Aislamiento e Identificacin de Levaduras y Bacterias Lcticas a partir de vinos

Obtenidos por fermentacin natural de uvas.

Muestra:
-Mosto de uva al inicio de la fermentacin.
-Mosto durante la fermentacin primaria.
-Mosto al finalizar la fermentacin secundaria.

Sembrar 0.1 ml de las 2 ltimas diluciones (10- y 10) en Agar YPG pH

5,5, agar Man Rogosa Sharpe +jt pH 5,5, Agar Plate Count y Agar
MacConkey pH 7,0 por el mtodo de diseminacin.

- Incubar a 28 37 C durante 48 a 72 horas.

- Seleccionar las colonias de acuerdo a sus caractersticas y anotar resultados.

- Realizar coloracin Gram. Transferir las colonias seleccionadas a medios lquidos
adecuados para obtener cultivos puros.

- Realizar las pruebas de seleccin y de diferenciacin bioqumica de las cepas

microbianas dominantes en cada etapa de la fermentacin.
- Reportar datos al finalizar el tiempo de fermentacin.

NOTA: Para identificar levaduras, realizar adems de los estudios morfolgicos y culturales,
las pruebas de filamentizacin, esporulacin, asimilacin y fermentacin de carbohidratos,
asimilacin de compuestos nitrogenados por el mtodo auxonogrfico e hidrlisis de la urea.
Para identificar bacterias lcticas, realizar las pruebas bioqumicas utilizando diferentes
carbohidratos incluir la prueba de glucosa de potasio para la diferenciacin de las bacterias
lcticas heterfermentativas y homofermentativas y la prueba de Voges proskauer para la
deteccin de cepas lcticas productoras de sustancias aromticas (acetoina, diacetilo 2,3
butanodiol etc)

Anlisis Fsico Qumico

A. Determinacin del grado alcohlico.
B. Determinacin cuantitativa de carbohidratos por el mtodo de Antrona.
C. Determinacin de la acidez ( estas dos pruebas ver en procedimiento).

Determinacin del Grado Alcohlico por el Mtodo del Picnmetro o Densmetro Gay
Lussac y Cartier

Muestra: Destilado de Vino, aproximadamente 100 ml y

mantener a
20C.

Pesar el picnmetro, con una aproximacin de 0. L mgr= Peso 1 (P1) Pesar el Picnmetro
conteniendo Agua Destilada a 20C= Peso 2 (P2)
Pesar el Picnmetro (previamente secado) conteniendo el destilado de vino Peso 3 (P3)

Calcular la concentracin del alcohol en base a la Tabla AOAC

(Oficial Methods ofalysis)
Determinacin Cuantitativa de Carbohidratos por Mtodo de Antrona
Fundamento;
La reaccin de la Antrona constituye la base de un mtodo rpido y conveniente para la
determinacin de hexosas, aldopentosas y cidos hexurnicos, bien sea que estn libres o
formando parte de los polisacridos. La solucin azul verdosa muestra una absorcin mxima
de 620 nm, aunque algunos carbohidratos pueden dar otros colores. Esta reaccin no es
adecuada si en la muestra tambin se hallan presentes, protenas que contiene grandes
cantidades de triptfano, puesto que en este caso se obtiene una coloracin roja.
La extincin depende del compuesto investigado, peor es constante para una molcula dada.
Materiales:
1. Reactivo de Antrona (2 gr! 1 en H2S04 concent.)
2. Glucosa (0.1 gr/1 como carbohidrato patrn)..
Mtodo:
A 1 ml de una solucin de carbohidrato agrgar 4 ml del reactivo Antrona libre de protena y
mezclar rpidamente (Precaucin: cido fuerte). Colocar los tubos en un bao de agua
hirviendo durante 10 minutos taponndolos con una bola de vidrio para prevenir prdidas de
agua por evaporacin.
Enfriar y leer la extincin a 620 mm contra un blanco.
Preparar curvas patrones para. las soluciones de glucosa y comparar con la muestra problema.
Nota:
Si en la muestra hay presencia de protenas, seguir el siguiente procedimiento:
Colocar en un tubo, 1.5 ml de agua destilada estril y 0.1 ml de la muestra que contenga 50
a 150 microgramos de azcares y mezclar vigorosamnte. Aadir a la mezcla 0.2 ml de la
solucin de hidrxido de bario (0.3 molJ 1) y 0.2 ml de sulfato de zinc acuoso (Solucin de
sulfato de zinc Zn 504. 7H20, 50 g/l), mezclar y centrifugar. En caso de no contar con una
centrfuga, filtrar y utilizar papel filtro fino. De esta manera se precipita la protena y queda
la muestra transparente para los anlisis posteriores de azcares.
Determinacin de la Acidez Total (procedimiento):
1. Depositar 25 ml de
destilado de vino en un matraz de 300 ml. ). En el caso de que la muestra fuera turbia, diluir
con aproximadamente 2 veces su volumen con agua destilada libre de CO2 (para eliminar el
CO2, hervir el agua destilada durante 5 minutos y enfriar sumergiendo bruscamente el tubo
en agua de cao)
2. Adicionar 5 gotas de
fenofialema al 2% (solucion de fenoflalema al 2% en etanol de 95% y/y) Titular con una
solucion de NAOH O 1N hasta la aparicion de un color rosado tenue perdurable durante 30
segundos (se realiza esta operacion por duplicado)
3. La diferencia entre los
volmenes de soda gastada no debe ser mayor de 0.1 mi, de lo contrario repetir la prueba
4. Calcular en miligramos por
ciento el acido acetico presente en la muestra Si se trata de vinos, sidras o productos lacteos,
se expresa en acido tartarico, acido malico o acido lactico p/v, respectivamente
5. Ejemplo Si se asume que se
ha gastado 3 55 ml de soda promedio, se obtiene el resultado de la siguiente manera:
Peso molecular de NaOH = 40
Peso molecular de CH3COOH =60 gr.

