DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DEPARTAMENTO DE

INGENIERÍA DE SISTEMAS

TESIS PARA GRADO DE MAESTRÍA EN BIOLOGÍA COMPUTACIONAL

Universidad de los Andes

Explorando el efecto de la introducción de polímeros en comunidades microbianas

provenientes de suelos de manglares en el Caribe Colombiano: Un experimento con

microcosmos

FELIPE SIERRA ALFONSO

DIRECTOR

Diego Javier Jiménez, PhD

CO-DIRECTOR

Alejandro Reyes, PhD

BOGOTÁ, D.C

Mayo 2023

1
Resumen

Los suelos de bosques de manglar albergan diversidad microbiana clave para algunos

servicios ecosistémicos que prestan estos ambientes. Estos suelos se han convertido en

sumidero de diferentes tipos de desechos, incluyendo los microplásticos. El objetivo de este

estudio fue develar el impacto de la entrada de partículas de tereftalato de polietileno (PET)

y de polímeros vegetales en la diversidad microbiana de los suelos de bosque de manglar

en el caribe Colombiano. Para esto se llevó a cabo un experimento de microcosmos con los

siguientes tratamientos: 1) Suelo + PET; 2) Suelo + cascarilla de arroz (principalmente

lignocelulosa); 3) Suelo sin polímeros. Estos fueron incubados en presencia/ausencia de

agua de mar a 30 ºC durante 30 y 90 días. Los resultados de secuenciación del gen

ribosomal 16S y la región intergénica ITS2 mostraron que el factor más relevante en cuanto

a su efecto en la estructura de la comunidad microbiana fue el uso de lignocelulosa, seguido

por la presencia de agua de mar y el tiempo de incubación. En presencia de la cascarilla de

arroz se incrementó la abundancia relativa de Firmicutes y algunos taxones (e.g.,

Blastopirullela) explicaron los cambios en la diversidad; además se observó una disminución

de la riqueza de hongos debido a las condiciones impuestas después de 30 días. De

manera particular observamos que la presencia de las partículas de PET generan cambios

menores en la diversidad de los suelos (p 0,046). El análisis de los microorganismos menos

abundantes (biosfera rara) mostró que las especies que explican los cambios en la beta

diversidad fueron diferentes en comparación con todo el set de datos. Por otro lado, los

microcosmos con ausencia de agua de mar e incubados durante 90 días mostraron una

selección diferencial de especies de bacterias halófilas (e.g. Halobacillus), sugiriendo un

aumento de la concentración de sales debido a la pérdida de humedad del microcosmo.

Con estos resultados logramos identificar factores y taxones claves en la reestructuración

de la diversidad microbiana de los suelos de manglar a causa de perturbaciones externas

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relacionadas con el impacto antropogénico (e.g. contaminación con polímeros) y el cambio

climático (e.g. sequía) en estos ecosistemas.

Introducción

Los bosques de manglar son ecosistemas de gran valor ecológico y socioeconómico, ya

que proveen servicios tanto a la humanidad, como a especies tropicales marinas y

terrestres (Lin et al., 2019; Singh et al., 2010). Son considerados hotspots de biodiversidad

(Feller et al., 2010), tienen la capacidad de capturar altas cantidades de CO2, son claves

para la formación del suelo, los ciclos biogeoquímicos, pueden regular el clima y evitar la

erosión en zonas costeras (Balvanera et al., 2017). Además, un gran porcentaje de las

capturas mundiales de peces de consumo humano, dependen de estos ecosistemas (Feller

et al., 2010; Kathiresan, 2012). Junto a lo anterior, otro aspecto relevante de los manglares

es su amplio potencial biotecnológico, ya que la microbiota asociada a este ecosistema

puede servir de fuente para la bioprospección e identificación de moléculas con fines

farmacológicos (Feller et al., 2010) y otros productos de interés industrial (Saccá et al.,

2017). Cabe resaltar, que los microbiomas asociados a los vuelos de manglares son claves

para el sostenimiento de diversos servicios ecosistémicos: regulación, provisión, culturales y

de sostenimiento de los cuales dependen la economía y el estilo de vida de las

comunidades aledañas a estos manglares (Wagg et al., 2019).

