Cuantificación de ácido ascórbico en jugo de naranja del Valle por

espectrofotometría UV-vis utilizando extracción líquido-líquido

María Alejandra González Mazuera1, Sarita Leguizamón Echeverry1

1
Universidad Nacional de Colombia. Bogotá, Colombia.
mgonzalezmaz@unal.edu.co
sleguizamone@unal.edu.co
Entregado: 22/Noviembre/2023

Resumen

La vitamina C, también conocida como ácido ascórbico, es una vitamina hidrosoluble

esencial para diversas funciones en el organismo. Esta vitamina se encuentra presente en
una gran variedad de frutas y verduras. El ácido ascórbico es utilizado en la industria
alimentaria como conservante, antioxidante y regulador de acidez. Para este estudio se
buscó determinar la concentración de ácido ascórbico en una muestra de jugo del valle
citrus fruit y de una pastilla de vitamina C comercial por un método espectrofotométrico. En
el presente trabajo se presentan los resultados obtenidos donde la concentración de ácido
ascórbico por el método de patrón externo es de 480.7 ±16.2 mg/L, por el método de
adición de estándar es de 427.3±22.7mg/L y para la pastilla de vitamina C es de
1.063±0.028g. Estos resultados indican una sobreestimación de la concentración causado
principalmente por los colorantes presentes para el caso del jugo del valle. Por su parte el
resultado de la concentración en la pastilla es muy cercano al valor reportado por el
fabricante con un error del 6.03% en la medida.

Abstract

Vitamin C, also known as ascorbic acid, is a water-soluble vitamin essential for various
functions in the body. This vitamin is present in a wide variety of fruits and vegetables.
Ascorbic acid is used in the food industry as a preservative, antioxidant, and acidity
regulator. This study aimed to determine the concentration of ascorbic acid in a sample of
juice del Valle Citrus Fruit and a commercial vitamin C tablet using a spectrophotometric
method. The results obtained in this study show that the concentration of ascorbic acid by
the external standard method is 480.7 ±16.2 mg/L, by the standard addition method is 427.3
±13.7 mg/L, and for the vitamin C tablet, it is 1.063 ±0.028 g. These results indicate an
overestimation of the concentration, mainly caused by the presence of colorants in the case
of del Valle juice. On the other hand, the concentration result in the tablet is very close to
the value reported by the manufacturer, with an error of 6.03% in the measurement.

Introducción

El ácido ascórbico o vitamina C es un compuesto químico con un fuerte poder antioxidante.

Protege las células del daño en el ADN producto del estrés oxidativo. Actúa como un
donador de electrones que promueve la producción de colágeno. Es útil en la protección del
organismo contra el estrés. La deficiencia de esta vitamina puede causar debilidad en los
tejidos. Los seres humanos no pueden sintetizar esta vitamina, de ahí que necesite ser
consumida [1].

De manera natural, la vitamina C se encuentra en alimentos como las naranjas, espinacas,

guayabas, cerezas, perejil, limones, kiwi, col de Bruselas, entre otras. [1] De acuerdo con
las autoridades a nivel mundial una persona debería consumir entre 45 y 200mg de ácido
ascórbico por día, sin embargo, teniendo en cuenta comorbilidades como el consumo del
tabaco o la obesidad, podría ser necesario que una persona consuma una tasa mayor a
este contenido [2].

El ácido ascórbico tiene la propiedad de absorber en luz en el espectro ultravioleta. A pH 3

presenta el mayor coeficiente de absortividad molar en la longitud de onda 255nm [3].

Las bebidas comerciales que contienen jugo de frutos cítricos suelen tener ácido ascórbico
proveniente de las frutas, además de un añadido de esta vitamina con el fin de preservar el
líquido. En este trabajo se busca cuantificar la cantidad de vitamina C contenida en la
bebida Del Valle Fresh Citrus.

Algunas bebidas que contienen jugos naturales hacen uso de diferentes conservantes como
los antioxidantes, el ácido benzoico y el ácido sórbico. [4] Tal es el caso de la muestra
analizada. El fabricante reporta como ingredientes el sorbato de potasio el benzoato de
potasio y los colorantes amarillo #5, amarillo #6, rojo #40[5]. Estos últimos absorben en el
rango ultravioleta y en el caso de los colorantes también en el rango visible. De ahí que para
realizar la cuantificación por espectroscopia UV-Vis sea necesario realizar una extracción de
estos componentes.