60 gr CH3COOH ----------------1000 ml.H20 Destilada -----------------1 N

x---------------------------------------------------------------------------------- 0.1N
X = 6 gr de cido actico.

Si en 25 ml---------------------------- 0. 0213 gr. de cido actico

100 ml ----------------------------------------------X
X = 0.0852 gr/l00 ml.

1,000 ml NaOH 0.1 ---------------N 6 gr. de cido actico

3.55 ml NaOH 0.1 N------------------------------------- X
 X =0.0213 gr. de cido actico en 25 ml de muestra.
Si en 25 ml ---------------------------0.0213 gr ido acticb
100 ml -----------------------------------X
X 0.0852 gr/lOO ml.

1 gr--------------------- 1000 mgr.

0.0852gr ------------------------X
X = 85.2 mg/lOO ml.

Nota: Es importante obtener el peso molecular del cido actico y del hidrxido de sodio. El
resultado final obtenido debe convertirse en miligramos, Globalmente se expresa la fuerza
de todos los cidos como Acidez Total del vino, de la sidra, vinagre o productos lcteos, y se
expresa en el cido caracterstico de la uva, que es el cido tartrico, de la manzana que es el
cido mlico, del vinagre que es el cido actico, o leche y derivados que es el cido lctico.
Para la determinacin de la acidez total se puede tambin utilizar el siguiente mtodo:
En este caso se aplica la siguiente frmula:

%acidez = A.xBxC X100

D

A: Cantidad del lcali gastado (mi)

B: Normalidad del NaOH 0.1 N utilizado
C: Peso equivalente (gr) del cido orgnico que predomina en la muestra
D: Peso de la muestra (mgr.)

Ejemplo:

3.55x0.1x60 X100 =85.2%

25
Se gast 3 55 ml del lcali y e utiliz 25 mL de la muestra para determinar la acide total.

Equivalencias: 1 K = 1 Lt.
1000 mgr. = 1000 mgr.
25mgr. = 25ml

ACIDOS ORGNICOS PREDOMINANTES EN PRODUCTOS FERMENTADOS.

cido Peso Molecular Nmero de Iones Peso Equivalente

Hidrgeno
Acido actico 60 1 60
Acido Ctrico 192 3 64
Acido lctico 90 1 90
Acido mlico 134 2 67
Acido tartrico 150 2 75

PAPEL DE LAS EVADURAS Y BACTERIAS LCTICAS EN VINIFICACIN

Las levaduras transforman los azucares del mosto de uva en etanol, CO2 y otros compuestos
qumicos por medio de un proceso bioqumico denominado fermentacin alcohlica. De esta
manera se obtiene el vino. Desde principios del siglo XX se sabe que en la elaboracin de
algunos vinos pueden intervenir, adems de las levaduras, otros microorganismos cuya
misin es transformar el cido mlico del vino en cido lctico. Esta transformacin que es
denominada fermentacin malolactica y que es llevada a cabo por diversas especies de
bacterias lcticas, es considerada una fermentacin de suavizacin del vino que conviene a
todos los vinos tintos y a aquellos vinos blancos Cuyo contenido en acido macho sea muy
elevado
La fermentacin del mosto suele desencadenarse de forma natural y espontnea a partir de
las propias levaduras presentes en el mosto, a este tipo de fermentacin se le denomina
fermentacin espontnea. Se caracteriza porque en el transcurso de la misma intervienen
varias especies de levaduras, algunas de las cuales coexisten en el tiempo y otras se suceden
secuencialmente en funcin de su poder alcoholgeno. En la sucesin de especies primero
suelen intervenir las levaduras de primera fase generalmente asporgenas y luego las de
segunda fase en su mayora esporgenas, de modo que Saccharomyces cerevisiae domina
durante la mayor parte del tiempo, pudiendo ser desplazado al final por Saccharomyces
baycnus.
En ocasiones, la conjuncin de un sulfitado excesivo y bajas temperaturas, retardan el inicio
de la fermentacin. En estos casos, y en aquellos en los que el vinicultor desea conducir la
fermentacin alcohlica con un tipo concreto de levaduras, se recurre a la adicin de
levaduras al mosto.. Se pueden emplear levaduras autctonas preparando lo que se llama un
pie de cuba, o bien levaduras comerciales. En el primer caso, se parte de una fraccin
pequefia de la pr6pia vendimia, el mosto de uvas sanas, se deja fermentar espontneamente.
Cuando la fraccin est en plena fermentacin puede ser utilizada como inculo para el resto
del mosto. En el segundo caso, se suele recurrir al empleo de las denominadas levaduras
secas activas bajo el aspecto de polvos secos, que a menudo deben ser rehidratadas en agua
tibia antes de su utilizacin, las levaduras secas activas son levaduras deshidratadas
generalmente pertenecientes a las especies Sacchromyces cerevisiae y
Saccharomycesbayanus.
Para que la fermentacin alcohlica tenga lugar, el most2. ha ae hallarse en condiciones de
limitacin de oxgeno.
En condiciones de aerobiosis las levaduras se multiplican abundantemente con un
rendimiento en biomasa muy alto ya que consigue lg de levaduras por cada 4 g de azucares
consumidos.
En anaerobiosis las levaduras realizan la fermentacin alcohlica, es decir degradan los
azucares en forma incompleta generando etanol, C02 y energa. En estas condiciones el
rendimiento en biomasa es de tan slo l g de levadura por cada 100 g de azucares consumidos.
La fermentacin malolctica es una segunda fermentacin que, a no ser que se impida, la
sufren los vinos jvenes cuando ha terminado o est a punto de terminar la fermentacin
alcohlica.
Bioqumicamente es un proceso llevado a cabo por las bacterias lcticas que consiste en la
transformacin del cido mlico del vino en cido lctico ms CO2. de ah el nombre de
malolctica.
El inters enolgico de las bacterias lcticas deriva de la capacidad que poseen algunas de
sus especies para realizar la fermentacin malolctica. Las especies ms importantes son:
Oenococcu oeni,, Lactobacillusplantarum y Pediococcuspentosaceus. De todas estas especies
la ms frecuentemente aislada en los vinos en plena fermentacin malolctica es Oenococcus
oeni y es considerada como la principal responsable de la fermentacin malolctica de los
vinos. Las cepas de Oenococcus oeni son seleccionadas por su resistencia al bajo pH, al alto
grado alcohlico y por su posibilidad de adicin directa al vino sin reactivacin previa.
Si la fermentacin malolctica no conviene a un vino puede impedirse trasegando y
sulfitando el vino tras finalizar la fermentacin alcohlica. Con ello se evita adems de la
fermentacin malolctica, los riegos de enfermedades causadas por las bacterias
perjudiciales. Si por el contrario se desea que un vino pase la fermentacin malolctica, y
esta no se desencadena, pese a ser favorables las condiciones, habr que adicionar bacterias
tiles al vino. Entre las distintas formas de inculo se citan:
a) La mezcla de estos vinos con otros en plena fermentacin malolctica.
b) La utilizacin de las las (sedimentos que deja el vino tras su fermentacin en el fondo de
los depsitos) de vinos que acaben de pasar la fermentacin malolctica,
c) La utilizacin de cultivos puros comerciales.

