic iales, pero aún so n necesarios dos o n11ento de las proteín as que afedJ
una c1ase entera de proteí na - ¡ ·
requisitos b ás icos, para cualquier ensayo, a fin de estud iar este tipo de ¡d f . 's, as enzimas solubles de l lisosom a. ¿Cua'I
es¡ de . e ecto molecular en la enfermedad de las células¡, ·Q ué afe cta
transporte proteico. ¿Cuáles son y cómo los enfoques exper ime ntales e 1recc 1onam1e nt o de un a 1 • l .
recientes sat isfacen sus criterios? . case entera de proteín asi •Qué otros ti ·
pos d e mut act0 nes podría produ · . . · l
cir e 1mismo fenotipo?

666 CAPITULO 14 • Tráfico, secreción y endocitosis vesiculares

 J. La RTG , la red tra ns-Golgi , es el si ti o de múltiples procesos de lfpido fluorescent e, los llpidos con fluorescencia se di luía n y dis minuí a
1
clasificaci ón a med ida qu e las pro teína s y los lípidos sa len del com - el au toapagado. Tres conjuntos de li posomas se prepararon empleando
plejo de Golgi. Compare )' contraste la cl asifi caci ~n de proteínas a los comp lejos t-SNARE de las levad uras: con t-SNARE de la membrana
lisosom as con el empaquetamient o de las prote111as en los grá nul os plasmática, co n t-SNARE del aparato d e Go lgi y con t-SNARE vac uolar.
secretores regul ados, tales como los que co nti enen insulina. Compare Cada uno de ellos se mezcló co n liposomas fluorescentes que co nte-
contras te la clas ificación de proteínas a las superficies celulares ba- nían una de tres v-SNARE diferentes de levadu ras. Se obtuvieron los
:olateral y apical en las células MDCK y a los hepatocitos. sigui entes datos:
vesi-
12 . ¿Qu é revela el brote de los virus de la gripe y de la estomatitis
cu lada (VSV) de las células MDCK polarizadas acerca de la clasifica- v-S NARE 3
v-SNARE 1 v-SNARE 2
ción de las proteínas de la membrana plasmática recién sintetizadas
hacia los dominios apical o basolateral? Considere ahora el siguiente tSNARE =
ro membrana
resultado: un péptido con una secuencia idéntica al dominio cito- "ü
plasm áti ca
e:
plasmático de la proteína G del VSV inhibe el direccionamiento de Q)
u
(J)
la proteína G a la superficie basolateral y carece de efecto en el direc- Q)

cionamiento de la HA a la membrana apical, pero un péptido en el

o
::,
;:¡::
cual un único residuo de tirosina está mutado a una alanina no tiene ~ tSNARE = Golg i
efecto sobre la proteína G en su direccionamiento a la cara basolate- Q)
"O
ral. ¿Qué le dice esto acerca del proceso de clasificación? "O
ro
"O
·¡¡;
13. Describa el modo en que el pH desempeña un papel en la regu- e:
Q) tSNARE =
lación de la interacción entre la manosa 6-fosfato y el receptor de la e vacu o lar
manosa 6-fosfato. ¿Por qué el aumento del pH de los endosomas lle-
va a la secreción de enzimas lisosómicas recién sintetizadas al medio
extracelular? Tiempo después de la mezcla
14. ¿Qué características mecánicas se comparten entre (a) la forma-
ción de endosomas multivesiculados por gemación al interior del en- a. ¿Qué puede deducirse de estos datos acerca de la especificidad de
dosoma y (b ) la gemación hacia el exterior del VIH en la superficie los eventos de fusión de la membrana?
de la célula? Usted desea diseñar un péptido inhibidor/compe tidor
b. ¿Dónde podría esperar encontrar v-SNARE l, 2 y 3 en las leva-
de la gemación del VIH y decide mimetizar en un péptido sintético
duras?
una porción de la proteína Gag del VIH. ¿Qué porción de la proteína
Gag del VIH sería una elección lógica? ¿Qué proceso celular normal c. ¿Qué clase de experimento diseñaría para determinar en qué lu-
bloquearía este inhibidor? gar de la vía secretora se requeriría un v-SNARE in vivo?

