RE-10-LAB-316 METODOS INSTRUMENTALES AVANZADOS v3

Código: RE-10-LAB-316
GUÍA DE LABORATORIO DE MÉTODOS Versión: 3.0

INSTRUMENTALES AVANZADOS
Vigencia desde: 2023-07-31
Práctica No. 1
Validación métodos analíticos: Espectroscopía

Determinación de hierro por diferentes técnicas espectrofotométricas métricas.
1. CONOCIMIENTO TEORICO REQUERIDO
Los complejos coloreados formados por iones metálicos con reactivos orgánicos
forman una gran variedad de métodos espectrofotométricos especialmente útiles en el
campo de los análisis clínicos y de alimentos. La mayoría de esos complejos son de
tipo “quelatos”, donde el metal participa de un anillo heterocíclico por ligarse con dos
o más grupos funcionales en la molécula orgánica.
La reacción entre el hierro II y la fenantrolina para formar un complejo coloreado, sirve

como método sensible de determinación espectrofotométrica de hierro en soluciones
acuosas. La intensidad del color del complejo así formado es independiente del pH en
el rango de 2 a 9, y es muy estable ya que la intensidad del color no sufre cambios en
largos periodos de tiempo. La ley de Lambert y Beer es obedecida en una amplia gama
de concentraciones
2. COMPETENCIA(S)
● Determina la concentración de hierro en una muestra mediante un

espectrofotómetro UV-Vis
● Entiende el fundamento de la Espectrofotometría con la utilización de un
compuesto que proporciona color (cromóforo) al compuesto en estudio
3. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS:

EQUIPOS y MATERIALES
Ítem DENOMINACIÓN Cantidad Unidad Observaciones
Cantidad solicitada para 25 estudiantes, para cada

1 Pipetas de 5 y 10 mL 6 grupo de la asignatura a-1, a-2.

2 Peras 6 grupo de la asignatura a-1, a-2.

3 Propipetas 6 grupo de la asign0atura a-1, a-2.
1


4 Vasos de precipitado 100, 250, 500 ml 8 grupo de la asignatura a-1, a-2.

5 Matraces aforados 50 ml 6 grupo de la asignatura a-1, a-2.

6 Vidrio de reloj 6 grupo de la asignatura a-1, a-2.

7 Espátulas 6 grupo de la asignatura a-1, a-2.

8 Probetas de 100 y 250 ml 8 grupo de la asignatura a-1, a-2.

9 Goteros 10 grupo de la asignatura a-1, a-2.
Micropipetas 1000 ul, 100 ul

10 3 grupo de la asignatura a-1, a-2.

11 Picetas 4 grupo de la asignatura a-1, a-2.

12 Puntas para micro pipetas 1000 ul, 100 ul . 40 grupo de la asignatura a-1, a-2.

13 Embudos 6 grupo de la asignatura a-1, a-2.

14 Varillas 6 grupo de la asignatura a-1, a-2.
Papel filtro varios


16 Pinzas de madera 10 grupo de la asignatura a-1, a-2.

17 Tubos de ensayo para Star Fax 40 grupo de la asignatura a-1, a-2.

18 Cola de zorro. 6 grupo de la asignatura a-1, a-2.

19 Morteros 6 grupo de la asignatura a-1, a-2.

20 Centrifugadora 1 grupo de la asignatura a-1, a-2.

21 Jeringas descartables 5ml 6 grupo de la asignatura a-1, a-2.
2


22 Algodón torundas 10 grupo de la asignatura a-1, a-2.

23 Balanza analítica 3 grupo de la asignatura a-1, a-2.

24 Balanza semianalitica 1 grupo de la asignatura a-1, a-2.
25 Star fax. 2
INSUMOS

1 Cromato de potasio 0,04mg/L 150 ml Cantidad solicitada para 25 estudiantes, para
cada grupo de la asignatura a-1, a-2
2 Hidróxido de potasio 0,05M 150 ml Cantidad solicitada para 25 estudiantes, para
Cantidad solicitada para 25 estudiantes, para
3 NaOH 5 gr 1 cada grupo de la asignatura a-1, a-2
4 NaCl 5 gr 1 cada grupo de la asignatura a-1, a-2
5 Lugol 15 ml 1 cada grupo de la asignatura a-1, a-2
6 Permanganato de potasio 15 ml 1 cada grupo de la asignatura a-1, a-2
7 Etanol 70% 15 ml 1 cada grupo de la asignatura a-1, a-2
8 Ácido acético 15 ml 1 cada grupo de la asignatura a-1, a-2
Orto – fenantrolina 0,1% 450 ml Cantidad solicitada para 25 estudiantes, para cada
9 grupo de la asignatura a-1, a-2
Patrón de Hierro 0,04mgFe/ml 348 ml Cantidad solicitada para 25 estudiantes, para cada
Clorhidrato de Hidroxilamina 10% 45 Cantidad solicitada para 25 estudiantes, para cada
Solución buffer 0,1M Acetato – Ácido acético pH
3,5 450 Cantidad solicitada para 25 estudiantes, para cada
Solución problema
Diferentes muestras en cuestión. Cantidad solicitada para 25 estudiantes, para cada

4. TECNICA O PROCEDIMIENTO
Espectro de absorción de varias sustancias: En vasos de precipitados de 100ml

coloque de 20ml a 50ml de solución de las siguientes sustancias y según las
indicaciones del profesor, tómeles el espectro de absorción en el rango de longitud de
onda deseado. Observe las partes del espectrofotómetro y los espectros. - fenolftaleina
en medio básico - fenolftaleina en medio neutro - verde de bromocresol en medio
básico - verde de bromo cresol en medio ácido - gelatina o BSA - permanganato de
potasio - Complejo hierro- Orto-fenantrolina
3

Preparación de la curva de calibración para la determinación de hierro: En

matraces aforados de 100ml adicionar las cantidades correspondientes de los
reactivos a utilizar según la tabla No 1, después completar con agua destilada hasta el
volumen correspondiente, homogenizar y dejar reposar por 5 minutos para el
desarrollo del color.
Tubo patrón (Fe) ml (Sin patrón ml Hidroxilamina ml Buffer pH ml O-
de Fe) 3,5 fenantrolina
Blanco 0 0 1 10 10
1 0,6 1,5 1 10 10
2 1 2,5 1 10 10
3 2 5 1 10 10
4 4 10 1 10 10
5 6 15 1 10 10
6 8 20 1 10 10
7 10 25 1 10 10
8 14 35 1 10 10
9 20 50 1 10 10
Lavar muy bien las celdas de medición y para calibrar el equipo al 100% de
transmitancia coloque la longitud de onda en a cual se va a medir la absorbancia
(510nm) y se usa como referencia el blanco de la reacción. Cuide que sobre las
paredes de la celda no queden huellas digitales, manchas, rayones muy fuertes, o
otros que impidan el paso adecuado de la luz. Mida la absorbancia de las soluciones
patrón de hierro a 510 nm, entre cada medida lave la celda con suficiente agua
destilada y limpie cuidadosamente las paredes externas. Haga una gráfica de
absorbancia vs concentración de hierro en ppm y linealícela.
Determinación de la cantidad de Fe presente en una gragea de sulfato ferroso:

(solución problema) Pese una gragea de sulfato ferroso y luego colóquela en un
mortero con mano, adicione 20ml de agua destilada y realice la extracción. Filtre la
solución obtenida a través del papel de filtro y lave el residuo con 30 ml de agua
destilada. Transvase el filtrado a un balón aforado de 100ml (solución No 1). De la
solución anterior tome 1,0ml y colóquelo en un balón aforado de100ml, adicione luego
4

1ml de hidroxilamina, 10,0ml de solución buffer y 10,0 ml de orto-fenantrolina; lleve a

volumen con agua destilada y deje en reposo por 15min.Lee la absorbancia de la
solución a 510nm. Calcule la concentración de sulfato ferroso y la concentración de
hierro elemental, por gragea.
5. TIEMPO DE DURACION DE LA PRÁCTICA:
100 Minutos
6.MEDICIÓN, CALCULOS Y GRAFICOS.-
- Representar la Curva de calibración de absorbancia (510nm) vs concentración de hierro

(ppm)
- Calcular de la concentración de hierro de la solución problema
- Analizar las observaciones y resultados obtenidos
7.RESULTADO DE APRENDIZAJE.
Selecciona método y técnica adecuada considerando la naturaleza de la muestra y

analito en cuestión para el correcto análisis instrumental.
Identifica los Métodos instrumentales ópticos para el control analítico de procesos

bioquímicos y farmacéuticos, teniendo en cuenta la precisión y exactitud de estos en
base a su validación.
1. CUESTIONARIO
1) ¿Cómo se construye una curva espectral? ¿Cuál es el criterio a seguir para

seleccionar la longitud de onda de trabajo?
2) ¿Por qué es necesario utilizar un blanco para realizar las mediciones?
3) ¿Cuál es el objeto de adicionar hidroxilamina en la determinación?
4) ¿Por qué la fenantrolina está en solución de acetato de sodio?
5) ¿Cómo se forma el complejo entre el hierro y la 1,10 fenantrolina?
6) ¿Cómo se preparan las soluciones de hierro a partir de hierro sólido?
7) Mencione otros reactivos usados en la determinación espectrofotométrica de

hierro. ¿Con qué criterio compararía la sensibilidad de los mismo.
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Practica N°2
CURVA ESPECTRAL

Una curva patrón se obtiene midiendo la absorbancia del compuesto a diferentes
concentraciones. Para eso se preparan una serie de disoluciones estándar de la
sustancia problema y un blanco. Se mide la absorbancia de cada disolución,
trabajando siempre a la misma longitud de onda, que generalmente corresponde con
el máximo de absorción del compuesto.
La representación gráfica de las absorbancias medidas frente a las concentraciones

preparadas es una recta.
2. COMPETENCIAS
● Realiza la construcción del espectro de absorción en las longitudes de onda
del rango visible.
● Determina la concentración de una solución problema a cierta longitud de onda.
● Identifica los Métodos instrumentales ópticos para el control analítico de
procesos bioquímicos y farmacéuticos, teniendo en cuenta la precisión y
exactitud de estos.
6

3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS

Micropipetas 1000 ul, 100 ul Cantidad solicitada para 25 estudiantes, para cada
Papel filtro varios Cantidad solicitada para 25 estudiantes, para cada

25 Star fax. 1
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INSUMOS

1 Cromato de potasio 0,04mg/L 150 ml cada grupo de la asignatura a-1, a-2
2 Hidróxido de potasio 0,05M 150 ml cada grupo de la asignatura a-1, a-2
3 NaOH 5 gr 1 cada grupo de la asignatura a-1, a-2
4 NaCl 5 gr 1 cada grupo de la asignatura a-1, a-2
5 Lugol 15 ml 1 cada grupo de la asignatura a-1, a-2
6 Permanganato de potasio 15 ml 1 cada grupo de la asignatura a-1, a-2
7 Etanol 70% 15 ml 1 cada grupo de la asignatura a-1, a-2
8 Ácido acético 15 ml 1 cada grupo de la asignatura a-1, a-2
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11
12
13
1. A partir de la disolución de K2CrO4 preparar las siguientes diluciones con KOH
0,05M en seis tubos de ensayo:
Tubo Blanco1 2 3 4 5
ml K2CrO
0 4 2 4 6 8 10
ml KOH
10 8 6 4 2 0
2. Seleccionar en el espectrofotómetro la longitud de onda del máximo de

absorción.
3. Llenar una de las cubetas con el blanco y colocarla en el compartimento de
muestras. Ajustar con el mando correspondiente el cero de absorbancia.
4. Sustituir el blanco por cada una de las disoluciones preparadas en los tubos
(siempre se trabaja de las más diluida a la más concentrada) y leer la
absorbancia. Repetir la medida tres veces por cada disolución (vaciando la
cubeta cada vez en el respectivo tubo) y anotar los valores obtenidos en la tabla
de resultados. Se empleará siempre la misma cubeta.
5. TIEMPO DE DURACION DE LA PRÁCTICA
8

200 MINUTOS
6. MEDICIÓN, CALCULOS Y GRAFICOS. -
Representar gráficamente en el papel milimetrado el parámetro medido A frente a las

concentraciones de K2CrO4 calculadas indicando unidades. Unir los puntos obtenidos
para obtener la recta de calibrado. Esta recta tiene que pasar por el centro de
coordenadas
Utilizar la ecuación general de la recta, y reemplazar los datos de a, b, x e y.
Además se desarrollara un control de calidad estadístico interno, externo .
7. RESULTADOS DE APRENDIZAJE.

base a su validación
8. CUESTIONARIO
1.- ¿Para qué sirve una curva de calibración y cómo se obtiene?
2.- La relación Concentración / Absorbancia tiene un límite, ¿cómo se denomina la ley
que lo explica?
3.- ¿Qué significa coeficiente de correlación y cómo se obtiene?
4.- Es posible obtener una ecuación con los datos experimentales?
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Practica N ° 3
Seminario de espectroscopía UV-visible. Estudio de caso: Validación.
1. INTRODUCCION -SIGNIFICACION CLINICA

La patología más común relacionada con el metabolismo de los hidratos de carbono
es la diabetes mellitus. El diagnóstico precoz y el control de los pacientes diabéticos,
tienen por objeto evitar la cetoacidosis y las complicaciones de los síntomas
resultantes de la hiperglicemia, mediante el tratamiento adecuado. Dado que existen
múltiples factores causales de hiper o hipoglicemia, debe considerarse en cada caso
la condición fisiológica y/o la patología presente en el paciente en cuestión.
2. COMEPTENCIAS

bioquímicos y farmacéuticos, teniendo en cuenta la precisión y exactitud de estos.
3. FUNDAMENTOS DEL METODO

El esquema de reacción es el siguiente:
GOD
glucosa + O2 + H2O ácido glucónico + H2O2
POD
2 H2O2 + 4- AF + fenol quinona coloreada + 4 H2O
4. MATERIALES Y REACTIVOS





