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Investigación sobre carbohidratos 352

(2012) 60-64

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Investigación sobre carbohidratos

Pág i n a w e b d e l a r e v i s ta : www.elsevier.com/locate/carres

Nanopartículas de plata: un nanocatalizador potencial para la

degradación rápida de la hidrólisis del almidón por la a-amilasa
Vinita Ernest, P.J. Shiny, Amitava Mukherjee, N. Chandrasekaran ⇑
Centro de Nanobiotecnología, Universidad VIT, Vellore 14, India

A R t í c I N f O A Bs tR A Cto
u l O

Historia del artículo: Las nanopartículas de plata (AgNPs) han demostrado ser un material catalítico eficaz para diversas
Recibido el 4 de enero de 2012 aplicaciones debido a sus excelentes propiedades ópticas y electrónicas. En este trabajo, describimos
Recibido en versión revisada el 10 de
un enfoque novedoso para la degradación del almidón utilizando el comportamiento catalítico de las
febrero de 2012 Aceptado el 12 de febrero
AgNPs en una reacción de almidón catalizada por enzimas.
de 2012
hidrólisis por a-amilasa. Las AgNPs se sintetizaron mediante almidón soluble que redujo el nitrato de
Disponible en línea el 21 de febrero de 2012
plata a plata
átomos. Un aumento de 4,7 veces en la formación de azúcar reductor y una actividad enzimática 1,5
Palabras clave:
veces más rápida confirmaron la actividad catalítica de las AgNPs como nanocatalizador.
Nanopartículas de
Sorprendentemente, las pruebas de degradación del almidón revelaron que
plata Almidón
Amilasa Nanocatálisis
Se hidrolizaron 9,9 mg de almidón en 5 min, lo que corrobora el ensayo del azúcar reductor. En resumen,
Degradación Enzimas el presente estudio allana el camino para la degradación más rápida del almidón mediante la
inmovilizadas inmovilización de la enzima en la superficie de la AgNP, lo que podría ser una aplicación prometedora en
la industria alimentaria.
2012 Elsevier Ltd. Todos los derechos
reservados.

La industria alimentaria es un sector importante en el que la

1. Introducción
materia prima almidón se utiliza principalmente para la fabricación
de maltodextrina, dextrosa líquida, glucosa líquida, jarabes de maíz
Las nanopartículas de plata (AgNPs) se han utilizado
con alto contenido en fructosa y licores de maíz. Las enzimas son
ampliamente en muchos productos comerciales, y en catálisis,
catalizadores biológicos que aceleran las reacciones
energía, electrónica, biotecnología, textiles, cosméticos, industrias
alimentarias de envasado y biotecnología debido a sus excelentes * Autor correspondiente. Tel.: +91 416 2202624.
propiedades opto-electrónicas. Estas especies también poseen Direcciones de correo electrónico: nchandrasekaran@vit.ac.in,
prometedoras aplicaciones médicas para la cicatrización de heridas, nchandra40@hotmail.com (N. Chandrasekaran).

el diagnóstico, la biodetección y la administración de fármacos.1–6

También son excelentes agentes antimicrobianos en la industria
alimentaria. La plata se considera el mejor conductor entre los
metales.7
Las AgNP facilitan una transferencia de electrones más eficaz
que las nanopartículas de oro en los biosensores. En los últimos
años se ha prestado mucha atención a la interacción de
nanopartículas metálicas con biomoléculas para el desarrollo de
diagnósticos, sensores y la administración selectiva de fármacos. La
sensibilidad de los biosensores de glucosa se triplicó cuando la
glucosa oxidasa se inmovilizó en AgNPs.8
En la actualidad, las síntesis orgánicas de moléculas
complejas utilizan nanopartículas para la catálisis debido a sus
excepcionales activi- dades catalíticas y selectividades de los
materiales nanométricos. El tamaño y la forma de la
nanopartícula, las condiciones de preparación, la adición de
materiales de soporte y el agente de recubrimiento son factores
importantes en la catálisis.9

