Las cenizas volcánicas del Complejo Volcánico

Puyehue-Cordón Caulle y Calbuco promueven una

respuesta diferencial de mediadores
proinflamatorios y de estrés oxidativo en células
epiteliales conjuntivales humanas.

Las cenizas volcánicas podrían suponer un peligro para la superficie ocular ya que
se encuentra constantemente expuesta a partículas ambientales. Expusimos células
conjuntivales al complejo volcánico Puyehue-Cordón Caulle (PCCVC) o a partículas
de ceniza de Calbuco y evaluamos la proliferación, viabilidad, apoptosis, expresión
de MUC1, citoquinas proinflamatorias y marcadores de estrés oxidativo. Las
partículas de ceniza de estos volcanes varían en tamaño, composición y morfología.
Nuestros resultados demuestran que las partículas de ceniza del PCCVC, pero no
las del Calbuco, inducen citotoxicidad en las células epiteliales conjuntivales
humanas, que se manifiesta como una disminución de la proliferación celular y de
la expresión de la mucina transmembrana MUC1; una respuesta inflamatoria
mediada por IL-6 e IL-8; y un desequilibrio del entorno redox que conduce a un
daño oxidativo de las proteínas. Este es el primer estudio in vitro que evalúa el
efecto biológico de las partículas de ceniza volcánica sobre las células epiteliales
conjuntivales humanas y la implicación de los mediadores inflamatorios y el estrés
oxidativo como mecanismos de daño. Nuestros resultados podrían proporcionar
una mejor comprensión de los síntomas oculares que manifiestan las personas que
viven cerca de zonas volcánicas.

Introducción
(…) Anteriormente se ha estudiado el impacto de la contaminación atmosférica
procedente de fuentes antropogénica en la superficie ocular. Los resultados
epidemiológicos demostraron que los sujetos expuestos a contaminantes
atmosféricos presentaban síntomas de malestar ocular e inestabilidad de la
película de lágrimas (Jungetal., 2018 Novaesetal., 2010; Torricellietal., 2013).
Además, se ha demostrado que las células epiteliales corneales y conjuntivales en
presencia de partículas de contaminación atmosférica urbana provocan una
respuesta proinflamatoria mediada por la interleucina (IL)6, la alteración del
equilibrio redox intracelular y la expresión diferencial de las mucinas
(Fujishimaetal., 2013 Lasagni Vitaretal., 2018, 2015; Tauetal., 2013).
(…) Por lo tanto, el propósito de este trabajo fue evaluar el efecto de la ceniza
volcánica de PCCVC y Calbuco en las células epiteliales conjuntivales humanas,
analizando la proliferación, viabilidad, apoptosis, expresión de MUC1, citocinas
proinflamatorias y marcadores de estrés oxidativo.

2. Materiales y métodos

2.1. RECOGIDA Y CARACTERIZACIÓN DE CENIZAS VOLCÁNICAS

Las muestras de cenizas volcánicas se recogieron en el área urbana de Villa la

Angostura, en la provincia de Neuquén, Argentina. Las muestras del complejo
volcánico Pueyehue-Cordón Caulle (PCCVC) se recogieron en septiembre de
2011 y las del Calbuco en abril de 2015.

(…) Se emplearon la microscopía electrónica de barrido y la espectroscopia de

dispersión de energía de rayos X (EDX) para analizar la morfología, el tamaño y la
composición química de las partículas.

2.2. CULTIVO DE CÉLULAS IOBA-NHC

La línea celular de epitelio conjuntival humano normal (IOBA-NHC) fue cedida

amablemente por la doctora Yolanda Diebold (Instituto Universitario de
Oftalmobiología Aplicada, Universidad de Valladolid, Valladolid, España,
(Dieboldetal., 2003)). Las células se subcultivaron una vez a la semana para
mantener la línea celular.

Las IOBA-NHC (pasajes 75-80) se cultivaron en placas de 24 pocillos (Jet Biofil,

Guangzhou, China) en 1 mL de medio de cultivo por pocillo a una densidad de
siembra de 2×105 células/pocillo. El medio consistía en medio de Eagle
modificado de Dulbecco (DMEM)-F12 suplementado con 10% de suero bovino
fetal (Internegocios, Mercedes, Buenos Aires, Argentina), 2 ng/mL de factor de
crecimiento epidérmico (EGF), 5 μg/mL de hidrocortisona (Sigma, St.Louis, MO), 1
μg/mL de insulina de páncreas bovino, (Sigma), 50 U/mL de penicilina, 50 μg/mL
de estreptomicina y 2 mg/mL de anfotericina B. Las células se incubaron en
una atmósfera húmeda de 37°C con un 5% de CO2 y alcanzaron una confluencia
del 90-100% al cabo de 24 horas. Todos los experimentos se realizaron en
estas condiciones, excepto el ensayo MTT, que se detalla en la Sección 2.4.

2.3. EXPOSICIÓN DE CULTIVOS CELULARES A CENIZAS VOLCÁNICAS

Se realizó una suspensión de cenizas de 1000 μg/mL de las
erupciones de PCCVC o Calbuco.

(…) Las células se expusieron a una suspensión de 100 μg/mL de partículas de

escape diésel (DEP)(Laksetal.,2008) para mostrar la capacidad de respuesta del
sistema celular.