Sin embargo, y a pesar de la importancia de estos bosques, hoy en día, son uno de

los ecosistemas más amenazados del planeta (Uribe, E et al., 2020). La UICN ha clasificado

estos ecosistemas en la categoría vulnerable a nivel mundial, esto en consecuencia a que el

44% del ecosistema ha desaparecido en los últimos 50 años debido a múltiples presiones

antropogénicas. (Aljahdali & Alhassan, 2020; Cregger et al., 2014; ELTurk et al., 2019; Giri

et al., 2011; Urrego et al., 2014). Aún así, existen algunos factores indirectos que pueden

generar degradación de este ecosistema, pero que son más difíciles de observar y evaluar

3
(Urrego et al., 2014). Uno de estos factores, es el efecto de potenciales contaminantes

como metales pesados (magnesio, cobre, zinc y plomo) (Wu et al., 2014), aguas residuales,

aceites (Yim & Tam, 1999) y microplásticos como: el polietileno tereftalato (PET),

polipropileno (PP), poliéster (PS), entre otros (Deng et al., 2021; Rhodes, 2018). Además, la

literatura ha evidenciado que los manglares almacenan y retienen estos contaminantes

(especialmente microplásticos), impidiendo su ingreso directo hacia el mar (Yan et al.,

2022). Los estudios realizados en este tema hasta la fecha, se han ocupado principalmente

en entender cómo los contaminantes pueden afectar macroorganismos de importancia

económica como los peces (Garcés-Ordóñez, Mejía-Esquivia, et al., 2020) y la ecología del

paisaje de estos bosques (Giri et al., 2011; Uribe, E et al., 2020). Sin embargo, poco se

sabe del impacto de los microplásticos en los microbiomas asociados al manglar. En

especial en suelos, se sabe que los microplásticos pueden afectar el ciclo del carbono

(Rillig, Leifheit, et al., 2021). En este sentido, la contaminación por microplásticos es una de

las más preocupantes, debido a su continua producción industrial y presencia en cuerpos de

agua, además de ser uno de los contaminantes que más se acumula en los suelos de los

ecosistemas de manglar (Garcés-Ordóñez et al., 2021). Algunos estudios de microbiomas

de suelo de manglar contaminados con microplásticos se han realizado en China, India y

Brasil señalando que los plásticos pueden afectar la riqueza y diversidad de los

microorganismos en estos ecosistemas (Ceccon et al., 2019; Chen et al., 2022; G.

Kantharajan et al., 2018).

En Colombia, la evaluación de la contaminación por microplásticos ha sido estudiada

previamente por Garcés-Ordóñez et al., 2019, 2021. Pero, aún no existen estudios previos

que busquen evaluar cómo la presencia de microplásticos puede afectar la diversidad y

estructura de comunidades microbianas (e.g. bacterias y hongos), asociadas a suelos de

manglar del caribe Colombiano. Además, según los informes dados en los planes de

manejo en Colombia, existen otras potenciales amenazas en nuestro contexto que no se

4
habían tenido en cuenta en ningún estudio previo, por ejemplo la entrada de residuos

agrícolas como la cascarilla de arroz. Ya que en algunas zonas del Caribe colombiano se

han talado coberturas de bosque de manglar y han sido reemplazadas con cultivos de arroz,

que al ser muy cercanas a los ecosistemas aledaños pueden generar una entrada (input)

constante en los mismos. La otra amenaza es la pérdida del equilibrio entre agua dulce y

salada que resulta en la pérdida de la presencia de agua en el corto plazo, que como

consecuencia llevan a la muerte de los manglares y la extrema desecación del suelo

(INVEMAR & CVS, 2009).

Por otro lado, las comunidades microbianas de bacterias y hongos presentan una

porción de su riqueza conocida como la biosfera rara (rare-biosphere), lo cual, se ha

definido como aquellas especies que están en muy baja abundancia en una comunidad,

pero que son residentes de la misma y no solo bacterias transitorias (Sogin et al., 2006). No

obstante, a pesar de su baja abundancia, investigaciones de los últimos años sugieren que

estas bacterias y hongos raros son más relevantes para las funcionalidades ecosistémicas

de lo anticipado (Caruso et al., 2016). Por un lado, son organismos con gran plasticidad ya

que crecen en condiciones de constantes cambios y que por ejemplo, responden a

perturbaciones. Además, (Sauret et al., 2014), diversas investigaciones han sugerido que la

biosfera rara funciona como un banco de semillas para acelerar la respuesta de las

comunidades microbianas a cambios ambientales (Lynch & Neufeld, 2015; Pester et al.,

2010). Pero, el estudiar estos organismos en los últimos años, ha representado constante

debate, ya que las delimitaciones de lo poco abundante se ha hecho de forma arbitraria al

tener como umbral las especies que están entre el umbral del 0.1% o el 0.01% y cada uno

puede dar una resolución diferente de la biosfera rara (Pascoal et al., 2021).