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Papel filtro varios









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25 Star fax. 2
INSUMOS

Reactivo A: solución de 4-aminofenazona 25
mmol/l en Buffer Tris 0,92 mol/l.
Reactivo B: solución de fenol 55 mmol/l.
Reactivo C: solución de glucosa oxidasa (1000
U/ml) y peroxidasa (120 U/ml).
Standard: solución de glucosa 1 g/l.
Kit determinacion glucosa en suero
samguineo
1 1 Kit Cantidad solicitada para 25 estudiantes, para
Espectrofotómetro o
fotocolorímetro.
2 - 1 Pza Cantidad solicitada para 25 estudiantes, para
- Tubos o cubetas espectrofotométricas de caras
paralelas.
- .
3 10 Uni cada grupo de la asignatura a-1, a-2
4 Baño de agua a 37oC. - Reloj o timer 1 pza cada grupo de la asignatura a-1, a-2
5 Star fax 1 Uni cada grupo de la asignatura a-1, a-2
5. PROCEDIMIENTO
INSTRUCCIONES PARA SU USO
Standard: listo para usar.
Reactivo A: listo para usar.
Reactivo B: listo para usar.
Reactivo C: homogeneizar por inversión antes de usar, evitando la formación de
espuma.
Reactivo de Trabajo: de acuerdo al volumen de trabajo, colocar en una probeta 500
partes de agua destilada, 50 partes de Reactivo A, 50 partes de Reactivo B y llevar a
1000 partes con agua destilada. Agregar 3 partes de Reactivo C previamente
homogeneizadas. Mezclar por inversión, sin agitar. Rotular y fechar. Pueden
prepararse distintas cantidades respetando las proporciones antedichas. Es
importante además, respetar el orden de agregado de los reactivos y asegurar una
perfecta homogeneización de los mismos, a fin de que el Reactivo B no deteriore el
Reactivo de Trabajo.
PRECAUCIONES
Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".
El Reactivo B (fenol) es nocivo y corrosivo. H301 + H311 + H331 Tóxico en caso de
ingestión, contacto con la piel o inhalación. H314: Provoca quemaduras graves en la
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piel y lesiones oculares graves. P262: Evitar el contacto con los ojos, la piel o la ropa.
P305 + P351 + P338: EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Enjuagar
cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si
lleva y resulta fácil. Seguir enjuagando. P302 + P352: EN CASO DE CONTACTO CON
LA PIEL: Lavar con agua y jabón abundantes. P280: Llevar
guantes/prendas/gafas/máscara de protección. Utilizar los reactivos guardando las
precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de análisis clínicos. Todos los
reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a la normativa local vigente.
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO
Reactivos Provistos: son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de
vencimiento indicada en la caja. No mantener a temperaturas elevadas durante lapsos
prolongados. Reactivo de Trabajo: en refrigerador (2-10oC) y en frasco color
caramelo es estable un mes a partir de la fecha de su preparación.
INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS
Durante el uso, el Reactivo de Trabajo puede desarrollar un ligero color rosado que no
afecta su funcionamiento siempre que se procese un Blanco con cada lote de
determinaciones y un Standard periódicamente. Desechar cuando las lecturas del
Blanco sean superiores a 0,160 D.O. o las lecturas del Standard sean anormalmente
bajas.
MUESTRA
Suero o plasma
a) Recolección: se debe obtener suero o plasma de la manera usual. Cuando no es
posible extraer sangre venosa o en casos de extrema urgencia, la determinación se
puede realizar en sangre capilar.
b) Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma, se recomienda el uso de
Anticoagulante G de Wiener lab. para su obtención (el mismo contiene fluoruro como
conservador).
c) Sustancias interferentes conocidas: los sueros o plasmas con hemólisis visible o
intensa deben ser desproteinizados. No se observan interferencias por: bilirrubina
hasta 200 mg/l, ácido ascórbico hasta 75 mg/l, ácido úrico hasta 200 mg/l, hemólisis
ligera.
Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente
método.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: los hematíes y leucocitos son los
responsables de la destrucción enzimática de la glucosa sanguínea, siendo máxima a
37oC, razón por la cual debe centrifugarse la sangre dentro de las dos horas
posteriores a la extracción, hasta obtener un sobrenadante límpido y transferir a otro
tubo para su conservación. En estas condiciones la glucosa es estable 4 horas a
temperatura ambiente o 24 horas refrigerada (2-10oC). En caso de no poder
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procesarse la muestra de la forma antes indicada, deberá adicionarse un conservador

en el momento de la extracción para inhibir la glucólisis.
CONDICIONES DE REACCION
- Longitud de onda: 505 nm en espectrofotómetro o en fotocolorímetro con filtro verde
(490-530 nm).
- Temperatura de reacción: 37oC
- Tiempo de reacción: 10 minutos
- Volumen de muestra: 20 ul
- Volumen de Reactivo de Trabajo: 2 ml
- Volumen final de reacción: 2,02 ml
Los volúmenes de Muestra y de Reactivo pueden variarse proporcionalmente (Ej.: 50
ul de Muestra + 5 ml de Reactivo de Trabajo).
PROCEDIMIENTO
En tres tubos marcados B (Blanco) S (Standard) y D (Desconocido) colocar:
B S D
Standard - 20 ul -
Muestra - - 20
ul
Reactivo de 2 ml 2 ml 2
Trabajo ml
Incubar 10 minutos en baño de agua a 37oC. Luego leer en espectrofotómetro a 505 nm o
en fotocolorímetro con filtro verde (490-530 nm) llevando el aparato a cero con el blanco.
ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL
El color de reacción final es estable 1 hora, por lo que la absorbancia debe ser leída
dentro de este lapso.
6. CALCULO DE LOS RESULTADOS
1,00 g/l
glucosa g/l = D x f donde f =
S
METODO DE CONTROL DE CALIDAD

Procesar 2 niveles de un material de control de calidad (Standatrol S-E 2 niveles) con
concentraciones conocidas de glicemia, con cada determinación.
VALORES DE REFERENCIA
Se analizaron con Glicemia enzimática, 120 muestras de individuos en ayunas, de
ambos sexos, con edades comprendidas entre 20 y 45 años, provenientes de la ciudad
de Rosario (Argentina), sin síntomas de diabetes o cualquier otra enfermedad
aparente. Se encontró que el 95% de los resultados cubrieron el siguiente rango:
14

Suero o plasma: 0,70 a 1,10 g/l

En la literatura (Tietz, N.W.) se menciona el siguiente rango de referencia:
Suero o plasma: 0,74 - 1,06 g/l
Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia,
teniendo en cuenta sexo, edad hábitos alimenticios y otros factores.
CONVERSION DE UNIDADES
Glucosa (g/l) = Glucosa (mg/dl) x 0,01
Glucosa (mg/dl) x 0,0555 = Glucosa (mmol/l)
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. Los reductores disminuyen la
respuesta de color, mientras que los oxidantes colorean el Reactivo aumentando los
Blancos. Dichos agentes son frecuentemente encontrados en el agua destilada
empleada para preparar el Reactivo de Trabajo, por lo que se recomienda controlar la
calidad de la misma.
Los detergentes, metales pesados y cianuros son inhibidores enzimáticos.
PERFORMANCE
a) Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en 10 días
diferentes, se obtuvo lo siguiente:
Nivel D.S. C.V.
1,00 g/l ± 0,022 g/l 2,37 %
2,00 g/l ± 0,030 g/l 1,50 %
b) Recuperación: agregando cantidades conocidas de glucosa a distintos sueros,
se obtuvo una recuperación entre 99 y 101%.
c) Linealidad: la reacción es lineal hasta 4,5 g/l. Para valores superiores, diluir 1/2
la solución coloreada final con el Reactivo de Trabajo y repetir la lectura multiplicando
el resultado final por dos.
d) Exactitud: empleando el método de la hexoquinasa como referencia, se
observa que la correlación estadística entre ambos métodos es excelente (r= 0,99).
e) Sensibilidad: el mínimo límite de detección es 0,0054 g/l y la sensibilidad
analítica es de 0,042 g/l.
7.TIEMPO DE DURACION DE LA PRÁCTICA:
100 MINUTOS
8. MEDICIÓN, CALCULOS Y GRAFICOS.-

(ppm)
- Calcular de la concentración de glucosa en las muestras.
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-Validar el método de manera estadística .
9. RESULTADO DE APRENDIZAJE.


CUESTIONARIO
a) ¿Cómo se construye una curva espectral? ¿Cuál es el criterio a seguir para

seleccionar la longitud de onda de trabajo?
b) ¿Por qué es necesario utilizar un blanco para realizar las mediciones?
c) ¿Cuál es el objeto de adicionar los reactivos enzimáticos en la determinación?
d) ¿Por qué el patrón positivo está en solución y que contiene?
e) ¿En qué consiste la reacción enzimática fundamente?
f) ¿Cómo se preparan las soluciones del patrón a partir del patrón original?
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Práctica Nº4
Seminario de espectroscopía de IR. Estudio de caso: Validación.
Cuando la radiación infrarroja incide sobre una muestra, es capaz de provocar cambios
en los estados vibracionales de las moléculas constituyentes de la misma. La
absorción de radiación por parte de una muestra es indicativa del tipo de enlaces y
grupos funcionales presentes.
Tanto desde el punto de vista instrumental como de sus aplicaciones es conveniente

dividir la región infrarroja en tres regiones denominadas infrarrojo cercano (NIR),
infrarrojo medio (MIR) e infrarrojo lejano (FIR). La gran mayoría de las aplicaciones
analíticas clásicas de la espectroscopia infrarroja se basan en el empleo del infrarrojo
medio (4000-600 cm-1) y el infrarrojo cercano, que proporciona la posibilidad de
convertir esta técnica en una técnica cuantitativa. La técnica de transformada de
Fourier, que permite mediante una operación matemática, convertir un espectro en
dominio del tiempo a un espectro en dominio de frecuencia, permite la obtención de
espectros de forma rápida, precisa y con relaciones Señal/Ruido (S/N) elevadas.
La obtención de espectros IR se puede llevar a cabo a través de las siguientes técnicas

de medida:
• Transmisión : En este método de medida la radiación IR atraviesa la muestra

registrándose la cantidad de energía absorbida por la muestra. A partir de la
comparación de la radiación registrada tras atravesar la muestra, con un
experimento de referencia se obtiene el espectro IR. Esta técnica permite
analizar con los accesorios adecuados, muestras gaseosas, líquidas y sólidas.
En caso de muestras sólidas, éstas se muelen junto con KBr en polvo
(ópticamente transparente) y se prensa para obtener una pastilla delgada que
se expone a la radiación infrarroja.
• Reflexión : La radiación infrarroja es reflejada sobre la muestra. Analizando la
radiación reflejada y comparándola con la radiación incidente se obtiene
información molecular de la muestra. Para utilizar esta técnica de medida la
muestra debe ser reflectante o estar colocada sobre una superficie reflectante.
• Modo ATR : Es un modo de muestreo en el que el haz IR se proyecta en un
cristal de alto índice de refracción. El haz se refleja en la cara interna del cristal
y crea una onda evanescente que penetra en la muestra. Ésta debe estar en
íntimo contacto con el cristal. Parte de la energía de la onda evanescente es
absorbida y la radiación reflejada (con la información química de la muestra) es
conducida al detector. Se trata de un método muy versátil que permite la medida
de muestras líquidas y sólidas sin prácticamente preparación de las mismas.
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Aplicaciones
La espectroscopía infrarroja es una de las técnicas espectroscópicas más versátiles y

de mayor aplicación. Algunas de las aplicaciones más importantes son:
• Caracterización e identificación de materiales

o Polímeros y plásticos
o Sólidos inorgánicos (minerales, catalizadores, materiales compuestos…)
• Análisis de productos farmacéuticos y de síntesis.
• Análisis de contaminantes
• Ciencia Forense (identificación)
• Biomedicina (análisis de tejidos)
• Conservación artística (análisis de pigmentos, materiales utilizados…)
• Industria del reciclaje (identificación de materiales poliméricos)
• Agricultura y alimentación (IR cercano)
• Seguimiento de procesos químicos
o Polimerizaciones, curado, reticulaciones…
o Reacciones catalíticas.
• Análisis de microplásticos
Equipamiento
• Espectrómetro BRUKER IFS 66/S, capaz de trabajar con una resolución de

hasta 1 cm-1. Dispone de una fuente de IR medio, un divisor de haz de KBr y
dos detectores: Un detector DLaTGS a temperatura ambiente para medidas de
rutina y la obtención de espectros entre 7000 y 400 cm-1 y otro detector MCT
refrigerado por nitrógeno líquido de alta sensibilidad y rapidez de medida, ideal
para medidas cinéticas entre 4000 y 600 cm-1. (1)
•
•
•
• Accesorio ATR Specac Golden Gate de prisma de diamante monolítico para la
medida de muestras sólidas y líquidas sin preparación previa de la muestra.
18

Posee un puente de presión para asegurarse tanto un íntimo contacto entre el

cristal y la muestra como unos resultados reproducibles.
• Espectrómetro JASCO FTIR 4700, capaz de trabajar con una resolución de

hasta 0,5 cm-1. Dispone de una fuente de IR medio, un divisor de haz de KBr
encapsulado en Germanio y un detector DLaTGS para medidas de rutina.
Rango de frecuencia medible entre 7800 y 400 cm-1. (2)
• Microscopio FTIR JASCO IRT-5200 con objetivo Cassegrain de 16x y detector
MCT (7000 – 600 cm-1) con posibilidad de medir en modo transmisión o en
modo reflexión (área mínima analizable 5x5 micras). Incluye un polarizador y
analizador para la observación con luz polarizada. Función IQ Mapping para
experimentos de mapeo de superficies.(2)
• Objetivo ATR Clearview con prisma de Germanio 32x y sensor de presión (ATR-
5000-SG) acoplado al microscopio IRT-5200. Permite la obtención de espectros
FTIR-ATR de muestras microscópicas, tal y como defectos en superficies,
impurezas, rastros, etc… Además, permite la obtención de imágenes mediante
mapeo de la superficie de la muestra.
• Espectrómetro de infrarrojo con fuente láser modulable AGILENT 8700 Laser
Direct Infrared (LDIR). Dispone de una fuente de IR sintonizable proporcionada
por un laser de cascada cuántica de estado sólido (tecnología QCL), con una
resolución de longitud de onda de 1 cm-1 y un intervalo espectral de 1800-975
cm-1; un detector refrigerado termoeléctricamente; un objetivo de ATR de
germanio, con sensor de presión; elementos polarizadores automáticos
controlados desde el software. El equipo permite realizar medidas con una
resolución espacial máxima de 5,5 micras en reflectancia o 1,5 micras en ATR.
El software de control del equipo, Agilent Clarity, permite realizar medidas de

áreas grandes de forma totalmente automatizada, así
como inspeccionar posteriormente con más detalle
áreas más pequeñas de interés sin realizar ningún
cambio en la óptica.
Se dispone de bases de datos de microplásticos,

ampliables con espectros medidos en el propio
equipo. Los espectros se pueden exportar a librerías
externas para confirmación de la identidad de los
materiales estudiados.

