Compartimientos membranosos de la vía secretora

Microscopía electrónica

Una célula de mamífero sintetiza

aproximadamente 20.000 proteínas
distintas, de las cuales la mitad son
distribuidas a diferentes compartimientos
membranosos, y cerca de un tercio son
sintetizadas asociadas al retículo
endoplásmico (RE), que es la puerta de
entrada a la vía secretora. Las proteínas
que entran en esta vía pueden ser de
membrana o solubles.

• La vía secretora está compuesta por

diversas estructuras o
compartimientos membranosos.
• El movimiento de proteínas entre
compartimientos requiere de la
gemación, transporte y fusión de
estructuras túbulo-vesiculares.

Lodish et al. MCB 1999

 El RE consiste en una red de túbulos y sacos membranosos (cisternas)
interconectados y continuos con la envoltura nuclear
La morfología general del RE (sacos, túbulos y envoltura nuclear) se revela por tinción con compuestos lipofílicos fluorescentes como por ej. rodamina hexil éster, (A),
inmunofluorescencia, o la expresión de proteínas residentes del RE fusionadas a GFP (B). La microscopía electrónica permite la distinción entre REL y RER (C).

El RE es un sistema de endomembranas que se extiende por toda la célula y delimita un espacio, denominado lumen,
que ocupa > 10% del volumen celular, y que es contínuo con el espacio entre la membrana nuclear interna y externa.

A B

microscopía electrónica
RE liso (REL) RE rugoso (RER)
C C

Voeltz et al., EMBORep 2002

Medcell.org; Shibata et al, Cell 2006 Friedman & Voeltz, TICB 2011
La morfología del RE está determinada por distintos mecanismos mediados por proteínas

a. Deformación mediada por proteínas que ejercen fuerzas mecánicas. Motores

moleculares como kinesinas, asociados a membranas de baja curvatura pueden generar
finos túbulos con álta curvatura (~20-60 nm de diámetro) al translocarse vectorialmente
sobre los microtúbulos. Alternativamente, proteínas ancladas al RE interaccionan con el
extremo de microtúbulos en fase de elongación, induciendo la tubulación.

b. Deformación mediada por proteínas “scaffolding” o andamiaje. En este caso,

proteínas individuales o asociadas formando oligómeros, generan una superficie
curvada que al asociarse a la membrana ejercen la fuerza suficiente para deformarla.
Por ejemplo, éste es el mecanismo empleado por las proteínas de la familia BAR y
por las proteínas de cubierta COP I, II y clatrina.

c. Deformación mediada por proteínas que se insertan de manera asimétrica. Esto

resulta en la alteración diferencial del empaquetamiento de los lípidos de las hemicapas.
Por ejemplo, miembros de la familia de reticulones actúan de esta manera.
 Diversas proteínas contribuyen a generar y estabilizar la forma del RE

reticulones

proteínas que
promueven álta Los dominios en bucle o tipo “hairpin”
curvatura, de los reticulones se insertan en la
ej. Reticulones hemicapa citosólica y deforman la
Proteínas que regulan las dimensiones membrana, promoviendo su curvatura.
del espacio luminal, ej. CLIMP63

lúmen
Proteínas que regulan la fusión de membranas: GTPasas, ej. Atlastinas

Interacciones intra-luminales Estabilizadores

de forma, ej. p180

Shibata et al, ARDB 2009; Friedman & Voeltz, TICB 2011; Wang & Rapoport, JCS 2019
 Los microtúbulos participan en la organización espacial y al dinamismo del RE
MTs

Los túbulos del RE se extienden hacia la periferia celular empleando dos mecanismos diferentes: RE
1) Mediante la asociación con moléculas motoras que se desplazan sobre los microtúbulos en dirección del extremo (+) 2)
2) Mediante la unión a complejos proteicos que interaccionan con tubulina-GTP en los extremos (+) de los microtúbulos elongación
1) (+)
RE
MTs

microtúbulos RE superposición

Los microtúbulos se marcaron

mediante la microinyección de
tubulina conjugada a rodamina
(rojo). El RE se marcó con el
compuesto DiO (verde). Las
flechas blancas largas señalan
la colocalización entre MTs y
RE. Las flechas amarillas
señalan el margen de la célula.
Note el co-alineamiento de los
microtúbulos y túbulos del RE

Análisis de la codistribución de MTs y RE por videomicroscopía. Las fotos muestran una región ampliada de la célula a tiempo cero.

Waterman-Storer & Salmon, CB 1998 (video disponible)

 La distribución y dinámica del RE puede analizarse por microscopía de
“time lapse” empleando células vivas
microscopio invertido equipado para fluorescencia, con cámara de
incubación que permite mantener constante la temperatura y el CO2
Las células se mantienen en un medio de cultivo apropiado,
a 37°C, a un pH balanceado, con todos los nutrientes, y
suplementado con suero fetal y antibióticos.

La exposición de las células a la luz, requerida para la

células adquisición de imágenes, se controla adecuadamente (tiempo,
intensidad) para evitar la foto-toxicidad y muerte celular.

El RE cambia de forma constantemente, y debido a

su comportamiento dinámico muestrea el 100% del
volumen del citoplasma en aprox. 15 min.

Los números indican tiempo transcurrido en segundos

Cámara
CCD

Cámara
termostatizada

Lu et al Sci Adv, 2020

Control de
temperatura
(videos disponibles)
 La técnica de FRAP permite visualizar la dinámica de proteínas en la membrana del RE
FRAP: Fluorescence Recovery After Photobleaching

"photobleaching" es la fotodestrucción o “fotoblanqueo” de la fluorescencia emitida por un fluoróforo (por ej. la proteína GFP).
Usualmente esto se realiza en un área definida de la célula (flechas azules) y de manera rápida empleando un láser a máxima potencia.

tiempo
El análisis cuantitativo de los datos de FRAP permite calcular dos
parámetros cinéticos: 1) la fracción móvil (Mf), la cual es la fracción de
proteínas fluorescentes que difunden al área de fotoblanqueo; 2) la
constante de difusión, D, la cual es una medida de la velocidad de
desplazamiento de las proteínas. T1/2 , tiempo en el cual se alcanza la mitad
de la fluorescencia recuperada, es un parámetro que directamente permite
región definida comparar la movilidad de diferentes muestras en un mismo experimento.

FRAP: Comparación de dos proteínas con distinta movilidad fluorescencia

100% no recuperada
50%
fluorescence

intensity
50%

50% fluorescencia
recuperada
T1/2 T1/2

Experimentalmente se registra la intensidad de la fluorescencia

dentro de una región (ROI) de la célula en función del tiempo, antes y
después de la fotodestrucción (“photobleaching”) de la fluorescencia.
Note que las moléculas representadas por la curva roja exhiben una T1/2 time
movilidad o diffusion mayor que las representadas por la curva azul.
 VSVG-GFP
VSVG-GFP
FRAP revela que la glicoproteína VSVG-GFP se inmoviliza + Tunicamicina

en el RE cuando se inducen defectos en el plegado

VSVG

VSVG es una glicoproteína viral que se

expresa en la membrana plasmática de las
células infectadas. La técnica de FRAP revela La ventana muestra
su álta movilidad durante su tránsito por el RE. la región (ROI) de
fotodestrucción de
la fluorescencia.
Para esto se emplea
Curvas de FRAP un láser a máx
VSVG-GFP 100% de recuperación potencia.
de la fluorescencia

fracción inmóvil

VSVG-GFP + TM

40% de recuperación
de la fluorescencia

VSVG es glicosilada en el RE, proceso que es esencial para el plegado de

la proteína. La inhibición de la glicosilación con la droga tunicamicina (TM)
provoca su agregación y retención en el RE. Esto se revela en las curvas
obtenidas con los datos de FRAP y en los paneles de la microscopía.