en presencia o ausencia de cofactores sin ningún cambio en su
Las a-amilasas, una de las principales enzimas digestivas
presentes en la saliva y en el páncreas de los animales,
descomponen las proteínas de cadena larga de los alimentos.
polisacárido almidón en maltosa y glucosa. La endohidrólisis de
los enlaces a-(1?4)-D-glucosídicos del almidón es catalizada
por la a-amilasa.
Saxena et al. han utilizado nanopartículas de níquel como
catalizador para el acoplamiento oxidativo quimioselectivo de
tioles a disulfuros.10 El acoplamiento oxidativo de n-
dodecanotiol, n-butanotiol y n-octantiol a sus correspondientes
disulfuros fue catalizado por nanopartículas de plata recubiertas
de polivinilpirrolidona (PVP).11 Las AgNP soportadas en sílice
se utilizaron como catalizadores sólidos y reciclables para las
cicloadiciones Diels-Alder de 20-hidroxicalconas y dienos, lo
que dio lugar a un alto rendimiento y número de recambios.12
El presente estudio pretende investigar la hidrólisis del
almidón catalizada por enzimas en presencia de AgNPs y la
cinética de degradación del almidón. Esto constituye una base para
la interacción nanopartícula-bimolécula, que podría aplicarse
potencialmente en la industria alimentaria.
2. Materiales y métodos
2.1. Productos químicos y reactivos
a-Amilasa (extrapura ex-porcina), almidón soluble, nitrato
de plata, molibdato de amonio y todos los demás productos
químicos eran de alta pureza y se obtuvieron de SRL, India. El
arseniato disódico se obtuvo de SD-Fine Chemicals, India. Para
todos los experimentos se utilizó agua ultrafiltrada Milli-Q
(Millipore, EE.UU.).

0008-6215/$ - see front matter © 2012 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.
doi:10.1016/j.carres.2012.02.009
 V. Ernest et al. / Carbohydrate Research 352 (2012) 60-64 61
2.7. Estudios sobre la digestión del almidón
2.2. Síntesis en un solo paso de nanopartículas de
Para la cinética de digestión del almidón, se añadieron
plata sintetizadas con almidón
cantidades iguales de a-amilasa al almidón libre y al almidón-
AgNPs en tubos separados (en tripli-
Las AgNPs se sintetizaron biológicamente utilizando almidón
soluble siguiendo el método descrito por Vigneshwaran et al.13
Brevemente, 10—3 M de nitrato de plata se añadió al 1% de
almidón soluble y se autoclavó a 15 psi, 121 °C durante 5-10 min.
La solución de color amarillo confirmó la presencia de AgNPs. La
solución se enfrió y se utilizó para análisis posteriores. La
concentración de almidón varió entre 10 mg/mL y 70 mg/mL.
Para aislar las AgNPs sintetizadas con almidón, se dejó reposar la
solución durante toda la noche y se centrifugó a 15.000 rpm durante
30 minutos. El pellet se resuspendió en agua destilada. Este
procedimiento se realizó dos veces y el pellet final se suspendió
en agua destilada y se utilizó la concentración requerida para los
experimentos.

2.3. Estudios espectrales UV-visible

Las AgNP sintetizadas a partir de almidón se sometieron a un

análisis UV-visible. Las muestras se analizaron a intervalos
regulares y se comprobó la presencia de nanopartículas de plata
en el intervalo de 300 a 600 nm en un espectrofotómetro UV-
visible (Systronics, 2201).

2.4. Microscopía electrónica de transmisión

La forma y el tamaño de las AgNPs sintetizadas se

observaron mediante microscopía electrónica de transmisión. Se
añadieron dos partes de la solución de nanopartículas sintetizada
a una parte de ácido fosfotúngstico acuoso neutro de 10 mg/mL
sobre una rejilla de cobre y se secaron al vacío. La imagen se
registró en un microscopio electrónico de transmisión operado a
un voltaje acelerado de 80 kV (Technai 10, Philips).

2.5. Medidas dinámicas de dispersión de la luz

La solución de AgNPs sintetizada con almidón se sometió a un

análisis del tamaño de las partículas utilizando el 90Plus Particle
Size Analyzer (Brookhaven Instruments Corp., Holtsville, Nueva
York, EE.UU.). Se midieron el diámetro medio y el índice de
polidispersidad de la solución.