INSUMOS
19


Herramientas digitales aplicaciones en
específico que ayudaran a desarrollar la
practica en aula.
Aplicación como: prezi, genially, quizis, La dinámica está
canva, slidego canva, jamboard, diseñada para trabajar
clasrom screan, woocalp, Simuladores, en un espacio
videos tutoriales, emaze, menti.com, sincrónico, asincrónico,
1 otros. ---- ---- o presencial.
● Realizar el seminario de la práctica
200 MINUTOS
La práctica consiste en el aprendizaje en base a la simulación donde el analista podrá
desarrollar cálculos pertinentes en base a la validación del método estudiado.
7. RESULTADOS DE APRENDIZAJE
Desarrolla un análisis específico con métodos instrumentales electroquímicos durante

la realización de prácticas de laboratorio.
8. CUESTIONARIO:
1.- ¿Para qué sirve un espectro de absorción de una sustancia orgánica?
2.- ¿Se podrá utilizar para corregir la longitud de onda para calibrar el equipo utilizado?
3.- ¿Será posible identificar una sustancia orgánica utilizando solo un espectro de
absorción?
4.- ¿Cómo se realiza la obtención de un espectro de absorción en forma manual?
20

Práctica Nº5
Seminario de espectroscopía de fluorescencia Molecular

La espectrofotometría es una técnica analítica basada en la medida de la intensidad
de una radiación electromagnética (REM) que interacciona con la materia, mediante
un proceso de absorción. En esta técnica una REM de una determinada longitud de
onda (ʎ) se hace incidir sobre una sustancia en disolución. La REM es absorbida total
o parcialmente por las moléculas de la sustancia. Como resultado del proceso de
absorción, la intensidad de la REM incidente disminuye al atravesar la muestra y tendrá
una intensidad de luz emergente, pero se mantiene la misma longitud de onda.
Mediante el instrumento adecuado se mide la relación de la intensidad de la REM

emergente comparándola con la intensidad de la REM incidente. La cantidad de REM
absorbida al atravesar la disolución depende de:
● La estructura de las moléculas absorbentes de la muestra
● Su concentración en la disolución
● Espesor de la muestra
Las radiaciones electromagnéticas pueden tener diferentes energías y al conjunto se
le denomina espectro electromagnético que se divide en regiones de acuerdo a la
longitud de onda. Las zonas o regiones en las que se trabaja en espectrofotometría:
- UV-Visible: entre 200 y 380nm
- Visible: entre 380 y 780nm
- IR: entre 780nm y 300µm
En espectrofotometría se hace incidir una REM monocromática de una determinada
longitud de onda sobre una muestra contenida en una cubeta. La intensidad de la REM
que ha atravesado la muestra se mide mediante un detector. Para caracterizar la luz
absorbida por una muestra disuelta se utiliza la ley de Lambert-Beer cuyo enunciado
es: “La intensidad de una radiación monocromática que atraviesa una disolución
transparente, homogénea e isótropa, disminuye potencialmente con la concentración
de la misma, de acuerdo a la expresión:
I = Io x 10-abc
Siendo Io e I las intensidades de las radiaciones incidente y transmitida, b el espesor
de la muestra líquida, a la absortividad y c la concentración de la disolución. En la
práctica esta ley se denomina Ley de Beer.
El disolvente, los reactivos utilizados y los componentes de la matriz pueden absorber
la ʎ utilizada, por lo que es necesario preparar una disolución blanco, que es aquella
que contiene todos los componentes excepto el compuesto problema o Analito. Será
una disolución de concentración 0. A la disolución blanco se le asigna un valor de
21

absorbancia 0 mediante un mando de ajuste del instrumento (o también se puede ir

restando el valor obtenido para la disolución blanco del valor obtenido en cada caso).
El espectro de absorción es la representación gráfica de la distribución dela intensidad
de una radiación que absorbe una sustancia, en función de su longitud de onda
(también se utiliza el número de onda y la frecuencia). La intensidad de la REM
absorbida se expresa en absorbancia y transmitancia.
La curva patrón o curva de calibración se utiliza en el análisis cuantitativo y es la
representación gráfica de la correspondencia entre los valores de la magnitud medida
y las lecturas efectuadas con el instrumento de medida. Una curva patrón se obtiene
midiendo la absorbancia de un compuesto a diferentes concentraciones. A partir de
una curva patrón se puede calcular la concentración de una muestra desconocida
siempre que se realice la medida utilizando las mismas condiciones experimentales
que se utilizaron para la obtención de la curva patrón. Se mide la absorbancia de la
disolución problema, previo ajuste con el blanco y por interpolación en la curva patrón
se calcula la concentración de la muestra. Nunca se puede extrapolar en una curva
patrón. Si se obtienen valores de absorbancia para una muestra problema, superiores
a los de la curva patrón es preciso diluirla, medir la absorbancia, calcular la
concentración de esta muestra y posteriormente realizar los cálculos para obtener la
concentración original.
La espectrometría de fluorescencia (también llamada fluorometría o
espectrofluorimetría) es un tipo de espectroscopia electromagnética que analiza la
fluorescencia de una muestra. Se trata de utilizar un haz de luz, por lo general luz
ultravioleta, que excita los electrones de las moléculas de ciertos compuestos y
provoca que emitan luz de una menor energía, generalmente luz visible (aunque no
necesariamente). Una técnica complementaria es la espectrometría de absorción.
Los dispositivos que miden la fluorescencia se llaman fluorómetros o fluorímetros.

TEORÍA DE LA FLUORESCENCIA
Las moléculas tienen diferentes estados llamados niveles de energía. La

espectrometría de fluorescencia se refiere principalmente a estados vibracionales y
electrónicos. En general, las especies objeto de examen tendrán un estado electrónico
basal (un estado de baja energía) de interés, y un estado electrónico excitado de mayor
energía. Dentro de cada uno de estos estados electrónicos hay diferentes estados
vibracionales.
En la espectroscopia de fluorescencia, primero se excita la muestra mediante la

absorción de un fotón de luz, desde su estado electrónico basal a uno de los distintos
estados vibracionales del estado electrónico excitado. Las colisiones con otras
moléculas causan que la molécula excitada pierda energía vibracional hasta que
alcanza el estado vibracional más bajo del estado electrónico excitado.
La molécula desciende luego a uno de los distintos niveles de vibración del estado
22

electrónico basal, emitiendo un fotón en el proceso. Como las moléculas pueden caer
a cualquiera de los diferentes niveles de vibración en el estado basal, los fotones
emitidos tendrán diferentes energías y, por lo tanto, frecuencias. Así pues, mediante
el análisis de las diferentes frecuencias de luz emitida por espectrometría de
fluorescencia, junto con sus intensidades relativas, se puede determinar la estructura
de los diferentes niveles de vibración.
En un experimento típico, se miden las diferentes frecuencias de luz fluorescente

emitida por una muestra, manteniendo la luz de excitación a una longitud de onda
constante. A esto se le llama espectro de emisión. Un espectro de excitación se mide
mediante el registro de una serie de espectros de emisión utilizando luz de diferentes
longitudes de onda.
INSTRUMENTOS
En la espectrometría de fluorescencia se utilizan dos tipos generales de instrumentos:
* Fluorómetros de filtro. Utilizan filtros para aislar la luz incidente y la luz fluorescente.
* Espectrofluorómetros. Usan monocromadores de retículo de difracción para aislar la
luz incidente y la luz fluorescente.
Ambos tipos de instrumentos utilizan el siguiente esquema. La luz de una fuente de
excitación pasa a través de un filtro o monocromador, e incide sobre la muestra. Una
parte de la luz incidente es absorbida por la muestra, y algunas de las moléculas de la
muestra producen una fluorescencia. La luz fluorescente es emitida en todas las
direcciones. Parte de esta luz fluorescente pasa a través de un segundo filtro o
monocromador y llega a un detector, el cual muy a menudo se encuentra a 90° con
respecto al haz de luz incidente para minimizar el riesgo de que la luz incidente
reflejada o transmitida llegue al detector
Diversas fuentes de luz pueden ser utilizadas como fuentes de excitación, incluyendo
el láser, fotodiodos y lámparas; arcos de xenón y lámparas de vapor de mercurio. Un
láser sólo emite luz de alta irradiancia en un intervalo muy estrecho de longitudes de
onda, por lo general a 0,01 nm, lo que hace innecesario el monocromador de excitación
o el filtro. La desventaja de este método es que la longitud de onda de un láser no se
puede cambiar mucho. Una lámpara de vapor de mercurio es una lámpara lineal, lo
que significa que emite luz cerca del pico de longitudes de onda. Por el contrario, un
arco de xenón tiene un espectro de emisión continuo con intensidad casi constante en
el rango de 300-800 nm, y una irradiancia suficiente para las mediciones hasta justo
por encima de 200 nm.
En los fluorímetros pueden usarse filtros y/o monocromadores. Un monocromador
transmite luz de una longitud de onda y tolerancia ajustables. El tipo más común de
monocromador utiliza un retículo de difracción; es decir, la luz colimada entra en una
rejilla y sale con un ángulo diferente dependiendo de la longitud de onda. El
23

monocromador puede entonces seleccionar qué longitudes de onda transmite. Para

permitir mediciones de anisotropía se añaden dos filtros de polarización: uno después
del monocromador de excitación o filtro, y otro antes del monocromador de emisión o
filtro.
Como se mencionó antes, la fluorescencia se mide más a menudo en un ángulo de

90° en relación a la luz de excitación. Esta geometría se utiliza en lugar de colocar el
sensor en la línea de la luz de excitación en un ángulo de 180° a fin de evitar la
interferencia de la luz de excitación transmitida. El monocromador no es perfecto y
transmitirá la luz con otras longitudes de onda diferentes a las establecidas. Un
monocromador ideal sólo transmite luz en el rango especificado y tiene una
transmisión independiente de la longitud de onda. Al medir en un ángulo de 90º, sólo
la luz dispersa por la muestra provoca luz. Esto se traduce en una mejor relación señal-
ruido, y reduce el límite de detección a un factor de aproximadamente 10000, si se
compara con la geometría de 180°. Por otra parte, la fluorescencia también puede ser
medida desde la parte delantera, procedimiento que se utiliza a menudo para las
muestras turbias.El detector puede ser de un solo canal o de múltiples canales. El
detector de un único canal sólo puede detectar la intensidad de una longitud de onda
en cada momento, mientras que el de múltiples canales detecta la intensidad en todas
las longitudes de onda simultáneamente, con lo que el monocromador de emisión o
filtro es innecesario. Los diferentes tipos de detectores tienen sus ventajas y
desventajas.
El fluorímetro más versátil, con monocromadores dobles y una fuente de luz de

excitación continua, puede registrar tanto un espectro de excitación como un espectro
de fluorescencia. Al medir los espectros de fluorescencia, la longitud de onda de la luz
de excitación se mantiene constante, de preferencia en una longitud de onda de alta
absorción, y el monocromador de emisión escanea el espectro. Para medir los
espectros de excitación, la longitud de onda que pasa a través del filtro o
monocromador de emisión se mantiene constante y el monocromador de excitación va
escaneando. El espectro de excitación generalmente es idéntico al espectro de
absorción, ya que la intensidad de la fluorescencia es proporcional a la absorción.
2. COMPETENCIAS
● Identifica los Métodos instrumentales ópticos para el control analítico de

procesos bioquímicos y farmacéuticos, teniendo en cuenta la precisión y
exactitud de estos
● .Conoce los elementos que forman parte y el fundamento del espectrofotómetro
UV-Vis
● Describe el fundamento del procedimiento de la determinación de absorbancia
● Describe las características de un espectro de absorción
24


INSUMOS
practica en aula.
● Realizar el seminario de la práctica
200 MINUTOS
La práctica consiste en el aprendizaje en base a la simulación donde el analista podrá
desarrollar cálculos pertinentes en base a la validación del método estudiado.
RESULTADOS DE APRENDIZAJE
Desarrolla un análisis específico con métodos instrumentales electroquímicos durante

la realización de prácticas de laboratorio.
8. CUESTIONARIO:
1.- ¿Para qué sirve un espectro de absorción de una sustancia orgánica?
2.- ¿Se podrá utilizar para corregir la longitud de onda para calibrar el equipo utilizado?
3.- ¿Será posible identificar una sustancia orgánica utilizando solo un espectro de
absorción?
4.- ¿Cómo se realiza la obtención de un espectro de absorción en forma manual?
25

Práctica Nº6
Seminario de espectrometría de Masas. Estudio de caso

La espectrometría de masas es una técnica de análisis que permite determinar la
distribución de las moléculas de una sustancia en función de su masa.
El espectrómetro de masas es un dispositivo que permite analizar con gran precisión
la composición de diferentes elementos químicos e isótopos atómicos, separando los
núcleos atómicos en función de su relación entre masa y carga (m/z). Puede utilizarse
para identificar los diferentes elementos químicos que forman un compuesto, o para
determinar el contenido isotópico de diferentes elementos en un mismo compuesto.
Con frecuencia se encuentra como detector de un cromatógrafo de gases, en una
técnica híbrida conocida por sus iniciales en inglés, GC-MS.
El espectrómetro de masas mide razones masa/carga de iones, calentando un haz de
material del compuesto a analizar hasta vaporizarlo e ionizar los diferentes átomos. El
haz de iones produce un patrón específico en el detector, que permite analizar el
compuesto. En la industria es una técnica altamente utilizada en el análisis elemental
de semiconductores, biosensores, cadenas poliméricas complejas, fármacos,
productos de síntesis química, análisis forense, contaminación
medioambiental, perfumes y todo tipo de analitos que sean susceptibles de pasar a
fase vapor e ionizarse sin descomponerse.
Analizador de masa
Parte eléctrica.
26

Parte magnética.
El analizador de masa es la pieza más flexible del espectrómetro de masa. Utiliza un
campo eléctrico o magnético para afectar la trayectoria o la velocidad de las partículas
cargadas de una cierta manera. La fuerza ejercida por los campos eléctricos y
magnéticos es definida por la fuerza de Lorentz:
donde:
● es el vector campo eléctrico

● es el vector campo magnético,
● es la carga de la partícula,
● es el vector velocidad y
● simboliza el producto vectorial.
Todos los analizadores totales utilizan las fuerzas de Lorentz de una manera u otra en
la determinación de masa-carga, estáticamente o dinámicamente. Además de los tipos
originales del área magnética, otros tipos de analizadores están actualmente en un
uso más común, incluyendo tiempo-de-vuelo, la trampa de iones con cuadrupolo,
cuadrupolo y Fourier transforma analizadores de la masa de la resonancia del ciclotrón
del ion. Además de estos hay muchos más analizadores totales experimentales y
combinaciones exóticas de analizadores.
Según lo mostrado arriba, los instrumentos del área cambian la dirección de los iones
que están volando a través del analizador total. Los iones, a causa del campo
magnético o el campo eléctrico, ven desviadas sus trayectorias en función de su masa
y su carga, de manera que cuanto más se desvíen, más ligeros serán. Así, el
27

analizador dirige las partículas al detector, variando un campo eléctrico o magnético

que se basa en el cociente masa/carga (m/z).
Actualmente existen diferentes métodos para "filtrar" los iones respecto a su relación
Masa/carga. El más comúnmente usado es el denominado cuadrupolo. Se compone
de 4 barras alargadas en formación cuadrada, conectadas eléctricamente entre sí en
pares opuestos. A dichos pares (polos) se les aplica una tensión de radiofrecuencia
variable que sintoniza con un determinado ion. Cuando existe sintonía entre el ion que
está pasando por ellas y la frecuencia aplicada, dicho ion continúa su camino
desviándose todos los demás no sintonizados fuera del cuadrupolo y de esta manera
no impactan en el detector.
La configuración de los actuales espectrómetros de masa pasa por disponer de uno,
dos y hasta tres cuadrupolos en serie (triplecuadrupolo muy en boga). Existen también
configuraciones no cuadripolares, como pueden ser los hexapolos, aunque su
funcionamiento es análogo al cuadripolo.
El analizador se puede utilizar para seleccionar una gama estrecha de m/z's o para
explorar a través de una gama de m/z's para catalogar los iones presentes:
● quizás el más fácil de entender es el analizador del Tiempo-de-vuelo (TOF) que se
integra típicamente con fuentes del ion de MALDI. Alza los iones a la
misma energía cinética por el paso a través de un campo eléctrico y mide los
tiempos que toman para alcanzar el detector. Aunque la energía cinética es igual,
la velocidad es diferente, así que el ion más altamente cargado del alumbrador
alcanzará el detector primero;
● los analizadores totales cuadrupolo y los campos eléctricos oscilantes del ion del
uso cuadrupolo de las trampas [ QIT ] estabilizan selectívamente o desestabilizan
los iones que caen dentro de una ventana estrecha de los valores de m/z. Fourier
transforma medidas del espectrometría de masa que se forma detectando la
corriente de la imagen producida por los iones ciclotronándolos en presencia de un
campo magnético. Poder escoger el analizador más adecuado para un
experimento depende del tipo de información que se obtiene del experimento.
Detector
El elemento final del espectrómetro total es el detector. El detector registra la carga
inducida o la corriente producida cuando un ion pasa cerca o golpea una superficie.
En un instrumento de exploración la señal es producida en el detector durante la
trayectoria de la misma (en qué m/z) y producirá un espectro de masa, un expediente
del m/z's en el cual los iones están presentes. Típicamente, se utiliza un cierto tipo de
multiplicador de electrones (electromultiplicador), aunque se han empleado otros
detectores (como las tazas de Faraday).
28