(Nehls et al, Nature CB2000) recuperación No recuperación (videos disponibles)

 La técnica de FLIP permite analizar la movilidad y continuidad del
compartimiento membranoso donde se localiza la molécula fluorescente

Experimentalmente se registra la intensidad de la fluorescencia de toda la célula en función del tiempo

mientras se fotodestruye continuamente la fluorescencia dentro de una región definida (rectángulo en rojo).

Si la proteína está localizada en un compartimiento contínuo al

de la ventana de fotoblanqueo, la fluorescencia de la célula es
progresivamente destruída con el tiempo.

ventana de
fotodestrucción

Ciertas variantes de GFP sólo se tornan fluorescentes al ser fotoactivadas con un pulso de energía UV. Asi, la movilidad
y destino de las moléculas fluorescentes puede ser examinado independientemente de la síntesis de novo.

la intensidad de la fluorescencia dentro de

la ventana de fotoactivación disminuye
como consecuencia de la difusión
de las de moléculas fluorescentes.

Lippincott-Schwartz et al, Science 2003

 La técnica de FLIP revela la localización de KDEL-GFP en compartimientos discontínuos

Las proteínas solubles residentes del RE (ej. BiP) escapan al cis-Golgi como consecuencia del transporte vesicular y luego son
retornadas al RE por transporte retrógrado. Estas proteínas poseen la secuencia KDEL que actúa como una señal de recuperación al RE.

Los paneles superiores muestran que la fotodestrucción de la fluorescencia de KDEL-GFP ocurre solo en parte, y corresponde a la fracción de KDEL-GFP del RE.
La fluorescencia remanente corresponde a la fracción que se encuentra en vesículas de transporte entre el ER y Golgi (flechas). En contraste, los paneles
inferiores muestran que la fluorescencia de VSVG-GFP localizada en el RE (compartimiento membranoso continuo) es eliminada casi en su totalidad.

fotodestrucción

fluorescence
Nehls et al NCB2000
 La cinética del transporte de proteínas en la vía secretora puede
analizarse por microscopía de “time-lapse”

Microscopía de fluorescencia de células en cultivo que expresan una mutante termosensible de la proteína viral de membrana VSVGts fusionada a GFP.
La incubación de las células a 40°C provoca la retención de VSVGts en el RE. Cuando la temperatura se baja a 32°C, la VSVG se pliega correctamente y se
inicia su transporte hacia la superficie. Debajo se muestra la localización de la VSVG-GFP a distintos tiempos después de comenzar la incubación a 32°C.

Cuantificación de las distintas fracciones de

VSVG-GFP en el proceso de tráfico anterógrado

ER Golgi membrana plasmática

fusión de vesículas de VSVGts-GFP con la membrana plasmática (flechas)

videos disponibles

Hirschberg et al JCB 1998; Lippincott-Schwartz Hist. Cell Biol 2001

 La cinética del transporte también puede analizarse bioquímicamente empleando
endoglicosidasas que digieren glicanos específicos del RE y Golgi

Células que expresan la mutante VSVGts se incuban con un pulso de aminoácidos conjugados a radioisótopos a 40°C. Esto permite que las proteínas
sintetizadas en el RE (incluída la VSVGts) queden retenidas allí. Luego se cambia la temperatura a 32°C para que las proteínas se plieguen a su forma nativa
y comiencen a ser exportadas del RE. A distintos tiempos se toman muestras, se preparan los extractos proteicos, y se incuban con endoglicosidasa D.
Posteriormente los productos proteicos de interés son aislados, fraccionados en geles de poliacrilamida y analizados por fluorografía.
pasaje al Golgi

VSVG

Los N-glicanos agregados a proteínas en el ER,

usualmente Man8(GlcNAc)2, eventualmente son
procesados por manosidasas presentes en el
cis-Golgi y generan productos de Man5(GlcNAc)2.
La endoglicosidasa D es capaz de remover de incremento de
manera selectiva, y en bloque, a las cadenas de VSVG en el Golgi
Man5GlcNAc2 de los substratos, y no actúa sobre
los glicanos de Man8(GlcNAc)2 agregados en el RE.

VSVG retenida
en el RE

Lodish et al. MCB 2021

 Los eventos de exocitosis pueden ser visualizados y cuantificados mediante
epifluorescencia y TIRF en células vivas
TIRFM: Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

anclaje fusión
“docking” “flattening” difusión parte de una célula visualizada simultaneamente
mediante epifluorescencia convencional y TIRF

Campo
evanescente epifluorescencia

TIRF (zona de excitación de ~150 nm)

Dinámica del proceso de fusión

Vesículas visualizadas por epifluorescencia (rojo) y TIRF (verde) en células transfectadas con VSVG-GFP. Cuando
las vesículas se fusionan a la MP incrementa la fluorescencia de TIRF la cual difunde post-fusión (flechas).

Schmoranzer et al JCB2000
Toomre et al JCB2000

videos disponibles
El análisis genético en levaduras permitió identificar genes esenciales para el tráfico intracelular

Mutantes condicionales sensibles a la temperatura. Son aquellas que afectan la secreción en células haploides. Se
clasifican en diferentes clases de acuerdo a la etapa del transporte afectada en los fenotipos (denominadas mutantes sec).

Wild type

El análisis de doble mutantes en diferentes combinaciones permite reconstruir la secuencia de eventos que ocurren en la vía secretora.
Por ejemplo, si se generan doble mutantes de clase B y clase D, ¿cuál es el fenotipo esperado?...acumulación de proteínas en el ER!

Lodish et al. MCB 2004

Retículo endoplásmico rugoso (RER)
 La secuencia señal y secuencias de transmembrana determinan la topología de las
proteínas insertadas en la membrana el RE

La topología de una proteína

de membrana describe el
número de veces que la cadena
polipeptídica atraviesa la
membrana y la orientación de
los dominios de transmembrana.