SELECCIN DE BACTERIAS LCTICAS CON CAPACIDAD FERMENTATIVA

ASOCIADAS A VINOS OBTENIDOS POR FERMENTACIN ESPONTNEA.
El grupo de las bacterias lcticas rene varios gneros caracterizados por su capacidad de
fermentar los carbohidratos produciendo cido lctico. La fermentacin se denomina
homolctica si el cido lctico es prcticamente el nico producto formado, y heterolctica
si se forman tambin otros compuestos: cido actico, etanol, CO2, etc. Ciertas bacterias
homofermentativas son tambin capaces de fermentacin heterolctica en condiciones de
crecimiento no ptima o segn la naturaleza del azcar utilizado.
Las bacterias lcticas presentan otras caractersticas comunes que explican su
reagrupamiento:
1. Son bacterias Gram-positivas, generalmente inmviles, nunca esporuiadas, catalasa-
negativas, oxidasa-negativas, generalmente nirato reductasa negativas.
2. Su capacidad de biosntesis es dbil, lo que explica su poliauxotropa para diversos
aminocidos, bases nitrogenadas, vitaminas y cidos grasos, pero tambin su
metabolismo fermentativo: incapaces de sintetizar el ncleo hemo de las porfirinas,
estn normalmente desprovistas de citocrornos y en consecuencia son ineptas para
cualquier respiracin aerobia o anaerobia.
3. Son bacterias anaerobias facultativas: microaerfilas, capaces de fermentar tanto en
aerobiosis como en anaerobiosis.
Las bacterias lcticas estn representadas por, los gneros Streptococcus, Lactococcus,
Enterococcus, Leuconostoc, Fediococcus, Oenococcus (cocos) y Lactobacillus (bacilos). Se
distinguen adems por su tipo de fermentacin: homolctica o herolctica. A estos gneros
ha sido recientemente aadido el gnero Bfidobacterium. La inclusin de estos gneros en
un mismo grupo est confirmado por la taxonoma molecular: el anlisis de la secuencia
nucleotdica de su ARN ribosomal (A,RNr) permite reunir en un mismo grupo filogentico
a los gneros Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Streptococcus,
Lactococcus, Enterococcus, Bacillus, Clostridium, Fropionibacterium y Bfidobacterium..
Ciertas cepas poseen muchas propiedades de inters industrial, sin embargo, existen otras
bacterias lcticas denominadas perjudiciales, que se caracterizan por metabolizar
preferentemente los azcares, el cido tartrico y el glicerol y elevar la acidez voltil
causando con ello las enfermedades del vino
 SELECCIN DE BACTERIAS LCTICAS DE INTERS INDUSTRIA
ELABORACIN DE PRODUCTOS LACTEOS

1. INTRODUCCIN
Las bacterias lcticas que constituyen parte de la microflora natural de la fermentacin de
una diversidad de alimentos y bebidas tradicionales, son ampliamente utilizadas en la
elaboracin y conservacin de diversos productos fermentados para la alimentacin humana
y animal. Transforman una variedad de azcares presentes en los mostos, en productos
benficos o perjudiciales dependiendo de las especies y/o de las condiciones en la cual se
desarrollan.
Las bacterias lcticas agrupa a todas aquellas bacterias capaces de producir cido lctico a
partir de azcares y estn conformadas principalmente por los gneros:
Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Sfreptococcus Lactococcus y Eierococcus
incluyendo Bfidobacteriuni. y Propionibacterium Representan un grupo de microorganismos
de gran importancia en la industria alimentaria como agentes de biocontrol, cultivos
iniciadores y probiticos. Muchos de sus productos metablicos, mejoran la calidad y
seguridad de los alimentos. Las bacterias lcticas productoras de cidos orgnicos (cido
lctico, cido actico entre otros), perxido de hidrgeno, diacetilo, acetoina, acetaldehdo,
etanol, CO2, bacteriocinas, etc. contribuyen al mejoramiento de la calidad sensorial y a la
preservacin de diversos productos alimenticios.