Debido a las problemáticas presentadas anteriormente, hace algunos años se creó

la iniciativa para microbiomas de manglar, conformada por científicos interesados en

comprender la biología microbiana de los manglares con miras en entender, proteger y

5
rehabilitar estos ecosistemas (Allard,S et al., 2020). Conectado con las prioridades de

investigación de esta iniciativa, el presente trabajo tiene como objetivo explorar los efectos,

a corto (30 días) y mediano plazo (90 días), de la entrada de polímeros sintéticos (PET) y

lignocelulosa (cascarilla de arroz) en la diversidad de los microbiomas de suelo de manglar

en presencia y ausencia de agua de mar. Para esto se llevó a cabo un experimento

controlado de microcosmos y se realizó la caracterización de la diversidad de bacterias y

hongos, mediante la secuenciación del gen ribosomal 16S y la región intergénica ITS2,

respectivamente. Con base en esto, identificamos los principales factores que podrían

desencadenar cambios en la diversidad microbiana abundante y rara para así, poder

discutir los posibles efectos funcionales en el ecosistema. Nuestra principal hipótesis es que

se encontraran cambios significativos en la biodiversidad de los tratamientos con plástico y

lignocelulosa, pero también, una diferencia significativa entre aquellos microcosmos con

agua en comparación con aquellos sin agua y entre los dos tiempos evaluados.

Metodología

Muestreo de suelo de manglar y agua de mar

Las muestras de suelo para el experimento fueron colectadas en la ciénaga de los Vasquez

en la península de Barú, en el caribe colombiano. Las muestras fueron recolectadas en 24

puntos en diferentes áreas del manglar (borde y zonas del interior del manglar). Cada uno

de estos puntos de muestreo fue georeferenciado (N 10° 15' 48.1'' W 0.75° 35' 29.8'') (Figura

1). En cada punto se tomaron muestras de 10 cm³ de suelo, con una profundidad de entre 5

a 10 cm. Junto con lo anterior, dos litros de agua de manglar fueron recolectados cerca de

los sitios de muestreo (ver figura 1). Una vez obtenidos el suelo y agua de mar, estos fueron

llevados al laboratorio (Universidad Tecnológica de Bolívar), donde el suelo se sometió a un

proceso de homogeneización en condiciones sépticas bajo una cabina de flujo (Figura 2). El

proceso de homogeneización consistió en tomar porciones de suelo de los 24 puntos

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muestreados, las cuales fueron mezcladas en una única bolsa, lo que permitió obtener una

sola muestra de suelo que al adicionarse a los microcosmos, permite que la porción de

suelo añadida al microcosmos tenga características de la biodiversidad del suelo en todas

las zonas muestreadas del bosque.

Figura 1. A) Mapa del área de estudio, B,C,D) muestreo de suelos en diferentes zonas del manglar de la

ciénaga de los Vasquez.

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Construcción de microcosmos y tratamientos

Para poder evaluar el efecto de las diferentes entradas de polímeros en las comunidades de

bacterias y hongos en los suelos de manglares de la ciénaga de los Vasquez, se desarrolló

un experimento basado en microcosmos, estos son reproducciones a pequeña escala que

pueden ser útiles para evaluar problemas globales aparentemente intratables como el

cambio climático y contaminaciones (Benton et al., 2007). Este experimento consistió en

tres tipos de microcosmos: 1) Suelo + PET 2) Suelo + Lignocelulosa y 3) Suelo sin adición

de ningún polímero (control). Adicionalmente, cada uno de estos tratamientos fue

subdividido en dos categorías, un grupo que se mantuvo igual y otro grupo al que se le

agregó agua de mar. Estos microcosmos fueron incubados en condiciones estáticas a 30°C

y se dividieron en dos grupos adicionales, uno se incubó durante 30 días (nombrado