El funcionamiento del electromultiplicador se basa en el efecto cascada producido al

impactar un determinado ion (o iones) en el mismo. Aplicando una diferencia de
potencial entre sus extremos, se consigue aumentar el factor de amplificación, que
vendrá determinado por el número de subetapas amplificadoras que componen el
detector. Normalmente, es un componente sometido a desgaste que ha de
reemplazarse con el tiempo al perder eficiencia de amplificación.
Ya que el número de iones que dejan el analizador total en un instante particular es
realmente pequeño, una amplificación significativa es generalmente necesaria para
conseguir una señal mínimamente procesable. Los detectores de la placa de
Microchannel se utilizan comúnmente en instrumentos comerciales modernos. En
FTMS el "detector" es un par de placas de metal dentro de la región total del analizador
que los iones pasan solamente cerca. No se produce ninguna corriente de la C.C., sólo
una corriente débil de la imagen de la CA se produce en un circuito entre las placas.
2. COMPETENCIAS

INSUMOS
practica en aula.
Realizar el seminario de la práctica
5.TIEMPO DE DURACION DE LA PRÁCTICA
100 MINUTOS
29

El analista deberá identificar los requisitos para la validación de un método analítico

de un principio activo para utilizarlo como protocolo de laboratorio y a correspondiente
interpretación los resultados encontrados.
Aplica criterios experimentales de los Métodos instrumentales ópticos durante la

realización de prácticas de laboratorio.
8. CUESTIONARIO.-
1.- ¿Cuál es el principio de la Espectrometría de Masas?

2.- ¿Cuáles son los componentes principales de un Espectrómetro de Masas?
3.- Describa 3 tipos de ionización que se usan en Espectroscopia de masas.
4.- ¿Qué es el ion molecular?
5.- ¿Qué es el pico base?
6.- ¿Qué diferencias existen en los patrones de fragmentación con la presencia de
cada uno de los halógenos F, Cl, Br y I?
30

Practica N°7
Seminario de Resonancia Magnética Nuclear. Estudio de caso
1. Conocimiento Teórico.
En las imágenes por resonancia magnética nuclear (RMN) se utiliza un campo
magnético potente y ondas de radio de muy alta frecuencia para producir
imágenes muy detalladas. La RMN no utiliza rayos X y
por lo general es segura. (Véase también Introducción a
las pruebas de diagnóstico por la imagen.)
Resonancia magnética nuclear (RMN) del cerebro
IMAGEN PROPORCIONADA POR JON A. JACOBSON,

MD.
Resonancia magnética nuclear (RMN) de la rodilla
IMAGEN PROPORCIONADA POR JON A JACOBSON,

MD.
Procedimiento para la RMN

Para la RMN, la persona se recuesta sobre una mesa motorizada que se mueve
dentro del estrecho interior de un gran escáner tubular que produce un campo
magnético potente. Por regla general, los protones (componentes del núcleo atómico
con carga positiva) no se encuentran en una posición determinada en los tejidos. Sin
embargo, cuando los protones están rodeados por un campo magnético intenso,
como en un escáner de RMN, se alinean con dicho campo magnético. A continuación,
el escáner emite un pulso de ondas de radio, que momentáneamente impulsa los
protones "fuera de la línea". A medida que los protones se alinean con el campo
magnético, liberan energía (denominada «señal»). La
intensidad de la señal varía según el tejido. Los aparatos de
resonancia magnética nuclear (RMN) registran estas
señales. Posteriormente se utiliza una computadora para
analizar las señales y producir imágenes.
Resonancia magnética nuclear (RMN)
31

Las personas que realizan la prueba pueden cambiar la forma en que aparecen los
diversos tejidos en la exploración mediante la variación de los pulsos de ondas de
radio, la intensidad y la dirección del campo magnético, además de otros factores.
Por ejemplo, el tejido graso aparece oscuro en un tipo de exploración y brillante en
otro. Estas imágenes diferentes proporcionan información complementaria, por lo
que, a menudo, se obtiene más de una.
Puede inyectarse un medio de contraste que contiene

gadolinio (un medio de contraste paramagnético) en una
vena o una articulación. Los medios de contraste con
gadolinio modifican el campo magnético de manera que
las imágenes obtenidas son más nítidas.
Antes de realizar la prueba, la persona debe desnudarse
parcial o totalmente, y se le proporciona una bata que no
tiene botones, broches, cremalleras ni otros metales.
Todos los objetos de metal (como las llaves, las joyas y
los teléfonos móviles) y otros objetos que pudieran verse afectados por el campo
magnético (como tarjetas de crédito o relojes de pulsera), deben dejarse fuera de la
sala de resonancia magnética nuclear (RMN). La persona debe permanecer tumbada
y quieta cuando se toman las imágenes, y puede que sea necesario que contenga la
respiración en algunos momentos. Dado que el escáner emite ruidos fuertes, se le
pueden proporcionar auriculares o tapones para los oídos. La prueba puede durar
entre 20 y 60 minutos. Una vez finalizada, se pueden retomar las actividades diarias
inmediatamente.
Usos de la RMN
Se prefiere la resonancia magnética nuclear (RMN) a la tomografía
computarizada (TC) cuando el médico necesita más detalles sobre los tejidos
blandos, por ejemplo para obtener imágenes de anomalías en el cerebro, médula
espinal, músculos e hígado. La RMN es particularmente útil para identificar tumores
en estos tejidos.
La RMN también se utiliza para lo siguiente:
• Medir ciertas moléculas en el encéfalo que distinguen un tumor de un absceso
• Identificar alteraciones en los genitales femeninos y fracturas en la cadera y la

pelvis
• Facilitar al médico la valoración de ciertas anomalías articulares frecuentes

(como roturas de ligamentos o cartílagos de la rodilla) y esguinces
• Facilitar al médico la valoración de hemorragias e infecciones
32

La RMN también se utiliza cuando los riesgos de la TC son altos. Por ejemplo, la
RMN puede preferirse para personas que hayan tenido una reacción a los medios de
contraste yodados utilizados en la TC y para mujeres embarazadas (porque la
radiación puede causar problemas en el feto).
La RMN realizada después de inyectar un medio de contraste con gadolinio en una
vena facilita al médico la valoración de inflamaciones, tumores y vasos sanguíneos.
La inyección de este medio de contraste en una articulación permite al médico
obtener una imagen más nítida de las anomalías articulares, particularmente si son
complejas (como las lesiones o la degeneración de los ligamentos y los cartílagos de
la rodilla).
Tipos de RMN
RMN funcional
Esta técnica detecta los cambios metabólicos que se producen cuando el cerebro
está activo. Por lo tanto, puede mostrar las áreas del cerebro que se activan cuando
una persona realiza una tarea específica, tal como leer, escribir, recordar, calcular o
mover una extremidad. La resonancia magnética nuclear (RMN) funcional se puede
utilizar en entornos clínicos y de investigación, por ejemplo, para planificar cirugías
de epilepsia cerebral.
RMN por perfusión

Con esta técnica, el médico puede estimar el flujo de sangre en una zona en
particular. Esta información puede ser útil durante un accidente cerebrovascular para
determinar si la irrigación sanguínea a ciertas partes del cerebro se ha visto reducida.
También se puede utilizar para identificar las áreas donde el flujo de sangre está
aumentado, por ejemplo, en los tumores.
RMN ponderada por difusión

Esta técnica detecta cambios en los movimientos del agua de las células que no
están funcionando de manera normal. Se utiliza principalmente para identificar fases
tempranas de accidentes cerebrovasculares. También se utiliza para detectar ciertos
trastornos cerebrales, determinar si un tumor se ha extendido al cerebro o diferenciar
un absceso cerebral de un tumor. El uso de esta técnica para mostrar otras áreas del
cerebro es limitado. La RMN ponderada en difusión se combina a menudo con otras
técnicas para evaluar tumores, principalmente en el cerebro.
Espectroscopia por resonancia magnética nuclear

Esta técnica utiliza ondas de radio que se emiten de forma prácticamente continua
en lugar de emitirse en forma de pulsos, como en la resonancia magnética nuclear
(RMN) convencional. La espectroscopia por resonancia magnética nuclear se utiliza
para detectar trastornos cerebrales, como epilepsia, enfermedad de Alzheimer y
tumores y abscesos cerebrales. Este método puede distinguir entre el tejido muerto
dentro de un absceso y la presencia de células multiplicándose dentro de un tumor.
33

Esta técnica también se utiliza para valorar los trastornos metabólicos de los
músculos y el sistema nervioso.
Angiografía por resonancia magnética nuclear (ARM)

La angiografía por resonancia magnética nuclear (ARM), como la angiografía
convencional y la angiografía por TC, puede proporcionar imágenes detalladas de
los vasos sanguíneos. Sin embargo, es más segura y más fácil de realizar, aunque
más cara. A menudo, la ARM puede hacerse sin inyectar medios de contraste.
La angiografía por resonancia magnética nuclear puede mostrar el flujo sanguíneo a
través de las arterias y venas o el flujo sanguíneo que transcurre en una sola
dirección, y por lo tanto, solo muestra o arterias o venas (no ambas a la vez). Al igual
que con la angiografía por TC, se utiliza una computadora para eliminar de la imagen
todos los tejidos excepto los vasos sanguíneos.
A menudo, se inyecta en una vena un medio de contraste con gadolinio para delinear
los vasos sanguíneos. La persona que realiza la prueba programa cuidadosamente
los tiempos de escaneado, de manera que las imágenes se toman cuando el
gadolinio se concentra en los vasos sanguíneos que están siendo valorados.
La angio-RM se utiliza para valorar los vasos sanguíneos del cerebro, el corazón, los
órganos abdominales, los brazos y las piernas. Se utiliza para detectar los trastornos
siguientes:
• Aneurismas aórticos
• Disección de aorta
• Estrechamiento de las arterias de las extremidades
• Trombos en las venas de las extremidades y la pelvis
• Flujo sanguíneo a los tumores
• Tumores que afectan a los vasos sanguíneos
Venografía por resonancia magnética nuclear

Este término se refiere específicamente a la ARM de las venas. A menudo se utiliza
para detectar trombos en una vena que lleva sangre desde el cerebro (trombosis
venosa cerebral) y para controlar la respuesta al tratamiento de este trastorno.
Secuencias de imágenes eco-planares

Esta técnica ultrarrápida produce secuencias de imágenes en segundos. Puede
utilizarse para obtener imágenes del cerebro, el corazón y el abdomen. Dado que se
trata de una técnica rápida, el movimiento de la persona examinada no distorsiona
34

tanto las imágenes. Además, la técnica puede proporcionar información acerca del
funcionamiento de los tejidos.
Sin embargo, requiere un equipo especial y, debido a su naturaleza, es más probable

que esta técnica distorsione ciertas estructuras en comparación con la RMN
convencional.
Desventajas de la RMN
El tiempo necesario para realizar una RMN es más largo que el necesario para la TC.
Además, es menos probable que esté disponible de inmediato la RMN que la TC. Por
lo tanto, la TC puede ser preferible en situaciones de urgencia, como lesiones graves
y accidentes cerebrovasculares. El coste económico de la RMN es, además, superior
al de la TC.
Otras desventajas incluyen
• Claustrofobia y a veces dificultades para entrar en la máquina de RMN ya que

es un espacio pequeño y cerrado
• Los efectos que ejerce el campo magnético en los dispositivos metálicos

implantados en el cuerpo del paciente
• Reacciones al agente de contraste
Problemas relacionados con el espacio pequeño y cerrado

El espacio en el interior del escáner de RMN es pequeño y cerrado, por lo que hay
personas que pueden sentir claustrofobia, incluso cuando los espacios cerrados no
les produzcan ansiedad de manera habitual. Algunas personas obesas tienen
dificultad para entrar en el escáner.
Algunos escáneres de RMN (llamados escáneres abiertos de RMN), tienen un lado

abierto y un interior más amplio. En ellos, las personas pueden sentir menos
claustrofobia, y los obesos pueden entrar con mayor facilidad. Las imágenes
producidas en escáneres de RMN abiertos pueden ser de peor calidad que las
producidas por los cerrados, dependiendo de la potencia de los imanes, pero aun así
pueden utilizarse para realizar diagnósticos.
A las personas que se sienten preocupadas y ansiosas por tener que realizarse una
RMN se les puede administrar un ansiolítico, como alprazolam o lorazepam, de 15 a
30 minutos antes del escáner.
Efectos del campo magnético
Por lo general, la RMN no se utiliza si la gente tiene
• Ciertos materiales (como metralla) en determinadas partes de su cuerpo,

especialmente en el ojo
35

• Dispositivos implantados que puedan verse afectados por los campos

magnéticos potentes
Entre estos dispositivos se encuentran algunos tipos de marcapasos cardíacos,

desfibriladores, implantes cocleares y clips magnéticos metálicos utilizados en el
tratamiento de aneurismas. El campo magnético utilizado en la RMN puede provocar
que un dispositivo implantado se desplace, se sobrecaliente o funcione de forma
inadecuada. Es más probable que el dispositivo se vea afectado si se ha implantado
en las 6 semanas previas a la prueba (porque el tejido cicatricial, que contribuye a
mantener el dispositivo en su lugar, aún no se ha formado correctamente). Estos
dispositivos también pueden distorsionar las imágenes de la RMN.
En cambio otros dispositivos, tales como los implantes dentales comunes, una
prótesis en la cadera o las varillas utilizadas para enderezar la columna vertebral no
resultan afectados al realizar una RMN.
Antes de realizar una RMN, las personas que tienen un dispositivo implantado deben
informar a su médico, quien determinará si es seguro realizar esta prueba de imagen.
El campo magnético de la resonancia magnética nuclear (RMN) es muy potente y

está siempre activo. Por este motivo, si un objeto metálico (como un tanque de
oxígeno o un portasueros) se encuentra cerca de la entrada en la sala de exploración,
puede ser empujado dentro del escáner a una gran velocidad. Si esto ocurre, puede
lesionar a la persona que está siendo explorada y en algunos casos resulta difícil
separar el objeto del imán.
Reacciones al agente de contraste empleado en la RMN

Los medios de contraste con gadolinio pueden provocar dolor de cabeza, náuseas,
dolor y sensación de frío en el lugar de la inyección, distorsión del gusto y mareos.
Con estos contrastes, es mucho menos probable que se produzcan reacciones

graves que con los medios de contraste yodados utilizados en la TC convencional y
en la angiografía por TC.
Sin embargo, puede desarrollarse un trastorno grave y potencialmente mortal,

denominado fibrosis sistémica nefrógena, si se utilizan agentes de contraste que
contengan gadolinio en personas que ya sufren problemas renales graves o están
sometidas a diálisis. En la fibrosis sistémica nefrogénica, la piel, el tejido conjuntivo
y los órganos aumentan de grosor. Pueden aparecer manchas rojas u oscuras en la
piel, o esta puede sentirse tirante, los movimientos pueden resultar más difíciles y
limitados y es posible que los órganos funcionen de forma inadecuada. Para evitar la
aparición de dicha enfermedad, los médicos tienen en cuenta los aspectos
siguientes:
36

• Determinar si los riñones están funcionando de forma correcta, comprobando

la historia clínica del paciente y realizando análisis de sangre y orina
• Utilizar gadolinio sólo cuando sea necesario, y emplear la dosis más baja y el
agente más seguro posible
• Considerar otras pruebas de diagnóstico por la imagen si el paciente tiene

problemas renales graves
2. COMPETENCIAS

INSUMOS
practica en aula.
100 MINUTOS

37

Aplica criterios experimentales de los Métodos instrumentales ópticos durante la

realización de prácticas de laboratorio.
8. CUESTIONARIO.-
1.- ¿Cuál es el principio de la RMN?

