UNIVERSIDAD DE SONORA

Departamento de Agricultura y Ganadería

Licenciatura en Medicina Veterinaria y Zootecnia

Laboratorio de Virología Veterinaria

Práctica #4 Cultivo celular primario

Equipo 1:
Uriel Flores Figueroa
María del Amor Gokoku Flores
Diana Paloma Medina Castro
Kariana Janeth Nóperi Córdova
Marisol Ortega Del Castillo
Maestra:
MVZ María Helena Guzmán León

Hermosillo, Sonora. 8 de octubre del 2023

 1. Introducción

El cultivo de tejidos ha sido considerado durante mucho tiempo como una

mezcla de ciencia y arte. Inicialmente fue considerada como una técnica
particularmente difícil de aprender. Sin embargo, hoy en día estas dificultades están
superadas gracias a factores como los medios de composición definida, la
disponibilidad de antibióticos, las instalaciones asépticas (salas de cultivo limpias,
cabinas de flujo laminar, incubadoras estériles, etc.) y dispositivos de cultivo
(botellas con tapones filtrantes, placas de Petri ventiladas, entre otros).

La mayoría de las células animales y vegetales aisladas pueden vivir,

multiplicarse e incluso presentar ciertas propiedades diferenciales si se les cultiva
en placas de plástico con los medios de cultivo adecuados. Así, las células pueden
ser observadas continuamente bajo el microscopio o analizadas bioquímicamente,
para estudiar los efectos del agregado o remoción de moléculas específicas, como
hormonas o factores de crecimiento. Además, se pueden estudiar las interacciones
entre células, cultivando en la misma placa más de un tipo celular. Cuando los
experimentos se realizan con cultivos celulares, se les denomina ensayos “in vitro”
para diferenciarlos de aquellos que se llevan a cabo en organismos completos, o
experimentos “in vivo” (“en organismo viviente”). Existen diferentes tipos de cultivos
celulares: primarios, secundarios o diploides y líneas celulares continuas.

Los cultivos primarios están constituidos por células que han sido aisladas de
un tejido y que proliferan en las condiciones apropiadas. Al crecer y multiplicarse,
consumen nutrientes y cada cierto tiempo hay que traspasar parte de ellas a otro
recipiente para que tengan más espacio y añadir nutrientes frescos. Esto se conoce
como subcultivar o pasar las células. Las células mantienen la mayoría de las
características de los tejidos de los que derivan, lo que es una gran ventaja. Pero
tras un número limitado de pases o subcultivos, generalmente unos 10-20, las
células alcanzan la senescencia y son incapaces de continuar multiplicándose. Los
cultivos primarios se emplean para el aislamiento de virus y para la producción de
vacunas.
 En algunas ocasiones los cultivos primarios pueden continuar pasándose 50
a 100 veces antes de alcanzar la senescencia, constituyéndose en lo que se llama
cultivo secundario, diploide o línea celular semicontinua. Se llaman diploides porque
retienen el mismo número de cromosomas que las células de las que derivan.
También se emplean para el cultivo de virus fastidiosos y la producción de vacunas
víricas.

Al pasar las células, se seleccionan aquellas que tienen una mayor capacidad
de crecimiento y se van volviendo uniformes en su genotipo y fenotipo. Durante el
proceso, o ya desde el origen, pueden ser células cancerosas con el potencial de
multiplicarse indefinidamente. De esta manera, se convierten en líneas celulares
continuas que pueden subcultivarse de forma seriada durante muchos pases, sin
perder la capacidad de crecer.

2. Objetivo

Los alumnos aprenderán a obtener células de cultivo primario.

3. Metodología

Agregar 5 Filtrar
3 20ml de Tapa de 5 sobrenadante
2
1
Lavar 2 veces Macerar con PBS aluminio y lavar con
Tomar un trozo con PBS PBS PBS
de 5x5 cm3 Verter al matraz
4
y agitar 10min

Distribuir el
6 7 mismo 8 Centrifugar: 9
5 5 1200rpm Agregar 10ml
volumen en 2
10min Descartar de PBS
Volver a filtrar tubos
sobrenadante
10ml del
Botón Para
filtrado
celular suspender el
anterior
sedimento
(x2)

10 Agregar 90 µL
11 12
Azul de Tripano
10µL en cámara Determinar cantidad de células totales:
+ 10 µL de
de Neubauer
suspensión
celular
En el fondo del
tubo y agitar Contar células
vivas y muertas
 4. Resultados

Figura 1. Fotografía microscópica de células muertas de hígado de pollo, vistas en

cámara de Neubauer a 100X con aceite de inmersión.