Lúmen
del RE

citosol
La orientación de la secuencia señal y de los
dominios de transmembrana depende
La topología de las proteínas básicamente de 3 factores:
integrales de membrana en 1) residuos básicos que flanquean la secuencia
general es determinada y fijada hidrofóbica,
durante la inserción inicial del 2) estructura del terminal amino,
polipéptido en la membrana. 3) hidrofobicidad y largo de la región hidrofóbica.

s
Higy et al. Biochem. 2004
 Proteínas luminales y de secreción

5’ mRNA 3’
traducción
N polipéptido C

Estas proteínas se translocan en su

totalidad al lúmen del RE. Poseen una
secuencia señal clivable y no tienen
segmentos de transmembrana.
 Proteínas de membrana tipo I

(ss)

(translocón)

• Las proteìnas poseen una secuencia señal amino terminal (ss) que se inserta en el translocon
sec61 formando una horquilla, con el extremo amino terminal orientado hacia el citosol.
• Durante la translocación del polipéptido, una secuencia interna hidrofóbica actúa como
secuencia de parada de la translocación y de inserción a la membrana (en naranja).
• El clivado de la ss genera un nuevo extremo amino terminal luminal, que en general es de gran
tamaño. El extremo carboxilo de la proteína madura se localiza en el citosol.
Ejemplos de estas proteínas son las integrinas, caderinas, EGFR, receptor de la insulina, etc
Proteínas de membrana tipo II y III

Proteína tipo II

• Estas proteìnas poseen una secuencia hidrofóbica interna (no clivable) que
actúa como secuencia señal y de inserción a la membrana.
• Su orientación es similar a la de las proteínas de tipo I en el translocón sec61.
El extremo amino de la proteína madura permanece en el citosol y el extremo
carboxilo se transloca al lúmen.
Ejemplos de este tipo de proteínas son el receptor de transferrina, muchas
glicosil transferasas, etc

Proteína tipo III

• Poseen una secuencia hidrofóbica interna (no clivable) que actúa como secuencia
señal y de inserción a la membrana.
• Su inserción es opuesta a la de las proteínas de tipo I y II, y requiere de la insertasa
EMC (no mostrada en el esquema). El extremo amino, que es usualmente corto, se
transloca y el extremo carboxilo de la proteína madura permanece en el citosol.
Ejemplos son: citocromo P-450
Proteínas de membrana de múltiples pasos de transmembrana (tipo IV)

Estas proteínas se anclan a la membrana por

varios dominios de transmembrana (TM). La
orientación topológica del primer TM define
la orientación de los subsiguientes TM.
 Varias proteínas se insertan en membranas mediante múltiples dominios de transmembrana

El perfil hidropático resulta del análisis de hidrofobicidad de la Los segmentos hidrofóbicos inician la translocación (“start transfer signal”,
secuencia de aminoácidos. Este perfil permite identificar dominios en rojo) o detienen la translocación (“stop transfer signal”, en naranja) en
de transmembrana (naranja-rojo) y regiones hidrofílicas (verde). proteínas con múltiples pasos de transmembrana (TM). Las regiones
translocadas son las que se localizan en el lúmen del RE.

topología

Ejemplos de estas proteínas son los receptores

acoplados a proteínas G, como la rodopsina, o el
receptor beta adrenérgico.
 Un grupo de proteínas se anclan a la hemicapa ectoplásmica de la membrana plasmática
mediante un ancla de glicosil fosfatidil inositol (GPI)

Hidrofílico
(polar)

La señal de ancla a GPI no está conservada a nivel de la secuencia de aminoácidos.

• Los precursores de proteínas ancladas a membrana por anclas de GPI típicamente

poseen una secuencia señal amino terminal clivable y una secuencia hidrofóbica
localizada en el extremo carboxilo precedida por un corto segmento hidrofílico que
actúa como señal para el clivado y sitio del anclaje (ω).
• El GPI es un glicolípido sintetizado en el ER y transferido a la proteína aceptora
ω
recién sintetizada en una reacción post-traducción.
• La reacción es catalizada por la GPI transamidasa del RE la cual cliva el dominio de
transmembrana en el flanco luminal (flecha) y transfiere el nuevo extremo carboxilo
del polipéptido (residuo ω) a un grupo GPI preformado en el RE (transamidación).
• Las proteínas ancladas por GPI difunden rápidamente en el plano de la membrana.
Ejemplos incluyen a receptors de adhesión, enzimas hidrolíticas, reguladores del
complemento, etc
Lodish et al MCB 2022; Liu et al., Biomolecules 2021
 Enzimas asociadas a la cara citosólica de la membrana del RE sintetizan fosfolípidos

scramblasa

Ácidos grasos esterificados a la coenzima A y generados en el citosol son esterificados al glicerol fosfato por enzimas localizadas en el RE, formando
ácido fosfatídico en la hemicapa citosólica del RE (1). La adición del grupo polar o cargado es catalizado por otras enzimas adicionales asociadas al
RE (2, 3). La síntesis de fosfatidil serina, etanolamina y fosfatidil inositol ocurre de manera similar. Enzimas denominadas scramblasas catalizan el
movimiento inespecífico de fosfolípidos desde la hemicapa citosólica a la hemicapa exoplásmica uniformando su distribución.
Lodish et al, MBC 2016
Las enzimas scramblasas y flipasas catalizan la translocación de fosfolípidos entre hemicapas

 Las enzimas mezcladoras ¨scramblasas¨ catalizan el

movimiento bidireccional de fosfolípidos y equilibran los
fosfolípidos entre ambas hemicapas. Las scramblasas son
inespecíficas y su función no requiere de ATP. En el RE, las
scramblasas aseguran que las nuevas moléculas de fosfolípidos
sintetizadas en la hemicapa citosólica se distribuyan de manera
simétrica entre las hemicapas.

 Las enzimas flipasas son ATPasas y generan asímetría en las

membranas. En la membrana plasmática catalizan la
translocación de fosfolípidos específicos desde la hemicapa
extracellular a la hemicapa citosólica, generando asimetría en la
distribución lipídica. Por ej. En células funcionales translocan
fosfatidilserina (PS) y fosfatidiletanolamina (PE).

Notablemente, la activación de caspasas durante apoptosis produce

simultáneamente la inactivación de las flipasas y la activación de las
scramblasas en la membrana plasmática, favoreciendo la exposición
de PS en la hemicapa exoplásmica. PS actúa como una señal de
“eat me” para los fagocitos (p. ej. los macrófagos).

cytosol
Alberts et al, MBC 2016
 En su tránsito por la vía secretora los polipéptidos experimentan
diversas modificaciones antes de alcanzar sus destinos finales:

Plegado (estructura terciaria y cuaternaria)

En el RE Formación de puentes disulfuro
 Glicosilación en el nitrógeno de residuos asparagina (N-glycosylation)

 Glicosilación en el oxígeno de residuos serina o treonina (O-glycosylation)

En el Golgi
 Procesamiento proteolítico

Varias familias de chaperonas asisten en el plegado de los polipéptidos translocados al lumen del RE:

- Hsp70 (ej. BiP)

- Hsp40
- Hsp90
- peptidil-prolil isomerasas
- disulfuro isomerasas
- calnexina y calreticulina
 La formación y rearreglo de puentes disulfuro en los polipéptidos del RE es catalizado
por proteínas disulfuro isomerasas (PDI)
Los puentes disulfuro intra e intermolecular estabilizan la estructura terciaria y cuaternaria de varias proteínas de secreción o de los dominios exoplásmicos
de proteínas de membrana. Se forman por oxidación de grupos sulfidrilos (SH-) de residuos cisteína. En eucariotas solo se forman en el lúmen del RE.

3 El lúmen del RE es un ambiente oxidante que favorece la formación

de puentes disulfuro. La enzima PDI posee dos cisteínas en su sitio
activo que son rápidamente interconvertidas entre su forma
oxidada, formando un puente disulfuro, y su forma reducida (di-tiol).