Normalmente, las bacterias lcticas son especies determinadas y su actividad global

caracteriza al fermento: la acidificacin, la proteolisis, la formacin de aromas, la obtencin
de una textura, etc. Actualmente las cepas comercializadas han sido aisladas de leche o de
productos lcteos y en particular de cultivos iniciadores artesanales. Con el desarrollo de la
gentica, se utilizan ya cepas recombinadas naturalmente.
2. GENERALIDADES
En general, las bacterias del cido lctico son organismos inmviles de forma bacilar,
cocobacilar o esfrica, Gram positivas y su nombre deriva del hecho de que sintetizan ATP
a travs de fermentaciones de carbohidratos que dan cido lctico como principal producto
final. Son anaerobios facultativos. Sin embargo, son incapaces de sintetizar ATP por
respiracin, lo cual es un reflejo de su incapacidad para sintetizar citocromos y otras enzimas
que contengan grupos heminas.
Una consecuencia de la incapacidad de sintetizar protenas hmicas es que las
bacterias lcticas son Catalasa negativas y por lo tanto no pueden descomponer el 11202
y para no acumularlo, utilizan una Peroxidasa que cataliza la oxidacin del NADH a
partir del 11202 que se reduce a H20.
Todos estos organismos son muy exigentes nutricionalmente, requieren factores de
crecimiento, vitaminas del grupo B y una considerable cantidad de aminocidos. Las
bacterias cocoides del cido lctico pueden iniciar su crecimiento en medios neutros o
alcalinos, las formas bacilares no pueden crecer en medios con un pH inicial mayor de 6,5.
El crecimiento de estos microorganismos contina, hasta que el pH disminuya por
fermentacin a un valor de 4,5 o menos, siendo por lo tanto cido tolerantes.
Las bacterias del cido lctico se dividen en dos subgrupos bioqumicos que se distinguen
por los productos formados a partir de la glucosa.
1. Los homofermentativos: Convierten la glucosa, de forma casi cuantitativa, en cido
lctico, va gliclisis.
2. Los heterofermentativos: Convierten la glucosa en una mezcla equimolar de cido lctico,
cido actico, etanol y CO2, va pentosa - fosfato.
Las bacterias lcticas homofermentativas intervienen en procesos extensos tales como la
fabricacin de mantequilla, quesos y leche agria. Para la obtencin de estos productos, es
factor importante la transformacin de la lactosa en cido lctico y el aporte del aroma.
El yogurt es una de las leches fermentadas ms antiguas que se conocen, en contraste con el
kefir y el kumis, levemente cidos y ligeramente alcohlicos. El yogurt es una preparacin
de coagulacin rpida y cida y con muy poco o ningn alcohol y se prepara unas veces a
partir de un cultivo mixto de Lactobacillus delbrueckii sabsp. buigari cus y Streptococcus
thermoplzilus, otras, se hacen a expensas de cultivos con los dos grmenes separados que se
mezclan en el momento de su empleo en las proporciones adecuadas. Para lograr buenos
resultados estos organismos deben halla.rse en el cultivo en nmero aproximadamente igual,
de no ser as, el yoghurt carecer de la consistencia, el sabor y el olor ms deseable. Cuando
se inocula la mezcla en la leche los cocos proliferan mucho ms rpido que los bacilos y al
terminar la primera hora de incubacin a 35C, a menudo su nmero es superior al de los
ltimos en proporcin de 3 6 4 a 1 debindose el cido inicial en gran parte a la actividad de
Streptococcus thermophilus. Los bacilos van aumentando progresivamente en nmero, hasta
que al final del periodo de incubacin, su nmero es aproximadamente el mismo que el de
los cocos. La produccin de cido durante la ltima parte del periodo de incubacin la llevan
a cabo Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus. Se ha demostrado que los bacilos
estimulan la proliferacin de Streptococcus thermop hilas al liberar aminocidos esenciales
en especial Valina de las protenas de la leche.
El gnero Lactobacillus fue propuesto por Beijerinck en 1901. Su descripcin esta basada en
sus propiedades morfolgicas, fisiolgicas y genticas. Se caracterizan por ser bacilos o
cocobacilos Gram positivos, a menudo formando cadenas, son quimioorganotrficos, crecen
slo en medios ricos nutricionalmente y requieren carbohidratos como fuente de energa.
Estos microorganismos carecen de citocromos y son usualmente Catalasa negativos. Su
crecimiento ptimo es en condiciones de microaerofihia pH 5.5 a 6.5. Su crecimiento a
menudo se inhibe a pH neutro o alcalino (por encima de pH 7.0 7.5). La mayora de los
lactobacilos contienen el tipo Peptidoglican LLys-D-Asp. En muy
pocos casos, la Lisina es reemplazada por la Omitina o cido Meso - Diaminopimlico.
Este gnero comprende ms de 60 especies descritas las que son genticamente diversas. Su
contenido de DNA guanina ms citosina (GH-C) est en el rango de 32-54
3. METODOLOGA DE ESTUDIO
3.1 Recoleccin de la muestra.
- Los. gneros Lactobacillus , Lactococcus, Leuconostoc, Enterococcus y otros afines,
pueden ser aislados de muestras de alimentos y bebidas obtenidas por fermentacin
espontnea y comerciales: leches fermentadas artesanales, yogurt, kefir, quesos, mantequilla
y otros.
- Las muestras deben ser recolectadas en frascos estriles con tapa de rosca y ser mantenidas
en refrigeracin hasta su procesamiento.

3.2 Procesamiento de la muestra.

- Realizar coloracin Gram de la muestra problema.
- Observar la morfologa celular (cocos, bacilos .o cocobacilos no esporulados Gram
positivos). .
- Realizar diluciones seriadas, hasta 106, en Solucin Salina Peptonada de las muestras
seleccionadas.

3.3 Aislamiento primario.

Sembrar por diseminacin en agar LAPTg, M17 y/o MRS (pH 6,0 6,5) con Cicloheximide
(concentracin final 0.02 %).
Incubar a 30C por 48 a 72 horas en condiciones de microaerfilas (mtodo de la vela).