Para esto debe tenerse en cuenta que la solubilidad de las especies protonadas de los
conservantes, presentan una solubilidad de 1.56g/L[6] en agua para el ácido sórbico y
2.9g/L[7], mientras que el ácido ascórbico se disuelve a una tasa de 330g/L[8]. Por su parte
los colorantes presentan un nivel mayor de solubilidad en agua debido a la presencia de
grupos sulfónicos.

Metodología

Cuantificación de Ácido ascórbico en muestra del jugo del valle por patrón externo

Para la preparación de la muestra se tomaron 20mL de jugo del valle frutos cítricos y se
filtró la solución con un embudo Büchner utilizando vacío. Se tomó una alícuota de 5mL del
filtrado, con pipeta aforada y se llevó a 20mL en matraz aforado con una solución de ácido
clorhídrico 1M. Se vertieron 10mL de diclorometano a un embudo de decantación y se
añadió lentamente la solución ácida de jugo. Se agitó cuidadosamente el líquido. Se
descartó la fase orgánica y se recogió la fase acuosa en un vaso de precipitados. Se realizó
una segunda extracción con DCM. A partir de esta solución obtenida se prepararon tres
muestras tomando una alícuota de 2 mL de la solución extraída que se llevó a 10mL con
ácido clorhídrico 0.1M. Se tomó una porción de 2mL de esta última solución y se llevó a
10mL con ácido clorhídrico 0.1M. Para el blanco de procedimiento se utilizaron 5mL de
agua desionizada y se llevaron a 20mL con HCl 1M. Se regresó el DCM utilizado para la
previa extracción al embudo de decantación y se agregó el agua ácida. Después de ser
agitado vigorosamente, se realizaron las dos diluciones que se hicieron a la muestra.
Para la preparación de la curva de calibración por patrón externo se preparó una solución
de 0.2056g de ácido ascórbico y se llevó a 100mL. Se tomó una alícuota de 1mL de esta
solución y se llevó a 100mL con ácido clorhídrico 0.1 M. Los niveles de la curva se hicieron
tomando alícuotas de 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 y 5.0 mL de esta última solución que fueron
llevados a 10mL con una solución de ácido clorhídrico 0.1M.

Cuantificación de Ácido Ascórbico en muestra del jugo del Valle por adición de
estándar

Para la adición de estándar se tomó la muestra diluida, descrita anteriormente. A partir de

esto se diseñó la adición de 3 puntos de estándar de la siguiente manera. A todos los
matraces de 10mL se les adiciono 2mL de la muestra y para cada adición se le agregó una
cantidad de patrón de ácido ascórbico 20.56mg/L 1, 2 y 3mL. Finalmente, todos estos se
enrasaron con ácido clorhídrico 0.1M.

Cuantificación de Ácido Ascórbico en pastilla de vitamina C comercial

Para cuantificar el ácido ascórbico presente en la pastilla de vitamina c comercial, se

pesaron 2 pastillas de 1.2741g y 1.2960g las cuales se maceraron hasta obtener un polvo
fino. De este polvo fino de la pastilla se pesaron 0.1332g y se disolvieron en una pequeña
cantidad de ácido clorhídrico 0.1M, esta mezcla se filtró para evitar la presencia de
partículas suspendidas. Este líquido filtrado se llevó a un matraz de 100mL y se enraso con
HCl 0.1M. Esta muestra se volvió a diluir tomando una alícuota de 0.5mL de la solución y
llevándola a un matraz de 50mL. A esta muestra se le tomó su espectro UV-vis.

Descripción del equipo

Para la cuantificación se utilizó el espectrofotómetro Cary 50 conc, el cual cuenta con una
lámpara de Xenón y un detector de arreglo de diodos.