Se observan estructuras intracelulares teñidas con azul de tripano por un

posible daño en la membrana celular.

Figura 2. Fotografía microscópica de células vivas de hígado de pollo, vistas en

cámara de Neubauer a 100X con aceite de inmersión.
 5. Discusión

En la figura 1, se observa sedimentación de cristales de azul de tripano en la

cámara de Neubauer, lo cual puede ser un problema común en la técnica de conteo
de células, sin embargo, esto puede deberse a la calidad de la muestra o a la técnica
de manejo. Es importante mencionar que los cristales de azul de tripano pueden
interferir significativamente con la visualización de las células bajo el microscopio,
lo que dificulta el conteo preciso (Filipiak, Y., & Larocca, C., 2012).

También se puede observar la presencia de células muertas o dañadas,

teñidas con azul de tripano (intracelularmente) es un indicio de que la muestra
analizada no era reciente. Las células primarias tienden a tener una vida limitada en
cultivo y con el tiempo, muchas de ellas pueden morir (Cruz B., Mónica, & Bello,
Felio J., 2012).

A diferencia de las células teñidas con azul de tripano, como se muestra en

la figura 1, en la figura 2 se aprecian células vivas. Esto se deduce debido a su
forma circular y uniforme, las cuales no presentan estructuras teñidas, lo que
permite observarlas en su coloración original.

La razón por la que las células muertas se tiñen con azul de tripano se debe
a las propiedades químicas de este colorante y a lo que sucede cuando entra en
contacto con las células. Este colorante se incorpora selectivamente en células con
membranas celulares dañadas o comprometidas. Cuando una célula muere o su
membrana se daña, esta se vuelve más permeable (Piedra, M. et al., 2012).

La falta de éxito del conteo celular debido a la sedimentación de cristales de

azul de tripano y la presencia de una gran cantidad de células muertas teñidas
sugiere que no se realizó un cultivo primario viable, esto, debido posiblemente a la
calidad de la muestra o el tiempo empleado en la realización de la técnica.
 6. Conclusión

En el transcurso de esta práctica de cultivo celular primario, se tuvieron

contratiempos significativos relacionados con la calidad de la muestra y la idoneidad
para el cultivo. La presencia abundante de cristales en la muestra de cultivo,
visualizada bajo el microscopio, dificulto la posibilidad de realizar un conteo celular
preciso y confiable utilizando la técnica de tinción con azul de tripano. Estos cristales
interfieren con la visualización de las células, lo que dificulta su identificación y
conteo.

Los resultados obtenidos destacan la importancia de la calidad de la muestra

en el éxito de los cultivos celulares primarios. En futuros experimentos, se deben
considerar cuidadosamente las condiciones de la muestra y se deben tomar
medidas para mejorar su calidad, incluido como punto importante concluir la práctica
en el tiempo adecuado, para obtener resultados óptimos.

Además, se puede intentar mejorar la técnica de teñido con azul de tripano

para reducir la formación de cristales. También, es fundamental utilizar muestras
más frescas cuando sea posible, para obtener resultados más representativos de la
población celular en estudio.

7. Asignatura

7.1. Define cultivo celular:

Se entiende por cultivo celular al conjunto de técnicas que permiten el

mantenimiento de las células “in vitro”, manteniendo al máximo sus propiedades
fisiológicas, bioquímicas y genéticas.

7.2. Menciona la importancia de realizar cultivos celulares en medicina

veterinaria
 De manera general, los cultivos celulares permiten la obtención de células
viables para estudiar los procesos que ocurren en ellas, y, dependiendo del área,
se puede llegar a distintos objetivos.

● Virología: Aislamientos de virus, lo que facilita el diagnóstico clínico animal

y la producción de vacunas.
● Biotecnología: Producción de moléculas de interés industrial, como
fármacos en bioreactores (interferón, insulina, hormona del crecimiento, etc.).
● Inmunología: Producción de anticuerpos monoclonales, señalización,
fenómenos de inflamación.
● Farmacología: Análisis de los efectos de fármacos, interacción con el
receptor, fenómenos de resistencia, etc.
● Toxicología: Análisis de citotoxicidad, mutagénesis, carcinogénesis, etc.
● Ingeniería de tejidos: Producción de tejidos artificiales (como piel o
cartílago) para el tratamiento de grandes quemaduras, injertos o trasplantes,
desdiferenciación y diferenciación inducida.