3.4 Recuento de bacterias lcticas.

- Reconocer las colonias pequeas blancas o translcidas de borde liso Hacer el recuento y
estimar la poblacin total de bacterias por gramo o mL de muestra.
- Sembrar las colonias tpicas en caldo LAPTg, M17 yio caldo MRS (pH 6,0 6,5) para
obtener cultivos puros.
- Incubar a 30C por 48 - 72 horas, en condiciones de microaerofilia.

3.5 Identificacin presuntiva.

Coloracin Gram: Realizar la coloracin Gram de los cultivos puros y verificar la presencia
de bacilos o cocos Gram positivos, dispuestos en pares, cortas cadenas, o aislados no
esporulados.
- Prueba de la Catalasa: Usualmente las bacterias lcticas son Catalasa negativos, con
excepcin de algunas cepas que pueden manifestar una positividad dbil. Agregar a
los cultivos puros 3 gotas de H202 y observar si hay o no presencia de
- burbujas.
- Sembrar los cultivos seleccionados en medios frescos para su mantenimiento a 4C y
posterior caracterizacin.

3.6 Identificacin bioqumica.

- Obtener cultivos activos en fase exponencial de las cepas patrones y cepas problema.
- Lavar las clulas bacterianas con Solucin Salina estril (0,85 %) por 2 veces. La
centrifugacin se realiza a 3500 rpm por 10 mm.
- A partir del paquete celular, preparar la suspensin bacteriana (D O = 0,6 a 560nm)
- Agregar 300 .tl (0,3 mL) de la suspensin celular a 5 mL de medio Gluconato de
potasio o medio Gibson y medios de fermentacin de carbohidratos conteniendo
Glucosa, Fructosa, Maltosa, Galactosa, Sacarosa, Manitol, Arabinosa, Xilosa,
- Ribosa entre otros. Al tubo con Gluconato de potasio aadir VASPAR 1:1 (2 mJ.)
para crear condiciones anaerbicas y observar la produccin de gas. El medio
- base para la fermentacin de carbohidratos del Gnero Lactobacillus es el medio
MRS pH 6.5. Para el Gnero Lactococcus, se recomienda el medio base LAPTg
pH6.5
- Incubar a 30C por 24 a 96 horas.
 - Hacer la lectura y verificar el perfil bioqumico de acuerdo a las tablas de
diferenciacin bioqumica (Tabla 1, 2 y 3).
- Sembrar las cepas seleccionadas en caldo MRS pH 6,5 ms glicerol al 20%, previo
lavado del paquete celular y mantener a -20C.

MEDIOS DE CULTIVO:
1. Agar Man Rogosa Sharpe: (g/lt)
Para el aislamiento y enumeracin de Lactobacillus

Peptona de casena 10 g
Extracto de carne 10 g
Extracto de Levadura 5g
D-glucosa 20 g
K2ETPO4 (Fosfato dipotsico) 2g
CH3COONa.3H20 (Acetato de sodio) 5g
Citrato diamnico 2g
MgSO4.7H20 0,2 g
MnSO4.4H20 0.05 g
Tween 80 1 ml.
Agar en polvo 18 g

Completar hasta 1 .Lt. con agua destilada y ajustar el pH a 5.5 6.5 con NaOH 1N HCL 2N.
Autoclavar a 110C por 10 minutos.
El pH bajo y la alta concentracin de Acetato de sodio, suprimen la flora contaminante.
El Tween 80 (Polisorbato 80, USP) es un agente activo de superficie que cuando se incluye
en un medio, disminuye la tensin interfacial alrededor de las bacterias suspendiden el medio,
permitiendo as una entrada ms rpida de los compuestos deseados dentro de la cii
bacteriana. Esto pede dar lugar a un crecimiento ms rpido o a otra actividad entre la
bacteria y los compuestos reactivos del medio.
2. Agar LAPTg (g/Lt)
Extracto de levadura 1%
Triptona 1%
Peptona de carne 1.5%
Glucosa 1%
Lactosa 2%
Tween80 0.1%
pH 6.06.5
Autoclavar a 3/4 atmsferas durante 15 minutos, El Medio LAPTg, puede ser utilizado para
el aislamiento de las bacterias lcticas asociadas a productos lacteos y tambien como medio
base para la diferenciacion bioqumica del gnero Lactococcus (En este caso, no debe
incluirse peptona de carne, glucosa ni lactosa). Como indicador usar prpura de bromocresol.
3. Medio M17 Segn TERZAGHI(Gnero Lactococcus) (g/Lt)
Peptona de harina de soya 5.0 g
Peptona de carne 2.5 g
Peptona de casena 2.5 g
Extracto de levadura 2.5 g
Extracto de carne 5.0 g
D-Lactosa 50 g
Acido ascrbico 0.5 g
3-glicerofosfato de sodio 19.0 g
Sulfato de magnesio 0.25 g
Agar agar 150g

pH65
Autoclavar en las mismas condiciones de los anteriores medios de cultivo.
Este medio es superior a otros medios de cultivo, es posible aislar mutantes que han perdido
la facultad de fermentar lactosa Mediante la adicion de f3glicerofosfato de sodio se aumenta
la capacidad tampn del medio. Este hecho favorece el crecimiento de Laciococcus y el
desarrollo de placas mayores de bacterifagos.