(…)Se expusieron monocapas de células conjuntivales a 1 mL de

suspensiones de cenizas, DEP como control positivo y medio de
cultivo completo como control experimental, durante 24h.

2.4. EVALUACIÓN DE LA PROLIFERACIÓN

La proliferación celular se determinó mediante el ensayo MTT (3-(4,5

dimetiltiazol2-il)-2,5-bromuro de difeniltetrazolio). El MTT es una solución acuosa
amarillenta que se reduce por las deshidrogenasas y los agentes reductores
presentes en las células metabólicamente activas a cristales insolubles de
formazán azul violáceo. Las células IOBA-NHC se sembraron a razón de 3×104
células por pocillo en una placa de cultivo de 24 pocillos durante 24 horas antes
del tratamiento. Se retiró el medio de cultivo y se añadieron suspensiones de
ceniza volcánica de PCCVC o Calbuco (50, 100, 500 y 1000 μg/mL) durante 24 h.
Se retiró el medio de las células de control o expuestas de los cultivos celulares,
se lavaron dos veces con PBS1× y, a continuación, se añadieron 0,5 mL de medio
de crecimiento completo fresco suplementado con 50 μL de MTT (4mg/mL)
durante 3h. Inmediatamente después de la incubación, se añadió SDS al 10%
para detener la reacción del MTT y solubilizar el precipitado de formazán. Por
último, se homogeneizó el lisado de cada pocillo y se centrifugó a 10.000 g para
eliminar las partículas de ceniza restantes. La absorbancia de cada sobrenadante
se midió a 550 nm en un lector de placas (iMark Microplate Absorbance Reader;
Bio-Rad, Hercules, CA).

2.5. IMÁGENES DE CULTIVOS CELULARES

Las células IOBA tratadas con cenizas o con medios de cultivo como control se
analizaron mediante microscopía óptica para evaluar cualquier cambio en la
morfología celular. Se cultivaron monocapas celulares sobre cubreobjetos de vidrio
de 10 mm y se expusieron a partículas de ceniza o a medios de cultivo como
control. Los cubreobjetos se lavaron dos veces con PBS1× y se fijaron en metanol
al 100%. Las monocapas celulares se tiñeron con la técnica de Papanicolaou
(PAP).
(…) Se añadió medio de montaje DPX (Biopack, Argentina) directamente a las
monocapas celulares y se montó cubreobjetos de vidrio sobre los portaobjetos.
Las imágenes se capturaron con un aumento de 400× utilizando un microscopio
óptico (OlympusCX21FS2, Tokio, Japón).

2.6. EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD CELULAR Y LA APOPTOSIS

El porcentaje de células apoptóticas y necróticas se determinó por citometría de

flujo (FACSCalibur; BD Biosciences) utilizando el kit Annexin V-FITC y yoduro de
propidio (PI) (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Las monocapas celulares se
lavaron dos veces con 1 mL de PBS y se tripsinizaron (250 μL por pocillo durante
2-5 min, 37 °C, 5% CO2).
(…) Los valores obtenidos se analizaron con Cyflogic 1.2.1 (CyFlo Ltd., Turku,
Finlandia). La anexina V se une a superficies de fosfolípidos con carga negativa
con una especificidad mayor para la fosfatidilserina (PS) que para la mayoría de
los demás fosfolípidos. La PS es un fosfolípido interno de la membrana plasmática
que en la cascada apoptótica temprana está expuesto en la capa externa de la
membrana plasmática, antes de que las células se vuelvan permeables al PI. Por
lo tanto, las células apoptóticas tempranas son Annexin V-FITC positivas y PI
negativas, y las células apoptóticas tardías o necróticas son ambas, Annexin
V-FITC y PI positivas. Las células viables son Annexin V-FITC y PI negativas.

2.7. PREPARACIÓN DEL LISADO CELULAR

Los lisados experimentales de las células de control, PCCVC y Calbuco se

obtuvieron raspando las monocapas de la placa de cultivo con 100 μL de buffer de
lisis (50 mMTrisHCl, 150 mMNaCl, 1 mM inhibidor de proteasas (Sigma), 2 mM
EDTA, 1% Triton X-100) y sonicando en agua fría durante 10 min (lisado
completo). Por último, los lisados enteros se centrifugaron a 1000g durante 10 min
para obtener los lisados celulares. Las proteínas en los sobrenadantes se
determinaron por el método de Lowry (Lowry, 1951).

2.8. EVALUACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA MUC1 MEDIANTE WESTERN

BLOT
Los lisados celulares (40μg de proteínas/carril) se resolvieron en geles SDS-PAGE
de acrilamida al 7,5%. Las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF y se
bloquearon durante 1 h en leche en polvo descremada al 5% en PBS con NaN3 al
13% y se hibridaron durante la noche con anti-MUC1 (1-200; sc-7313, Santa Cruz
Biotechnology) o anti-actina (Calbiochem, CP01). Las membranas se lavaron tres
veces en PBS, y la detección secundaria se realizó utilizando diluciones 1:5000
de anticuerpo anti-ratón conjugado con HRP (Cappel). Las membranas se lavaron
tres veces y la detección quimioluminiscente se realizó con ECL (Thermo
Scientific). Las bandas se cuantificaron con el programa Image J (1.50i, Wayne
Rasband, National Institutes of Health, EE.UU.).