short-term) y el otro por 90 días (nombrado long-term) (Ver figura 2). Cada tipo de

microcosmos se montó por cuadruplicado en frascos Erlenmeyer de 100 ml con 15 gr de

suelo combinados con 15 ml de agua de mar (en aquellos que contenían agua) y se

añadieron 1.5 gr (10% p/p) de partículas de PET o lignocelulosa dependiendo del

tratamiento, estos polímeros fueron previamente lavados con agua esteril y alcohol

isopropílico (al 70%), adicionalmente se sometieron a un secado en cámara de calor para

remover el exceso de agua. Adicionalmente, 4 muestras directas de suelo del manglar

fueron utilizadas como control y se usaron para extracción de ADN directo. El experimento

fué realizado entre los meses de junio y julio de 2021, y el montaje de los experimentos en

laboratorio se muestra en la Figura 2.

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Figura 2. Fotos de recolección y montaje. Aquí A) Homogeneización del suelo, B) microcosmos autoclavados
sin adicionar, C) Microcosmos control sin agua y con agua , D) Microcosmos de lignocelulosa sin agua y con
agua, E) Microcosmos con PET con agua y sin agua, F) Los 52 experimentos en incubadora a 30°.

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Figura 3. Imagen del experimento realizado para este estudio. En la izquierda se puede observar la
representación de las cuatro muestras obtenidas directamente del manglar y a partir de la bolsa con suelo
homogeneizado se crearon los microcosmos de Control, lignocelulosa y plástico, cada uno dividido en dos
secciones una con agua y las otras sin agua. Por último a la derecha se ve la división de los dos tiempos
evaluados en el estudio de 30 días (Corto plazo) y 90 días (Plazo medio).

Extracción de ADN y secuenciación (16S ARNr e ITS2)

Después de cada uno de los periodos de incubación, el suelo de los microcosmos fue

recuperado, posteriormente 0.25gr de cada suelo fue usado para la extracción de ADN

utilizando el kit Qiagen Power Soil DNA Extraction. Una vez obtenidas las muestras de

ADN, se realizaron PCRs de 35 ciclos con ciclos de denaturación a 95° por 45 segundos y

de anillamiento a 54° por un minuto y elongación a 72° por dos minutos. También se

realizaron electroforesis de todas las muestras con el fin de verificar la cantidad y calidad

del ADN extraído. Posterior a la verificación de las extracciones, se enviaron las muestras

para su secuenciación con la tecnología Illumina MiSeq paired-end de 2x250bp en

Macrogen (Corea). Allí, se realizó secuenciación de amplicones de 16S ARNr (V3

(Bakt_341F) & V4 (primers Bakt_805R)) para bacterias y el ITS en la región de ITS2 (ITS2

macrogen) para la identificación de comunidades fúngicas.

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Análisis bioinformáticos y estadísticos

Para realizar los análisis bioinformáticos de las secuencias se utilizó el software Qiime2

(Bolyen et al., 2019). Al obtener los archivos de secuenciación en formato fastq el primer

paso fué convertir y comprimir todos los fastq a formato .qza (qiime zipped artifact). Para

esto, se especificó el tipo de datos como: “PairedEnd SequencesWithQuality”, junto con ello,

se creó un manifest file en formato .csv para indicar la ubicación de los archivos crudos de

fastq y los nombres de los archivos de las lecturas forward y reverse. Una vez realizada la

importación, se realizó el denoising con el programa Dada2 (Callahan et al., 2016), allí se

removieron las lecturas de baja calidad y se removieron las secuencias quiméricas. Los

puntos de corte o “trimming” para la eliminación de ruido o “denoising” se determinaron con

el resumen de calidad del archivo importado. Una vez realizado el análisis de denoising, se

obtuvieron tres archivos, el primero son las tablas de ASVs (Amplicon sequence variants),

estas son tablas que dan un código según un 100% de identidad y muestran la abundancia

absoluta de esa ASV en cada muestra, con ello se obtuvieron las secuencias

representativas y un estadístico del porcentaje de lecturas obtenidas del filtrado de calidad

de Dada2. Por un lado, las tablas de ASVs fueron utilizadas para estimar todos los índices

de diversidad alfa de Shannon, Simpson y Chao1. La beta diversidad se estimó con el

plugin de Core Diversity Metrics que utiliza a su vez la tabla de ASVs para estimar tanto los