15. Las vías fagocítica y autofágica cumplen dos funciones fundamen -
tales, pero ambas entregan sus vesíc ulas al lisosoma. ¿Cuáles son las
diferencias fundame ntales entre ambas vías? Describa los tres pasos
básicos en la formación y la fusión de las vesículas autofágicas.
16. Compare y contraste la ubicación y la sensibilidad al pH de la
interacción receptor-ligando de las vías de endocitosis mediada por
receptor (EMR) de la LDL y la transferrina.
17. ¿Qué revelan las mutaciones del dominio citoplasmático del re -
ceptor de LDL (LDLR) que provocan hipercolesterolem ia familiar
acerca de la vía de la endocitosis mediada por receptor (EM R)?
d. El dominio citoplasmático de la v-SNARE 2 se ha expresado y
purificado a partir de E. coli. Cantidades variables de este dominio se
incubaron con los liposomas de t-SNARE de Golgi o con liposomas
v-SNARE 2; luego, los liposomas se lavaron y quedaron libres de pro -
teína unida . Los distintos liposomas se mezclaron según se indicó y se
midió la fluorescencia de cada muestra una hora después de mezcladas.
¿De qué manera podrían explicarse los datos? ¿Cómo podría p redecir
el resultado si las levaduras sobreexpresaran el dominio citoplasmát ico
de la v-SNARE 2?

~ ro ~ ~ - - - - - - - - - Liposomas v-SNARE 2 incubados con el

~ ·uc:-
',,.._ dominio citoplasmático de v-SNARE 2 y ,
-o Q) ,.._ luego, mezclados con liposomas de
Análisis de los datos ~
ro u
gJ
,.._ t-SNARE del Golgi
......
l. Para examinar Ja especificidad de la fusión de membrana conferida
~ o ' , Liposomas de t-SNARE de Golgi incubados
2~ con el dominio citoplasmát ico de v-SNARE 2
por las v-SNARE y t-SNARE específicas, los investigadores reconsti- e: - Y, luego, mezc lados con liposomas con
v-SNARE 2
tuyeron liposomas (membranas lipídicas artificiales) con complejos ~------ -----
t-SNARE O v-SNARE específicos (véase McNew y cols., 2000, Nature Cantidad añadida de dominio
407:153-159 ). Para medir la fusión, los liposomas con v-SNARE tam- citoplasmático de v-SNARE 2
bién contenían un lípido fluorescente a una concentración relativa-
mente elevada, de modo tal que su fluorescencia se autoapagaba (el au - 2. Usted ha diseñado genéticamente una proteí na flu o rescente verde
toapagado es la reducción de la fluorescencia relativo a lo esperado. En (PFV) que contiene la secuencia KDEL. Cuando el constructo es tran s-
este caso, el autoapagado ocurre porque los lípidos fluorescentes están ferido a fi broblastos humanos normales y exami nado al microscopio
demasiado concentrados e interfieren con la capacidad del resto como de fluorescencia se ve fluorescencia en todo el citoplasma, según se
para excitarse). AJ fusi o narse estos liposomas con los que carecían del muestra más abajo.

Análisis de los dato s 667

 fibroblastos de sus padres (columnas I y 2) y de sus hermanos ( 1
* courn
anos empleando método de transferencia,.,
nas 4 a 6 ), todos S , . •vestern ·
anticuerpos contra N-acetilglucosamina fosfotransfe rasa ( ~ ¡45 kD )
. . a11,
actin a ( control carga, - 43 kDa ) , se o bserva 1o s1gu1ente: .

s~
rz,v
o'
~
~º
<l
~~
o'°
<:]>
' 2 3* 4 5 6

150 kDa
-- - - - - - -
--
a. ¿Cóm o explicaría este patrón, dado que se supone que KDEL es 102 kDa
una secuencia de clasificación específica para el RE? 86 kDa

b. Para analizar los resultados más ampliamente se reunieron frac-
ciones de diferentes orgánulos y del citoplasma a partir de células que
expresaban este constructo de PFV que contenía KDEL y, luego, se exa-
minaron con el método de transferencia Western empleando anticuer-
pos contra la PFV (de 27 kDa) y la proteína isomerasa disulfuro (POI ),
una proteína residente del RE rugoso (RER) de, aproximadamente,
55 kDa.
- - - ----
49 kDa
31 kDa
En un segundo conjunto de experimentos, la N -acetilglucosamina fos-
fotransferasa se aisló de las células del niño afectado y de sus padres,
sanos, y se empleó en un ensayo con 32 P para medir la actividad enzi-
mática y la producción de manosa 6-fosfato. El ensayo dio los siguien-
tes resultados:

