Usando la ley de Beer se puede calcular la

4. Preguntas de la guía de laboratorio concentración de la muestra.

𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 = 𝐶 * 𝐿 * α

1. Elabore una gráfica de concentración Ecuación 1

de producto [P] vs tiempo para cada Donde C es la concentración del producto, L
concentración de sustrato analizada es la longitud de la celda que es usualmente
(Ensayos 1-6). Recuerde que la 1cm y α es el coeficiente de extinción.
concentración de producto se puede
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎
calcular usando la absorbancia del 𝐶= 𝐿*α
producto (4-nitrofenil) y su
coeficiente de extinción Ecuación 2
(mencionado en la guía).

El coeficiente de extinción es: 18.5

mM-1cm-1

Absorbancia(405nm)
Tiempo
Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3 Ensayo 4 Ensayo 5 Ensayo 6
(minutos)
0,75 0,204 0,283 0,114 0,103 0,058 0,0
1,5 0,464 0,502 0,328 0,218 0,136 0,0
3 0,683 0,786 0,525 0,476 0,262 0,
5 0,995 1,014 0,709 0,66 0,428 0,3
10 1,28 1,298 1,119 1,022 0,585 0,4
Tabla 1. Absorbancia obtenida de cada ensayo en un periodo de tiempo determinado.

● Ensayo #1 tiempo 0,75 minutos: ● Ensayo #1 tiempo 5 minutos:

0,995
𝐶=
0,204
= 0, 011𝑚𝑀
𝐶= 1 = 0, 053𝑚𝑀
1 18,5* 𝑚𝑀*𝑐𝑚 *1 𝑐𝑚
18,5* 𝑚𝑀*𝑐𝑚 *1 𝑐𝑚

● Ensayo #1 tiempo 1,5 minutos: ● Ensayo #1 tiempo 10 minutos:

1,28
0,464 𝐶= 1 = 0, 069𝑚𝑀
𝐶= 1 = 0, 025𝑚𝑀 18,5* 𝑚𝑀*𝑐𝑚 *1 𝑐𝑚
18,5* 𝑚𝑀*𝑐𝑚
*1 𝑐𝑚

● Ensayo #1 tiempo 3 minutos ● Ensayo #2 tiempo 0,75 minutos:

0,283
0,683
𝐶= 1 = 0, 015𝑚𝑀
18,5* 𝑚𝑀*𝑐𝑚 *1 𝑐𝑚
𝐶= 1 = 0, 036𝑚𝑀
18,5* 𝑚𝑀*𝑐𝑚
*1 𝑐𝑚
● Ensayo #2 tiempo 1,5 minutos: ● Ensayo #4 tiempo 3 minutos:
0,502 0,476
𝐶= 1 = 0, 027𝑚𝑀 𝐶= 1 = 0, 025𝑚𝑀
18,5* 𝑚𝑀*𝑐𝑚 *1 𝑐𝑚 18,5* 𝑚𝑀*𝑐𝑚 *1 𝑐𝑚

● Ensayo #2 tiempo 3 minutos: ● Ensayo #4 tiempo 5 minutos:

0,786 0,66
𝐶= = 0, 042𝑚𝑀 𝐶= 1 = 0, 035𝑚𝑀
1 18,5* 𝑚𝑀*𝑐𝑚 *1 𝑐𝑚
18,5* 𝑚𝑀*𝑐𝑚
*1 𝑐𝑚

● Ensayo #2 tiempo 5 minutos:

● Ensayo #4 tiempo 10 minutos:
1,022
1,014 𝐶= = 0, 055𝑚𝑀
𝐶= 1 = 0, 054𝑚𝑀 1
18,5* 𝑚𝑀*𝑐𝑚 *1 𝑐𝑚
18,5* 𝑚𝑀*𝑐𝑚
*1 𝑐𝑚

● Ensayo #2 tiempo 10 minutos:

● Ensayo #5 tiempo 0,75 minutos:
0,058
1,298 𝐶= = 0, 003𝑚𝑀
𝐶= 1 = 0, 070𝑚𝑀 1
18,5* 𝑚𝑀*𝑐𝑚 *1 𝑐𝑚
18,5* 𝑚𝑀*𝑐𝑚
*1 𝑐𝑚

● Ensayo #5 tiempo 1,5 minutos:

0,136
𝐶= 1 = 0, 007𝑚𝑀
18,5* 𝑚𝑀*𝑐𝑚 *1 𝑐𝑚
● Ensayo #3 tiempo 0,75 minutos:
0,114
𝐶= 1 = 0, 006𝑚𝑀 ● Ensayo #5 tiempo 3 minutos:
18,5* 𝑚𝑀*𝑐𝑚 *1 𝑐𝑚 0,262
𝐶= 1 = 0, 014𝑚𝑀
18,5* 𝑚𝑀*𝑐𝑚 *1 𝑐𝑚
● Ensayo #3 tiempo 1,5 minutos:
0,328
𝐶= 1 = 0, 017𝑚𝑀 ● Ensayo #5 tiempo 5 minutos:
18,5* 𝑚𝑀*𝑐𝑚 *1 𝑐𝑚 0,428
𝐶= 1 = 0, 023𝑚𝑀
18,5* 𝑚𝑀*𝑐𝑚 *1 𝑐𝑚

● Ensayo #3 tiempo 3 minutos:

𝐶=
0,525
1 = 0, 028𝑚𝑀 ● Ensayo #5 tiempo 10 minutos:
18,5* 𝑚𝑀*𝑐𝑚 *1 𝑐𝑚 0,585
𝐶= 1 = 0, 031𝑚𝑀
18,5* 𝑚𝑀*𝑐𝑚 *1 𝑐𝑚
● Ensayo #3 tiempo 5 minutos:
0,709
𝐶= 1 = 0, 038𝑚𝑀
18,5* 𝑚𝑀*𝑐𝑚 *1 𝑐𝑚

● Ensayo #3 tiempo 10 minutos:

● Ensayo #6 tiempo 0,75 minutos:
1,119
● 𝐶= 1 = 0, 060𝑚𝑀 𝐶=
0,024
= 0, 001𝑚𝑀
18,5* 𝑚𝑀*𝑐𝑚 *1 𝑐𝑚 1
18,5* 𝑚𝑀*𝑐𝑚 *1 𝑐𝑚

● Ensayo #4 tiempo 0,75 minutos: ● Ensayo #6 tiempo 1,5 minutos:

0,103
𝐶= 1 = 0, 005𝑚𝑀 𝐶=
0,048
= 0, 002𝑚𝑀
18,5* 𝑚𝑀*𝑐𝑚 *1 𝑐𝑚 1
18,5* 𝑚𝑀*𝑐𝑚 *1 𝑐𝑚

● Ensayo #4 tiempo 1,5 minutos:

● Ensayo #6 tiempo 3 minutos:
0,155
0,218 𝐶= = 0, 008𝑚𝑀
● 𝐶= 1 = 0, 011𝑚𝑀 1
18,5* 𝑚𝑀*𝑐𝑚 *1 𝑐𝑚
18,5* 𝑚𝑀*𝑐𝑚 *1 𝑐𝑚
 ● Ensayo #6 tiempo 5 minutos:
0,301
𝐶= 1 = 0, 016𝑚𝑀
18,5* 𝑚𝑀*𝑐𝑚 *1 𝑐𝑚

● Ensayo #6 tiempo 10 minutos:

0,482
𝐶= 1 = 0, 026𝑚𝑀
18,5* 𝑚𝑀*𝑐𝑚 *1 𝑐𝑚

Absorbancia(405nm)
Tiempo
Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3 Ensayo 4 Ensayo 5 Ensayo 6
(minutos)
0,75 0,011027027 0,015297297 0,006162162 0,005567568 0,003135135 0,001297297
1,5 0,025081081 0,027135135 0,01772973 0,011783784 0,007351351 0,002594595
3 0,036918919 0,042486486 0,028378378 0,02572973 0,014162162 0,008378378
5 0,053783784 0,054810811 0,038324324 0,035675676 0,023135135 0,01627027
10 0,069189189 0,070162162 0,060486486 0,055243243 0,031621622 0,026054054
Tabla 2. Concentración de producto de cada ensayo, utilizando la ley de Beer.

Graficó 1. Concentración de producto contra tiempo.