2.- Investigue la aplicabilidad de este equipo y su importancia.
3.- El profesional del área esta capacitado para el manejo de un RMN , justifique
38

Práctica Nº8
Seminario de biosensores. Estudio de caso.
1. INTRODUCCION -SIGNIFICACION CLINICA

La patología más común relacionada con el metabolismo de los hidratos de carbono
es la diabetes mellitus. El diagnóstico precoz y el control de los pacientes diabéticos,
tienen por objeto evitar la cetoacidosis y las complicaciones de los síntomas
resultantes de la hiperglicemia, mediante el tratamiento adecuado. Dado que existen
múltiples factores causales de hiper o hipoglicemia, debe considerarse en cada caso
la condición fisiológica y/o la patología presente en el paciente en cuestión.
2. COMEPTENCIAS

3. FUNDAMENTOS DEL METODO

El esquema de reacción es el siguiente:
GOD
glucosa + O2 + H2O ácido glucónico + H2O2
POD
2 H2O2 + 4- AF + fenol quinona coloreada + 4 H2O






39









Papel filtro varios










40

25 Star fax. 2
INSUMOS

1 1 Pza Cantidad solicitada para 25 estudiantes, para
Glucómetro –biosensor cada grupo de la asignatura a-1, a-2
5. PROCEDIMIENTO
PROCEDIMIENTO
En tres tubos marcados B (Blanco) S (Standard) y D (Desconocido) colocar:
B S D
Standard - 20 ul -
Muestra - - 20
ul
Reactivo de 2 ml 2 ml 2
Trabajo ml
Incubar 10 minutos en baño de agua a 37oC. Luego leer en espectrofotómetro a 505 nm o
en fotocolorímetro con filtro verde (490-530 nm) llevando el aparato a cero con el blanco.
6. CALCULO DE LOS RESULTADOS
1,00 g/l
glucosa g/l = D x f donde f =
S
METODO DE CONTROL DE CALIDAD

Procesar 2 niveles de un material de control de calidad (Standatrol S-E 2 niveles) con
concentraciones conocidas de glicemia, con cada determinación.
VALORES DE REFERENCIA
Se analizaron con Glicemia enzimática, 120 muestras de individuos en ayunas, de
ambos sexos, con edades comprendidas entre 20 y 45 años, provenientes de la ciudad
de Rosario (Argentina), sin síntomas de diabetes o cualquier otra enfermedad
aparente. Se encontró que el 95% de los resultados cubrieron el siguiente rango:
Suero o plasma: 0,70 a 1,10 g/l
En la literatura (Tietz, N.W.) se menciona el siguiente rango de referencia:
Suero o plasma: 0,74 - 1,06 g/l
Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia,
teniendo en cuenta sexo, edad hábitos alimenticios y otros factores.
CONVERSION DE UNIDADES
Glucosa (g/l) = Glucosa (mg/dl) x 0,01
Glucosa (mg/dl) x 0,0555 = Glucosa (mmol/l)
41

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. Los reductores disminuyen la
respuesta de color, mientras que los oxidantes colorean el Reactivo aumentando los
Blancos. Dichos agentes son frecuentemente encontrados en el agua destilada
empleada para preparar el Reactivo de Trabajo, por lo que se recomienda controlar la
calidad de la misma.
Los detergentes, metales pesados y cianuros son inhibidores enzimáticos.
PERFORMANCE
f) Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en 10 días
diferentes, se obtuvo lo siguiente:
Nivel D.S. C.V.
1,00 g/l ± 0,022 g/l 2,37 %
2,00 g/l ± 0,030 g/l 1,50 %
g) Recuperación: agregando cantidades conocidas de glucosa a distintos sueros,
se obtuvo una recuperación entre 99 y 101%.
h) Linealidad: la reacción es lineal hasta 4,5 g/l. Para valores superiores, diluir 1/2
la solución coloreada final con el Reactivo de Trabajo y repetir la lectura multiplicando
el resultado final por dos.
i) Exactitud: empleando el método de la hexoquinasa como referencia, se
observa que la correlación estadística entre ambos métodos es excelente (r= 0,99).
j) Sensibilidad: el mínimo límite de detección es 0,0054 g/l y la sensibilidad
analítica es de 0,042 g/l.
7 TIEMPO DE DURACION DE LA PRÁCTICA:

100MINUTOS
8 MEDICIÓN, CALCULOS Y GRAFICOS.-

(ppm)
- Calcular de la concentración de glucosa en las muestras.
-Validar el método de manera estadística .
9 RESULTADO DE APRENDIZAJE.

42


10 CUESTIONARIO
a) ¿Cuáles son los pchmetro más actuales , investigue
b) Investigue como se calibra un pchmetro.
c) Que cuidados se deben tener al manejar un equipo potenciómetrico
43

Práctica Nº9
Refractometría en muestras diversas
1. INTRODUCCION
El índice de refracción de un aceite es un indicador de pureza y parte de su control de

calidad con el fin de verificar su pureza o adulteración.
2. COMPETENCIAS
Analiza diferentes Métodos instrumentales no espectrofotométricos para su aplicación

en diferentes áreas de su formación a través de un control de calidad estadístico.
3. FUNDAMENTO TEORICO
El fenómeno de la refracción está basado en el cambio de velocidad que experimenta

la radiación electromagnética al pasar de un medio a otro, como consecuencia de su
interacción con los átomos y moléculas del otro medio. Dicho cambio de velocidad se
manifiesta en una variación en la dirección de propagación.
La medida relativa de la variación entre dos medios tomando uno fijo como referencia
se le conoce como índice de refracción n y en general está expresado con respecto al
aire. El instrumento para medir n, es básicamente un sistema óptico que busca medir
el ángulo que se ha desviado la radiación, utilizando para ello dos prismas: uno fijo de
iluminación sobre el cual se deposita la muestra y uno móvil de refracción. Los prismas
están rodeados de una corriente de agua termostatizada, ya que la temperatura es
una de las variables que afecta a la medida Cuando la radiación electromagnética
atraviesa un límite entre dos medios, cambia su velocidad de propagación. Si la
radiación incidente no es perpendicular al límite, también cambia su dirección. El
cociente entre la velocidad de propagación en el espacio libre (vacío) y la velocidad de
propagación dentro de un medio se llama índice de refracción del medio.

44














Papel filtro varios





45






25 Star fax. 2
INSUMOS

1 1 Pza Cantidad solicitada para 25 estudiantes, para
Refractómetro ABBE cada grupo de la asignatura a-1, a-2
Espectrofotómetro o
fotocolorímetro.
2 - 1 Pza Cantidad solicitada para 25 estudiantes, para
- Tubos o cubetas espectrofotométricas de caras
paralelas.
- .
3 10 Uni cada grupo de la asignatura a-1, a-2
4 Baño de agua a 37oC. - Reloj o timer 1 pza cada grupo de la asignatura a-1, a-2
5 Star fax 1 Uni cada grupo de la asignatura a-1, a-2
5. PROCEDIMIENTO
▪ Preparamos solución de azúcar-agua para concentraciones de porcentaje en peso: 10,
20, 35, 50, 65, 80, 85. 9
▪ Para todas concentraciones seguir el siguiente procedimiento para determinar el índice
de refracción.
▪ Abrir el prisma.
▪ Frotar ambas caras del prisma con un pedazo de algodón humedecido con alcohol.
▪ Una vez limpias y secas introducir una gota de solución de azúcar.

100 Minutos
- Calcular el índice de refracción de cada muestra

46

-Validar el método de manera estadística.
8. RESULTADO DE APRENDIZAJE.

Identifica los Métodos instrumentales ópticos no espectrofotométricos para el control

analítico de procesos bioquímicos y farmacéuticos, teniendo en cuenta la precisión y
exactitud de estos en base a su validación.
9. CUESTIONARIO
a) Qué tipo de refractómetros existen, investigue.
b) Cuáles son las ventajas y desventajas de refractómetro ABBE.

c) Indique la importancia de determinar el índice de refracción en algunas
muestras.
47

Práctica Nº10
Seminario de Polarografia. Estudio de caso
1. INTRODUCCION
La polarografía es una medida voltamperométrica cuya respuesta está determinada
por el transporte combinado de masa difusión/convección. La polarografía es un tipo
específico de medida que cae en la categoría general de voltamperometría de barrido
lineal, donde el potencial de electrodo se encuentra alterado en forma lineal desde el
potencial inicial hasta el potencial final. Como método de barrido lineal controlado por
el transporte de masa por difusión/convección, la respuesta corriente vs. potencial de
un experimento polarográfico tiene la típica forma sigmoidal. Lo que hace a la
polarografía diferente de otras medidas de voltamperometría lineal de barrido es que
polarografía hace uso del electrodo de gota.
Una gráfica de la corriente vs. potencial en un experimento de polarografía muestra
las oscilaciones de corriente correspondientes a las gotas de mercurio que caen desde
el capilar. Si se conecta el máximo de corriente de cada gota resultaría una forma
sigmoidea. La corriente limitante (la meseta en el sigmoide), llamada corriente de
difusión porque la difusión es la principal contribución al flujo de material electroactivo
en este momento de la vida gota de mercurio, se relaciona con la concentración
del analito .
2. COMPETENCIAS
Analiza diferentes Métodos instrumentales no espectrofotométricos para su aplicación

en diferentes áreas de su formación a través de un control de calidad estadístico.
INSUMOS
practica en aula.
4. DURACION DE LA PRÁCTICA
100 Minutos
48


no espectrofotométrico útil en el analisis de diferentes muestras validando el mismo
para ser utilizado
Desarrolla un análisis específico con métodos instrumentales no
espectrofotométricos durante la realización de prácticas de laboratorio.
7. CUESTIONARIO
a) Investigue algunos tipos de equipos polarograficos y refactometricos.
b) Explique la utilidad de equipos refactometricos en las diferentes áreas de la
carrera.
49

Práctica Nº11
Aplicación de equipos potenciométricos
1. CONOCIMIENTO TEORICO REQUERIDO. -
El pH es una medida indirecta de la concentración de iones hidrogeno en una

determinada solución. Muchas reacciones químicas y bioquímicas se producen a
valores específicos o en rangos determinados de pH, por lo cual es de importancia la
medida de este parámetro.
La medida del pH puede realizarse a través de mediciones potenciométricas
(peachimetro) y por cambios de coloración de los compuestos (papel tornasol,
indicadores químicos).
El estudiante deberá ser capaz de medir el nivel pH que producirá una solución de un
compuesto determinado.
2. COMPETENCIAS. -
- Desarrolla diferentes tipos de análisis clínico y farmacéutico, para asegurar la

calidad de los resultados utilizando diferentes métodos instrumentales
electroquímicos, considerando la naturaleza de los analitos.
- Utiliza criterios de equilibrio químico mediante métodos del análisis químico
para preparación de soluciones utilizadas en el campo de la profesión.
- El alumno aprenderá el concepto de pH, las diferentes formas de medición y se
familiarizará con equipos y materiales necesarios para la medición de este
parámetro.
- Por las características del compuesto, el alumno podrá predecir el nivel de pH
de la solución que obtendrá a partir de esta.
3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.-


Cantidad solicitada para 25 estudiantes ,
1 Pipetas de 5 y 10 mL 6 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2.
2 Peras 6 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2.
3 Propipetas 6 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2.
4 Vasos de precipitado 100, 250, 500 ml 8 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2.
5 Matraces aforados 50 ml 6 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2.
50


6 Vidrio de reloj 6 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2.
7 Espátulas 6 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2.
8 Probetas de 100 y 250 ml 8 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2.
9 Goteros 15 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2.
Micropipetas Cantidad solicitada para 25 estudiantes ,
10 3 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2.
11 Picetas 4 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2.
12 Puntas para micro pipetas 40 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2.
13 Embudos 6 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2.
14 Varillas 6 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2.
Papel filtro varios Cantidad solicitada para 25 estudiantes ,
16 Pinzas de madera 10 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2.
17 Frascos de orina estéril 6 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2.
Cola de zorro Cantidad solicitada para 25 estudiantes ,
19 Morteros 6 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2.
20 Centrifugadora 1 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2.
21 Buretas25 ml 4 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2.
22 Pinzas para bureta y soportes 4 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2.
Cantidad solicitada para 25 estudiantes,
para cada grupo de la asignatura a-1, a-2.
25 Tubos de ensayo 40
26 Gradillas de metal o madera 4 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2.
27 Papel tornasol , tiras de Ph 15

28
Estufas y rejillas de amianto 4
29 Pchmetro 2
30 Balanza semianalitica 1 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2.
31 Balanza analítica 3 Cantidad solicitada para 25 estudiantes ,

para cada grupo de la asignatura a-1, a-2
51

INSUMOS

1 HCl 5 ml 1 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2
2 H2SO4 5ml 1 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2
3 NaOH 5 gr 1 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2
4 NaCl 5 gr 1 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2
5 Etanol 70% 15 ml 1 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2
6 Ácido acético 15 ml 1 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2
7 NaOH 5 gr 1 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2
NaCl Cantidad solicitada para 25 estudiantes ,
8 5 gr 1 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2
Fenolftaleína, naranja de metilo, verde de bromo
cresol. Cantidad solicitada para 25 estudiantes ,
9 2 ml 1 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2
CaCO3
Muestras a sleccionar para cada equipo de Cantidad solicitada para 25 estudiantes ,
10 trabajo designado por el docente. 5 gr 1 para cada grupo de la asignatura a-1, a-2
4. TECNICA Ó PROCEDIMIENTO.-
- De acuerdo a las indicaciones del docente, realizar los cálculos de las

soluciones indicadas.
- Pesar (en el caso de sólidos) ó medir (en el caso de líquidos) la cantidad de
soluto necesario.
- Agregar el soluto al material de vidrio adecuado y aforar con agua destilada
hasta el volumen solicitado por el docente.
- Colocar en el envase de la solución datos como nombre de la solución,
concentración, nombre de la persona que lo realizo y fecha.
- De una cantidad necesaria de la solución proceder a la medición del pH de la
misma usando el peachimetro, anotar el valor.
- A esta misma cantidad de solución medir el pH con ayuda del papel tornasol,
anotar el valor.
- Colocar la solución en tubos de ensayo, adicionar 2 a 3 gotas de los
indicadores químicos y observar.
5. TIEMPO DE DURACION DE LA PRACTICA.-
El tiempo de duración de la práctica es de 150 min.
52