2.6. Cuantificación de azúcares reductores en la

degradación del almidón por a-amilasa

Las pruebas se realizaron en tubos que contenían almidón

(libre) como control y AgNPs sintetizadas con almidón como
prueba. La concentración de almidón varió de 10-70 mg/ml en
ambos casos. Se utilizaron 25 UI/ml (1 mg/
mL) de a-amilasa para hidrolizar el almidón. Se utilizaron
cantidades iguales de
de almidón y a-amilasa se añadieron a los tubos y se incubaron
a 37 °C durante 5 minutos y se determinó la concentración de
azúcares reductores según el método de Somogyi-Nelson.14
Brevemente, se añadió 1 mL de reactivo alcalino de tartrato de Cu
tras 5 min de interacción, y se mantuvo en agua hirviendo durante
10 min. A continuación, se enfriaron los tubos y se añadió 1 mL de
reactivo de arsenomolibdato y el color azul desarrollado se midió
en un colorímetro a 620 nm después de 10 min. A continuación, los
valores de absorbancia obtenidos se compararon con un conjunto de
patrones (las pruebas se realizaron por triplicado). La determinación
del azúcar liberado durante la reacción se estimó utilizando la curva
patrón de la maltosa. Se cuantificó el azúcar liberado en la muestra
de ensayo y se calculó la actividad enzimática (expresada en
mg/mL/min).14 Se trazó un gráfico de Michaelis-Menten y se
obtuvieron los valores Km y V .max
cate) y se incubaron a temperatura ambiente durante 60
minutos. Se tomaron alícuotas a intervalos regulares y se Figura 1. Nanopartículas de plata sintetizadas con almidón Nanopartículas de plata
añadió solución de yodo para investigar la desaparición del sintetizadas con almidón que muestran un pico prominente a 401 nm.
color negro azulado del almidón. El contenido de almidón en
las muestras de ensayo se cuantificó con el correspondiente
gráfico estándar de patrones de almidón y se calculó la
velocidad de deg- radación del almidón. El valor de
absorbancia del color se leyó a 620 nm. Se comprobó que en
ambas condiciones de ensayo se utilizara la misma cantidad de
proteína (enzima).15

3. Resultados y debate

El presente estudio revela que las AgNPs muestran una mayor

actividad en- zimática en la endohidrólisis del almidón. Esto se
dedujo de los resultados del ensayo de azúcar reductor (Somogyi-
Nelson) y de las pruebas de degradación del almidón. La solución
se volvió amarillo pálido al cabo de 10 minutos, y el cambio de
color confirmó la presencia de AgNPs. Se supone que la
terminación aldehídica del almidón soluble reduce el nitrato de
sil- ver, estabilizando así las AgNPs por el propio almidón.13 El
pico plasmónico observado a 401 nm confirmó la presencia de
AgNPs (Fig. 1). Las AgNPs resultantes eran de naturaleza
monodispersa con un índice de polidispersidad de 0,325. El
tamaño de la partícula a partir de la imagen TEM oscilaba entre 5
y 40 nm. El diámetro medio se calculó en 23,2 ± 3,4 nm (Figs. 2 y
3). También se observó que la solución de nanopartículas
resultante era estable durante más de un mes sin aglomeración de
partículas.
Los resultados obtenidos mediante la cuantificación de
azúcares reductores por el método de Somo- gyi-Nelson abogaron
por mayores cantidades de producción de glucosa en presencia de
AgNPs en comparación con el almidón libre. A partir del gráfico
estándar, se calculó que el contenido de glucosa en el almidón
libre y en la hidrólisis del almidón sintetizado con AgNPs era de
48,2 y 226,5 mg de glucosa, respectivamente. La formación de
azúcares reductores se multiplicó por 4,7, lo que sugiere que las
nanopartículas desempeñan un papel importante como
nanocatalizador en la degradación rápida del polisacárido
complejo almidón en azúcares reductores. Se observó que la
velocidad de reacción aumentaba en la pres-
ence de nanopartículas de plata y se representa en la Figura 4a. La
tasa inicial de formación de azúcar reductor por hidrólisis de a-
amilasa cuando
calculados a partir de los gráficos fueron de 3,902 y 5,652 mg
(min mL)—1 para el almidón libre y para las NPs de Ag
sintetizadas con almidón, respectivamente. Esta última reacción
es 1,5 veces (aprox.) más rápida que la primera.
Los valores de Km y Vmax obtenidos a partir de la ecuación de
Michaelis-Menten fueron 33,62 mg/mL y 23,50 mg/mL/min y
35,78 mg/ mL y 37,73 mg/mL/min para las AgNPs sintetizadas
con almidón y almidón, respectivamente Figura 4a. Los valores
más altos de Km y Vmax significan que
62 V. Ernest et al. / Carbohydrate Research 352 (2012) 60-64