2.9 DETERMINACIÓN DE CITOQUINAS PRO-INFLAMATORIAS

La secreción de citoquinas se determinó a partir de sobrenadantes recogidos tras

la exposición a la ceniza. Para eliminar las partículas de ceniza restantes, los
sobrenadantes se centrifugaron a 10.000 g durante 10 minutos a 4°C. Se utilizaron
kits de ensayo inmunoenzimático (ELISA) (BD Biosciences) para realizar la
cuantificación de IL-6 (nº 2645KI) e IL-8 (nº 2654KI) siguiendo el protocolo del
fabricante.

2.10. PRODUCCIÓN INTRACELULAR DE ROS

Las monocapas celulares se lavaron con 1 mL de PBS y se tripsinizaron como se

describe en la Sección 2.6. Las células (2,5 × 105 células/ mL) se cargaron con 5
μM2′,7′-diclorofluoresceína (DCF) diacetato y se analizaron por citometría de flujo.
El diacetato de DCF se difusa pasivamente en las células, donde es
desesterificado por las esterasas intracelulares y fácilmente oxidado al producto
verde-fluorescente DCF tras su reacción con especies oxidantes. Este indica la
generación intracelular de especies oxidantes. Tras una incubación de 30 minutos
en la oscuridad a 37°C, se adquirieron 20.000 eventos por muestra en un
FACSCalibur; BD Biosciences equipado con un láser de argón de 488 nm. La
población celular se clasificó en función de las propiedades de dispersión de la luz.
La señal DCF se analizó en el canal FL-1 con Cyflogic 1.2.1 (CyFlo Ltd., Turku,
Finlandia) y se cuantificó como intensidades de fluorescencia medias (MFI)
(Lasagni Vitar et al., 2015). Los resultados se expresaron como el pliegue medio
de aumento con respecto a las células de control.

2.11 MEDICIÓN INDIRECTA DE LA PRODUCCIÓN DE ÓXIDO NÍTRICO (NO)

La concentración de NO en los sobrenadantes de los cultivos celulares se
determinó mediante la acumulación de nitrito (NO2-). La concentración de nitrito
se midió mediante un método espectrofotométrico basado en la reacción de Griess
(Ding et al., 1988). Los sobrenadantes de los cultivos celulares se centrifugaron
como se describe en la Sección 2.9. La concentración de nitrito se determinó
midiendo la absorbancia a 550 nm en comparación con soluciones patrón de nitrito
sódico a diferentes concentraciones. Los resultados se expresaron como nmol/ mg
de proteína.

2.12. ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS ANTIOXIDANTES

2.12.1. Superóxido dismutasa (SOD)

Se utilizó un ensayo colorimétrico basado en la inhibición de la tasa de formación
de adreno-cromo a 37°C debida a la adición de cantidades crecientes de lisado
celular en un medio de reacción consistente en 1 mM de epi-nefrina y 50 mM de
glicina buffer (pH= 10,50). Las mediciones se realizaron a 480 nm en un
espectrofotómetro Hitachi U-2000 (Hitachi Ltd., Chiyoda, Tokio, Japón). La
actividad enzimática se expresa como USOD/mg de proteína. Una unidad de SOD
se definió como el volumen de muestra necesario para inhibir la tasa de formación
de adreno-cromo en un 50% (Misra y Fridovich, 1972).

2.12.2. Glutatión S-transferasa (GST)

La actividad de la glutatión S-transferasa se midió utilizando 1 cloro-2,4
dinitrobenceno (CDNB), que forma GS-dinitrobenceno (GS-DNB) en presencia de
glutatión, reacción catalizada por la GST proporcionada por el lisado celular. Este
aducto absorbe a 340 nm. Briefly, el lisado celular (50 μL) se mezcló en el medio
de reacción consistente en buffer fosfato (pH = 6,50), 10 mM de glutatión (GSH) y
20 mM de CDNB. Los resultados se expresaron como mUGST/mg de proteína.
Una unidad de GST se definió como la cantidad de enzima que cataliza la
formación de 1 μmol de GS-DNB por minuto a 30 °C (Habig et al., 1974).

2.13. NIVELES REDUCIDOS DE GLUTATIÓN (GSH)

Las muestras de lisado celular (100 μL) se mezclaron con 1 M HClO4 2mM EDTA
(1:1) y se centrifugaron a 20.000 g durante 20 min a 4 °C. Los sobrenadantes se
filtraron a través de membranas de acetato de celulosa de 0,22 μm (Corning Inc.,
NY, EE.UU.) y se congelaron a -80°C hasta su uso. El análisis por HPLC se
realizó en un cromatógrafo de líquidos Perkin Elmer LC 250 (Perkin Elmer,
Waltham, MA, EE.UU.), equipado con un procesador de muestras avanzado
Perkin Elmer LC ISS 200 y un detector electroquímico Coulochem II (ESA,
Bedford, MA, EE.UU.). Para la separación de las muestras se utilizó una columna
Supelcosil LC-18 (250 × 4,6 mm ID, 5 μm de tamaño de partícula) protegida por
una precolumna Supelguard (20 × 4,6 mm ID) (Supelco, Bellfonte, PA, EE.UU.). El
GSH se eluyó a una velocidad de flujo de 1,2 mL/min con fosfato sódico 20 mM
(pH= 2,70), y se detectó electroquímicamente a un potencial de oxidación aplicado
de +0,800 V. Se realizó una curva de calibración con un estándar de GSH.
Los resultados se expresaron como nmol/1 × 106 células (Rodríguez-Ariza et al.,
1994).