- Analiza diferentes muestras en base a la determinación del pH como

indicador de calidad seleccionando la técnica y metodología correcta
considerando su validación.
La fórmula del pH es:

pH = - log([H+]
A partir de esta se despeja la concentración de iones hidrogeno como:
[H+] = 10-pH
8. CALCULOS , GRAFICOS ,RESULTADOS.-
- El analista deberá, tabular, organizar los resultados dependiendo del

analisis designado.
- Desarrollo de POES.
9. CUESTIONARIO.-
1. ¿Por qué la solución del acetato de sodio presenta un pH básico? Realice

las reacciones respectivas. Estime el valor del pH en forma teórica a partir
del equilibrio acido-base de este compuesto.
2. ¿Por qué la solución del cloruro de amonio presenta un pH ácido? Realice
las reacciones respectivas. Estime el valor del pH en forma teórica a partir
del equilibrio acido-base de este compuesto
53

Práctica N°12
Seminario métodos instrumentales electroquímicos: Electroforesis

Electroforesis en gel
La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN (u
otras macromoléculas, como ARN y proteínas) por su tamaño y carga. La
electroforesis consiste en aplicar una corriente a través de un gel que contiene las
moléculas de interés. Con base en su tamaño y carga, las moléculas se desplazarán
por el gel en diferentes direcciones o a distintas velocidades, con lo que se separan
unas de otras.
Todas las moléculas de ADN tienen la misma cantidad de carga por masa. Debido a
esto, la electroforesis en gel separa los fragmentos de ADN únicamente por su tamaño.
La electroforesis nos permite ver cuántos fragmentos diferentes de ADN están
presentes en una muestra y cuán grandes son unos con respecto a otros. También
podemos determinar el tamaño absoluto de un fragmento de ADN examinándolo junto
a una "escala" estándar de fragmentos de tamaño conocido
Como su nombre lo indica, en la electroforesis en gel participa un gel: un bloque de
material similar a la gelatina. Los geles para separar ADN suelen estar hechos de un
polisacárido llamado agarosa, que se consigue como hojuelas secas pulverizadas.
Cuando la agarosa se calienta en una solución amortiguadora (agua mezclada con
algunas sales) y deja enfriar, se forma un gel sólido ligeramente blando. A nivel
molecular, el gel es una matriz de moléculas de agarosa que se mantienen unidas por
puentes de hidrógeno y que forman pequeños poros.
En un extremo, el gel tiene muescas en forma de ranuras llamadas pozos, que son
donde se colocarán las muestras de ADN:
Una vez que el gel está en la cámara, cada una de las muestras de ADN que queremos
analizar (por ejemplo, cada reacción de PCR o cada plásmido digerido con enzimas
de restricción) se transfiere cuidadosamente a uno de los pozos. Un pozo se reserva
54

para el marcador de peso molecular, un estándar de referencia que contiene

fragmentos de ADN de longitudes conocidas. Los marcadores de ADN comerciales
cubren diferentes intervalos de tamaños, por lo que trataremos de usar uno con buena
"cobertura" en el intervalo de tamaños en el que esperamos encontrar nuestros
fragmentos.
A continuación, se aplica energía eléctrica a la cámara y empieza a fluir corriente a
través del gel. Los grupos fosfato de su esqueleto de azúcares-fosfato le otorgan una
carga negativa a las moléculas de ADN, por lo que comienzan a moverse a través de
la matriz de gel hacia el polo positivo. Cuando el sistema está encendido y pasa
corriente por el gel, se dice que el gel está corriendo.
Las muestras de ADN se cargan en pozos en el extremo del gel más cercano al
electrodo negativo.
Se enciende la fuente de poder y los fragmentos de ADN migran a través del gel (hacia
el electrodo positivo).
Cuando el gel ha corrido, los fragmentos se separan por tamaño. Los fragmentos más
grandes están cerca de la parte superior del gel (del electrodo negativo, donde
comenzaron) y los fragmentos más pequeños, cerca del fondo (del electrodo positivo).
Basado en un diagrama similar de Reece et al.^22squared
Conforme corre el gel, los fragmentos más cortos de ADN viajarán más rápido a través
de los poros de la matriz del gel que los fragmentos más grandes. Después de un rato
que ha corrido el gel, los fragmentos más cortos de ADN estarán más cerca del
extremo positivo del gel y los más largos se mantendrán cerca de los pozos. Los
fragmentos de ADN muy pequeños podrían correr hasta salirse del gel si lo dejáramos
corriendo por demasiado tiempo (¡algo de lo que definitivamente he sido culpable!).
55

Visualización de los fragmentos de ADN
Una vez que los fragmentos se han separado, podemos examinar el gel y saber el
tamaño de las bandas que se encuentran en él. Cuando un gel se tiñe con un pigmento
que se une al ADN y se coloca bajo luz UV, los fragmentos de ADN brillarán, lo cual
nos permite ver el ADN presente en distintos lugares a lo largo del gel.
El pb que está al lado de cada número en el

marcador indica cuántos pares de
bases tiene el fragmento de ADN.
Una "línea" de ADN bien definida en un gel
se llama banda. Cada banda contiene un
gran número de fragmentos de ADN del
mismo tamaño que han viajado juntos a la
misma posición. Un fragmento único de ADN
(o incluso un pequeño grupo de fragmentos
de ADN) no sería visible por sí mismo en un
gel.
Al comparar una banda en una muestra con el marcador de peso molecular, podemos
determinar su tamaño aproximado. Por ejemplo, la banda brillante del gel anterior tiene
un tamaño aproximado de 700700700 pares de bases (pb).
ELECTROFORESIS CAPILAR
La electroforesis capilar (EC) es una técnica de separación utilizada en distintas áreas
(química, bioquímica, etc.) para separar las diferentes moléculas presentes en una
disolución de acuerdo con la relación masa/carga de las mismas. La separación se
lleva a cabo en un tubo hueco de diámetro muy pequeño (menos de 50 µm de
diámetro), de ahí que reciba el nombre de capilar.
Dentro del capilar de separación se encuentra la disolución que contiene los analitos
o las moléculas a separar y el tampón o medio electrolítico que es el encargado de
conducir la corriente. El interior se encuentra formado por grupos silanol (Si-OH), los
56

cuales al ser desprotonados (Si-O), elevan considerablemente pH y favorecen la

presencia de analitos específicos.
Como se ha dicho, la separación se lleva a cabo según la relación masa/carga de las
distintas moléculas. Para que esto sea posible es necesario aplicar una diferencia de
potencial (de 100 a 500 V/cm) entre los dos extremos del capilar que hará que las
moléculas se muevan hacia un extremo u otro del capilar (movilidad electroforética: las
moléculas catiónicas hacia el polo negativo y las aniónicas hacia el polo positivo) y
que se vayan separando entre sí.
Además, existe dentro del capilar otro fenómeno denominado flujo
electroosmotico que se da debido a que la superficie interna del capilar está cargada.
El flujo electroosmótico es el mismo dentro de todo el capilar y afecta de igual forma a
todas las moléculas arrastrándolas hacia uno de los extremos. Así, la separación se
verá afectada por el flujo electroosmótico y por la movilidad electroforética de cada una
de las moléculas.
La inducción del alto potencial eléctrico permite:
1) que la separación sea más sensible entre las diferentes moléculas (aumento de
la resolución) y
2) que el tiempo de análisis sea más corto.
La eficacia y la velocidad de la separación se pueden mejorar mediante
la optimización de diferentes factores como son la temperatura, el voltaje aplicado, el
medio de separación, el disolvente en el que se encuentra disuelta la muestra, etc.
Generalmente se obtienen tiempos de análisis bastante bajos si se compara con otras
técnicas separativas como la cromatografía de gases o la de líquidos. Además, el
consumo de muestra y reactivos es muchísimo menor por lo que se la puede
considerar una técnica más limpia.
Es muy versátil ya que se puede emplear para separar cualquier tipo de compuesto
eligiendo bien el detector; se puede acoplar a un detector UV, de fluorescencia, un
espectrómetro de masas, etc.
Todas estas características convierten a la EC en un método eficiente y económico,
capaz de separar cientos de componentes de forma simultánea, empleando
cantidades mínimas de muestras y reactivos.
2. COMPETENCIAS
Selecciona de manera pertinente los métodos instrumentales de separación

innovadores, para el desarrollo de todo tipo de análisis considerando la identificación,
cuantificación y aislamiento de diferentes analitos presentes en muestras.
57

3.MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS
INSUMOS
practica en aula.

100 MINUTOS
6. MEDICIÓN, CALCULOS Y GRAFICOS

7.RESULTADOS DE APRENDIZAJE
Diferencia los Métodos instrumentales por separación considerando la bibliografía

actual y guías de práctica proporcionada.
8. CUESTIONARIO
1.- ¿Qué es una solución buffer y cómo se prepara?

2.- ¿Qué relación existe entre el pH y la migración iónica?
3.- ¿A qué se denomina contra electroforesis?
4.- ¿Se producirá calor en el proceso de la electroforesis?, explicar al respecto.
5.- ¿Qué es un cromatograma y que información puedo obtener de él?
6.- ¿Qué indican los parámetros cromatográficos conocidos como: eficiencia,
selectividad, factor de capacidad y resolución?
7.- ¿Qué es el poder de elución y cuál es el parámetro que nos lo da en cromatografía
de gases?
58

Práctica Nº13
Seminario de biosensores Electroquímicos
1. INTRODUCCION
Como se describió en el artículo introductorio de este número, las enzimas son
catalizadores biológicos producidos por los seres vivos para acelerar las reacciones
bioquímicas. Esa capacidad es explotada por el hombre para generar diversos bienes
y servicios, entre ellos, la detección de moléculas de un cierto compuesto, saber si
está presente o no en determinado ambiente, y en qué concentración está. Los
biosensores, por otro lado, son dispositivos que proporcionan información cualitativa,
cuantitativa o semicuantitativa del medio ambiente que lo rodea a partir de reacciones
bioquímicas específicas. De acuerdo con la Unión Internacional de Química Pura y
Aplicada (IUPAC, por sus siglas en inglés), un biosensor es un dispositivo que usa
reacciones bioquímicas específicas mediadas por enzimas, anticuerpos, organelos,
tejidos o células completas para detectar compuestos químicos usualmente por
señales eléctricas, térmicas u ópticas (FLORINEL, 2012).
Los elementos biológicos mencionados funcionan como elementos de reconocimiento,
es decir, entran en contacto directo con el compuesto químico que nos interesa
detectar (llamado analito), generando un cambio particular que otro componente del
sensor, el elemento transductor, convierte en una señal fácilmente medible. En
algunas ocasiones, entre el elemento de reconocimiento y el transductor se establece
un tercer componente: una interfase para amplificar más la señal o hacer más estable
el dispositivo. En la Figura 1 se esquematiza un biosensor con los componentes
básicos que lo integran.
Figura 1. Representación esquemática de un biosensor.
59

Para fabricar un biosensor se debe conocer por separado cada componente que lo
conforma. Esto permite construirlo como un dispositivo integrado, es decir, en el que
los componentes existen como si fueran uno
solo.
Figura 2. Representacion esquematica de la
cloroperoxidasa de Caldariomyces fumago,
donde se muestran en colores los diferentes
aminoácidos reactivos en la enzima: rojo
(lisinas), verde (ácidos glutámico) y amarillo
(histidinas y tirosinas). En rosa se muestra el
grupo hemo, sitio activo de la enzima.
En el caso de los biosensores enzimáticos, el elemento de reconocimiento es una
enzima. A manera de ejemplo, en la Figura 2 se muestra la estructura tridimensional
de una enzima en la que se ilustran los diversos grupos químicos que están expuestos
en la superificie (por ejemplo, carboxilos y aminos); estos grupos químicos, siempre
que no sean esenciales para la función de la enzima como elemento de
reconocimiento, pueden ser empleados para unir la enzima al transductor a través de
enlaces químicos o simple adsorción.
Como se mencionó, el anclaje o unión de la enzima al transductor usualmente se

produce mediante una interfase que puede ser orgánica, inorgánica o híbrida. Las que
recientemente son más utilizadas son los nanomateriales, tales como nanopartículas
de oro, plata, sulfuro de cadmio, de carbono o sílice. Éstas deben ser modificadas para
ser compatibles a las enzimas. La Figura 3 ejemplifica la integración entre enzima,
interfase, y transductor para la construcción de un biosensor. El método óptimo de
integración de los componentes del biosensor será aquel que permita una respuesta
rápida, sensible, selectiva, reproducible, precisa, exacta, y que le dé estabilidad al
dispositivo.
60

Figura 3. Construcción de un biosensor

electroquímico a base de la enzima cloroperoxidasa (elemento de reconocimiento). La
enzima se une al transductor (electrodo de grafito) mediante una interfase compuesta
de ácido mercaptopentanoico y nanopartículas de oro. La interface puede unirse
covalentemente a la enzima por ejemplo por un enlace amida, entre el grupo amino de
las lisinas superficiales de la enzima con el grupo carboxilo del ácido (elaboración
propia).
Los biosensores enzimáticos son muy utilizados debido principalmente a su alta

selectividad, es decir, la capacidad de reconocer un tipo de compuesto en particular
en una mezcla donde otros están presentes. Normalmente, un biosensor enzimático
cuantifica la concentración del analito a partir del efecto producido por la reacción
catalizada. Como consecuencia de la reacción enzimática puede ocurrir un cambio de
color, un cambio en la concentración de los protones o electrones en la muestra, un
desprendimiento o una captación de gases, una emisión de luz o de calor, o bien la
producción de compuestos de productos electroactivos. Todos esos cambios pueden
ser transformados por medio de un transductor a una señal amplificada y medible por
el usuario final.
Un biosensor puede ser clasificado en óptico, piezoeléctrico, térmico o electroquímico

dependiendo del transductor utilizado para medir dichos cambios. Los biosensores
enzimáticos electroquímicos (aquellos cuyo transductor es un electrodo) son el tipo
más común debido a que presenta múltiples ventajas como: mínima preparación de la
muestra, alta sensibilidad y selectividad, conversión directa de la señal electroquímica
a señales eléctricas (lo que repercute en simplicidad de diseño y operación), rapidez,
viabilidad en costo, miniaturización y portabilidad, entre otros.
El primer biosensor enzimático, de tipo electroquímico para la detección de glucosa en

sangre, fue desarrollado en el Hospital Infantil de Cincinnati, en Estados Unidos, por
Clark y Lyons en el año de 1962. El dispositivo consistió en confinar a la enzima
glucosa oxidasa (abreviada como GOx) dentro de membranas semipermeables unidas
a un electrodo, con el fin de detectar oxígeno. El principio de detección fue el siguiente:
la GOx cataliza la reacción entre oxígeno
61

y glucosa, produciendo peróxido de hidrógeno (H2O2) y ácido glucónico. La

concentración de glucosa se determina indirectamente cuantificando el oxígeno
remanente, cuya concentración disminuye conforme avanza la reacción. Después de
diez años de haber construido el primer prototipo, la compañía estadunidense Yellow
Spring comercializó con gran éxito esta tecnología, como el primer analizador de
glucosa en sangre que utiliza únicamente 25 l de muestra. Hoy en día existen más de
500 compañías y organizaciones de investigación en todo el mundo dedicadas al
desarrollo de biosensores.
Las áreas en las que los biosensores enzimáticos han tenido mayor impacto son las
de monitoreo ambiental, la de análisis clínico y la de alimentos. En los próximos
párrafos, seleccionamos algunos ejemplos representativos acerca del funcionamiento
de algunos biosensores enzimáticos utilizados en estas áreas.
2. COMPETENCIAS
3. MATERIALES Y RECTIVOS
INSUMOS
practica en aula.