La reacción de oxidación del substrato incluye dos pasos y la

1 formación de un intermediario enzima-substrato (1). Como resultado
dos tioles del substrato forman un puente disulfuro y la enzima queda
en su forma reducida con 2 tioles (2). La reconstitución de la forma
oxidada de la PDI depende de la enzima Ero1, la cual es reducida (3).

PDI también contribuye a corregir puentes disulfuros en

intermediarios con plegado defectuoso, en un proceso denominado
isomerización. En este caso, la enzima reduce puentes disulfuro del
substrato permitiendo cambios conformacionales y la formación de
puentes disulfuro nuevos compatibles con la estructura nativa (b).

Lodish et al. MCB 2016

 La rotación de los polipéptidos en los enlaces peptídicos que preceden a prolinas es
catalizada por peptidil-prolil-isomerasas (PPI)

Los enlaces peptídicos (C-N, ω) tienen un carácter de doble enlace parcial, lo cual impide la rotación de los átomos a ambos extremos
y posee una geometría planar (señalada en gris). La rotación puede ocurrir en los enlaces del carbono alfa (phi φ, psi ψ).
Los enlaces peptídicos en su mayoría poseen una configuración trans aunque la presencia de prolina favorece la configuración cis
debido a interacciones estéricas (líneas en marrón). La rotación de los enlaces peptidyl-prolil es lenta y limitante del proceso de
plegamiento. Las PPIs catalizan las rotaciones de tales enlaces facilitando el plegado.

Dipéptido en trans
Rotación del enlace peptídico

Cα Cα
ω ω

Williamson, 2012
 BiP, calnexina y calreticulina contribuyen al plegado del polipéptido de diferentes maneras

• La chaperona Bip se une a regiones hidrofóbicas del polipéptido y evita su agregación. Su función requiere de unión e hidrólisis de ATP.
• Las chaperonas Calnexina y Calreticulina poseen un dominio conservado de lectina que reconoce regiones glicosiladas
(monoglucosiladas) y contribuyen a monitorear el plegado del polipéptido. La función de ambas requiere de la unión de iones Ca2+.

Lodish et al. MCB 2016

La N-glicosilación de proteínas se inicia con el agregado en bloque de un oligosacárido a la
cadena naciente mientras es translocada al lúmen del RE

α1,2
La glicosilación promueve el plegado, incrementa la solubilidad de las
proteínas, inhibe la agregación y estabiliza la conformación nativa.
α1,3

α1,3

α1,2 α1,2 α1,2

(GlcNac2Man9Glc3)
α1,3
α1,2 α1,6
α1,3 α1,6

β1,4

La enzima oligosacaril transferasa, forma un complejo con el translocón en

la cara luminal del RER, y cataliza la transferencia en bloque del oligosacárido β1,4
precursor unido al dolicol, al átomo de nitrógeno del residuo asparagina en la
secuencia Asn-X-Ser/Thr del polipéptido naciente (en rojo). β1,N

Lodish et al. MCB 2016

 El oligosacárido precursor es sintetizado en el citosol asociado al dolicol,
un lípido poli-isoprenoide inserto en la membrana del RE

Enzimas asociadas a la membrana del RE catalizan, a partir de nucleótido-azúcares, la síntesis del oligosacárido precursor unido al
dolicol. La tunicamicina es una droga que inhibe a la enzima de la primera reacción. Dos GlcNac y cinco manosas son agregadas
en secuencia por enzimas asociadas a la cara citosólica del RE (1-3). El intermediario de siete azúcares es translocado a la cara
luminal por una flipasa de la membrana del RE (4). El resto de las adiciones de manosa y glucosa ocurren en el lúmen (5, 6).
poli-isoprenoide

Lodish et al. MCB 2004

El oligosacárido precursor participa de un mecanismo de control de calidad del plegado en el ER

1- Transferencia del oligosacárido precursor a la cadena polipeptídica naciente por la oligosacaril transferase (OST).
2 y 3- Inmediatamente dos glucosas terminales son removidas por glucosidasas I y II. El oligosacárido monoglucosilado es retenido por las lectinas
calnexina y calreticulina facilitando el plegado del polipéptido por la acción de las disulfuro isomerasas y prolil isomerasas.
4- La remoción de la glucosa terminal por la GII disocia el polipéptido de las chaperonas. Una glucosil transferasa es capaz de distinguir
polipéptidos que no alcanzaron la conformación nativa y en éste caso reglucosilan una manosa terminal. El ciclo de remoción/agregado de la
glucosa terminal se repite hasta que la proteína alcanza la conformación nativa. La proteína nativa no se reglucosila y sigue su ruta.

OST

calreticulin

calnexin

Lodish et al. MCB 2016

 Ciclos de deglucosilación-glucosilación contribuyen al control de calidad del plegado

Calnexina y calreticulina retienen a los

polipéptidos monoglucosilados en el RE.
Glucosidasa II remueve la glucosa terminal y
elimina la retención por calnexina/calreticulina.
sensor del
Glucosil transferasa (GT) actúa como un sensor plegado
del plegado y solo re-glucosila a polipéptidos
parcialmente plegados. Estos son nuevamente
retenidos por calreticulina y calnexina.
Man9

* ERp57 es una disulfuro isomerasa asociada a calnexina que cataliza la formación de puentes disulfuro en el polipéptido y contribuye al plegado.

Ellgaard et al, Science 1999

 La estructura del oligosacárido reporta el estado del plegado de la proteína y actúa
como una señal para la degradación asociada al RE (ERAD)
• Proteínas con defectos en el plegado son translocadas al citosol y degradadas en proteosomas citosólicos, proceso conocido como “dislocación”.
• La dislocación involucra varias proteínas del RE que cumplen 3 funciones básicas:
• 1) Reconocimiento. Chaperonas y lectinas detectan y unen a las proteínas substrato. La remoción de manosas por manosidasas del RE constituye una señal para
su derivación al ERAD. Por ej. glicanos Man5-6(GlcNAc)2 son reconocidos por las lectinas EDEM y OS-9.
• 2) Retrotranslocación. Los polipéptidos son retrotranslocados a través de un canal proteico formado en la membrana. Complejos de ATPasas participan en el
desplegado y descarga de los polipéptidos en el citosol.
• 3) Ubiquitinación y degradación. Depende de ubiquitina-ligasas citosólicas que poliubiquitinan al polipéptido y lo transfieren para su degradación en proteosomas.

ERAD (ER-Associated Degradation); EDEM (ER-Degradation Enhancing α-Mannosidase) Lodish et al. MCB 2016
Mecanismos de detección y retrotranslocación de substrates solubles (ERAD)

Alberts MBC 2016

Yos9 es una lectina que reconoce el substrato no

completamente plegado (se une a la manosa 1,6 expuesta en
el oligosacárido del substrato) y lo transfiere al canal.

Hrd3 y Usa1 son proteínas scaffold.

Hrd1 y Der1 forman el canal a través del cual son retro-

translocados los polipéptidos desde el lúmen del RE al citosol.