2.14. DAÑOS OXIDATIVOS EN MACROMOLÉCULAS

2.14.1 Oxidación de proteínas

El contenido celular de grupos carbonilo de proteínas modificadas oxidativamente
se detectó en lisado celular con 10 mM de 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH), que da
lugar a la formación de un producto estable de 2,4-dinitrofenilhy-drazona (DNP)
que es soluble en 6 M de guanidina. El DNP absorbe la luz ultravioleta, por lo que
el contenido total de carbonilo de una proteína puede cuantificarse mediante un
ensayo espectrofotométrico a 370 nm (Levine et al., 1990). Los resultados se
expresaron como nmol/mg de proteína.

2.14.2 Oxidación de lípidos

El daño oxidativo a los lípidos se determinó como sustancias reactivas al ácido
tiobarbitúrico (TBARS), utilizando un ensayo fluorométrico (Yagi, 1976). Briefly, se
incubaron muestras de lisados enteros (100 μL) con 200 μL de HCl 0,1 N, 30 μL
de ácido fosfotúngstico al 10% (p/v) y 100 μL de ácido 2-tiobarbitúrico (TBA) al
0,7% (p/v) en un baño seco. Después de 60 min, los TBARS se extrajeron en 500
μL de n-butanol y se centrifugaron a 1000g durante 10 min. La fluorescencia de la
capa butanólica se midió en un espectrómetro de fluorescencia Perkin Elmer LS
55 (Perkin Elmer, Wal-tham, MA, US) a 515 nm (excitación) y 553 nm (emisión).
Se realizó una curva de calibración utilizando 1,1,3,3-tetrametoxipropano (MDA)
como patrón. Los resultados se expresaron como nmol MDA/ mg de proteína.

2.15 ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Todos los datos se expresaron como media ± error estándar de la media (SEM) de
al menos 3 experimentos independientes.
(…) Las pruebas se consideraron significantes cuando p < 0,05.
3. RESULTADOS

3.1 Caracterización de las partículas de ceniza

El tamaño de las partículas de las muestras de cenizas del PCCVC es
heterogéneo y oscila entre menos de 10-100 μm (Fig. 1a). Las imágenes de
microscopía electrónica de barrido de la Fig. 1b, muestran que las muestras de
Calbuco presentan principalmente partículas en bloque de 100-300 μm y
pequeñas partículas de menos de 10 μm. La composición de óxidos de la ceniza
analizada por EDX confirmó que las partículas de PCCVC contienen más SiO2,
NaO y K2O (70% frente a 56%, 6% frente a 3% y 2,9% frente a 0,5%
respectivamente, p < 0,05) y menos FeO, CaO y MgO (5% frente a 9%, 2% frente
a 10% y 0,3% frente a 5,6% respectivamente, p < 0,01) en comparación con las
partículas de ceniza de Calbuco (Fig. 1c).
3.2 Proliferación de IOBA-NHC
Examinamos el effecto de las partículas de ceniza volcánica (50, 100, 500 y 1000
μg/mL) sobre la proliferación celular mediante el ensayo MTT. La proliferación de
IOBA-NHC disminuyó significativamente un 26% y un 29% tras la exposición a 500
y 1000 μg/mL de ceniza de PCCVC respectivamente en comparación con el
control (p<0,01). Las partículas de Calbuco no indujeron una reducción
significativa de los valores de MTT (Fig. 2).

3.3 PROLIFERACIÓN DE IOBA-NHC

Las IOBA-NHC se tiñeron con la técnica PAP para evaluar la morfología celular.
Las células tratadas con partículas de ceniza (PCCVC o Calbuco) no mostraron
alteraciones en su morfología en comparación con el control. Las células
mostraron la típica morfología poligonal, la presencia de núcleos con nucléolos
intensamente teñidos y algunas figuras mitóticas (Fig. 3).
3.4. EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD Y LA APOPTOSIS
La viabilidad celular, la apoptosis y la necrosis se evaluaron mediante citometría
de flujo utilizando el kit Anexin V/PI en células expuestas a concentraciones de
partículas de ceniza de 500 y 1000 μg/mL. La viabilidad de IOBA-NHC fue superior
al 95% en todos los grupos y los porcentajes de apoptosis o necrosis también
permanecieron inalterados en comparación con el control (Tabla 1).
3.5. EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA MUC1
Decidimos evaluar la expresión de la proteína transmembrana MUC1 mediante
western blot. La Fig. 4a1 muestra que la expresión de MUC1 disminuyó en los
lisados celulares expuestos previamente a las concentraciones más altas de
ceniza de PCCVC (500 y 1000 μg/mL). Cuando se calculó la expresión proteica
relativa (Fig. 4b) observamos una disminución del 60% y 78% en la expresión de
MUC1 en los grupos PCCVC 500 y PCCVC 1000, respectivamente (p < 0,05).
Las concentraciones más bajas de ceniza de PCCVC (100 μg/mL) o la
concentración más alta ensayada para la ceniza de Calbuco (1000 μg/mL) como
se muestra en la Fig. 4 a2 no alteraron la expresión de MUC1 en las células
IOBA-NHC.
3.6. SECRECIÓN DE CITOQUINAS PROINFLAMATORIAS
La exposición de IOBA-NHC a las concentraciones más altas de partículas
PCCVC (500-1000 μg/mL) produjo un aumento significante (p < 0,05) de la
liberación de IL-6 e IL-8 en comparación con el grupo de control. Mientras que la
exposición de IOBA-NHC sólo a la concentración más alta de partículas de
Calbuco (1000 μg/mL) utilizada fue capaz de aumentar (p < 0,05) la liberación de
IL-8 en comparación con el grupo de control (Fig. 5a y b).