Resultados y análisis

Extracción líquido-líquido

Con la extracción líquido-líquido se pretendía retirar la mayor cantidad posible de ácido

benzoico, ácido sórbico y de colorantes. Llevar el blanco al embudo de decantación con el
DCM utilizado para la extracción de la muestra cumple la función de regresar al agua parte
de las sustancias retiradas. Debe recordarse que dos extracciones no logran retirar las
sustancias de interés por completo, debido a que estas se disuelven tanto en solventes
polares como en apolares de acuerdo con su coeficiente de reparto. En este sentido se
espera que una parte de los conservantes extraídos regresen a la fase acuosa, pero que se
mantengan en una mayor proporción en la fase orgánica.

En la figura 1 se encuentran los espectros obtenidos de blanco y muestra con una única
dilución.
 Espectros de blanco y muestra concentrados
0.6

0.5
Absorbancia (U.A.)

0.4

0.3

0.2

0.0999999999999999

-8.32667268468867E-17
200 300 400 500 600 700 800 900
-0.1

Longitud de onda (nm)

Patrón ácido ascórbico Blanco concentrado Muestra concentrada

Figura 1. Espectros de absorbancia del blanco de procedimiento y la primera dilución de la muestra.

La presencia un pico de absorción del blanco hacia 270nm, sugiere que se logró extraer una
buena parte de los conservantes, pues de acuerdo con lo observado pueden presentarse
picos hacia esta zona (ver Figura 2). Por el contrario, la extracción de colorantes no fue
posible pues su coeficiente de reparto indicaba mayor afinidad por solventes polares. Esto
se evidenció en primer lugar porque el DCM utilizado en la extracción no presentó ninguna
coloración apreciable a simple vista, en segundo lugar, porque el blanco utilizado no arrojó
señales significativas en el espectro visible y finalmente se observó que la muestra con la
primera dilución presentó absorbancia en casi todo el espectro visible.

Se realizó una segunda dilución con el objetivo de disminuir interferencias causadas por el
color. Sin embargo, se espera que la cuantificación obtenida sobreestime la concentración
de ácido ascórbico debido a las señales de los colorantes que no pudieron ser retiradas en
su totalidad y tampoco pueden ser descontadas con un blanco.

(a) (b)
Figura 2. Espectros UV del (a) ácido benzoico [9] y (b) ácido sórbico [10]
Cuantificación

La curva de calibración se realizó a una única longitud de onda (255nm) de acuerdo con la
máxima absorbancia de la vitamina C reportada por la literatura [3].

Curva de calibración
0.4
f(x) = 0.037414867253338 x − 0.0010038329319795
R² = 0.999853393261113
Absorbancia (U.A.)

0.3

0.2

0.1

0
0 2 4 6 8 10 12

Concentración de ácido ascórbico (mg/L)

Figura 3. Curva de calibración de patrón externo de ácido ascórbico en espectrofotometría UV-Vis

longitud de onda 255nm.

A esta curva de calibración se le realizaron algunas pruebas estadísticas como se muestra

en la tabla 1. Se puede verificar con la prueba F para el 95% de confianza que hay
correlación entre las variables x y y. Con la prueba T regresión, se verifica que la pendiente
obtenida es diferente de 0. Igualmente, la prueba T del coeficiente de correlación indica que
esta es significativamente diferente de 0. Por último, no puede descartarse la hipótesis de
que la intersección con el eje y sea diferente de 0, lo cuál es esperado debido al ajuste de
un blanco para absorbancia 0.

Tabla 1. Pruebas estadísticas curva de calibración por patrón externo

Estadístico Experimental Calculado para
95% de confianza
F 6819.96886 7.70864742
T regresión 426.942208 2.77644511
T del coeficiente de correlación 165.166205 2.77644511
T intersección -1.5882168 -2.7764451

El límite de detección para este método es 0.021mg/L mientras que el límite de

cuantificación es 0.064mg/L.

Posteriormente, se tomó el espectro de los patrones de vitamina c, como se observa en la

figura 4.

Figura 4. Espectro en UV-vis de la curva de calibración por patrón externo de ácido ascórbico.
 Curva de calibración por patrón externo
0.6

0.5
Absorbancia (U.A.)

0.4

0.3

0.2

0.0999999999999999

-8.32667268468867E-17
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
-0.1

Longitud de onda (nm)

Blanco Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Nivel 4 Nivel 5 Nivel 6

A partir de esta curva de calibración se tomó el espectro de la muestra diluida de tal manera
que se encontrara a la mitad de la curva como se observa en la figura 5. A partir del valor de
absorbancia obtenido para la muestra, se realizó la cuantificación de ácido ascórbico
haciendo uso de la ecuación de la recta para el patrón externo, todo esto teniendo en
cuenta los factores de dilución utilizados para la preparación de la muestra.