PCoAs de beta diversidad, como matrices de distancia, las cuales se usaron para el análisis

de Biplot el cual permite identificar las especies que mayor aportan a las diferencias entre

las comunidades. Por otro lado, las secuencias representativas fueron usadas para la

creación de árboles filogenéticos y para la asignación taxonómica, realizada con el plugin de

Sklearn utilizando las bases de datos de Silva y Unite, pre entrenadas para asignar

taxonómicamente bacterias y hongos respectivamente. Una vez obtenida la asignación

taxonómica, se integró esta información a la tabla de ASVs para poder realizar diferentes

análisis de composición de los tratamientos.

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Definición de la biosfera rara

Con el objetivo de evaluar los patrones de diversidad de la comunidad menos

abundante, se realizaron curvas de rarefacción que permitían identificar las bacterias con

mayor y menor aporte a la abundancia en la comunidad. Esta biosfera rara se caracteriza

por representar un alto porcentaje de la riqueza (es un alto número de especies) pero

corresponde a un bajo porcentaje de la abundancia.. Para bacterias y hongos, se filtraron

las tablas de ASVs dejando solamente aquellos individuos que estuviesen en un rango de

abundancia de entre 0,004% y 0,0001% de abundancia en al menos una muestra en

bacterias, y en hongos un rango de abundancia entre 0.2% y 0.004% de abundancia en al

menos una muestra. La razón para elegir estos rangos, es porque a pesar de representar

sólo un 28% de la abundancia relativa total, estas representan cerca de un 95% de la

riqueza de bacterias y aproximadamente un 74% de la riqueza de hongos.

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 Figura 4. A) Ilustración del orden realizado en el análisis bioinformático con Qiime2. B) Ilustración de cómo se

hicieron los cortes de la biosfera rara para bacterias.

Resultados

Resultados fisicoquímicos

En la obtención de las muestras del manglar se realizó un análisis fisicoquímico de los

manglares de la ciénaga de los Vasquez. Los resultados señalaron que el pH del suelo es

alcalino (8.54) y que tiene una alta concentración de materia orgánica (9343, mg/L) y

carbono orgánico (8204 mg/Kg), mientras que lo menos abundante en el suelo fueron los

nitritos (5,09 mg/Kg). Y, por otro lado, en el análisis del agua del manglar se identificó una

alta presencia de sulfatos (3020 mg/L) y cloruros (17350 mg/L).

Análisis de composición a nivel de phylum

Como resultado del análisis bioinformático, en total se obtuvieron 16.000 ASVs de bacterias

(16S ARNr) y 12.000 ASVs de hongos (ITS). De manera general, la entrada de

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lignocelulosa fue el factor más relevante para los cambios en la estructura taxonómica de

los suelos dentro de los microcosmos. En especial, grandes cambios fueron observados

después de 30 días de incubación con lignocelulosa en presencia de agua de mar (Figura

5). En este tratamiento, se observó un enriquecimiento de Firmicutes y una reducción de las

Proteobacterias. Por otro lado, no se observaron grandes cambios en la composición

taxonómica (a nivel de Phylum) entre los tratamientos control vs. los microcosmos que

contenían plásticos. Sin embargo, la presencia de agua de mar y el tiempo de incubación

fueron también factores que modificaron de alguna manera la composición taxonómica de

los suelos. Por otra parte y de manera particular, fue observado un incremento en la

abundancia relativa de los phylum halobacteria y firmicutes en los microcosmos control y

con plástico, sin agua de mar y después de la incubación por 90 días.

En contraste con las bacterias, la clasificación taxonómica de hongos no permite

desplegar más de siete phyla, y a diferencia de las bacterias la equidad de la proporción de

estos phyla es mucho más baja en comparación. Aunque ver patrones de cambio en los

tratamientos de control es difícil, se pueden apreciar algunos cambios en la equitatividad

taxonómica de los demás tratamientos. Por ejemplo, en los microcosmos con lignocelulosa

la abundancia del phylum Ascomycota es mucho mayor al resto, en la ausencia de agua, ya

que cuando hay presencia de agua en estos microcosmos la proporción de estas parece

disminuir en corto plazo pero aumenta en el mediano plazo. Este mismo patrón, fue

evidenciado en los tratamientos con plástico aunque en una menor abundancia.