7.3. ¿Qué es tripsinización?

Denominada también “Proteolisis con tripsina”. Es un proceso utilizado en

cultivos celulares para separar las células adherentes del sustrato de cultivo,
utilizando como medio la tripsina, que es una enzima proteolítica que degrada las
proteínas de adhesión.

7.4. Menciona que es cultivo celular primario y las ventajas que tiene

El cultivo celular primario es aquel que se obtiene directamente del tejido u

órgano y a partir del cual, se pueden obtener subcultivos.

Sus ventajas son:

- Pueden iniciarse con o sin fraccionamiento previo para separar los distintos
tipos celulares.
- En estos cultivos las células están vivas, conservan sus características
originales y su proliferación es limitada.
 - Pueden ser removidas del recipiente de cultivo para formar cultivos
secundarios.
- Las células utilizadas son relativamente fáciles de mantener, debido a que
pueden crecer en altas densidades de manera rápida.

7.5. ¿Cuáles son las diferencias entre un cultivo primario y uno secundario?

PRIMARIO SECUNDARIO
Constituido por células aisladas Se dan cuando el cultivo primario
directamente de un tejido u órgano y que alcanza la secuencia diploide o línea
proliferan en condiciones apropiadas celular semicontinua. Es el subcultivo
brindando subcultivos. del cultivo primario.
Se emplea para aislamiento de virus y Son diploides, por lo que retienen el
producción de vacunas. mismo número de cromosomas que las
células que la derivan
Al crecer y multiplicarse, consumen Se emplean para el cultivo de virus
nutrientes y cada cierto tiempo hay que fastidiosos y la producción de vacunas
traspasar a otro recipiente (subcultivar). víricas.
Las células mantienen la mayoría de las
características del tejido.

7.6. ¿Para qué nos sirve realizar un conteo celular?

El conteo celular es una técnica esencial en la investigación biológica y

médica que se utiliza para cuantificar células, evaluar su viabilidad, medir el
crecimiento y garantizar la reproducibilidad de los experimentos. Proporciona
información crítica para comprender el comportamiento y la respuesta de las células
en diversos contextos de investigación y aplicaciones biomédicas.
8. Referencias

1. Cruz B., Mónica, & Bello, Felio J. (2012). Características de cultivos celulares
primarios derivados de Sarconesiopsis magellanica (Le Guillou, 1842)
(Diptera: Calliphoridae). Revista U.D.C.A Actualidad & Divulgación Científica,
15(2), 313-321. ISSN 0123-4226.
2. Filipiak, Y., & Larocca, C. (2012). Utilización del azul de tripano para
diferenciar ovocitos bovinos vivos y muertos en fertilización in vitro.
Biotecnología de la Reproducción. Facultad de Veterinaria. UdelaR.
Montevideo, Uruguay.
3. Piedra, M. A. M., Garzón, I., Sánchez-Quevedo, M. C., & Alaminos, M. (2012).
Evaluación de la viabilidad celular y patrones apoptóticos en células madre
aisladas de la pulpa dental humana. Actual. Med., 97(786), 006-012.
4. Real Academia de Ingenieria RAING (s.f.) Tripsinización. Extraído de
http://diccionario.raing.es/es/lema/tripsinizaci%C3%B3n el día 26 de
septiembre de 2023.
5. Segretín, M. (2014) Los cultivos celulares y sus aplicaciones (cultivos de
células animales). Argen Bio.
6. Universidad Complutense de Madrid (s.f.) Los virus siempre crecen en
células vivas. Extraído de https://www.ucm.es/data/cont/docs/1462-2017-10-
18-1.3%20Cell%20culture_es.pdf el día 26 de septiembre de 2023.
7. Universidad pública en Leioa, España (S.F.) Introducción al cultivo celular.
Capítulo 1, extraído de
https://www.ehu.eus/biofisica/juanma/mbb/pdf/cultivo_celular.pdf el día 27
de septiembre de 2023.