UNIVERSIDAD MILITAR NUEVA GRANADA

Preparación de soluciones Buffer y sus aplicaciones bioquímicas

Identificación:
GL-AA-F-1

Guías de Prácticas de Número de

Revisión No.:
Páginas:
Laboratorio 2
11

Fecha Emisión:
2018/01/31

Laboratorio de:
BIOQUÍMICA

Título de la Práctica de Laboratorio:

Preparación de soluciones Buffer y sus aplicaciones bioquímicas

Elaborado por: Revisado por: Aprobado por:

Catalina Rozo Lugo. M.Sc. Laura Cerón Rincón, M.Sc. Comité Asesor de
Departamento de Química
Maria Claudia Sandoval D.
Sc.
Directora Departamento de
Química
Docentes Departamento de
Química

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​Control de Cambios

​Fecha de
​Descripción del Cambio ​Justificación del Cambio Elaboración /
Actualización

Se ajustaran las ​Estos cambios se plantean ​Diciembre 2022

concentraciones y cantidades de acuerdo a la
esperadas de cada mezcla de disponibilidad de los
sistemas buffer. reactivos e instrumentos.

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1. FACULTAD O UNIDAD ACADÉMICA: Facultad de Ciencias Básicas y Aplicadas

2. PROGRAMA: Ingeniería Ambiental

3. ASIGNATURA: Bioquímica

4. SEMESTRE: Cuarto

5. OBJETIVOS:

● Repasar y afianzar los conocimientos previos y el manejo matematico en la

preparación de disoluciones buffer.
● Analizar la capacidad buffer de sistemas utilizados en aplicaciones
bioquímicas.
● Aprender el manejo y uso del pH metro en el laboratorio.

6. MATERIALES, REACTIVOS, INSTRUMENTOS, SOFTWARE, HARDWARE O

EQUIPOS DEL LABORATORIO:

DESCRIPCIÓN (Material,
UNIDAD DE
reactivo, instrumento, software, CANTIDAD
MEDIDA
hardware, equipo)

Balanza analítica 1 unidad

Potenciómetro o pH-metro 4 unidad

Vidrios de reloj 8 unidades

Goteros o pipetas Pasteur 8 unidades

Beakers de 50 mL 12 unidades

Beakers de 100 mL 12 unidades

Pipetas aforadas de 5,00 mL 8 unidades

Micropipeta 100-1000 μL 4 unidad

Frasco lavador con agua destilada 4 unidad

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Balón aforado 50 mL 4 unidad

Balón aforado 10 mL 8 unidad

HCl 0,5 M 20 mL

NaOH 0,5 M 20 mL

Na2HPO4 3 g

NaH2PO4 3 g

ácido cítrico 3 g

citrato de sodio 3 g

acetato de sodio 3 g

ácido acético glacial 3 mL

Estos materiales son por sesión de laboratorio (4 grupos por sesión).

7. MATERIALES, REACTIVOS, INSTRUMENTOS, SOFTWARE, HARDWARE O

EQUIPOS DEL ESTUDIANTE:

DESCRIPCIÓN (Material,
UNIDAD DE
reactivo, instrumento, software, CANTIDAD
MEDIDA
hardware, equipo)

Bata de poliéster blanca. 1 unidad

Gafas de seguridad. 1 par

Guantes de nitrilo 2 pares

Bayetilla 1 unidad

Toallas de papel Scott 10 unidades

Marcador tipo Sharpie 1 unidad

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Cinta de enmascarar 1 rollo

Cuaderno de laboratorio 1 unidad

8. PRECAUCIONES CON LOS MATERIALES, REACTIVOS, INSTRUMENTOS Y

EQUIPOS A UTILIZAR:

● Antes de entrar al laboratorio lea la guía de trabajo.

● Debe tener las precauciones mencionadas en el acta de capacitación para la
realización de todas las prácticas.
● Escuche las explicaciones del profesor al inicio de la práctica y tome atenta nota
sobre los componentes del espectrofotómetro y del pH metro, sus usos y los
cuidados que se deben tener para el correcto uso de este equipo.
● Debe leer y tener consignado en su cuaderno las fichas de seguridad de cada uno de
los reactivos, y debe tener conocimiento de dónde deben desecharse los residuos de
los mismos.