100 MINUTOS
6.MEDICIÓN, CALCULOS Y GRAFICOS

62


8. CUESTIONARIO
a) Investigue cuales son los biosensores que generan utilidad amplia en las diferentes
areas de la carrera.
b) Investigue como se diseña un biosnesor.
63

Practica Nº14
Seminario técnicas separativas: Cromatografía de gases
1. Conocimiento Teórico
En general, los métodos para el análisis químico son en el mejor de los casos
selectivos, pocos si es que los hay son verdaderamente específi cos. En consecuencia,
la separación del analito de las posibles interferencias es a menudo una etapa de vital
importancia en los procedimientos analíticos. Si a mediados del siglo XX, las
separaciones analíticas se llevaban a cabo mediante procedimientos clásicos como
precipitación, destilación y extracción, hoy día sin embargo, las separaciones analíticas
se realizan en la mayoría de los casos por cromatografía. La cromatografía es un
método de separación que tiene aplicación en todas las ramas de la ciencia y es
frecuentemente empleado en la industria como testigo de procesos industriales. Por
ejemplo industrias químicas, petroquímicas y farmacéuticas emplean la cromatografía
como técnica de determinación y control de compuestos orgánicos originados en su
proceso. Por otra parte, esta técnica del mismo modo es utilizada como medida de
control medioambiental: contaminantes aromáticos en aire, en agua, detección y
medida de pesticidas, etc.
La cromatografía de gases es una técnica analítica que permite separar mezclas de

compuestos facilmente volatilizables y térmicamente estables en sus componentes
individuales. En todas las separaciones cromatográfi cas, la muestra se desplaza con
una fase móvil, a través de una fase estacionaria con la que es inmiscible fi jada a una
columna o a una superfi cie sólida. Las dos fases se eligen de tal forma que los
componentes de la muestra se distribuyan de modo distinto entre ambas. Aquellos
componentes fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente
con el fl ujo de la fase móvil; por el contrario, los componentes que se unen débilmente
se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes
de la muestra se separan en bandas que pueden identifi carse cualitativa y/o
determinarse cuantitativamente. La clasifi cación mas frecuente en cromatografía, la
marca el tipo de fase móvil, en este sentido la cromatografía de gases emplea como
fase móvil un gas. En cromatografía de gases (CG), la muestra se volatiliza y se inyecta
en la cabeza de una columna cromatográfi ca. La elución se produce por el fl ujo de
una fase móvil de gas inerte, la fase móvil no interacciona con las moléculas del analito
cuya única función es la del transporte de este a través de la columna. En este punto
se produce la separación de los componentes de la mezcla, que fi nalmente son
64

determinados gracias a un detector que amplifi ca la señal integrándola y dando lugar

a los resultados analíticos. Existen fundamentalmente dos tipos de cromatografía de
gases: Cromatografía Gas-Sólido (CGS) cuya fase estacionaria es un sólido y el tipo
de equilibrio con la fase móvil es una adsorción. Cromatografía Gas-Líquido (CGL)
cuya fase estacionaria es un líquido adsorbido sobre un sólido, el equilibrio lo marca
el coefi ciente de reparto. 0.035 0.030 0.025 0.020 0.015 0.010 0.005 0 –0.005 0 100
200 300 400 500 Gas detector Señal Horno Gas portador Inyector Detector Abelló
Linde ELEMENTOS BÁSICOS DE LA CROMATOGRAFÍA DE GASES La efi cacia de
la columna requiere una muestra de tamaño adecuado. La inyección lenta de muestras
demasiado grandes provoca un endanchamiento de las bandas y una pobre
resolución. El uso de microjeringas para la inyección de muestras líquidas o gaseosas
a través de un septum es el método más efi caz. La muestra pasa a una cámara de
vaporización instantanea situada en la cabeza de la columna. Los gases portadores
cuya única función es la de transportar el analito a través de la fase estacionaria, deben
ser químicamente inertes y no reaccionar ni con los analitos a determinar ni con la fase
estacionaria de la columna. Comunmente se utiliza el helio, el nitrógeno y el hidrógeno.
La elección del gas portador queda determinada no sólo por el tipo de detector a utilizar
sino por la efi ciencia de la separación, así como por su velocidad. En este sentido el
hidrógeno al tener la más baja viscosidad de todos los gases propuestos proporciona
una alta movilidad originando tiempos de análisis cortos. Sin embargo es el helio el
que proporciona en la mayoría de los casos las mejores resoluciones, y es el más
usado. Otro punto a tener presente en la elección del gas portador, es su pureza.
Impurezas como hidrocarburos originan ruido en la línea base disminuyendo la
sensibilidad y los límites de detección de la separación. De igual modo, trazas de agua
y oxígeno pueden descomponer la fase estacionaria y con ello la destrucción
prematura de la columna. Con el suministro del gas se encuentran asociados los
materiales necesarios para la correcta incorporación de los gases al cromatógrafo
(reguladores de presión, manómetros y caudalímetros). En CG se emplean dos tipos
de columnas, las empaquetadas y las capilares. Estas columnas varían desde 2 a 50m
de longuitud estan construidas en acero inoxidable, vidrio, sílice fundida o tefl ón. La
temperatura de la columna es una variable importante para un trabajo preciso, por ello
se introduce en el interior de un horno de temperatura controlada. La temperatura
óptima de la columna depende del punto de ebullición de la muestra y del grado de
separación requerido. Para muestras cuyo componentes presentan un amplio intervalo
de temperaturas de ebullición, a menudo es conveniente emplear una programación
de temperaturas. En general, la resolución óptima se asocia con una temperatura
mínima; en contrapartida la reducción de temperatura produce un aumento en el
tiempo de elución, y por tanto el tiempo que se necesita para completar el análisis. Las
65

características de un detector ideal deben ser las siguientes: Adecuada sensibilidad,

buena estabilidad y reproducibilidad, respuesta lineal, amplio intervalo de temperatura
de trabajo, tiempo de respuesta corto, alta fi abilidad y manejo sencillo y no destructivo.
A día de hoy, no existe un detector que reuna todas estas características. Por el
contrario existen en la actualidad un gran número de detectores cuya elección depende
del tipo de componente a determinar. Los mas comunes son: Detector de Ionización
de Llama (FID), Detector de Conductividad Térmica (TCD), Detector de Captura
Electrónica (ECD), Detector de Nitrógeno/Fósforo (NPD), Detector de
Quimioluminiscencia del Azufre, Detector de Emisión Atómica (AED), Detector
Termoiónico (TID), Detector Fotométrico de Llama (FPD), Detector de Fotoionización
(PID), etc. Los detectores por lo general necesitan de gases auxiliares de alta pureza
para su buen funcionamiento, independientes de los gases portadores. De este modo
FID, NPD y FPD necesitan una mezcla de aire sintético e hidrógeno para crear la llama,
ECD funciona con una mezcla de metano en argón o nitrógeno. Los TCD emplean los
mismos gases portadores del sistema. En la siguiente tabla se representan los gases
portadores y de detección necesarios para cada uno de los detectores empleados en
CG. Esquema básico de gases portadores y de detección en CG. Gas portador / Gas
detector Detector H2 He Ar N2 CH4 / Ar Aire sintético FID TCD ECD FPD NPD PID
Gas portador Gas detector .
2 COMPETENCIAS
3 MATERIALES Y RECTIVOS
INSUMOS
practica en aula.
66


100 MINUTOS
6 MEDICIÓN, CALCULOS Y GRAFICOS

7 RESULTADOS DE APRENDIZAJE

8 CUESTIONARIO
a) Investigue cuales son los cromatógrafos de gases más actuales y todas
sus características.
b) Explique cuál sería la utilidad de este equipo en la profesión.
c) Porque es importante la calibración de este equipo.
67

Práctica Nº15
Seminario técnicas separativas: HPLC
HPLC
La cromatografía líquida de alta eficacia o high performance liquid
chromatography (HPLC) es un tipo de cromatografía en columna utilizada
frecuentemente en bioquímica y química analítica. También se la denomina a
veces cromatografía líquida de alta presión o cromatografía líquida de alta
resolución (high pressure liquid chromatography) (HPLC), aunque esta terminología se
considera antigua y está en desuso. El HPLC es una técnica utilizada para separar los
componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas
entre las sustancias analizadas y la columna cromatográfica.
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
En la HPLC isocrática el compuesto pasa por la columna cromatográfica a través de
la fase estacionaria(normalmente, un cilindro con pequeñas partículas redondeadas
con ciertas características químicas en su superficie) mediante el bombeo de líquido
(fase móvil) a alta presión a través de la columna. La muestra a analizar es introducida
en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente
dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida
que adelantan por la columna. El grado de retención de los componentes de la muestra
depende de la naturaleza del compuesto, de la composición de la fase estacionaria y
de la fase móvil. El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se
denomina tiempo de retención y se considera una propiedad identificativa
característica de un compuesto en una determinada fase móvil y estacionaria. La
utilización de presión en este tipo de cromatografías incrementa la velocidad lineal de
los compuestos dentro de la columna y reduce así su difusión dentro de la columna
mejorando la resolución de la cromatografía. Los disolventes más utilizados son
el agua, el metanol y el acetonitrilo. El agua puede contener tampones, sales, o
compuestos como el ácido trifluoroacético, que ayudan a la separación de los
compuestos.
Una mejora introducida en la técnica de HPLC descrita fue la variación en la
composición de la fase móvil durante el análisis, conocida como elución en gradiente.
Un gradiente normal en una cromatografía de fase reversa puede empezar a un 5%
de acetonitrilo y progresar de forma lineal hasta un 50% en 25 minutos. El gradiente
utilizado varía en función de la hidrofobicidad del compuesto. El gradiente separa los
componentes de la muestra como una función de la afinidad del compuesto por la fase
móvil utilizada respecto a la afinidad por la fase estacionaria. En el ejemplo, utilizando
68

un gradiente agua/acetonitrilo los compuestos más hidrofílicos eluirán a mayor

concentración de agua, mientras que los compuestos más hidrofóbicos eluirán a
concentraciones elevadas de acetonitrilo. A menudo, hace falta realizar una serie de
pruebas previas con tal de optimizar el gradiente de forma que permita una buena
separación de los compuestos.
Tipos de HPLC
Cromatografía de fase normal

La cromatografía de fase normal o normal phase HPLC (NP-HPLC) fue el primer tipo
de sistema HPLC utilizado en el campo de la química, y se caracteriza por separar los
compuestos sobre la base de su polaridad. Esta técnica utiliza una fase estacionaria
polar y una fase móvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de interés es bastante
polar. El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria. La fuerza
de adsorción aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la
interacción entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparación a la
fase móvil) aumenta el tiempo de retención.
La fuerza de interacción no sólo depende de los grupos funcionales del compuesto de
interés, sino también en factores estéricos de forma que los isómeros estructurales a
menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La utilización de disolventes más polares
en la fase móvil disminuye el tiempo de retención de los compuestos mientras que los
disolventes más hidrofóbicos tienden a aumentar el tiempo de retención.
La NP-HPLC cayó en desuso a los años 1970 con el desarrollo del HPLC de fase
reversa o reversed-phase HPLC debido a la falta de reproductibilidad de los tiempos
de retención puesto que los disolventes próticos cambiaban el estado de hidratación
de la silica o alúmina de la cromatografía.
Cromatografía de fase inversa (o reversa)

La HPLC de fase inversa (RP-HPLC) consiste en una fase estacionaria apolar y una
fase móvil de polaridad moderada. Una de las fases estacionarias más comunes de
este tipo de cromatografía es la silica tratada con RMe2SiCl, donde la R es una cadena
alquil tal como C18H37 o C8H17. El tiempo de retención es mayor para las moléculas de
naturaleza apolar, mientras que las moléculas de carácter polar eluyen más
rápidamente.
Cromatografía de exclusión molecular

La cromatografía de exclusión molecular, también conocida como cromatografía por
filtración en gel, separa las partículas de la muestra en función de su tamaño.
69

Generalmente se trata de una cromatografía de baja resolución de forma que se suele

utilizar en los pasos finales del proceso de purificación. También es muy útil para la
determinación de la estructura terciaria y la estructura cuaternaria de las proteínas
purificadas.
La cromatografía de filtración molecular es un método de cromatografía en columna
por el cual las moléculas se separan en solución según su peso molecular, o más
precisamente, según su radio de Stokes.
Cromatografía de intercambio iónico

En la cromatografía de intercambio iónico, la retención se basa en la atracción
electrostática entre los iones en solución y las cargas inmovilizadas a la fase
estacionaria. Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga
opuesta son retenidos por la columna. Algunos tipos de intercambiadores iónicos son:
i) Resinas de poliestireno, ii) intercambiadores iónicos de celulosa y dextranos (geles)
y iii) Silica porosa o vidrio de tamaño de poro controlado. En general los
intercambiadores iónicos favorecen la unión de iones elevada carga y radio pequeño.
Un incremento en la concentración del contraión (respecto a los grupos funcionales de
la resina) reduce el tiempo de retención. Un incremento en el pH reduce el tiempo de
retención en las cromatografías de intercambio catiónico mientras que una disminución
del pH reduce el tiempo de retención en las cromatografías de intercambio aniónico.
Este tipo de cromatografía es ampliamente utilizado en las siguientes aplicaciones:
purificación de agua, concentración de componentes traza, Ligand-exchange
chromatography, Ion-exchange chromatography of proteins, High-pH anion-exchange
chromatography of carbohydrates and oligosaccharides, etc.
Cromatografía basada en bioafinidad

Este tipo de cromatografía se basa en la capacidad de las sustancias biológicamente
activas de formar complejos estables, específicos y reversibles. La formación de estos
complejos implica la participación de fuerzas moleculares como las interacciones de
Van der Waals, interacciones electrostáticas, interacciones dipolo-
dipolo, interacciones hidrofóbicas y puentes de hidrógeno entre las partículas de la
muestra y la fase estacionaria.
Cromatografía líquida de alta eficacia en condiciones desnaturalizantes (DHPLC)