Fig. 5. IL-6 (a) e IL-8 (b) liberadas en sobrenadantes de células IOBA-NHC. Control experimental: células
cultivadas en medio de cultivo y control positivo: células expuestas a 100 µg/mL de DEP. Los resultados son
valores medios ± SEM de n = 3-5 experimentos independientes. *p < 0,05, **p < 0,01, ***P < 0,001 en
comparación con el control mediante ANOVA seguido de la prueba post hoc de Dunnett.

3.7 EVALUACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ROS Y RNS

Para evaluar ROS y RNS, expusimos IOBA-NHC a una concentración baja (50
μg/mL) y alta (1000 μg/mL) de partículas de ceniza. La generación intracelular de
especies oxidantes se determinó con la sonda DCF-DA mediante citometría de
flujo. Como se muestra en la Fig. 6a, las células se seleccionaron en función de
las propiedades de dispersión de la luz (dispersión lateral [SSC] frente a
dispersión frontal [FSC]) y se adquirieron 20.000 eventos por muestra. La Fig.6b
muestra que los histogramas superpuestos de los grupos PCCVC mostraron un
aumento de FL-1 DCF en comparación con el grupo control mientras que, los
histogramas de los grupos Calbuco, coinciden con el histograma del grupo control
(Fig. 6c). La MFI de DCF aumentó un 25% y un 19% en las células expuestas a 50
y 1000 μg/mL de ceniza de PCCVC, respectivamente (p < 0.01, Fig. 6d). El
aumento de la oxidación de DCF indica un aumento de la producción intracelular
de ROS en los grupos PCCVC. Por el contrario, la intensidad de la fluorescencia
DCF de los grupos Calbuco no differ significativamente del control. El nivel de
nitrito se utilizó para evaluar la producción de NO, ya que es su metabolito final.
Se observó un aumento de los niveles de nitrito en los grupos PCCVC expuestos a
50 μg/mL (183%, p < 0,01) o 1000 μg/mL (143%, p < 0,01) en comparación con el
control. Los grupos de calbuco mostraron un ligero aumento de la concentración
de nitritos, aunque no fue significativo con respecto al grupo de control (Fig. 7).

Fig. 6. ROS production of IOBA-NHC. Experimental control: cells cultured in culture media and positive control:
cells exposed to 100 µg/mL of DEP. (a) Cells were selected based on light-scattering properties (SSC versus
FSC) and 20,000 events per sample were acquired. (b) Overlaid histograms of PCCVC groups displayed an
increase in FL-1 DCF compared with the experimental control group. (c) Histograms of Calbuco groups
coincide with the control group histogram. (d) Dichlorofluorescein (DCF) fluorescence quantification. Results
are expressed as the fold of increase; mean ± SEM of n = 3 independent experiments. **p < 0.01 compared
with control by One way ANOVA followed by Dunnett's post hoc test.
Fig. 7. Concentración de nitrito en sobrenadantes de cultivos celulares de IOBA-NHC. Control experimental:
células cultivadas en medios de cultivo y control positivo: células expuestas a 100 µg/mL de DEP. Los
resultados son valores medios ± SEM de n = 3 experimentos independientes. **p < 0,01 ***p < 0,001 en
comparación con el control mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Dunnett.

3.8 EVALUACIÓN DE LAS DEFENSAS ANTIOXIDANTES

En la Tabla 2 se muestra la actividad de las enzimas antioxidantes. La SOD es una

enzima clave en la detoxificación del anión superóxido. En nuestro modelo experimental,
observamos un aumento de la actividad de la SOD en las células incubadas con 50 y
1000 µg/mL de ceniza de PCCVC en comparación con el grupo de control (29% y 39%,
respectivamente, p < 0,01). En cambio, sólo observamos un aumento de esta actividad
enzimática en la concentración más alta de ceniza de Calbuco empleada (1000 µg/mL, p
< 0,05).
GSH, el principal antioxidante intracelular de bajo peso molecular, se encontró
incrementado en las células bajo tratamiento con ceniza de PCCVC, independientemente
de la concentración empleada. No se observaron cambios en los niveles de GSH en los
grupos tratados con Calbuco en comparación con los controles (Tabla 2). GST
permaneció inalterada en todos los grupos estudiados.
Los valores se expresan como media ± SEM. Los resultados son valores medios de tres experimentos
independientes.
* p < 0.05.
** p < 0.01.
*** p < 0,001 en comparación con el control mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de
Dunnett.

3.9 OXIDACIÓN DE PROTEÍNA Y LÍPIDOS

Para evaluar el daño oxidativo de las proteínas, medimos los grupos carbonilo, uno de los
productos de oxidación de las proteínas. Se encontraron mayores niveles de carbonilos en
las células IOBA-NHC expuestas a 1000 µg/mL de cenizas de PCCVC (p < 0,05). No se
observaron differencias significativas en el contenido de carbonilos en las células
cultivadas con la misma concentración de ceniza de Calbuco o con la concentración más
baja de partículas de PCCVC (50 µg/mL). El daño oxidativo de los lípidos se determinó
como lipoperoxidación mediante TBARS. Los niveles de TBARS en las células con
tratamiento de ceniza fueron similares al con-trol, por lo que no se demostró daño
oxidativo a los lípidos bajo estas condiciones experimentales (Tabla 3).