Starc h
a 30 Starc h AgNP

(mg/ml/min)
20

enzimática
Actividad
10

0
0 20 40 60 80
Concentración de almidón ( mg/ml)

b 10

(mg/ml/min)
enzimática
6

Δ Actividad
4

0
Figura 2. Imagen TEM de nanopartículas de plata sintetizadas 0 10 20 30 40 50
mediante almidón.
Concentración de almidón (mg/ml)

Figura 4. (a) Curva de Michaelis-Menten que muestra el aumento de la actividad

enzimática en presencia de AgNPs sintetizadas con almidón. (b) Gráfico entre la
concentración de almidón y la actividad enzimática D que muestra un aumento
lineal de la actividad enzimática.

1.5
almidón
almidón
AgNP
Contenido de
almidón
(mg/ml)

1.0

0.5

0.0
Figura 3. Medición de la dispersión dinámica de la luz de las nanopartículas de 0 1 2 3 4 5
plata sintetizadas.
Tiempo (min)
la actividad enzimática aumenta en presencia de AgNPs. En la Figura 5. Curva de degradación del almidón (10 mg/ml) Curva de degradación del
Figura 4b se representa la diferencia en la actividad enzimática almidón (10 mg/ml) que muestra una degradación más rápida de la molécula de
entre el almidón libre y las AgNP sintetizadas en almidón. El almidón en presencia de nanopartículas de plata.

gráfico muestra una relación lineal entre la concentración de

almidón y el aumento de l a a c t i v i d a d e n z i m á t i c a .
La degradación del almidón se estudió mediante la formación 3
de complejos almidón-yodo a 620 nm (Fig. 5). Los resultados
sugirieron que en el
(mg min -1 ml-1)

final de 5 min, 0,53 mg/mL de almidón seguían presentes en la estructura de la enzima eran responsables
2
Velocidad de
degradación

hidrólisis del almidón libre, mientras que sólo 0,1 mg/mL de la reducción de AuCl— a Au
quedaban sin hidrolizar; es decir,
Se han hidrolizado 9,9 mg/mL de almidón en presencia de AgNPs.
1
Esto confirma que la actividad de la enzima ha aumentado. Un
gráfico comparativo entre la velocidad de degradación del almidón
y la concentración de sustrato en presencia y ausencia de AgNPs
0
demuestra claramente que la degradación del almidón aumentó 0 10
(Fig. 6). 20
La síntesis de NPs de Au mediante a-amilasa conservó su activi- 30
al tiempo que demostraba que los enlaces tiol presentes en la 40
50
4
 Concentración de almidón (mg/ml) almidón
almidón AgNP
NPs. La cinética de la digestión del almidón en presencia de la Figura 6. Cinética comparativa de la degradación del almidón en la AgNP y el almidón
enzima pura y del complejo Au NP-a-amilasa reveló que la zona libre.
formada sobre
 V. Ernest et al. / Carbohydrate Research 352 (2012) 60-64 63

Figura 7. Mecanismo propuesto de inmovilización de la a-amilasa en la AgNP para formar un complejo enzimático de nanopartículas y la subsiguiente degradación del almidón
libre. La estructura 3D de l a a m i l a s a se tomó de PDB (1DHK).