150

90 kDa - 125

72 kDa -

66 kDa

40 kDa

21 kDa
-

- - - - ~
s
en
o ....J
". E
(O ---
<1l
¡g
e:
<1l
O)
:i
100

75
O Pa dre
X Niño
2 O Madre
50

La transferencia confirm a la p resencia de PFV exclusivamente en el 25

citoplasma y, como se esperaba, una señal POI en la fracción RER.
¿Cómo explicaría la banda de POI, aunque débil, en la fracción de Gol-
o
gi? Dada la función de las proteínas POI, ¿qué esperaría si ambos alelos o 5 15 30 60 120 240
de un gen de PO I estuvieran inactivados en un ratón?
Tiempo (min) a 37 ºC
c. Los anticuerpos empleados más arriba no detectan ninguna se-
ñal en la fracción nuclear, lo cual indica su especificidad o el hecho de
que no se aislaron proteínas y se cargaron en el carril de la fracción nu-
clear. ¿Qué anticuerpo debería usarse para mostrar que había proteínas
nucleares presentes en esta muestra? ª· A partir de fibroblastos cultivados del niño, diseñe un experi-
mento
. empleando
. ant·icuerpo d e N-acetilglucosamina
. fosfotransi,cerasa
3. Un niño parece estar afectado por la en fermedad de las células 1, Y m1croscop1a de fluo · .
. rescenc,a y extra iga los resultados que perrnitaO
pero cuando la muestra de sus proteínas (columna 3*, abajo), aisladas explicar por qué el n mo
· - presenta smtomas
, . .
similares a los de l·a enfrr
de fibroblastos de la piel, se compara con las muestras de pro teínas de medad de células I.

668 CAPITULO 14 • Tráfico, secreción y endocitosi s vesicula res

 b. V~d,,, lo~ re•,ultad,J'> de <:~tr,., trc., experimento,, ¿cómo explica-
rlalo, ;ín tc,rniJ .. dt la énformcdad de célula~ 1 pre~entc~ en el niño y qué
c-xperim<:nlíJ propondría para probar su hi póte,i,í!>?
c. Una mí,mfotíJgrafía confocal de barrido l~er de 1~ células
MUCK marcadas wn un antícuc-rpo contra el receptor de manosa
1;-ír,,fat/J muc:~tra lo ~íguícntc:
Superficie apical
'¡f l_)\~J-\ J
Superfici e basa l
;Cómo explicaría el marcado de las superficies apical y basolateral para
un rec<:ptor cuya fu nción es di rigir las enzimas desde la red tra ns-Golgi
/RTG) hacía el lisosoma? De modo similar, ¿q ué explica la marca vista
en el RER?
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670 CAPÍTULO 14 * Tráfico, secreción y endocitosis vesiculares