Los valores se expresan como media ± SEM. Los resultados son valores medios de tres experimentos
independientes.
* p < 0,05 en comparación con el control mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de
Dunnett.
4. DISCUSIÓN

La ceniza producida durante las erupciones volcánicas o removilizada de los depósitos de ceniza podría
suponer un peligro para la superficie ocular, ya que está constantemente expuesta a partículas ambientales.
El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto biológico de las partículas de ceniza volcánica sobre una línea
celular conjuntival humana (IOBA-NHC). Para ello, recolectamos partículas de ceniza en Villa la Angostura, un
pueblo severamente affectado por la dispersión de ceniza tras las últimas erupciones del PCCVC (2011) y del
volcán Calbuco (2015). Las partículas de ceniza de estos volcanes varían en tamaño, composición y
morfología. Encontramos que las partículas de ceniza del PCCVC oscilan entre menos de 10-100 µm mientras
que, las partículas del Calbuco presentan dos poblaciones definidas por tamaño: una que oscila entre 300100
y 300 µm y otra que incluye partículas de 10 µm o menos de 10 µm. En cuanto a la composición química, las
cenizas de PCCVC presentaron más SiO2, Na2O y K2O y menos FeO, CaO y MgO que las partículas de
Calbuco. Estos resultados son consistentes con estudios previos donde las cenizas de PCCVC recolectadas
en Villa la Angostura mostraron una composición predominantemente riolítica con porcentajes de óxidos
similares a los encontrados en este estudio (Botto et al., 2013; Canafoglia et al., 2012). Varios estudios han
encontrado que las partículas de ceniza del Calbuco presentan una composición basáltica-andesítica y una
distribución granulométrica bimodal con una población de partículas de 100-300 µm y ceniza fina de menos de
10 µm en muestras localizadas entre 80 y 150 km de la chimenea (Reckziegel et al., 2016; Romero et al.,
2016). Villa la Angostura se encuentra a 100 km del volcán Calbuco y los resultados de microscopía
electrónica de barrido de nuestras muestras reflectan esta tendencia ya que observamos poblaciones
granulométricas similares a las mencionadas anteriormente. El Servicio Geológico Minero Argentino
(SEGEMAR) realizó un monitoreo sistemático de PM10 (material particulado de diámetro aerodinámico ≤ 10
µm) durante 10 meses a partir de septiembre de 2011. El nivel de aerosoles respirables fue muy alto desde
septiembre de 2011 hasta enero de 2012 considerándose de riesgo alto a moderado para la salud humana
(Elissondo et al., 2016). Como no se encontraron datos sobre la concentración de partículas suspendidas
totales en Villa la Angostura después de la erupción del PCCVC o la erupción del Calbuco, no pudimos
estimar el rango de concentraciones potenciales de exposición ocular. En consecuencia, decidimos realizar
nuestros estudios utilizando concentraciones de partículas urbanas (50, 100, 500 y 1000 μg/mL) similares a
las utilizadas en otros experimentos in vitro de superficie ocular (Fujishima et al., 2013; Gao et al., 2016;
Lasagni Vitar et al., 2018, 2015; Tau et al., 2013). El equipo del SEGEMAR midió PM10 en una estación al aire
libre durante septiembre de 2011 y encontró que de acuerdo a los valores establecidos por la ley 24.585 (Ley
ambiental argentina sobre calidad estándar del aire, niveles de agua y suelo) se superaba ampliamente el
límite de exposición diaria (150 µg/m3). Algunos valores alcanzaron picos superiores a 300 µg/m3 (Elissondo
et al., 2016). No hemos encontrado información publicada sobre el volumen de aire en contacto con la
superficie ocular y, además de la falta de información sobre el total de partículas en suspensión presentes tras
la erupción, es difícil predecir la concentración real de ceniza que podría haber experimentado la superficie
ocular. Además, las concentraciones también pueden depender de condiciones meteorológicas como fuertes
vientos y ausencia de precipitaciones que intensificarían la resuspensión de cenizas. El estilo de vida de las
personas también influiría en la concentración final estimada. Aunque no podemos calcular una concentración
de exposición, creemos que, dado que los picos más altos de PM10 encontrados rondaban los 300 µg/m3,
incluso teniendo en cuenta el porcentaje de partículas de más de 10 µm de diámetro, este estudio se
asemejaría a una situación de sobrecarga, ya que hemos utilizado concentraciones de órdenes superiores de
magnitud.
En el presente estudio, evaluamos en primer lugar si las partículas de ceniza de PCCVC o Calbuco afectaban
a la proliferación y viabilidad de las células IOBA-NHC. Estudios anteriores realizados con cenizas volcánicas
de diversas fuentes en células respiratorias demostraron que las partículas de ceniza inducían un efecto
citotóxico que disminuía la proliferación celular, pero la viabilidad de las células permanecía inalterada (Damby
et al., 2016; Wilson et al., 2000). Nuestros resultados muestran que las cenizas de PCCVC en las dos
concentraciones más altas (500-1000 μg/mL) utilizadas en este estudio fueron capaces de reducir la
proliferación celular sin affectar la viabilidad celular. Además, la morfología celular no se alteró cuando las
células se expusieron a partículas de Calbuco o PCCVC. Las IOBA-NHC presentaban la típica morfología
poligonal, la presencia de núcleos con nucleolos intensamente teñidos y algunas figuras mitóticas descritas
por Diebold et al. (2003). Las células conjuntivales desempeñan un papel central en los procesos inflamatorios
y la liberación de varias citocinas/ quimiocinas contribuye a la inflamación (Contreras-Ruiz et al., 2013;
Ghasemi, 2017). Este estudio muestra que la citocina pro-inflamatoria, IL-6 y el quimioatrayente de neutrófilos
IL-8, provocaron un aumento de los niveles en las células epiteliales conjuntivales expuestas a altos niveles
de ceniza de PCCVC. La concentración más alta de ceniza de Calbuco indujo sólo un aumento de los niveles
de IL-8. Las concentraciones más bajas de partículas de ceniza (50-100 μg/mL) no promovieron una
respuesta proinflamatoria. Estos resultados son coherentes con otros estudios de exposición aguda a cenizas
realizados en células epiteliales pulmonares en los que no se observó una respuesta proinflamatoria para
concentraciones de partículas de ceniza volcánica de 50 o 100 μg/mL (Damby et al., 2016, 2013; Horwell et
al., 2013).