Wu et al Science 2020
 El estado de plegamiento de las proteínas en el lúmen del RE es monitoreado por una red
de señalización que activa un programa transcripcional denominado UPR
• Estrés del RE es una condición que ocurre cuando el influjo de nuevos polipéptidos al lúmen del RE excede su capacidad de plegarlos y/o procesarlos.
• La acumulación de proteínas con defectos en el plegado es sensada por los dominios luminales de 3 proteínas de transmembrana del RE, IRE1α, PERK y ATF6.
• La activación de los sensores dispara la respuesta UPR (“unfolded Protein Response”) que tiende a restaurar la homeostasis.

En condiciones de homeostasis, los dominios luminales de

IRE1, PERK y ATF6 interaccionan con la chaperona BiP.

 IRE1 y PERK se activan por dimerización.

 ATF6 es una proteína de transmembrana de tipo II cuyo dominio citosólico codifica
para un factor de transcripción. El dominio luminal de ATF6 posee secuencias de
exportación al Golgi y sitios de unión para BiP. En condiciones de homeostasis BiP
está unido a ATF6 y enmascara las señales de exportación. En contraste, en
condiciones de estrés del RE BiP se disocia y desenmascara las secuencias de
exportación a Golgi en ATF6. Así, ATF6 es transportado a Golgi donde proteasas
clivan el dominio de transmembrana de ATF6 liberando el dominio citosólico que
se transloca al núcleo y activa transcripción.

IRE1  oligomerización  procesamiento de Hac/XBP1 mRNA  ↑ síntesis de chaperonas (ej. BiP) y del proceso ERAD (ej. EDEM)
Estrés
PERK  oligomerización  fosforilación de eIF-2α  ↓ síntesis de proteínas
del RE
Alberts MBC 2016
ATF6  exportación al Golgi  proteasas clivan el TM  translocación al núcleo  ↑ síntesis de chaperonas (ej. BiP)
 Mecanismo de activación de IRE1

1. IRE1 y PERK tienen tendencia a formar dímeros. En condiciones normales BiP se

une a la región luminal de IRE1 y PERK e inhibe la dimerización. En
condiciones de estrés del RE, la saturación de BiP provoca su disociación de
IRE1 y PERK lo cual dispara la dimerización.

2. En su forma dimérica, IRE1 se autofosforila y activa el dominio citosólico de

endoribonucleasa, que remueve el intrón en el mRNA del factor de transcripción
Hac1 (XBP1 en mamíferos).

3. Los dos exones del factor de transcripción Hac1/XBP1 son ligados y forman un
mRNA maduro.

4. El mRNA es traducido en el citosol, la proteína Hac1/XBP1 se transloca al núcleo

y activa la transcripción de genes que codifican para chaperonas del RER (ej.
BiP) y componentes de la maquinaria de degradación (ej. EDEM) .

Lodish et al. MCB 2016

 Ocurre en sitios discretos del ER, sin ribosomas asociados (“ER-Exit Sites” o ERES)
 Requiere del reclutamiento y ensamble de complejos multiproteicos a partir de proteínas del citosol
 La exportación de proterínas del RE es en gran parte un proceso selectivo
 Ocurre en estructuras tubulo-vesiculares cuya formación y movimiento depende de microtúbulos
 Las vesículas que emergen del RE se fusionan formando estructuras
tubulo-vesiculares que se tranlocan al cis Golgi por microtúbulos

 Existe un transporte bi-direccional de proteínas entre el RE y Golgi.

 El transporte RE  Golgi requiere del ensamble de vesículas con cubierta COP II.
 El transporte Golgi  RE requiere del ensamble de vesículas con cubierta COP I.

• Los sitios especializados del RE a partir de los cuales emergen las

vesículas con cubierta de COP II son conocidos como RE de
transición (tER) o “ER-Exit sites” (ERES).
• Ocurren en regiones de alta curvatura del RE.
• Las vesículas COPII tienen 60-80 nm diámetro.

Debajo se muestra la localización de una mutante termosensible de VSVG-GFP que es retenida en el RE a 40°C (A).
Cuando la temperatura se baja a 32°C la VSVG-GFP se acumula rápidamente en sitios de exportación tER o ERES (B).
A tiempos posteriores la proteína ya se ha transportado y al Golgi (C).
A B C

Ellgaard & Helenius, NRMCB 2003

video disponible (Presley et al 1997)
 El transporte anterógrado hacia el Golgi depende de dineínas que se
translocan hacia el extremo (-) de microtúbulos

Las estructuras tubulo-vesiculares emergentes e intermediarias se unen a dineínas

y microtúbulos y migran en dirección al centrosoma de localización perinuclear.

membrana
plasmática

Célula polarizada (flecha). El Golgi (en naranja) tiene

una localización perinuclear y se orienta hacia el borde
de avance (“leading edge”).
microtúbulos

proteínas de
la cubierta

núcleo

Donaldson & Lippincott-Schwartz, Cell 2000

La exportación de las proteínas “cargo” solubles ocurre de manera pasiva o activa

Se postulan dos modelos de exportación de proteínas “cargo” solubles del RE:

(a) incorporación pasiva o
(b) concentración activa mediada por receptores de transmembrana.
Algunas proteínas solubles residentes del RE (R) pueden “escaparse” por el mecanismo de exportación pasivo.

Las enzimas amilasa y quimiotripsinógeno

son ejemplos de exportación pasiva (a)
ERGIC53 es un ejemplo de proteínas que
responden al modelo de exportación (b)

R
pasivo,
no ocurre activo, ocurre
concentración concentración
del cargo del cargo

R: proteínas residentes del RE

Barlowe, TICS 2003

Las proteínas “cargo” de transmembrana son seleccionadas en base a
“señales” o motivos localizados en sus dominios citosólicos

Las señales de exportación consisten en motivos de aminoácidos ácidos, básicos o hidrofóbicos

y son esenciales para su interacción con las proteínas de la cubierta COP II.

Bonifacino and Glick, Cell 2004

 Modelo de ensamble de la cubierta de proteínas COPII
Las vesículas con cubierta COPII median la exportación de cargos del RE

La cubierta COPII es formada

por el ensamble de 2 capas,
2 una interna y otra externa.

El proceso de formación de vesículas con cubierta COP II ocurre de acuerdo a la siguiente secuencia:

1) Asociación de la GTPasa Sar1 del citosol a la membrana del RE. Este paso requiere del intercambio del GDP por GTP en Sar1, el cual es catalizado por el GEF del RE
sec 12. Sar1-GTP despliega e inserta una alfa hélice anfipática del N-terminal en la membrana del RE e inicia su deformación.

2) Sar1-GTP recluta las proteínas de la capa interna, sec23/sec24. Sec23 interacciona directamente con Sar1-GTP. Existen varias isoformas de Sec24 las cuales
reconocen distintas señales de exportación de proteínas de transmembrana (cargo).

3) La cubierta de sec23-sec24 recluta a los complejos de proteínas sec13/31 que ensamblan una capa externa y completan la formación de la cubierta COPII.