Espectro de Absorción de la Muestra diluida con

respecto a la curva
0.6

0.5
Absorbancia (UA)

0.4

0.3

0.2

0.1

0
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

Longitud de Onda (nm)

Muestra Diluida
Figura 5. Espectro de absorción de la muestra diluida comparada con los espectros de absorción de
la curva de calibración.

Al realizar los cálculos correspondientes se determinó que la concentración de ácido

ascórbico en la muestra de jugo del valle es de 480.7 ±16.2 mg/L lo cual se encuentra muy
por encima del valor reportado por el fabricante [4]. A partir de este resultado podemos
afirmar que este valor es el resultado de una sobreestimación de la concentración
verdadera de ácido ascórbico, la cual puede ser causada principalmente por la presencia de
colorantes en la muestra los cuales absorben a la longitud de onda seleccionada (255nm).

2.000 mLdil 1 2.000 mL sol extraida 5.000 mLsol filtrada

4. 8065 mgAA / Ldil 2 ⋅ ⋅ ⋅ =480.7 mg AA / L solucion f
10.00 mLdil 2 10.00 mLdil 1 20.00 mL sol extraida

Adicionalmente se realizó un análisis de la sensibilidad del método a los diferentes puntos

de la curva de calibración con lo cual se obtuvo que la variación de los datos no supera ±5%
de la mediana como se puede observar en la figura 6. A partir de esto se puede asegurar
que la sensibilidad del método es confiable para todos los puntos de la curva.

Sensibilidad del método en diferentes pun-

tos de la curva
0.04
Sensibilidad (U.A. L/mg)

0.039
0.038
0.037
0.036
0.035
0.034
0.033
0 2 4 6 8 10 12

Concentración (mg/L)

Sensibilidad Mediana +5% Mediana -5%

Figura 6. Gráfico de sensibilidad de la curva de calibración por patrón externo de ácido ascórbico.

Por otra parte, se cuantificó la concentración de ácido ascórbico en el jugo del valle por el
método de adición de estándar con el fin de minimizar cualquier efecto matriz presente en la
mezcla. Para esto se tomó el espectro de absorción del blanco de curva, de la muestra
diluida y de cada uno de los niveles de la adición como se puede observar en la figura 7. A
partir de estos datos se obtuvo una regresión lineal la cual se utilizó para la cuantificación
del ácido ascórbico tomando en cuenta también los factores de dilución de la muestra. Al
realizar los cálculos correspondientes se determinó que la concentración de ácido ascórbico
en el jugo del valle es de 427.3±22.7mg/L. Esta medida también se considera que esta
sobreestimada de la concentración verdadera del ácido ascórbico en el jugo del valle esto a
causa de los colorantes presentes en la muestra.
 Curva por adición de estándar
0.6
0.5
Absorbancia (U.A.)
0.4
0.3
0.2
0.0999999999999999
-8.32667268468867E-17
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
-0.1

Longitud de onda (nm)

Blanco Muestra Adición 1 Adición 2 Adición 3

Figura 7. Espectros de absorción de la curva por adición de estándar

Curva de calibración por adición de estándar de

ácido ascórbico
0.5

0.4
Absorbancia (U.A.)

f(x) = 0.0371076523994811 x + 0.158576666666667

0.3 R² = 0.999807245394385

0.2

0.1

0
0 1 2 3 4 5 6 7
Concentración de ácido ascórbico (mg/L)

Figura 8. Curva de calibración de ácido ascórbico en jugo de naranja del valle por adición de
estándar

A la regresión lineal obtenida a partir de la curva de adición de estándar se le realizaron

algunas pruebas estadísticas como se muestra en la tabla 2.

Tabla 2. Pruebas estadísticas curva de calibración por adición de estándar

Estadístico Experimental Calculado para 95% de confianza
F 5186.94348 18.5128205
T regresión 373.872927 4.30265273
T del coeficiente de
correlación 101.85228 4.30265273
T intersección 195.997285 4.30265273
El límite de detección para este método es 0.021mg/L mientras que el límite de
cuantificación es 0.064mg/L. La diferencia entre las pendientes es de 0.000307215, la
diferencia es de 0.8% por lo cual no hay un efecto matriz.