4. Medio Base para la Fermentacin de Carbohidratos (Gnero Lactobacillus):

(g/Lt)
Peptona de casena 10.0 g
Extracto de Levadura 5.0 g
K2HPO4 (Fosfato dipotsico) 2.0 g
CH3COONa.3H20 (Acetato de sodio) 50 g
Citrato diamomco 20 g
MgSO47H2O 02g
MflSO4.4H20 0.05 g
Tween 80 1 ml.
Agar en polvo 18.0 g
Rojo de clorofenol 0.05% (P/V)

Se puede utilizar como indicador, Prpura de Bromocresol (ver frmula de levaduras)

Completar hasta 1 Lt. con agua destilada y ajustar el pH a 6.5 con NaOH 1N pH 6.5
Fraccionar el medio base de acuerdo a las necesidades y agregar los carbohidratos a la
concentracin final de 1 a 2%.
Distribuir en tubos la cantidad de 1 ml.
Autoclavar a 110C por 10 minutos.

5. Caldo Gluconto de Potasio (g/Lt..)

Para la diferenciacin de bacterias lcticas heterofermentativas y homofermentativas
Peptona de came 1.0
Extracto de levadura 1.0
K2P04 1.0
Gluconato de potasio 40.0
Agua destilada 1000.0 ml

PH 7.0 Autoclavar a 121C por 15 minutos

Nota: Puede ser utilizado fosfato disdico si no se tiene fosfato dipotsico.
Solucin Vaspar (1:1)
Se agrega aproximadamente 10 gotas gruesas de Vaspar (se forma un tapn) en la superficie
del caldo Gluconato de Potasio cultivado. La incubacin se realiza en condiciones de
rnicroearofihia.
Nota: Utilizar una pipeta pasteur estril para la adicin de Vaspar.

6. Prueba de Voges-Proskauer
Esta prueba se basa en la conversin del acetilmetilcarbinol (acetona) en diacetilo por accin
del KOH y el oxgeno atmosfrico. El diacetilo se convierte en un complejo rojo por accin
cataltica del ce-naftol y la creatina.
La formacin de acetoina y butilenglicol constituye una va alternativa del metabolismo del
cido pirvico.
Medios y Reactivos
El medio ms comnmente utilizado es el caldo rojo de metilo-VogesProskauer (RMVP),
segn la frmuila de Clark y Lubs.

Caldo RM-PV
Polpeptona 7.0 g
Glucosa 5.Og
Fosfato di potsico 5.0 g
Agua destilada c.s.p. 1 litro
pH 6.9

Reactivos
1. a.-naftol (5%) 5.0 g.
Alcohol etilico absoluto 100 ml
2. Hidrxido de Potasio (40%) 40 gr.
Agua destilada c.s.p. 100ml

Tcnica
Inocular en un tubo conteniendo 1.5 ml de caldo MR VP, 0.1 ml de un cultivo puro de
clulas previamente lavadas y suspendidas en 2m1 de solucin salina estril, Incubar durante
24 horas a 30C. Al finalizar este periodo, aadir al cultvo 0.2 ml. de hidrxido de potasio
al 40% y 0.6 mi de cL-nafiol al 5%. Agitar el tubo cuidadosamente para exponer el medio al
oxgeno atmosfrico y dejarlo reposar de 10 a 15 mm.

Interpretacin
Una prueba positiva est indicada por la aparicin de un color rojo a los 15 minutos de aadir
los reactivos, revelando la presencia de diacetilo, producto de oxidacin de la acetoina La
prueba no debe leerse despus de 1 hora, ya que cultivos Voges Proskauer negativos
pueden producir un color cobrizo, con la consecuente posibilidad de una interpretacin
positiva.
Esquema simplificado de la formacin de glucosa para la va Butilenglicol

GLUCOSA

ACIDO PIRUVICO

Acetilmetilcarbinol (Acetona)

KOH+Aire

Butilenglicol Diacetilo

& Naftol +
Creatina

CIMPLEJO ROJO
(Prueba de Voges Proskauer Positiva)
 ELABORACIN DE YOGITRT y/o KEFIR CON CULTIVOS IMCIADORES
(Cultivos Lcticos Comerciales)

Muestras: leche fresca de establo o leche fresca pasteurizada.

Fermentos naturales, yogurt y/o kefir

Realizar la prueba de la Fosfatasa y la prueba de la

Reductasa para el control de calidad de leche

-Para preparar Yogurt:

Previa coloracin Gram, realizar diluciones seriadas de la
leche cruda y fermentos lcticos comerciales hasta l0 .De
las 2 ltimas diluciones sembrar por el mtodo de
diseminacin en Agar M17, agar LAPTg y Agar MRS o
Man Rogosa Sharpe pH 6.5 e incubar en condiciones de
microaerofihia por 72 horas.
Seleccionar las colonias tipo de bacterias lcticas:
(Bacilos o Cocos Gram Positivos y Catalasa negativos).
A partir de cultivos puros realizar pruebas de
diferenciacin bioqumica.
Depositar en un baln 3 litros de leche
fresca pasteurizada y calentada a 40C,
agregar 100ml, de leche descremada
conteniendo un cultivo activo de
Lactobacillus delbrueckn subsp. bulgaricus
y Streptococcus thermophilus, o un starter
lctico a 3%. Remover bien, e incubar a
40C por 6 horas, hasta obtener una cuajada.
Luego conservar el producto en
refrigeracin para su consumo.
-Para preparar Kefir:
A 1 litro de leche fresca previamente tratada
ra1 calor y enfriada, inocular 100 gr. de una
macrocolonia de grnulos de Kefir. Dejar en
reposo por 24 a 48 horas a temperatura de
ambiente. Separar los grnulos utilizando
un filtro.- El filtrado distribuir en frascos de
vidrio y dejar en reposo por 24 horas a
temperatura del ambiente.