4) La fisión de la vesícula y desensamble de la cubierta es un evento que requiere de la hidrólisis del GTP de Sar1 y su disociación (no mostrado). Esto es promovido por
la actividad GAP de sec23 y por sec31. Es decir que hay un efecto de “timer” que es activado durante el ensamble y que activa posteriormente el desensamble.
Bonifacino & Glick, Cell 2004
 Proteínas solubles residentes del RE que escapan al Golgi son retornadas al
RE por un mecanismo específico dependiente del tetrapéptido KDEL

 La secuencia KDEL actúa como una señal de retención. Está presente en

el terminal carboxilo de proteínas solubles residents del RE (ej. BiP). cis Golgi
 La secuencia KDEL se une a un receptor de transmembrana en el medio pH ~ 6,2
ligeramente ácido del cis Golgi.
 El receptor de KDEL es una proteína de transmembrana que cicla entre el
RE y el cis-Golgi. Posee una señal KKXX en su dominio citosólico.
 El complejo KDEL/Receptor se incorpora en vesículas con cubierta COPI
y es retornado al RE. En el medio neutro del RE el complejo se disocia y
el cargo es liberado en el lúmen.

RE lumen
pH ~ 7,3

Lodish et al. MCB 2016

 Proteínas de membrana residentes del RE poseen señales de retención específicas
en su tallo citosólico

Ejemplos: …KKxx… …KxKxx…

Estos motivos presentes en los dominios citosólicos de proteínas de transmembrana
interaccionan con proteínas de la cubierta COPI y son retornadas al RE.

En algunos casos las señales de retención al RE representan mecanismos de control de calidad del proceso de tránsito. Por ejemplo:
(A) En ciertas proteínas oligoméricas, las señales de retención sólo son expuestas en los monómeros, y no en la estructura cuaternaria de los oligómeros
(B) En otros casos, la fosforilación de serinas adyacentes la señal de retención recluta proteínas “scaffold” 14-3-3 que la enmascaran.
(C) Algunas proteínas de membrana forman complejos con proteínas citosólicas que ocultan la señal de retención.

Señal de retención

A B
C
RE oligomerización RE fosforilación Al Golgi
Al Golgi
lúmen lúmen RE complejo Al Golgi
lúmen
citosol citosol
14-3-3 citosol
COP I COP I
recuperación recuperación
al RE al RE
 Modelo de ensamble de cubiertas COPI ERGIC/VTC y cisterna del cis Golgi
1

Las vesículas con cubierta COPI tienen ∼100 nm de diámetro, y transportan cargo entre cisternas
del Golgi y entre el cis-Golgi, y entre el compartimiento intermedio (ERGIC/VTC) y el RE.

1.La GTPasa ARF-GDP se asocia a un GEF de la membrana del Golgi que facilita el intercambio
del GDP por GTP. ARF-GTP se inserta en la membrana e inicia su deformación.

2. ARF-GTP recluta complejos heptaméricos preformados del citosol, denominados coatómeros,

y que interaccionan entre sí ensamblando la cubierta COPI. Las subunidades de los
coatómeros seleccionan las proteínas cargo y también a una ARF-GAP.
2
3. La hidrólisis de ARF-GTP mediada por ARF-GAP dispara la fisión y desensamblaje de la
cubierta COPI.

Las subunidades de los coatómeros reconocen motivos en los

dominios citosólicos de proteínas de transmembrana. Ej: KKXX

El ensamble en bloque de los coatómeros de las cubiertas COPI difiere

del ensamble de las cubiertas de COPII y de clatrina, cuyas subunidades 3
son reclutadas a la membrana de manera secuencial.

ERGIC: ER to Golgi Complex; VTC: Vesicular Tubular Cluster

Lodish et al. MCB 2016
La inhibición del flujo de proteínas entre el RE y el Golgi provoca su desaparición

La incubación de células con brefeldina A, una droga que inhibe la GTPasa ARF, provoca la reabsorción
del cis-Golgi en el RE. Este efecto se ilustra visualizando la redistribución de una galactosil-transferasa de
Golgi fusionada a GFP desde el Golgi al RE (fotos debajo).

Tiempo después de agregar BFA (min)

Golgi RE

video disponible
Sciaky et al., JCB 1997
 El Golgi es una estructura dinámica y polarizada donde se procesan, de manera
secuencial, glicoproteínas y glicolípidos

El Golgi consiste de sacos o cisternas a través de las cuales se transportan proteínas y lípidos. Puesto que el Golgi es una estructura dinámica, en estado
estacionario, existe un continuo flujo anterógrado y retrógrado. Las proteínas provenientes del RE se fusionan con cisternas del cis-Golgi, las cisternas intermedias
constituyen el medial-Golgi, y las más distales, el trans-Golgi. Vesículas y túbulos que emergen del trans-Golgi forman la red del trans-Golgi (TGN). Diversas
enzimas, glicosidasas y glicosiltransferasas, se localizan en distintas cisternas del Golgi y procesan los glicanos provenientes del RE de manera secuencial.

Sacos del Golgi en una célula

vegetal. Microscopía electrónica

cis

trans

- Modificación y procesamiento de carbohidratos en lípidos y proteínas

principales funciones del Golgi - Distribución y transporte a otras organelas y membrana plasmática
- Sitio de anclaje de proteínas de señalización, distribución y del citoesqueleto
Las distintas cisternas del Golgi contienen baterías de enzimas que modifican a los
oligosacáridos de las proteínas en tránsito

Las glicosil-transferasas son proteínas de transmembrana, cuyo dominio catalítico intraluminal agrega monosacáridos
específicos a los aceptores en tránsito. Cada enzima mantiene una localización intra-Golgi restringida.

Endo D Endo D
resistant sensitive

Alberts et al MBC 2016

Los N-glicanos observados en glicoproteínas maduras y que emergen del Golgi son de
dos tipos: 1) con álto contenido en manosas, 2) oligosacáridos complejos

Golgi
RE
Dependiendo de la proteína, se
observan dos tipos de N-oligosacáridos
en las proteínas maduras:
- oligosacáridos con alto contenido de
manosa (similar al precursor que
proviene del RE)
- oligosacáridos complejos. Resultan
de la eliminación de manosas y el
agregado de GlcNAc, galactosa y
ácido siálico en el medial/transGolgi.

Alberts et al MBC 2016

Estructuras de oligosacáridos (red del
encontrados en glicoproteínas trans Golgi)

(trans Golgi)

tipos:

O-oligosacáridos

N-oligosacáridos
- alta manosa
- complejos (red del
trans Golgi)

(trans Golgi)
(ER, red del
cis Golgi)

(motivos en proteínas aceptoras:

Asn-X-Ser o Asn-X-Thr)

Lodish et al. MCB 1999

Estructuras túbulo-vesiculares geman del trans-Golgi y forman una red o TGN. La
vesiculización requiere de la coordinación de fuerzas de tracción de la membrana ejercida
por moléculas motoras asociadas a microtúbulos y eventos de fisión (a). Factores que
promueven la fisión produce la fragmentación del Golgi en pequeñas vesículas (b); Estructuras túbulo-vesiculares que emergen y se elongan del
en contraste, su inhibición produce la formación de largas estructuras tubulares (c). trans-Golgi (flechas, 1-3) y la fisión de una vesícula del extremo
distal (4). Visualización de VSVG-GFP.

Bard & Malhotra, ARCDB 2006 Matteis & Luini, Nature Rev MCB 2008
TGN: Trans Golgi Network
 Las hidrolasas lisosomales que son modificadas en el Golgi originando una señal de M6P

M6P

 La señal de manosa 6-fosfato (M6P) es generada en dos pasos secuenciales

catalizados por distintas enzimas localizadas en compartimientos diferentes del Golgi.