2. Calcular la velocidad inicial de partir de la gráfica obtenida en la

reacción (Vi) a distintas pregunta 6.1. ¿Qué información
concentraciones de sustrato [S] a
 decidió usar para el cálculo de la 0,05 0,003855856
velocidad inicial y por qué? Tabla 4. Velocidades iniciales por cada
Para obtener la velocidad inicial se hizo usa concentración de sustrato.
de la pendiente de las rectas de cada
ensayo. Los valores de la pendiente
obtenidos son presentados en la
Tabla 3.

[𝑃]𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙−[𝑃]𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙
𝑚= 𝑇𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙−𝑇𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙

Donde [P] es la concentración de producto, y

T es el tiempo.

Grafica 2. Cinética de Michaelis-Menten.

Pendiente
Ens
3-5 5-10 3. ¿Qué consideraciones
ayo 0,75-1,5 1,5-3
minut minuto experimentales deberá tener en
# minutos minutos
os s cuenta para poder analizar la cinética
0,01873 0,00789 0,0084 0,0030 de esta enzima bajo las suposiciones
1
8739 1892 324 8108 del estado estacionario y poder
0,01578 0,01023 0,0061 0,0030 calcular los parámetros cinéticos
2
3784 4234 622 7027 (KM, Vmax)?
0,01542 0,00709 0,0049 0,0044
3 Se debe tomar como consideración el saturar
3423 9099 73 3243
0,00828 0,00929 0,0049 0,0039 la enzima con sustrato para que la
4
8288 7297 73 1351 velocidad de producción de producto sea
0,00562 0,00454 0,0044 0,0016 constante, pudiendo así calcular la
5
1622 0541 865 973 velocidad máxima. Al estar la enzima
0,00172 0,00385 0,0039 0,0019 saturada de sustrato, el Km será la mitad
6
973 5856 459 5676 de la velocidad máxima y este va a ser
Tabla 3. Pendiente de cada ensayo en independiente de la concentración de
intervalos de tiempo determinados. enzima en el medio, ya que el Km
representa afinidad de la enzima por el
Debido a que los datos obtenidos no poseen
sustrato en el estado estacionario.
resultados parecidos entre si se usaran los
datos más convenientes para la cinética de 4. Utilice los diferentes métodos
Michaelis-Menten. gráficos de linealización vistos en la
clase teórica para calcular los valores
Vo
[S](mM) experimentales de KM y Vmax. Haga
(mM/Min)
las gráficas necesarias, y explique las
0,3 0,018738739
ventajas y desventajas de cada
0,25 0,010234234
método para este ensayo en
0,2 0,007099099 particular.
0,15 0,009297297
0,1 0,004540541
Las linealizaciones aprendidas en la clase 1 −1
𝑉𝑚𝑎𝑥
= 32, 36 𝑚𝑀 𝑚𝑖𝑛
teórica han sido: Lineweaver-Burk,
Eadie-Hofstee y Hanes-Woolf. Todas estas 𝑉𝑚𝑎𝑥 = 0, 0309𝑚𝑀/𝑚𝑖𝑛
formas de linealización derivan de la
ecuación de Michaelis-Menten: El Km se obtiene de esta forma:
𝐾𝑀
𝑉𝑚𝑎𝑥*[𝑆]
𝑉𝑜 = 𝑉𝑀𝐴𝑋
= 𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒
𝐾𝑚+[𝑆]

1) Ecuación de linealización de 𝐾𝑚 = 𝑉𝑚𝑎𝑥 * 12, 429 𝑚𝑖𝑛

Lineweaver- Burk.
𝐾𝑚 = 0, 384 𝑚𝑀
1 𝐾𝑀 1 1
𝑣
= 𝑉𝑀𝐴𝑋
* [𝑆]
+ 𝑉𝑀𝐴𝑋 Ventajas:

Desventajas:

2) Linealización de Eadie-Hofstee.
𝑉
𝑉𝑜 =− 𝐾𝑀 * [𝑆]
+ 𝑉𝑚𝑎𝑥

1/[S] 1/Vo
3,33333333 259,345794
4 220,238095
5 107,55814
6,66666667 64,8364486
10 63,3561644
20 53,3653846
Tabla 5. Parámetros para la linealización de
Lineweaver-Burk.

Grafica 3. Linealización de Lineweaver-

Burk.

La velocidad máxima se calcula de esta

forma:
1
𝑉𝑀𝐴𝑋
=𝑏