Se trata de un método que se emplea para el rastreo de mutaciones (ya casi totalmente
en desuso debido al auge de la secuenciación), que permite detectar la presencia de
variaciones en el ADN aunque no se determinan específicamente cuáles. En este
caso, se utiliza la técnica cromatográfica para la detección de heterodúplex de ADN,
en lugar de utilizar un gel para correr las moléculas de ácidos nucleicos.
70

CROMATOGRAFÍA GASEOSA
La cromatografía de gases es una técnica cromatográfica en la que la muestra se
volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La elución se
produce por el flujo de una fase móvil de gas inerte. A diferencia de los otros tipos
de cromatografía, la fase móvil no interactúa con las moléculas del analito; su única
función es la de transportar el analito a través de la columna.
Existen dos tipos de cromatografía de gases (GC): la cromatografía gas-sólido (GSC)
y la cromatografía gas-líquido (GLC), siendo esta última la que se utiliza más
ampliamente, y que se puede llamar simplemente cromatografía de gases (GC). En la
GSC la fase estacionaria es sólida y la retención de los analitos en ella se produce
mediante el proceso de adsorción. Precisamente este proceso de adsorción, que no
es lineal, es el que ha provocado que este tipo de cromatografía tenga aplicación
limitada, ya que la retención del analito sobre la superficie es semipermanente y se
obtienen picos de elución con colas. Su única aplicación es la separación de especies
gaseosas de bajo peso molecular. La GLC utiliza como fase estacionaria moléculas de
líquido inmovilizadas sobre la superficie de un sólido inerte.
La GC se lleva a cabo en un cromatógrafo de gases. Éste consta de diversos
componentes como el gas portador, el sistema de inyección de muestra, la columna
(generalmente dentro de un horno), y el detector.
Aplicaciones
La GC tiene dos campos de aplicación importantes. Por una parte su capacidad para
separar mezclas orgánicas complejas, compuestos organometálicos y sistemas
bioquímicos. Su otra aplicación es como método para determinar cuantitativa y
cualitativamente los componentes de la muestra. Para el análisis cualitativo se suele
emplear el tiempo de retención, que es único de cada compuesto en condiciones
determinadas (mismo gas portador, rampa de temperatura y flujo), o el volumen de
retención. En aplicaciones cuantitativas, integrando las áreas de cada compuesto o
midiendo su altura, con los calibrados adecuados, se obtiene la concentración o
cantidad presente de cada analito.
2. . COMPETENCIAS

71

INSUMOS
practica en aula.
4. . TECNICA O PROCEDIMIENTO
100NUTOS
6. MEDICIÓN, CALCULOS Y GRAFICOS
La práctica no incluye mediciones ni cálculos

8. CUESTIONARIO

de gases?
72

Practica Nº16
Seminario técnicas separativas: Cromatografía de Iones
HPLC
La cromatografía líquida de alta eficacia o high performance liquid
chromatography (HPLC) es un tipo de cromatografía en columna utilizada
frecuentemente en bioquímica y química analítica. También se la denomina a
veces cromatografía líquida de alta presión o cromatografía líquida de alta
resolución (high pressure liquid chromatography) (HPLC), aunque esta terminología se
considera antigua y está en desuso. El HPLC es una técnica utilizada para separar los
componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas
entre las sustancias analizadas y la columna cromatográfica.
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
En la HPLC isocrática el compuesto pasa por la columna cromatográfica a través de
la fase estacionaria(normalmente, un cilindro con pequeñas partículas redondeadas
con ciertas características químicas en su superficie) mediante el bombeo de líquido
(fase móvil) a alta presión a través de la columna. La muestra a analizar es introducida
en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente
dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida
que adelantan por la columna. El grado de retención de los componentes de la muestra
depende de la naturaleza del compuesto, de la composición de la fase estacionaria y
de la fase móvil. El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se
denomina tiempo de retención y se considera una propiedad identificativa
característica de un compuesto en una determinada fase móvil y estacionaria. La
utilización de presión en este tipo de cromatografías incrementa la velocidad lineal de
los compuestos dentro de la columna y reduce así su difusión dentro de la columna
mejorando la resolución de la cromatografía. Los disolventes más utilizados son
el agua, el metanol y el acetonitrilo. El agua puede contener tampones, sales, o
compuestos como el ácido trifluoroacético, que ayudan a la separación de los
compuestos.
Una mejora introducida en la técnica de HPLC descrita fue la variación en la
composición de la fase móvil durante el análisis, conocida como elución en gradiente.
Un gradiente normal en una cromatografía de fase reversa puede empezar a un 5%
de acetonitrilo y progresar de forma lineal hasta un 50% en 25 minutos. El gradiente
utilizado varía en función de la hidrofobicidad del compuesto. El gradiente separa los
componentes de la muestra como una función de la afinidad del compuesto por la fase
móvil utilizada respecto a la afinidad por la fase estacionaria. En el ejemplo, utilizando
un gradiente agua/acetonitrilo los compuestos más hidrofílicos eluirán a mayor
73

concentración de agua, mientras que los compuestos más hidrofóbicos eluirán a

concentraciones elevadas de acetonitrilo. A menudo, hace falta realizar una serie de
pruebas previas con tal de optimizar el gradiente de forma que permita una buena
separación de los compuestos.
Tipos de HPLC
Cromatografía de fase normal

La cromatografía de fase normal o normal phase HPLC (NP-HPLC) fue el primer tipo
de sistema HPLC utilizado en el campo de la química, y se caracteriza por separar los
compuestos sobre la base de su polaridad. Esta técnica utiliza una fase estacionaria
polar y una fase móvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de interés es bastante
polar. El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria. La fuerza
de adsorción aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la
interacción entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparación a la
fase móvil) aumenta el tiempo de retención.
La fuerza de interacción no sólo depende de los grupos funcionales del compuesto de
interés, sino también en factores estéricos de forma que los isómeros estructurales a
menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La utilización de disolventes más polares
en la fase móvil disminuye el tiempo de retención de los compuestos mientras que los
disolventes más hidrofóbicos tienden a aumentar el tiempo de retención.
La NP-HPLC cayó en desuso a los años 1970 con el desarrollo del HPLC de fase
reversa o reversed-phase HPLC debido a la falta de reproductibilidad de los tiempos
de retención puesto que los disolventes próticos cambiaban el estado de hidratación
de la silica o alúmina de la cromatografía.
Cromatografía de fase inversa (o reversa)

La HPLC de fase inversa (RP-HPLC) consiste en una fase estacionaria apolar y una
fase móvil de polaridad moderada. Una de las fases estacionarias más comunes de
este tipo de cromatografía es la silica tratada con RMe2SiCl, donde la R es una cadena
alquil tal como C18H37 o C8H17. El tiempo de retención es mayor para las moléculas de
naturaleza apolar, mientras que las moléculas de carácter polar eluyen más
rápidamente.
Cromatografía de exclusión molecular

La cromatografía de exclusión molecular, también conocida como cromatografía por
filtración en gel, separa las partículas de la muestra en función de su tamaño.
Generalmente se trata de una cromatografía de baja resolución de forma que se suele
74

utilizar en los pasos finales del proceso de purificación. También es muy útil para la
determinación de la estructura terciaria y la estructura cuaternaria de las proteínas
purificadas.
La cromatografía de filtración molecular es un método de cromatografía en columna
por el cual las moléculas se separan en solución según su peso molecular, o más
precisamente, según su radio de Stokes.
Cromatografía de intercambio iónico

En la cromatografía de intercambio iónico, la retención se basa en la atracción
electrostática entre los iones en solución y las cargas inmovilizadas a la fase
estacionaria. Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga
opuesta son retenidos por la columna. Algunos tipos de intercambiadores iónicos son:
i) Resinas de poliestireno, ii) intercambiadores iónicos de celulosa y dextranos (geles)
y iii) Silica porosa o vidrio de tamaño de poro controlado. En general los
intercambiadores iónicos favorecen la unión de iones elevada carga y radio pequeño.
Un incremento en la concentración del contraión (respecto a los grupos funcionales de
la resina) reduce el tiempo de retención. Un incremento en el pH reduce el tiempo de
retención en las cromatografías de intercambio catiónico mientras que una disminución
del pH reduce el tiempo de retención en las cromatografías de intercambio aniónico.
Este tipo de cromatografía es ampliamente utilizado en las siguientes aplicaciones:
purificación de agua, concentración de componentes traza, Ligand-exchange
chromatography, Ion-exchange chromatography of proteins, High-pH anion-exchange
chromatography of carbohydrates and oligosaccharides, etc.
Cromatografía basada en bioafinidad

Este tipo de cromatografía se basa en la capacidad de las sustancias biológicamente
activas de formar complejos estables, específicos y reversibles. La formación de estos
complejos implica la participación de fuerzas moleculares como las interacciones de
Van der Waals, interacciones electrostáticas, interacciones dipolo-
dipolo, interacciones hidrofóbicas y puentes de hidrógeno entre las partículas de la
muestra y la fase estacionaria.
Cromatografía líquida de alta eficacia en condiciones desnaturalizantes (DHPLC)

Se trata de un método que se emplea para el rastreo de mutaciones (ya casi totalmente
en desuso debido al auge de la secuenciación), que permite detectar la presencia de
variaciones en el ADN aunque no se determinan específicamente cuáles. En este
caso, se utiliza la técnica cromatográfica para la detección de heterodúplex de ADN,
en lugar de utilizar un gel para correr las moléculas de ácidos nucleicos.
75

CROMATOGRAFÍA GASEOSA
La cromatografía de gases es una técnica cromatográfica en la que la muestra se
volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La elución se
produce por el flujo de una fase móvil de gas inerte. A diferencia de los otros tipos
de cromatografía, la fase móvil no interactúa con las moléculas del analito; su única
función es la de transportar el analito a través de la columna.
Existen dos tipos de cromatografía de gases (GC): la cromatografía gas-sólido (GSC)
y la cromatografía gas-líquido (GLC), siendo esta última la que se utiliza más
ampliamente, y que se puede llamar simplemente cromatografía de gases (GC). En la
GSC la fase estacionaria es sólida y la retención de los analitos en ella se produce
mediante el proceso de adsorción. Precisamente este proceso de adsorción, que no
es lineal, es el que ha provocado que este tipo de cromatografía tenga aplicación
limitada, ya que la retención del analito sobre la superficie es semipermanente y se
obtienen picos de elución con colas. Su única aplicación es la separación de especies
gaseosas de bajo peso molecular. La GLC utiliza como fase estacionaria moléculas de
líquido inmovilizadas sobre la superficie de un sólido inerte.
La GC se lleva a cabo en un cromatógrafo de gases. Éste consta de diversos
componentes como el gas portador, el sistema de inyección de muestra, la columna
(generalmente dentro de un horno), y el detector.
Aplicaciones
La GC tiene dos campos de aplicación importantes. Por una parte su capacidad para
separar mezclas orgánicas complejas, compuestos organometálicos y sistemas
bioquímicos. Su otra aplicación es como método para determinar cuantitativa y
cualitativamente los componentes de la muestra. Para el análisis cualitativo se suele
emplear el tiempo de retención, que es único de cada compuesto en condiciones
determinadas (mismo gas portador, rampa de temperatura y flujo), o el volumen de
retención. En aplicaciones cuantitativas, integrando las áreas de cada compuesto o
midiendo su altura, con los calibrados adecuados, se obtiene la concentración o
cantidad presente de cada analito.
2. COMPETENCIAS

3 MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS
76

INSUMOS
practica en aula.
5.TIEMPO DE DURACION DE LA PRÁCTICA
100 MINUTOS
6 MEDICIÓN, CALCULOS Y GRAFICOS
La práctica no incluye mediciones ni cálculos

8 .CUESTIONARIO

de gases?
77

IDENTIFICACIÓN DE CAMBIOS
Versión Fecha aprobación Modificación

2.0 Gestión 2022 Readecuación de acuerdo
con actualización del PA
Elaborado por: Revisado por: Aprobado por:
Dra. Neyza mamani Dra. Rosario Hidalgo F. Dra. Rosario Hidalgo F.

Osinaga Directora de Carrera de Directora de Carrera de
Docente Bioquímica y Farmacia Bioquímica y Farmacia
Fecha: 2022 Fecha: 2022 Fecha: 2022
78
79

RE-10-LAB-316 METODOS INSTRUMENTALES AVANZADOS v3

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Código: RE-10-LAB-316

GUÍA DE LABORATORIO DE MÉTODOS Versión: 3.0

Validación métodos analíticos: Espectroscopía

1. CONOCIMIENTO TEORICO REQUERIDO

La reacción entre el hierro II y la fenantrolina para formar un complejo coloreado, sirve

● Determina la concentración de hierro en una muestra mediante un

3. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS:

Ítem DENOMINACIÓN Cantidad Unidad Observaciones

Cantidad solicitada para 25 estudiantes, para cada

Cantidad solicitada para 25 estudiantes, para cada

Cantidad solicitada para 25 estudiantes, para cada

GUÍA DE LABORATORIO DE MÉTODOS Versión: 3.0

Cantidad solicitada para 25 estudiantes, para cada

Cantidad solicitada para 25 estudiantes, para cada

Cantidad solicitada para 25 estudiantes, para cada

Cantidad solicitada para 25 estudiantes, para cada

Cantidad solicitada para 25 estudiantes, para cada

Cantidad solicitada para 25 estudiantes, para cada

Micropipetas 1000 ul, 100 ul

Cantidad solicitada para 25 estudiantes, para cada

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Papel filtro varios

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GUÍA DE LABORATORIO DE MÉTODOS Versión: 3.0

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Ítem DENOMINACIÓN Cantidad Unidad Observaciones

Diferentes muestras en cuestión. Cantidad solicitada para 25 estudiantes, para cada

Espectro de absorción de varias sustancias: En vasos de precipitados de 100ml

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Preparación de la curva de calibración para la determinación de hierro: En

Determinación de la cantidad de Fe presente en una gragea de sulfato ferroso:

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1ml de hidroxilamina, 10,0ml de solución buffer y 10,0 ml de orto-fenantrolina; lleve a

5. TIEMPO DE DURACION DE LA PRÁCTICA:

6.MEDICIÓN, CALCULOS Y GRAFICOS.-

- Representar la Curva de calibración de absorbancia (510nm) vs concentración de hierro

Selecciona método y técnica adecuada considerando la naturaleza de la muestra y

Identifica los Métodos instrumentales ópticos para el control analítico de procesos

1) ¿Cómo se construye una curva espectral? ¿Cuál es el criterio a seguir para

2) ¿Por qué es necesario utilizar un blanco para realizar las mediciones?

3) ¿Cuál es el objeto de adicionar hidroxilamina en la determinación?

4) ¿Por qué la fenantrolina está en solución de acetato de sodio?

5) ¿Cómo se forma el complejo entre el hierro y la 1,10 fenantrolina?

6) ¿Cómo se preparan las soluciones de hierro a partir de hierro sólido?

7) Mencione otros reactivos usados en la determinación espectrofotométrica de

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1. CONOCIMIENTO TEORICO REQUERIDO

La representación gráfica de las absorbancias medidas frente a las concentraciones

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3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS

Ítem DENOMINACIÓN Cantidad Unidad Observaciones

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Ítem DENOMINACIÓN Cantidad Unidad Observaciones

2. Seleccionar en el espectrofotómetro la longitud de onda del máximo de