 Los precursores lisosomales N-glicosilados poseen una señal tridimensional en su estructura

nativa que es reconocida por la GluNac fosfotransferasa localizada en el cis-Golgi. Un bolsillo
de la enzima acomoda al UDP-GlcNac, el cual es transferido al grupo hidroxilo del carbono 6
de una o más manosas.
phosphodiesterase
 En un segundo paso, catalizado por una fosfodiesterasa localizada en el trans-Golgi, se
remueve GlNac y se genera la señal de M6P.
En el trans-Golgi los precursores lisosomales son concentrados por receptores de M6P y
empaquetados en vesículas cubiertas con clatrina

(1). Los precursores lisosomales son exportados del trans-Golgi en vesículas

cubiertas con clatrina.
(2,3). Posterior al desensamble de la cubierta, las vesículas se fusionan con
retrómero endosomas tardíos donde el pH ácido provoca la disociación del
complejo M6P-receptor. Fosfatasas remueven el fosfato de las M6P.
(4). Los precursores lisosomales se segregan en vesículas de transporte que
se fusionan a lisosomas.
(4a). Los receptores de M6P son retornados al Golgi por túbulos que geman
del endosoma tardío cubiertos por un complejo denominado retrómero.
(5). Una fracción de receptores son transportados a la membrana plasmática
donde contribuyen a internalizar precursores lisosomales que escapan a
la superficie.
(6-8). Los precursores recuperados en la superficie son transportados a
lisosomas empleando la vía endocítica.

Lodish et al. MCB 2016

 Proteínas adaptadoras reclutadas a microdominios de la membrana son esenciales para
el ensamble de cubiertas de clatrina
TGN,
endosomas

Las proteínas adaptadoras cumplen tres funciones esenciales:

 seleccionan las proteínas cargo reconociendo motivos específicos en sus dominios citosólicos.
 reclutan moléculas de clatrina a la membrana y promueven su ensamble
 interaccionan con proteínas reguladoras del ensamble y desensamble de la cubierta.

 Las proteínas adaptadoras son monoméricas (GGA) o tetraméricas (AP-1, AP-2, AP-3).
 Las proteínas adaptadoras son reclutadas a microdominios de la membrana
enriquecidas en ARF-GTP y fosfoinosítidos.

Las proteínas adaptadoras reconocen motivos específicos en

los dominios citosólicos de proteínas de transmembrana. Ej:

NPXY  AP-2 TGN,

endosomas
YXXØ  AP-1 y AP-2
LL  AP-2
DXXL  GGA

TGN,
endosomas
TGN, PM
Bonifacino & Traub, ARB 2003
 Fosfoinosítidos marcan microdominios de las membranas y contribuyen
a reclutar proteínas adaptadoras

Estructura y variedad de fosfoinosítidos

El reclutamiento de la proteína adaptadora AP2 a la membrana
es rigurosamente controlado. La asociación a la membrana
requiere de la simultánea presencia de PI(4,5)P2 y de motivos
específicos en los tallos citosólicos de las proteínas cargo.

Reconocimiento específico de
las variantes de fosfoinosítidos.

Alberts et al MBC 2016

La Clatrina reclutada a la membrana por proteínas adaptadoras se autoensambla y contribuye
a la formación de vesículas en el trans-Golgi y en la membrana plasmática

Cada molécula de clatrina está compuesta por tres subunidades grandes y tres pequeñas.
Numerosas moléculas de clatrina ensamblan una celda proteica asociada a la membrana.

video
Lodish et al. MCB 2016
 Modelo de formación de cubiertas de clatrina
cargo
Arf

(AP)

Las vesículas con clatrina se forman de acuerdo a la siguiente secuencia:

1. ARF-GTP se asocia a la membrana y recluta complejos de proteínas adaptadoras.

2. El reclutamiento y ensamble de la canasta de clatrina deforma la membrana.
3. El cuello de la vesícula se fisiona por acción de la GTPasa dinamina e implica la hidrólisis de GTP.
4. El desensamble de clatrina es asistido por chaperonas (Hsp70) y co-chaperonas (auxilina) con
gasto de ATP, y de la hidrólisis del GTP en ARF.

Lodish et al. MCB 2016

La GTPasa dinamina es esencial para la fisión de vesículas con clatrina.
Este proceso requiere de la hidrólisis del GTP

microscopía electrónica de células donde la

hidrólisis del GTP de dinamina está inhibida

vesícula
cuello

Moléculas de dinamina asociadas al

cuello y detectadas con un anticuerpo
unido a granos de oro coloidal

Lodish et al. MCB 2016

Transporte a la membrana plasmática: Análisis por video-microscopía de fluorescencia
en células vivas revela vesículas y estructuras tubulares que emergen del TGN

Células transfectadas con VSVG-GFP. La flecha señala la producción de una

estructura tubular y la fisión de una vesícula en el extremo distal.

video disponible
Hirschberg et al., JCB 1998
 En células epiteliales polarizadas existen mecanismos que transportan proteínas
selectivamente a la membrana apical o basolateral

proteínas ancladas por GPI, la proteína HA del

virus de la influenza son marcadores apicales.
apical apical La glicoproteína VSVG del virus VSV, caderinas
e integrinas son marcadores basolaterales.

 Algunas proteínas apicales de membrana se transportan al

dominio apical por una vía directa a partir del post-Golgi (A, rojo).
 Otras proteínas se transportan al dominio apical por una vía
basolateral indirecta que involucra el transporte e inserción en la membrana
basolateral y luego su re-direccionamiento por endocitosis a la
cara apical (B, rojo). Este proceso se denomina transcitosis.

Células polarizadas

Apical
membrane

basolateral
membrane

Alberts et al MBC
Hasan et al 2018
 Determinantes moleculares que contribuyen al direccionamiento
de proteínas a los dominios apical y basolateral

señales para localización apical y basolateral

tipo localización de la señal ejemplos Microdominios (~70 nm diámetro) formados en la membrana del
trans-Golgi y en la membrana apical de las células epiteliales,
denominados ¨lipid rafts¨, concentran proteínas ancladas por GPI
basolateral y proteínas que poseen un dominio de transmembrana más largo.
YXXØ..............................citoplasmática..............VSVG, caderinas
LL/IL................................citoplasmática..............receptor de Fc
otras................................citoplasmática..............TfR, LDLR

apical
anclaje de GPI..................membrana..................Thy-1
N-oligosacáridos...............luminal........................eritropoietina
transmembrana.................membrana..................hemaglutinina
 La segregación de proteínas al dominio apical y basolateral puede
visualizarse empleando proteínas fluorescentes

Células epiteliales polarizadas se transfectaron con cDNAs que codifican para proteínas fluorescentes. A la izquierda se
muestra la localización apical de una YFP modificada mediante el agregado de un ancla de GPI. A la derecha se muestra la
localización basolateral de una YFP fusionada a la proteína VSVG. Las células se observan en dos planos confocales (A y B).
YFP-GPI VSVG-YFP

A
A
B
B

observación de un
plano superficial (A) A

observación de un B
plano ecuatorial (B)

Keller et al, Nature CB 2001

Visualización de la segregación de proteínas del dominio apical y basolateral en el Golgi

Células transfectadas con CFP-GPI (verde) y VSVG-YFP (rojo). Note la separación

de túbulos conteniendo CFP-GPI y VSVG-YFP de la misma estructura (flechas).