Para preservar las funciones celulares vitales, es necesario mantener un equilibrio continuo entre las especies
prooxidantes y antioxidantes. Un aumento de las especies prooxidantes, como ROS y RNS, por encima de las
defensas antioxidantes, provoca estrés oxidativo/nitrosativo (Bandyopadhyay et al., 1999; Kohen y Nyska,
2002; Rahal et al., 2014). La contaminación ambiental se considera una fuente de especies prooxidantes
(Kohen y Nyska, 2002; Rahal et al., 2014). Estudios anteriores han sugerido que las partículas de ceniza
volcánica también tienen potencial oxidativo debido a iones metálicos de transición como el hierro, que es
capaz de generar radicales libres (Cullen et al., 2002; Horwell et al., 2003a; Horwell, 2007). En este estudio
encontramos un aumento significativo de ROS y RNS en células epiteliales conjuntivales expuestas a cenizas
de PCCVC en las dos concentraciones evaluadas.Se ha abordado que el NO podría desempeñar un papel
central en el desarrollo de la respuesta inflamatoria inducida por una gran variedad de noxas. Estas
respuestas biológicas incluyen un efecto directo en el que el NO actúa como especie oxidante contra las
noxas y un efecto indirecto en el que induce y regula la respuesta inflamatoria de las células inmunitarias
(Erdinest et al., 2015). Por lo tanto, el NO se considera un importante mensajero intracelular que, a su vez,
podría utilizarse como indicador extracelular del estado redox intracelular.
Un sistema antioxidante bien establecido es esencial para contrarrestar la acción del aumento de especies
prooxidantes (Valko et al., 2007), ya que las ROS y las RNS podrían dañar objetivos biológicos como lípidos,
ADN y proteínas (Birben et al., 2012; Kohen y Nyska, 2002; Valko et al., 2007). Encontramos en los grupos
PCCVC un aumento de la actividad enzimática de la SOD. Esta enzima cataliza la dismutación del anión
superóxido a H2O2, un componente esencial en las vías de transducción de señales que implican la
supervivencia celular (Trachootham et al., 2008). El nivel más alto de SOD correspondió al grupo PCCVC
1000, en el que se confirmó una respuesta inflamatoria mediada por IL-6 e IL-8. Se ha demostrado que la
actividad de la SOD se modula positivamente en un entorno proinflamatorio (Fattman et al., 2003). Los
antioxidantes no enzimáticos también desempeñan un papel importante en la regulación del equilibrio redox
celular. El GSH, el principal tiol de bajo peso molecular de la célula, es esencial para mantener la homeostasis
redox, así como para varios procesos celulares, como la regulación de la proliferación celular y la apoptosis, la
respuesta inmunitaria y la detoxificación (Lu, 2009; Shelly y Lu, 2014). GSH también actúa como un
secuestrador del radical hidroxilo, el iniciador de la reacción en cadena de peroxidación lipídica que se genera
por la combinación de H2O2 con iones metálicos de hierro o cobre mediante el daño oxidativo de
Fenton-Haber Weiss en el entorno pro-oxidante desencadenado por partículas de ceniza en concentraciones
y tiempos de exposición evaluados en este estudio. Sin embargo, detectamos carbonilación de proteínas en
células conjuntivales expuestas a 1000 μg/mL de cenizas de PCCVC. Debe señalarse que una dosis baja de
PCCVC indujo estrés oxidativo en el que la actividad de SOD y los niveles de GSH fueron capaces de
provocar una respuesta adaptativa, sin perjudicar la función y la proliferación celular en general. Por el
contrario, el PCCVC a la dosis más alta utilizada en este estudio indujo estrés oxidativo, pero las defensas
antioxidantes no fueron sufficientes para prevenir la oxidación de proteínas y la respuesta inflamatoria, dando
lugar a una proliferación reducida.
Las células epiteliales conjuntivales y corneales, entre otros componentes producen mucinas para proteger y
mantener la salud de la superficie ocular. Las mucinas son glicoproteínas grandes y altamente glicosiladas
que atrapan y eliminan residuos y patógenos nocivos del entorno externo y facilitan la lubricación de la
superficie ocular (Ablamowicz y Nichols, 2016; Dartt, 2004; Mantelli y Argüeso, 2008). Decidimos evaluar la
mucina MUC1, que es la mucina asociada a membrana (MAM) más ubicuamente expresada por los epitelios
corneales y conjuntivales (Govindarajan y Gipson, 2010) y normalmente está presente en las células
IOBA-NHC (Diebold et al., 2003). Encontramos que las mayores concentraciones de ceniza de PCCVC
provocaban una disminución de la expresión de MUC1. La expresión differencial de MUC1 observada podría
deberse a varios factores como la alteración de la transcripción del gen de la mucina, la traducción del ARNm
a proteína y/o la modificación postraduccional de la proteína (Dartt, 2004; Hodges y Dartt, 2013). Se ha
descrito que el estrés oxidativo podría producir una disminución de la expresión de mucina en la conjuntiva,
desterorizando la estabilidad de la película lagrimal (Kojima et al., 2015). Además, un estudio in vitro en
células epiteliales corneales demostró que la IL-6 desregula la proteína celular MUC1 sin modificar la
expresión del ARNm (Albertsmeyer et al., 2010). De acuerdo con esta hipótesis, encontramos un aumento de
IL-6 e IL-8 así como un desequilibrio redox en células epiteliales conjuntivales expuestas a ceniza de PCCVC.
Según Gipson y colaboradores (Gipson et al., 2014), una disminución de la expresión de MUC1 en las células
epiteliales corneales mejora su función de barrera, ya que deja una barrera más uniforme formada por
MUC16, que presenta un ectodominio más grande y está más glicosilado. Como MUC-16 también se expresa
en las células epiteliales conjuntivales, la disminución de la expresión de MUC1 podría ser una respuesta
adaptativa de las células conjuntivales para proteger la superficie ocular formando una barrera más uniforme
compuesta básicamente por MUC16. Deberían realizarse más estudios sobre MUC16 para revelar su función
de barrera en nuestras condiciones experimentales.