Realizar la evaluacin microbiolgica, fsico qumica y organolptica

Previa realizacin de la prueba de la reductasa y fosfatasa, hervir la leche fresca o calentar a
45C la leche pasteurizada. Cuando 2 litros de leche registren 40C, inocular l00 ml de cultivo
joven de yogurt conteniendo Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptocccus
thermophilus. o un starter al 2%.
Homogenizar completamente y distribuir en frascos medianos y estriles. Tapar bien los
recipientes y dejar en incubacin a 35 - 40C por 6 horas. Una vez cuajada la leche, guardar
en refrigeracin hasta su consumo.
Realizar un control fsico-qumico y microbiolgico al inicio y al final de la fermentacin
lctica, Sembrar las muestras en Caldo Man Rogosa Sharpe, LAPTg o Ml 7 e incubar a 30C
en microaerofihia durante 72 horas. Luego, resembrar por estra en placas Agar MRS e
incubar en condiciones de microaerofihia durante 72 horas a 30C. Seleccionar las colonias
en Caldo MRS, incubar por 24 horas, luego transferir 0.5 ml de un cultivo activo a un nuevo
medio MRS y mantener a 4C (cepario). Asimismo, realizar la coloracin Gram y la prueba
de la Catalasa para verificar la pureza
METODOLOGA DE ESTUDIO
Materiales por grupo de alumnos:
1 baln de 1 litro con 1000 ml de leche fresca o pasteurizada
2 balones de 2 litros con 2 litros de leche fresca o pasteurizada.
6 frascos medianos de boca ancha estriles
1 cultivo joven de yogurt
1 termmetro /
1 bagueta estril
1 batera Gram
1 tubo con Caldo Man Rogosa Sharpe (o Caldo LAPTg o Caldo M17.)
1 placa Agar MRS
1 campana de anaerobiosis
1 frasquito de penicilina con Agar Man Rogosa Sharpe y jugo de tomate pa.ra cepario.
1 frasco con agua oxigenada
1 frasco con azul de metileno
1 frasco con solucin de fenoltaleina al 2% (Solucion alcoholica)
1 frasco con NaOH 0 1 N
1 frasco con p-nitrofenil fosfato disdico
PRUEBA DE LA REDUCTASA

Muestra de leche

Distribuir 10 ml de leche en 3 tubos con tapa rosca.

Mantener los tubos con el contenido en un recipiente que contenga agua fra.

Aadir 1 ml de Sol. Azul de metileno a los 2 primeros tubos y 1 ml de agua

destilada al tercer tubo como control.

Llevar 2 tubos a tubos de agua hirviendo (uno que contenga leche + azul de
metileno y otro que contenga leche + azul de metileno y otro que contenga leche
+ agua destlada) durante 3 minutos, para destruir la accin reductora de la leche.
Mezclar invirtiendo los tubos dos veces.

Incubar los tres tubos en bao mara a 37C por 5:30 horas.
Invertir cada 30 minutos los tubos.
Hacer la lectura de acuerdo al cuadro descrito.
 PRUEBA DE IA FOSFATSA

Muestra original: Leche cruda y leche pasteurizada.

Control Control
Negativo Positivo

Distribuir 5 ml de leche en un tubo Distribuir 100ml de leche en un

de ensayo. Erlenmeyer.
Calentar a 90C por 1 minuto Calentar a 90C por 1 minuto
agitando con cuidado. Agitando con cuidado.

Enfriar rpidamente a temperatura

Enfriar rpidamente a temperatura de laboratorio.
de laboratorio Agregar 0.1 ml de leche cruda.

Distribuir en tres tubos con tapa rosca: al primer tubo 1 ml de leche procedente del
control negativo, en el segundo tubo 1 ml de leche del control positivo y en el tercer
tubo 1 ml de la muestra original.

Agregar 5 ml de reactivo a cada uno de los tubos.

Invertir varias veces
Colocar los tubos en bao mara a 36.6 por 2hr.36.6 por 2hr.
Prueba de Reductasa (Reduccin del azul de Metileno):

Fundamento:
La leche encierra numerosas enzimas naturales sensibles al calor y son: La aldehdo reductasa
o enzima Schardinger (temperatura letal 75C), la. peroxidasa (temperatura letal 75C
durante 5 minutos), la fosfatasa (temperatura letal 62C durante 30 minutos), la catalasa
(temperatura letal 70C por 30 minutos).
Adems, existen enzimas de origen microbiano, como la catalasa, citocromooxidasa y la
reductasa microbiana siendo la temperatura de reaccin 37C
El azul de metileno es un aceptor de hidrgeno y es reducido a su leucobase incolora; esto es
debido a que este colorante acta como un pigmento respiratorio cuando es agregado al
medio de cultivo. Ciertas diastasas elaboradas por los microorganismos, las deshidrogenasas,
producen la oxidacin intracelular del colorante debido a la liberacin de hidrgeno. La
decoloracin del colorante depende de .la densidad bacteriana que contiene la muestra de
leche en el examen.

Procedimiento:
1.- Distribuir 10 ml de leche en tres tubos con-tapa rosca y mantenerlos en agua fra, para
preservar la muestra.
2.- Agregar 1 ml de solucin alcohlica saturada de azul de metileno a los dos primeros tubos
y 1 ml de agua destilada al tercer tubo.
Uno de los tubos que contenga azul de metileno se lleva a bao de agua hirviendo por 3 para
destruir la accin reductora de la leche, a su vez este tuo es usado como control de intensidad
de color al inicio de la prueba, mientras que el tubo que contiene la leche ms agua destilada,
es usada como control al final de la prueba (reduccin final) la misma que es sometida a
calentamiento al igual que el primer tubo que contiene leche y azul de metileno.
El tercer tubo que contiene leche + azul de metileno es la muestra problema y no se lleva al
bao de agua hirviendo, es decir no se pasteuriza. Luego todos los tubos juntos son colocados
en bao mara a 37C por 5:30 horas.