Para la cuantificación de ácido ascórbico en la pastilla de vitamina C comercial se tomó el

espectro de la muestra diluida dando como resultado la gráfica que se observa en la figura
9. La absorbancia

Figura 9. Espectro de Absorción de la pastilla de Vitamina C comercial.

El resultado fue 5.517 ±0.127 mg/L para la muestra diluida, mientras que el porcentaje en
peso hallado fue 41.42%±1.08%. El total de vitamina C fue 1.063g±0.028. El fabricante
reportó 1.000g, de tal forma que el error en la medida está dado por

1.063−1.000
=6.03 %
1.000

Conclusiones

A partir de los resultados obtenidos se puede concluir que la cuantificación de ácido

ascórbico en la muestra del jugo del Valle se vio afectada por la presencia de colorantes los
cuales absorben a la misma longitud de onda que el analito de interés, es por esto que las
medidas de la concentración se encuentran sobreestimadas. A pesar de que a la muestra
de jugo se le realizo una extracción para intentar eliminar la mayor cantidad de interferentes,
se recomienda revisar otras técnicas de separación adicionales a la extracción líquido-
líquido para la eliminación de colorantes.

Adicionalmente, es recomendable realizar la toma del espectro completo antes de realizar la

toma de datos a una única longitud de onda, especialmente cuando varíen las condiciones
de pH de la muestra, pues puede ocasionar un corrimiento en los picos.
Referencias

[1] B. Mittu, Z. R. Bhat, A. Chauhan, J. Kour, A. Behera, y M. Kaur, Ascorbic acid.

Elsevier Inc., 2021. doi: 10.1016/B978-0-323-89779-2.00015-6.

[2] A. C. Carr y J. Lykkesfeldt, “Discrepancies in global vitamin C recommendations: a

review of RDA criteria and underlying health perspectives”, Crit. Rev. Food Sci. Nutr., vol.
61, núm. 5, pp. 742–755, 2021, doi: 10.1080/10408398.2020.1744513.

[3] K. Aguilar, A. Garvín, A. V. Lara-Sagahón, y A. Ibarz, “Ascorbic acid degradation in

aqueous solution during UV-Vis irradiation”, Food Chem., vol. 297, núm. December 2018, p.
124864, 2019, doi: 10.1016/j.foodchem.2019.05.138.

[4] S. Dey y B. H. Nagababu, “Applications of food color and bio-preservatives in the

food and its effect on the human health”, Food Chem. Adv., vol. 1, núm. January, p. 100019,
2022, doi: 10.1016/j.focha.2022.100019.

[5] The Coca Cola Company, “Del Valle Citrus Fresh Información nutricional”.
https://www.coca-cola.com/co/es/brands/del-valle#accordion-ae866c1811-item-aff5cccdc1
(consultado el 21 de noviembre de 2023).

[6] “Ficha de datos de seguridad Ácido sórbico”. 2022. [En línea]. Disponible en: Ficha
de Datos de Seguridad: Ácido sórbico (consultado el 21 de noviembre de 2023).

[7] “Ficha de datos de seguridad Ácido benzoico”. 2015. [En línea]. Disponible en: Ficha
de Datos de Seguridad: Ácido benzoico (consultado el 21 de noviembre de 2023).

[8] “Ficha de datos de seguridad Ácido ascórbico”. 2020. [En línea]. Disponible en: SDB-
NC00-ES-ES.pdf (carlroth.com) (consultado el 21 de noviembre de 2023).

[9] National Institute of Standards and Technology, “Benzoic Acid”. [En línea].
Disponible en: https://webbook.nist.gov/cgi/cbook.cgi?
ID=C65850&Units=SI&Mask=400#UV-Vis-Spec (consultado el 21 de noviembre de 2023).

[10] National Institute of Standards and Technology, “Sorbic Acid”.

https://webbook.nist.gov/cgi/cbook.cgi?ID=C110441&Mask=400 (consultado el 21 de
noviembre de 2023).