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Figura 5. Bar plots de las abundancias relativas de los 10 phyla más abundantes en las comunidades de A)
Bacterias y B) Hongos. Cada barra señala la presencia relativa de un phylum en cada réplica. En la parte inferior
se puede ver a que tipo de tratamiento esta asociado la presencia de los phyla donde lo amarillo son las
muestras directas, los rojos representan los controles, los verdes los microcosmos de lignocelulosa y los azules
los microcosmos con microplásticos. Además se puede apreciar la división de microcosmos con agua (azul
relleno) y sin agua (azúl sin relleno) y por los microcosmos de corto plazo (gris con borde púrpura) y plazo medio
(gris claro).

Beta diversidad entre los tratamientos

En segundo lugar, los análisis de Beta diversidad permitieron corroborar los principales

patrones observados en los análisis de composición. A pesar de que para este estudio se

realizaron tres índices de beta diversidad (Bray Curtis, Weighted and Unweighted Unifrac),

en este documento solo se usarán los análisis de Bray curtis ya que todos los índices

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mostraron los mismos patrones de la biodiversidad. Uno de los principales hallazgos

observados de todos los tratamientos, es que la lignocelulosa es el principal factor de

cambio de la estructura de las comunidades de bacterias y hongos. De la misma manera,

un segundo factor de cambio en la estructura de las comunidades es la presencia o

ausencia de agua, lo que se ve reflejado en todos los tratamientos, como se observa en el

eje 2. No obstante, al realizar los test estadísticos de Kruskall Wallis, se observó que los

tratamientos de control y con presencia de microplásticos, a pesar de estar bastante

próximos en los PCoA plots, son significativamente diferentes con un punto de corte de p

0,05 en el test.

Por otro lado, se incluyeron análisis adicionales que permitieran la comparación de

los microcosmos control con cada uno de los polímeros por separado e incluyendo la

muestra del microbioma del manglar recolectada directamente en el sitio de muestreo. Con

estas gráficas podemos corroborar que uno de los factores que más separan los

tratamientos es la presencia o ausencia de agua de mar, mientras que la segunda, es el

tiempo de incubación de los microcosmos. Estos patrones fueron muy similares cuando

analizamos también la biosfera rara. Es decir, la beta diversidad no arroja diferencias

significativas de cómo se agrupan los tratamientos con los datos completos y los de bajas

abundancias.

Figura 6. Análisis de beta diversidad por Bray curtis, en los PCoAs se observa que cada punto hace referencia a
uno de los microcosmos, los rojos son controles, los azules son los microcosmos con PET y los verdes son los

16
de lignocelulosa, los puntos naranja representan la beta diversidad directa del suelo donde se recolectaron las
muestras. A) PcoA de comunidades bacterianas de Bray Curtis generado con los datos completos, B) PCoA
Bray curtis de comunidades fúngicas generado con los datos completos.

Alpha Diversidad (PET vs. Control)

Los resultados del índice de Shannon mostraron que la Alfa diversidad no presentó cambios

estadísticamente significativos (Figura 7A). Así mismo, se observaron patrones similares

con los índices de Simpson y Chao. Aún así, un patrón observable es que hay una mayor

diversidad de bacterias que de hongos, ya que el índice de Shannon para bacterias está

entre 7,5 y 10, mientras que las comunidades de hongos están entre valores de 5 y 8. En

general, la Alpha diversidad cambia poco, pero mantiene los mismos rangos de diversidad

aun con presencia o ausencia de agua y sin importar el tiempo transcurrido del experimento

con respecto a la muestra directa del manglar.

Alfa diversidad (Control vs. Lignocelulosa)

Para esta comparación, los datos nos muestran que no hay un cambio evidenciable en la

diversidad bacteriana a lo largo de los diferentes tratamientos, ni tampoco detectable por el

test estadístico (Figura 6B). Por el contrario, cuando observamos las comunidades de

hongos vemos algunos cambios drásticos. El primero, es que en los microcosmos sin agua

de mar y con lignocelulosa la diversidad (riqueza y equidad) baja a menos de 2,5 , pero

después de 90 días de incubación se estabiliza a 5,0. Por otro lado, en los microcosmos con

agua de mar, se ve que después de 30 días la variación aumenta pero termina decayendo

después de 90 días con valores entre 4,0 y 5,2. Esto nos indica que la presencia de

lignocelulosa y la ausencia de agua, son factores que disminuyen la diversidad de las

comunidades de hongos en corto plazo, pero, este cambio no es permanente ya que

después de tres meses, la diversidad se acercará a la diversidad de los demás

microcosmos. Por el contrario, la presencia de agua en las comunidades de hongos

presenta un efecto opuesto ya que decae gradualmente a lo largo del tiempo.