Nuestros hallazgos demuestran que las partículas de PCCVC inducen una mayor respuesta citotóxica en las
células conjuntivales en cultivo que las partículas de Calbuco. Consideramos que algunos de estos efectos
podrían estar relacionados con diferencias en el tamaño y la composición de las partículas entre las cenizas
de PCCVC y las de Calbuco. La ceniza de Calbuco presenta una gama de tamaños de partícula mayor que la
ceniza de PCCVC, por lo que, a igual concentración de ceniza, habría menos partículas de Calbuco presentes
en los cultivos celulares. En consecuencia, habría menos partículas de Calbuco en contacto con las células
IOBA-NHC. También hay que considerar que IOBA-NHC son capaces de incorporar partículas (Lasagni Vitar
et al., 2015). Por lo tanto, es posible que los efectos de ceniza que detectamos se deban, al menos en parte, a
la ceniza de pequeño tamaño atrapada. Además, los efectos tóxicos podrían deberse también a los metales
solubles liberados en el medio de cultivo, especialmente si las partículas de ceniza son demasiado grandes
para ser absorbidas por las células. Esta situación podría explicar el hecho de que, aunque las partículas de
Calbuco presentan más FeO que las partículas de PCCVC, se encontró un mayor entorno oxidativo en las
células expuestas a las cenizas de PCCVC. Deberían realizarse más estudios utilizando una suspensión de
ceniza centrifugada y exponiendo las células únicamente al sobrenadante o empleando partículas de ceniza
de tamaños similares, con el fin de dilucidar si los efectos revelados en este estudio se deben principalmente
a la composición diflerencial de la ceniza o al tamaño de las partículas.
Además, dado que la superficie ocular está expuesta directamente al medio ambiente, creemos que sería
interesante estudiar la exposición a las cenizas de las células IOBA utilizando el novedoso método de
nebulización realizado por Tomašek et al. (Tomasek et al., 2016). Este método representa un escenario más
realista de exposición a cenizas, ya que la ceniza volcánica se aplica en su estado seco directamente sobre la
interfaz aire-líquido del cultivo celular. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que muestra los
efectos citotóxicos de cenizas volcánicas de distinto origen, tamaño y composición en células epiteliales
conjuntivales humanas. Nuestros resultados podrían aportar una mejor comprensión de los síntomas oculares
que manifiestan las personas que viven cerca de zonas volcánicas.

5. CONCLUSIONES

En resumen, nuestros resultados demuestran que las partículas de ceniza de PCCVC, pero no las de
Calbuco, son citotóxicas para las células epiteliales conjuntivales humanas, lo que se traduce en una
disminución de la proliferación celular; una expresión diferencial de la mucina transmembrana MUC1; una
respuesta proinflamatoria mediada por IL-6 e IL-8; y un desequilibrio del entorno redox que provoca daños
oxidativos en las proteínas. Como no evaluamos el daño mecánico que las partículas de ceniza podrían
provocar en la superficie ocular, creemos que sería necesario realizar experimentos in vivo, así como estudios
epidemiológicos, para lograr una mejor comprensión de los efectos globales de la ceniza volcánica en la
superficie ocular.