Se recomienda invertir los tubos, en donde no se note indicios de reduccin cada media hora.
3.- la lectura se hace de acuerdo al cuadro:

Contaminacin de la leche Tiempo de coloracin

Muy fuerte 15 minutos o menos

Fuerte 1 hora o menos

Ligera 1 o 3 horas

Leche buena ms de 3 horas

Prueba de la fosfatasa alcalina de la leche:

Fundamento:
La fosfatasa alcalina es una enzima termolbil y tiene la. propiedad de separar los grupos
fosfatos de diversos compuestos orgnicos. Se fundamenta en el hecho de que todas las leches
crudas poseen una fosfatasa ( perteneciente al grupo de las fosfomonoesterasas) la cual se
destruye por la pasteurizacin ( 65C por 30 mm), Por consiguiente, suausencia en le leche
indica una adecuada pasteurizacin y por ende la destruccin de microorganismos patgenos.
Cuando se utiliza el p-nitrofenil fosfato disdico que es incoloro, el producto de la hidrlisis
producida por la accin de la fosfatasa (.p-nitrofenil) es de color amarillo brillante. En
condiciones de incubacin con solucin reactivo estrictamente tamponada, la muestra de
leche no adecuadamente pasteurizada se torna de color amarillo.

Procedimiento:
1 Colocar en un tubo de prueba 5 ml de leche cruda y calentar a 90C por 1 minuto agitando
cuidadosamente para inactivar la fosfatasa, luego enfriar rpidamente. Despus, trasladar 1
ml de leche procesada ms 5 ml de reactivo a un tubo con tapa rosca, invertir varias veces y
llevar a bao mara a 36.5C por 2 horas. La prueba de la
Fosfatasa en esta prueba ser negativa (sin color), cualquier color queaparezca es debido a la
contaminacin de los reactivos y es el control negativo.
2. Distribuir 100 ml de leche cruda en un Erlenrneyer, luego calentar a 90C por 1 minuto
seguido de un enfriamiento rpido a temperatura de laboratorio. Adicionarle 0.1% de leche
fresca cruda. La prueba de la fosfatasa en esta muestra ser positiva (color amarillo).
Seguidamente colocar en otro tubo con tapa rosca, 1 ml de leche frasca + 5 ml de reactivo,
luego invertir varias veces y llevar a bao mara a 36.5C por 2 horas.
3. En el tercer. tubo distribuir 1 ml de la muestra original + 5m1 de reactivo, llevar a bao
mara a 36.5C.
despus de 2 horas de incubacin, colocar los tubos a la luz del da e interpretar los resultados.
Si la muestra de la leche no presenta cambio de color o presenta slo color amarillo dbil (no
ms intenso que el tubo de control negativo), las muestras de leche habrn sido pasteurizadas
adecuadamente.
Si los tubos con muestras de leche presentan color amarillo, se debe repetir la prueba de
fosfatasa con las muestras pasteurizadas ( para excluir fosfatasa microbiana que es
considerablemente ms resistente que la fosfatasa alcalina de la leche).

Prueba de la acidimetra o control de la acidez por el mtodo de Dornic

Fundamento:
Es una de las pruebas ms usadas para comprobar el valor higinico y biolgico de la leches.
As la leche fresca recin ordeada es ligeramente cida (17 18D), debido a los fosfatos
cidos, aminocidos, CO2 y casena en solucin que esta contiene, pero cuando la acidez
aumenta se debe a la accin de los microorganismos lcticos. Generalmente las leches con
una acidez sobre 20 21 D no se utilizan para el consumo directo sino que son destinadas
a la produccin de subproductos, especialmente queso y mantequilla, debido al peligro de
que coagule al calentar o hervir. Una leche debajo de 15 D sobre 22 D se considera
impropia para el consumo directo y debe drsele otro destino.

Representa la cantidad o porcentaje de cido lctico contenido en la leche. Un grado Dornic

equivale a 10 miligramos de cido lctico en 100 ml de leche.

Procedimiento:
La determinacin se hace por volumetra usando la solucin alcalina Dornic ( NAOH N/9
0.1 N) de la sguiente manera:
Se coloca 10 ml de leche en un recipiente especial del acidmetro Dornic, o un beaker, y se
le agregan 5 gotas de fenoltalena (solucin alcohlica al 2%) y se titula luego con la solucin
alcalina, hasta la aparicin de una coloracin rsada persistente. Cada mililitro de lcali
gastado equivale a 10 grados Domic.
Cuando no se dispone de un acidmetro Dornic, se puede emplear cualquier pipeta graduada
de 1 ml. El resultado obtenido se multiplica luego por el factor 0.009 correspondiente al peso
molecular del cido lctico (90) para obtener la acidez referida a cido lctico.

a.) 1 cc. de sosa Domic corresponde a 1 gr. de cido lctico por litro de leche titulada.
b.) 1 gr. de cido lctico 10 Dornc.

Peso molecular del cido lctico:

90gr.---------------------------- 1000H20 ----------------------1N

X--------------------------------------------------------------------- 0.1 N
X = 9 gr. de cido lctico
Factor = 9gr. de cido lctico= 0.009
1000 ml.
FUENTE BIBLIOGRFICA: Laboratorio de Microbiologa Industrial y
Biotecnologa Alimentaria. UNMSM.

Editor:
Mag. Elena Luzgarda Quillama Polo

Diseo de la Portada: Jos Arturo Olrtegui Livia

Carlos Limaco

Colaboradores:
Dr. Abad Flores Paucarima
Bigo. Mario Alcarrz Curi
Bach. Ginger Gandolfo Navarro
Bach. Yuriana Huamn Romero
Bach. Luis Rosales Hurtado
Bach. Liz Cruz Pio
Bach. Daniel Estrella Torero
Bach. Luisa Arizmendiz Snchez

Copyright 2009
Laboratorio de Microbiologa Industrial y
Biotecnologa Alimentaria.
Facultad de Ciencias Biolgicas
UNMSM
Lima-Per

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