 • •
Segu1m1ento de una proteína hacia el exterior de la célula
J Jarn1eson y G. Palade. 1966, Proc Natl. Acad Sci. USA 55(2):424- 43 1
a llegada de la m icroscopia electrónica
L perm itió a los investigadores ver la célu-
la y sus estructuras con un nivel de detalle
sin precedentes . George Palade empleó esta
herramienta no solo para mirar los detalles
finos de la célula, sino también para analizar
el proceso de secreció n . Combinando la m i-
croscopia electró n ica con los experimentos
de pulso y casa, Palade descubrió las vías que
las proteínas segu ían para salir de la célula.
Antecedentes
Además de sintetizar proteínas para llevar
a cabo funcion es celulares, muchas células
también producen y secretan proteínas adi-
cionales qu e desempeñan sus tareas fuera de
las células. Los biólogos celulares, incluido
Palade, se preguntaron cómo las proteínas
secretadas pasaban desde el interior hacia el
exterior de la célula. Los experimentos ini-
ciales que sugerían que las proteínas desti-
nadas para la secreció n se sintetizan en una
localización in tracelular particular y, luego,
siguen una vía hasta la superficie celular em-
pleaban métodos que rompían las células
que sintetizaban una proteína secretada en
particular y separaban sus diferentes orgá-
nulos por centrifugación. Estos estudios de
fraccionamiento celular mostraron que las
proteínas secretadas pueden encontrarse en
vesículas rodeadas por m embran a derivadas
del retículo endoplas mático (RE ), donde se
sintetizan, y dent ro de los gránulos de zimó-
geno, desde do nde, finalmente, se liberan.
Desafortunadamente, los resultados de estos
estudios resultaban difíciles de interpretar
debido a las dificultades para obtener una
separación lim pia de todos los diferentes or-
gán ulos que cont ienen proteínas secretadas.
Para escla recer adicionalmente la vía, Palade
se volvió hacia una técnica recién d esarro-
llada: la auto rradiografía de alta resoluc ión ,
que le permitió detectar la posición de pro-
teínas marcadas radi activamente en cortes
finos de células q ue hab ían sido preparadas
para el microscopio electró nico de orgánul os
intracelulares. Su trabaj o cond ujo al hallazgo
fundamental de que las proteínas sec retadas
viajan dentro de vesículas desde el RE hacia
el complejo de Golgi y, luego, a la membrana
plasmática.
El experimento
Palade deseaba identificar qué estructuras y
orgánulos celulares participaban en la secre-
ción de las proteínas. Para estudiar tal proce-
so complejo escogió cuidadosamente un sis-
tema modelo apropiado para sus estudios, la
célula exocrina pancreática responsable de la
producción y la secreción de grandes cantida -
des de enzimas digestivas. Dado que estas cé-
lulas tienen la propiedad inusual de expresar
solo proteínas secretadas, una marca general
para una proteína recién sintetizada, tal como
la leucina marcada radiactivamente, solo se-
ría incorporada a moléculas de proteína que
siguieran la vía de secreción.
Palade examinó en primer lugar la vía de
secreción de la proteína in vivo, inyectando
a cobayas vivas [3 H]-leucina, que fue incor-
porada a las proteínas recién sintetizadas,
marcándolas radiactivamente. En distintos
momentos, desde 4 minutos hasta 15 horas,
sacrificó a los animales y fijó el tejido pan-
creático. Sometiendo las muestras a autorra-
diografía y visualizándolas en el microsco-
pio electrónico pudo seguir la localización
de las proteínas marcadas en las células en
diferentes momentos. Como esperaba, la
radiactividad se localizaba en vesículas en
el RE en momentos puntuales - inmedia-
tamente después de la inyección de [3H] -
leucina- y en la membrana plasmática en
los últimos puntos de tiempo. La sorpresa se
produjo en los puntos temporales interme-
dios. Más que viajar linealmente desde el RE
hasta la membrana plasmática, las proteínas
marcadas radiactivamente parecían detener-
se en el complejo de Golgi en el medio de su
viaje. Además, no hab ía un momento en el
cu al las proteí nas radiomarcadas no queda -
ran confinadas en las vesículas.
La observaci ón de que el complejo de Gol -
gi estaba involucrado en la secreci ón de las
proteí nas resultó tan sorprendente co mo
in tr igante. Para establecer completamen-
Seguim iento de una proteína hacia el exterio r de la cé lula
EXPERIMENTO CLÁSICO 14.1
te el papel de este orgánulo en la secreción
de proteínas, Palade se valió de los exper i-
mentos de pulso y caza in vitro, que le per-
mitieron una monitorización más precisa
del destino de las proteínas marcadas . Con
esta técnica de marcado expuso las células al
precursor radio marcado -en este caso, [3H )-
leucina- durante un período breve, cono-
cido como el pulso. El precursor radiactivo
fu e reemplazado luego con una form a no
marcada, para el período ulterior de caza.
Las proteínas sintetizadas durante el período
de pulso estarían marcadas y se detectarían
por autorradiografía, mientras que aquellas
sintetizadas durante el período de caza , las
cuales no estarían marcadas, no se detecta-
rían . Palade comenzó cortando el páncreas
de cobayas en lonchas gruesas que, luego,
fueron incubadas durante tres minutos en
un medio que contenía [3H]-leucina. Al fi-
nal del pulso, añadió un exceso de leucin a
no marcada. Luego, las lonchas de tejido fue -
ron fijadas para autorradiografía, o bien se
usaron para el fraccionamiento celular. Para
asegurarse de que sus resultados fueran un
reflejo preciso de la secreción de proteína in
vivo, Palade caracterizó meticulosamente el
sistema. Una vez convencido de que su sis-
tema in vitro mimetizaba con precisión la
secreción de proteínas in vivo, procedió al
experimento crítico. Hizo pulso de m arcado
en lonchas de tejido con [3 H]-leucin a dura n-
te tres minutos y, luego, hizo caza de la mar-
ca durante 7, 17, 37, 57 y 11 7 minutos con
leucina no marcada. Nuevamente, la radiac-
tividad confinada en las vesículas comenzaba
en el RE, viajaba en vesículas al co mplejo de
Golgi y perm anecía en las vesículas a medida
que pasaban a través del aparato de Golgi y a
la membrana plasmát ica (véase la Fi g. l ). A
medida q ue las vesíc ul as viaj aban más lejos a
lo largo de la vía, se volvían más de nsamen te
empaquetadas co n la proteína radiac tiva. A
partir de esta notable serie de auto rradiogra -
m as en d ifere ntes momentos de caza, Pa lade
concl uyó que las prote ín as secreta das via jan
en vesículas desde el RE hacia el aparato de
Golgi y a la membra na plas mática )' que , a lo
largo de este proceso, permanecen en vesícu -
las y no se mezclan con el resto de la célula.
671
 (b)
secretorias pancre áti-
FIGURA 1 Síntesis y movim ient o de las prot eínas
diogra fía m icroscópica electró nica. Después
cas de cobayas en autorra
miscoscopio
del marcado con [3HJ _leucina, se tija el tejido, se corra 3para
ión del [ H] en las proteínas
electrónico y se fotografía. La semidesintegrac
gránulo s en la emulsió n, densos y sim ilares a gusanos,
sintetizadas produce
nulos están sobre el RER. (b)
que marcan su posición. (a) A los 3 minutos, los grá
parte está en el Golgi. (c) A los 37 minutos , la mayor
A los 7 minutos, la mayor
minutos, la mayor
parte se encuentra en vesículas inmaduras. (d) A los 117
G. Palade.)
parte está en gránulos de zimógeno. (Cortesía de J. Jamleson y