(video disponible)
Keller et al, Nature CB 2001
 El dominio apical en células epiteliales es equivalente al axón
en neuronas y el dominio basolateral al soma y dendritas

HA

HA

influenza virus
+ VSV virus influenza virus
+ VSV virus

VSVG VSVG

Alberts et al. MBC 2002

Las proteínas de secreción y de membrana son frecuentemente procesadas proteolíticamente
en el trans-Golgi para generar las formas maduras

Una familia de endoproteasas denominadas pro-protein convertasas

(PC) y furinas se localizan en la red del trans-Golgi y clivan
polipéptidos después de la secuencia dibásica Arg-Arg↓ o Lys-Arg↓.

Lodish et al. MCB 2016

 Las células poseen mecanismos de exocitosis constitutivos y regulados

Todas las células secretan proteínas continuamente (secreción constitutiva). Otras células, por ejemplo, las secretoras del páncreas endócrino
y exócrino, secretan proteínas sólo cuando son estimuladas (secreción regulada). Proteínas cuya secreción es regulada se concentran y forman
agregados en el trans-Golgi con proteínas de la familia de las cromograninas. Sin embargo, los mecanismos moleculares se desconocen.

Secreción regulada de insulina en célula β del páncreas

1. Captación de glucosa
2. Conversión a piruvato con síntesis de ATP
3. Cierre de canales de potasio dependiente de ATP
4. Depolarización de la membrana
5. Apertura de canales de calcio dependientes de voltaje
6. El incremento de Ca2+ en el citosol promueve la secreción de insulina

Alberts et al 2015
Lodish et al. MCB 2016, Fig 16.39
Ejemplos de proteínas secretadas en forma constitutiva y regulada
 Exocitosis regulada
Microscopía electrónica de una célula beta del páncreas endócrino
que muestra la exocitosis de vesículas conteniendo insulina

Agregados de insulina
 Exocitosis regulada
Secreción de histamina por mastocitos

Microscopía electrónica de mastocitos antes (A) y después (B) de liberar sus gránulos de histamina.
La exocitosis es estimulada por la agregación de los receptores de IgE en su superficie
 Exocitosis regulada
Las neuronas secretan neurotransmisores en respuesta a la
llegada de un potencial de acción al terminal axonal

axón
 El control del anclaje, por las proteínas Rabs, y de la fusión, por las proteínas SNARE, aseguran
la correcta distribución de proteínas entre compartimientos

La actividad de Rabs y SNAREs regula eventos posteriores al desensamble de la cubierta.

 Las Rabs son GTPasas que median la especificidad del anclaje de las vesículas
a la membrana blanco; existen más de 60 formas distintas en humanos.
 Rab-GDP se localiza en el citosol inhibida por factores reguladores (GDI).
v-SNARE
 La interacción del GDI asociado con un GEF en la membrana promueve el
intercambio del GDP por GTP en Rab. Rab-GTP es la forma activa.
 Rab-GTP expone un motivo hidrofóbico que le permite asociarse a la membrana
de la vesícula de transporte.
 Rab-GTP en la vesícula interacciona con distintas proteínas o efectores.
 Entre los efectores se encuentran receptores de Rab localizados en la membrana
aceptora, los cuales controlan el anclaje específico (“docking”) de la vesícula.
 La hidrólisis del GTP promueve la reasociación de Rab-GDP con un GDI que lo
t-SNAREs
extrae de la membrana.

Proteínas integrales de membrana denominadas v-SNARE se incorporan a la vesícula

durante su formación. La fusión de la membrana vesicular y la membrana blanco
requiere de la formación de un complejo tetramérico entre v-SNARE, y t-SNAREs.

GDI: GDP-Dissociation Inhibitor

SNARE: Soluble NSF Attachment REceptors
 Las proteínas SNARE controlan la especificidad de la fusión entre membranas
del compartimiento donor y aceptor
Existen 36 formas distintas de SNAREs en humanos.
Complejo trans-SNARE
Los complejos trans-SNARE se forman entre cuatro dominios
“coiled coil”, uno provisto por la v-SNARE y tres por las SNAREs de
la membrana blanco, trans-
Los complejos trans-SNARE cumplen dos funciones: inducir la
fusión de las membranas y contribuir a la especificidad de la fusión.
El ensamble de los complejos comienza en el terminal amino (N) y
procede hacia el terminal carboxilo, generando una fuerza (F) que
acerca las membranas, expulsa H2O y promueve la fusión.
El calcio dispara la fusión.
VAMP es una v-SNARE, y Syntaxin y
Detalle del proceso de fusión + Ca2+ SNAP25 son dos t-SNAREs descriptas
en la presinapsis neuronal.

Posterior a la fusión de las

membranas, las proteínas
adaptadoras α-SNAP reclutan
a la ATPasa NSF a los
complejos cis-SNARE.

Sudhof & Rothman, Science 2009

El NSF desensambla los complejos cis-SNARE NSF: N-ethylmaleimide Sensitive Factor

en un proceso que depende de hidrólisis de ATP. SNAP: Soluble NSF-Attachment Protein
 Vesículas cubiertas median transporte de materiales entre compartimientos.
 Eventos esenciales son la asociación de GTPasas al sitio de emergencia de la vesícula,
el reclutamiento de las proteínas de la cubierta y la selección del cargo.

Lodish et al 2004
 La cubierta se desensambla después de formarse la vesícula, evento promovido por la hidrólisis del GTP.

 Se exponen proteínas que determinan la especificidad del transporte y fusión con receptores en la membrana aceptora.

v/t-SNARE
complex Lodish et al 2004
Visualización del proceso de formación de vesículas cubiertas.

El ensamble de la cubierta provoca la curvatura de la membrana.

Microscopía electrónica

Lodish et al 2004
Resumen de tipos de vesículas cubiertas y GTPasas involucradas

Lodish et al MBC 2016

Resumen de las propiedades de las cubiertas proteicas
involucradas en el transporte vesicular

Lodish et al MBC 2016

 Resumen de la génesis, transporte y fusión de vesículas

Bonifacino & Glick, Cell 2004

1. Ensamble de la cubierta. Evento disparado por la asociación de una GTPasa (esfera roja) a la membrana del compartimiento
donor. Las proteínas cargo y proteínas v-SNARE se concentran en la vesícula en formación.
2. Gemación. Los componentes externos de la cubierta se ensamblan en una malla que curva la membrana y forman la vesícula.
3. Fisión del cuello entre la vesícula y el compartimiento donor. En este evento intervienen proteínas accesorias.
4. Desensamble de la cubierta. Participan chaperonas, fosfoinosítidos y GTPasas. Las proteínas de la cubierta son recicladas
5. Transporte de la vesícula hasta el compartimiento aceptor mediado por microtúbulos y proteínas motoras.
6. Anclaje mediado por la interacción de las GTPasas Rab y sus receptores.
7. Fusión mediada por la formación de los complejos trans-SNARE (v- y t-SNARE + SNAP 25).