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18
Figura 7. Violín plots que señalan la alfa diversidad de índice de Shannon, como se observa, cada violín plots
tiene cuatro puntos internos que representan la distribución de los microcosmos por cuadruplicado. En naranja
se representan las muestras directas del manglar, en rojo se pueden observar los microcosmos de control, en
azúl aquellos que tenían PET y en verde aquellos con lignocelulosa. A) PET vs control & directos, B)
Lignocelulosa vs Control directos.

Análisis de biplot

Este análisis permite obtener la variación de las ASVs de este estudio y graficar cómo se

relacionan las mismas con cada cluster. En la Figura 9 se muestra cómo estas especies

están relacionadas con microcosmos particulares según su abundancia relativa. Se observó

un patrón de especies representativas muy similar para los tratamientos con plásticos y los

controles, en ellos están presentes en una alta abundancia tres ASVs de los géneros

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Hallobacillus y Hallomarina quienes están en mayor abundancia particularmente en los

tratamientos sin agua de mar después de 90 días de incubación de los microcosmos. Por

otro lado, en el tratamiento con lignocelulosa, se observa que un ASV (afiliado a la familia

Micromonosporaceae) y dos ASVs del género Blastopierulla son aquellos que explican las

diferencias con los demás tratamientos, en particular en los microcosmos sin agua de mar

en los cuales aumentan del corto al mediano plazo. Además, el género Streptomyces

aparece en mayor abundancia en los tratamientos de lignocelulosa en mediano plazo sin

agua de mar (Ver Figura 9.).

En las comunidades de hongos, el análisis de Biplot, permitió observar una menor

resolución taxonómica en comparación con las bacterias. Tanto los tratamientos control

como los de plásticos muestran que un ASV (asociado al Phylum Ascomycota) y un ASV de

la especie Sporormiella irregularis explican la beta diversidad de estos microcosmos.

Adicionalmente, se puede observar que la abundancia de estos dos taxones aumenta

considerablemente en los tratamientos de plástico sin agua.

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Figura 9. Bar plots que muestran la abundancia relativa acomulada de los taxones resultantes del test biplot con
todos los datos de las tablas. Cada color señala un taxón y su abundancia relativa en cada uno de los
microcosmos. Cada barra señala la presencia relativa de un phylum en cada réplica. En la parte inferior se
puede ver a que tipo de tratamiento esta asociado la presencia de los phyla donde lo amarillo son las muestras
directas, los rojos representan los controles, los verdes los microcosmos de lignocelulosa y los azules los

21
microcosmos con microplásticos. Además se puede apreciar la división de microcosmos con agua (azul relleno)
y sin agua (azúl sin relleno) y por los microcosmos de corto plazo (gris con borde púrpura) y plazo medio (gris
claro).

Análisis de biplot (biosfera rara)

Por último, los análisis previos de composición, Alfa y Beta diversidad no exhibieron

cambios drásticos entre el total de las especies y las presentes en la biosfera rara. Pero, al

realizar el análisis de Biplot para la biosfera rara, se encontró que las especies que explican

la beta diversidad en efecto son diferentes. En Bacterias aparece una nueva composición

que explica la beta diversidad, entre ellas AVS asociados a la familia

Thermomonosporacaeae, al género Blastopirullela y la especie Alcanivorax venustensis

fueron abundantes en los tratamientos con lignocelulosa.

Por otro lado, los tratamientos controles obtuvieron una alta abundancia del órden de

los Halobacteriales y varias especies del género de Halobacillus. De manera particular, un

ASV asociado al orden Ardenticatenales explicó la beta diversidad de los microcosmos con

plástico después de 90 días de incubación. En cuanto a las comunidades de hongos, dos

patrones previos de diversidad se observaron nuevamente. El primero, que la resolución de

taxonomía no fue muy alta y segundo, el mismo patrón de diversidad de ASVs para

tratamientos de control y plásticos, mientras que los tratamientos de lignocelulosa

concluyeron en una mayor diversidad de ASVs principalmente en los experimentos que no

contenían agua (Figura 10).