(d)

Análisis
Los experimentos de Palade proporcionaro n
a los biólogos la primera mirada clara sobre
las etapas de la vía de secreción. Sus estudios
sobre las células exocrinas del páncreas faci-
litaron dos observaciones fundamentales. La
primera, que las proteínas secretadas pasan a
través del complejo de Golgi en su camino ha-
cia el exterio r de la célula: esta fue la primera
función asignada al complejo de Golgi; la se-
gunda, que las proteínas que serán secretadas
nunca se mezclan con las proteínas celulares
del citosol, sino que se segregan en vesícul as
durante todo el camino. Estos hallazgos fue-
ron obtenidos a partir de dos aspectos impor-
tantes del diseño experimental. El cuidad oso
uso de Palade de la microscopía electrónica
y la autorra diografía le permitió mirar los
detalles finos de la vía. De igual importancia
fue la elecció n del tipo celular destina do a la
secreción, la célula exocrin a pancreática como
sistema modelo . En un tipo celular distinto,
cantida des significativas de proteínas no se-
cretadas tambié n se hubier an producido du-
rante el marcad o, oscureciendo el destino de
las pro teínas secreta das en particular.
El trabajo de Palade estableció las bases
para estudios m ás detalla dos. Una vez que
la vía secreto ra fue descri ta con claridad ,
campo s entero s de investi gación se abrieron
para investi gar la síntesi s y el movimiento de
proteín as secreta das tanto como el de pro-
teínas de m embra na. Por este trabajo fun -
dam ental, Palade recibió el premio Nobel de
Fisiolo gía y Medicina en 197 4.

res
6 72 CAPÍTULO 14 • Tráfico, secreció n y endocit osis vesicula