el pozo de Au NP-a-amilasa era menor, porque la difusión era aumenta en el

limitada.15 Esto confirma que la degradación del almidón no fue presencia de AgNPs aunque el mecanismo exacto de unión aún está
tan eficaz cuando la nanopartícula fue sintetizada por la enzima. por explorar.
Los estudios sobre la captación de nanopartículas por el almidón En nuestro presente estudio, las AgNPs sintetizadas con almidón
Au nanocom- posito y la digestión de nanopartículas de almidón al interactuar con la a-amilasa fueron capaces de romper el
Au por a-amilasa se complejo de almidón
informó. La velocidad de digestión del almidón en el nanocom-
posito de Au y en el almidón libre fue casi similar a la estudiada
en mediante la prueba del yodo. La enzima se adhirió a la
nanopartícula tras la degradación del almidón del compuesto y no
a los azúcares reductores, mientras que se conservó la actividad
enzimática.16
Las AgNPs han demostrado ser catalizadores beneficiosos en la
industria. Las AgNPs recubiertas con PVP catalizaron el
acoplamiento oxidativo de tioles a disulfuros.11 Las propiedades
catalíticas de las AgNPs soportadas sobre esferas de sílice fueron
capaces de catalizar la reducción de colorantes por borohidruro
de sodio (NaBH4 ).17
El mecanismo propuesto para la velocidad de reacción más
rápida de la hidrólisis del almidón en presencia de las AgNPs se
representa en la figura 7. El nitrato de plata se reduce a NPs de
plata por el propio almidón y las NPs se formaron dentro del
núcleo helicoidal de la molécula de almidón.13 Las AgNPs se
incrustan dentro de la estructura helicoidal porque el extremo
aldehído de la molécula de almidón reduce la forma iónica de la
sal a
su estado atómico.13,16 Tras la interacción de la a-amilasa con el
AgNPs sintetizadas con almidón, el almidón es degradado por la
enzima en
azúcares reductores y la inmovilización de la a-amilasa tienen
lugar en la superficie de la AgNP. En general, las AgNP tienden
a
aglomerarse más rápidamente en cualquier medio biológico y
sedimentarse en el fondo. Para nuestra sorpresa, no se observó tal
aglomeración durante la reacción y, por lo tanto, confirmamos que
las AgNPs tienen la posibilidad de ser estabilizadas por la molécula
de proteína a través de los enlaces tiol, y así la molécula de enzima
queda inmovilizada.16 Un hecho bien conocido es que sobre un
soporte sólido, la eficacia de la enzima aumenta en comparación
con su forma libre.17 Esto degrada el almidón libre a un ritmo
mayor porque la colisión producida por el sistema será menor que
cuando se compara con el almidón libre. Esto podría actuar como
nanocatalizador en la hidrólisis del almidón cat-
alisada por la a-amilasa. Así, la velocidad de reacción
con la fijación de la enzima sobre su superficie, quedando así
inmovilizada y degradando el almidón mucho más rápidamente
que cuando se compara con el almidón libre. Dado que la
frecuencia de colisión entre la enzima soluble (libre) y la
molécula de sustrato y sus orientaciones estéricas constituye la
base de la actividad enzimática, la enzima inmovilizada supera
esta limitación con el apoyo de una nanopartícula sólida,
mientras que esto no ocurre en el caso del almidón libre.15 Por
lo tanto, la velocidad de reacción es alta y la descomposición
del almidón en moléculas más pequeñas como monosacáridos y
disacáridos es más rápida. Por lo tanto, las AgNP sintetizadas a
partir de almidón resultan ser un nanocatalizador más eficaz que
las nanopartículas de oro en la degradación del almidón a una
velocidad más rápida.15,16 en la degradación del almidón a
mayor velocidad.

4. Conclusión

En resumen, las AgNP sintetizadas con almidón mostraron

una mayor velocidad de reacción con la a-amilasa en
comparación con el almidón libre. El sitio
La degradación de la cinética de digestión del almidón en
presencia de AgNPs produjo rápidamente mayores cantidades
de azúcares reductores. Este estudio revela que las
nanopartículas pueden tener un efecto significativo en el campo
de la nanocatálisis, prometiendo un uso potencial en la
industria del almidón para la rápida degradación de moléculas
complejas a otras más simples mediante la inmovilización de las
enzimas en la superficie de las nanopartículas. También
podrían utilizarse en kits de ensayo, ya que requieren menos
tiempo, y en aplicaciones biomédicas como la administración
de fármacos y la detección.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la Dra. M. Anandachitra, del

Laboratorio Centralizado de Instrumentación, TANUVAS,
Chennai, su ayuda en la obtención de imágenes TEM.

Referencias

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