9. PROCEDIMIENTO, MÉTODO O ACTIVIDADES:

MARCO TEÓRICO
LA ESCALA DE PH

En la naturaleza existen diversas sustancias de carácter ácido o básico. Hay diferentes conceptos
para caracterizar un compuesto químico como ácido o base. Una de las definiciones más utilizadas es
la de Brønsted – Lowry. En esta definición se denomina ácido a toda aquella sustancia capaz de
ceder un protón (H+), mientras que una base es aquella que acepta un protón, la base usualmente
tiene pares de electrones libres.
El agua es un compuesto químico, que gracias a sus propiedades, es vital para el desarrollo de los
seres vivos. Una de las propiedades químicas más importantes del agua es su capacidad de actuar
como ácido o como base de acuerdo con las circunstancias. Una molécula de agua puede donar un
protón a otra molécula de agua, este proceso recibe el nombre de auto-ionización del agua, y permite
la formación del ion hidronio, usualmente representando como H+ y el ion hidroxilo (OH-). En la
presencia de un ácido el agua actúa como aceptor de protones (base) y en presencia de una base
actúa como un donador de protones (ácido).

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Fig. 1 Reacción de auto-ionización del agua.

La concentración de ion hidronio [H+(ac)] en una solución acuosa es normalmente muy pequeña. Por
conveniencia, expresamos casi siempre la concentración del ion hidronio se expresa en términos de
potencial de iones hidronio H+ abreviado como pH, el cual se define como el logaritmo negativo en
base 10 de la concentración molar de los iones hidronio [H+] en la solución.

pH = -log [H+]

El pH de una solución neutra es ≈ 7, es decir, la concentración de iones hidronio e hidroxilo es igual.

ÁCIDO NEUTRO BÁSICO

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Igualmente, la concentración del ion hidroxilo en una solución acuosa es comúnmente muy pequeña.
Por conveniencia, expresamos casi siempre [OH-] en términos de pOH, el cual se define como el
logaritmo negativo en base 10 de la concentración de los iones hidroxilo [OH-] en la solución.

pOH = -log [OH-]

pH + pOH = 14

DISOLUCIONES BUFFER

Las reacciones químicas de la vida necesitan unas condiciones de concentración de especies

químicas determinadas y precisas, es así como la relación entre los iones H+ y OH- deben
permanecer en rangos útiles para que se lleven a cabo las reacciones mediadas por enzimas.
Algunas enzimas necesitan medios ácidos y otras alcalinos. Para mantener estas condiciones de
equilibrio se debe trabajar con disoluciones amortiguadoras o buffer que evitan los cambios bruscos
de pH. Para medir el pH se utiliza el potenciómetro (pH metro), un instrumento que permite
determinar la concentración de hidrogeniones de una solución a través del paso de corriente por una
solución saturada de cloruro de potasio en un electrodo.

Para los sistemas buffer se puede hacer un estimativo del pH a través de la ecuación de
Henderson-Hasselbalch, en la cual se considera la ionización de un ácido débil HA que tiene algún
valor de pKa.

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+ −
𝐻𝐴 ↔ 𝐻 + 𝐴

La constante de disociación del ácido (Ka) para esta reacción, sería:

+1 −1
𝐾𝑎 = [ [𝐻𝐴
𝐻 ]*[𝐴 ]
]

Esta ecuación se puede reorganizar para obtener la ecuación:

−1
𝑝𝐻 = 𝑝𝑘𝑎 + 𝑙𝑜𝑔 [[𝐻𝐴]]
𝐴 [𝑏𝑎𝑠𝑒]
𝑜 𝑝𝐻 = 𝑝𝑘𝑎 + 𝑙𝑜𝑔 [á𝑐𝑖𝑑𝑜]

A esta la llamamos la ecuación de Henderson-Hasselbalch. El pKa, análogo al pH y al pOH, se puede

calcular de la siguiente forma:

pKa = - log Ka
En la ecuación de Henderson-Hasselbalch se puede ver que si el pH = pKa, el logaritmo de la relación
de concentraciones de las formas disociada y sin disociar será cero, de manera que estas
concentraciones serán iguales. En otras palabras, cuando el pH es igual al pKa, el ácido estará
disociado al 50%, es decir, [HA] = [A-

A cualquier valor de pH, la suma de las concentraciones siempre será la misma, ya que sin importar
qué tan disociado esté el ácido, la suma de todas las especies es constante. Por ejemplo, si se
prepara una disolución buffer de concentración 0,05M:

[HA] + [A-] = 0,05M

Una forma sencilla de calcular el pH esperado de una disolución cuando se disuelve una sal sólida, es
promediar los valores de pKa, teniendo en cuenta que el equilibrio puede desplazarse en cualquiera
de las dos direcciones.

− + 2− +
𝐻2𝐴 ⇌ 𝐻𝐴 + 𝐻 ⇌ 𝐴 + 2𝐻

Cada una de las reacciones es una reacción de disociación de un ácido débil, por lo que cada una
tiene una constante de equilibrio:
+ −
𝐾𝑎1 = [𝐻 ]*[𝐻𝐴 ]
[𝐻2𝐴]
+ 2−
𝐾𝑎2 = [ []𝐻𝐴]
𝐻 *[𝐴 ]

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Por esta razón, el pH esperado de la disolución preparada, será un promedio entre los dos valores
de pKa:

𝑝𝐾𝑎1+𝑝𝐾𝑎2
𝑝𝐻 = 2

Cuando el buffer se prepara disolviendo por el separado el ácido débil y su base conjugada, el
cálculo se puede realizar empleando la ecuación de Henderson-Hasselbalch, como en el siguiente
ejemplo:

¿Cuál es el pH de un buffer que tiene ácido láctico (CH3CH(OH)COOH) 0,12M y lactato de sodio
(CH3CH(OH)COONa)? (Ka del ácido láctico es 1,4 x 10-4).

El buffer contiene ácido láctico (CH3CH(OH)COOH) y su base conjugada el ión lactato

(CH3CH(OH)COO-). El pH se puede determinar de dos maneras. Para ello se debe escribir la
reacción en equilibrio, teniendo en cuenta que el ion Na+ es un ion espectador.

− +
CH3CH(OH)COOH ⇌ 𝐶𝐻3𝐶𝐻(𝑂𝐻)𝐶𝑂𝑂 + 𝐻

Concentración 0,12 0,10 0

inicial (M)

Concentración -x +x +x
Cambio (M)

Concentración 0,12 - x 0,10 + x x

en equilibro (M)

De acuerdo a lo mencionado anteriormente:

+1 −1
𝐾𝑎 = [𝐻 ]*[𝐴 ]
[𝐻𝐴]

Para este caso, se pueden reemplazar los términos:

+ −
𝐾𝑎 = [ [𝐶𝐻3𝐶𝐻
𝐻 ]×[𝐶𝐻3𝐶𝐻(𝑂𝐻)𝐶𝑂𝑂 ] −4 𝑥 × (0,10+𝑥)
(𝑂𝐻)𝐶𝑂𝑂𝐻]
= 1, 4×10 = (0,12−𝑥)

Se puede asumir que el valor de x es mucho menor a 0,10, por lo que la ecuación puede
simplificarse así:

−4 𝑥 × (0,10)
1, 4×10 = (0,12)

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−4
𝑥= (
1,4×10 )×(0,12) −4 +
0,10
= 1, 7×10 𝑀 = 𝐻 [ ]
Finalmente, el pH puede calcularse empleando la siguiente ecuación:

pH = -log [H+]

−4
pH = -log (1, 7×10 ) = 3,77
La segunda forma para calcular el pH de la disolución resultante es con la ecuación de
Henderson-Hasselbalch:
−
= 𝑝𝑘𝑎 + 𝑙𝑜𝑔 [[𝐶𝐻3𝐶𝐻(𝑂𝐻)𝐶𝑂𝑂𝐻]]
[𝑏𝑎𝑠𝑒] 𝐶𝐻3𝐶𝐻(𝑂𝐻)𝐶𝑂𝑂
𝑝𝐻 = 𝑝𝑘𝑎 + 𝑙𝑜𝑔 [á𝑐𝑖𝑑𝑜]

Reemplazando:
0,10
𝑝𝐻 = 3, 85 + 𝑙𝑜𝑔 0,12
= 3, 85 + (− 0, 08) = 3, 77

Por último, tenga en cuenta la siguiente ecuación para calcular el % de error:

𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜−𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙 |

%𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟 = || 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜 |×100

PREGUNTAS PREVIAS

El docente escogerá de las siguientes preguntas dos para la elaboración del

preinforme:
● Complete la siguiente tabla

ácido débil base conjugada base débil ácido conjugado

ácido fosfórico amoniaco

carbonato de fosfato diácido

sodio de potasio

ácido acético etilamina

lactato de sodio bicarbonato de

sodio

● Determine la concentración y el pH de las siguientes disoluciones:

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- 1,0346 g de ácido láctico llevados a volumen con agua en un balón de

250,0 mL.
- Una disolución de ácido acético glacial (0,35 mL) llevados a volumen
con agua en un balón de 150 mL.
- Una disolución preparada con 1,2536 g de ácido cítrico y 2,3564 g de
citrato de sodio, llevados a volumen en un balón de 1L.

PROCEDIMIENTO

9.1. CÁLCULOS PARA LA PREPARACIÓN DE LA DISOLUCIÓN BUFFER.

El docente le asignará a cada grupo de laboratorio uno de los siguientes sistemas buffer:
Buffer Fosfato (0,03 - 0,06 M) (pH = 7,0-7,5)
Buffer citrato ( 0,01 - 0,05 M) (pH = 3,5 - 6,0)
Buffer acetato (0,03 - 0,06 M) (pH= 3,5 -5)

Posteriormente y de acuerdo a las indicaciones del marco teórico y del docente el grupo
calculará las cantidades a pesar de los reactivos dados para preparar las 2 soluciones
stock de concentración de cada uno de los componentes del sistema buffer que permitan
posteriormente obtener 50 mL del buffer indicado a la concentración requerida y el pH
esperado, por lo que el estudiante debe tener claro la cantidad en gramos de cada
componente y el volumen de las alicuotas de las disolucioes stock requeridas para
preparar la disolución final. tambien debera tener en cuenta segun las fichas de
seguridad en que estado fisico se encuentran los reactivos.

9.2. PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES BUFFER

Para la preparación de los buffer se recomienda preparar soluciones stock de los

componentes y posteriormente mezclar estas disoluciones para llegar a la concentración
y pH establecido.

Ejemplo buffer fosfato

Para preparar este buffer se utilizan las siguientes sales Na2HPO4 y NaH2PO4, para cada
de las sales debe llevar a cabo el siguiene procedimiento. Pese la cantidad calculada en
el paso anterior, utilizando un pesamuestras, posteriormente transfiera a un vaso de
precipitadoy disuelva correctamente en agua destilada utilizando un agitador de vidrio y
transfiera a un balón de 25 mL y lleve a volumen con agua destilada. Obteniendo las
disoluciones A y B.

Posteriormente determine el pH de cada disolución stock (A y B) y proceda a mezclar las

alícuotas calculadas en el paso anterior y lleve a volumen con agua destilada en un

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balón aforado de 50 mL y determine el pH de la disolución buffer (disolución C),

determine el %error con relación al pH esperado

9.3. DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD BUFFER

Posteriormente rotule dos vasos de precipitados de 100 mL como buffer + ácido y buffer
+ base y adicione 25 mL del buffer preparado y corrobore el valor de pH. En el vaso
rotulado como buffer + ácido adicione a los 25 mL del sistema buffer 0,5 mL de HCl (0,5
M) y determine de nuevo el valor del pH, repita este procedimiento hasta adicionar en
total 5 mL y obtener 10 valores de pH. Posteriomente en el vaso rotulado como Buffer
mas base repita este procedimiento pero ahora utilizando NaOH 0,5 M. Finalmente
realice una grafica de Volumen HCl vs pH y Volume NaOH vs pH y analice hasta ese
punto si el sistema es más resistente al pH ácido o pH básico.

10. RESULTADOS ESPERADOS:

Posteriormente realice las gráficas de pH vs. Volumen de NaOH y volumen de HCl

respectivamente.

11. CRITERIO DE EVALUACIÓN A LA PRESENTE PRÁCTICA:

Presentación del informe grupal, el cual debe entregarse en el formato indicado en el acta de
capacitación que se les entregó previamente, con las características allí mencionadas.

En el cuaderno individual deben registrarse todos los resultados obtenidos, y podrán ser
revisados en la siguiente práctica.

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