22
Figura 10. Bar plots que muestran la abundancia relativa acumulada de los taxones resultantes del test biplot
con los datos de la biosfera rara de A) Bacterias y B) Hongos. Cada color señala un taxón y su abundancia
relativa en cada uno de los microcosmos. Cada barra señala la presencia relativa de un phylum en cada réplica.
En la parte inferior se puede ver a que tipo de tratamiento esta asociado la presencia de los phyla donde lo
amarillo son las muestras directas, los rojos representan los controles, los verdes los microcosmos de
lignocelulosa y los azules los microcosmos con microplásticos. Además se puede apreciar la división de
microcosmos con agua (azul relleno) y sin agua (azúl sin relleno) y por los microcosmos de corto plazo (gris con
borde púrpura) y plazo medio (gris claro).

23
Discusión

La presencia de lignocelulosa afecta en gran medida la diversidad microbiana de los

suelos de manglares

La lignocelulosa demostró ser el mayor factor de cambio de la biodiversidad de las

comunidades de bacterias y hongos. Esto puede ser explicado por las diferentes

estabilidades moleculares entre los dos polímeros, por un lado, el PET se ha reconocido

como un polímero altamente resistente a la biodegradación (Webb et al., 2013), mientras

que la lignocelulosa es más asequible y más degradable que el PET (Cortes-Tolalpa et al.,

2016) y por eso se ven los cambios más significativos de la biodiversidad microbiana en

esos microcosmos. Por otro lado, esto puede indicar que se pueden producir cambios

fuertes en las funciones en suelo de los manglares por la entrada de lignocelulosa. Pocos

estudios han evaluado el efecto de lignocelulosa en estos suelos. Sin embargo, Paixão

et al., 2021, han creado cultivos de enriquecimiento con lignocelulosa y suelos de manglar,

identificando alrededor de dieciocho mil enzimas activas en carbohidratos (Cazymes) con

probable actividad en celulosa y hemicelulosa. Si bien, lo anterior refleja la capacidad de

degradación de lignocelulosa de estas bacterias, así mismo en las comunidades de hongos

de los suelos de manglar también se han encontrado taxones encargados de producir

enzimas degradadoras de lignina (Arfi et al., 2013) en particular el hongo Pestalotiopsis sp.

Un patrón significativo en este estudio, es que la Alfa diversidad de las comunidades de

hongos fué muy baja en los microcosmos con lignocelulosa, y el patrón fué diferente cuando

estaban en presencia de agua a cuando no la había. Esto nos sugiere que las especies

fúngicas que responden a la entrada de lignocelulosa en ausencia de agua tienden a

consumir en un corto plazo sus recursos de entrada de carbono debido a la alta presión

ambiental a la que se ven sometidas, esto podría generar la caída en la biodiversidad

(Cortes-Tolalpa et al., 2018). Por otro lado, en los microcosmos con agua nos percatamos

que el decrecimiento es gradual lo que sugiere que poco a poco con ayuda del agua las

24
únicas especies que permanecen son aquellas con actividad degradadora lignocelulolítica.

Y en cuanto a los taxones observados en los biplots (Blastopirullela,

Thermomonosporacaeae y Streptomyces) se encontró que los estudios de (Ramachandra

et al., 1987; Souza et al., 2014) demostraron la capacidad de degradar lignocelulosa de las

dos últimas, indicando que aún no se tienen indicios en literatura de degradación de

lignocelulosa por Blastopirellula. Esto, da evidencias de una potencial capacidad

degradadora de lignocelulosa presente en manglares del caribe Colombiano.

En particular es importante entender este potencial degradador no solo como una

forma que tienen los manglares de responder a este contaminante sino también como un

potencial biotecnológico para crear consorcios microbianos capaces de producir enzimas

halofílicas que puedan ser útiles en la generación de biocombustibles partir de la

degradación de lignocelulosa (Paixão et al., 2021).

El microplástico (PET) en el suelo del manglar: La entrada de estos contaminantes

conlleva a pequeños cambios en la diversidad a corto plazo

El evaluar el impacto de microplásticos en los manglares de Colombia es importante ya que

en otros estudios se ha identificado que pueden disminuir la biodiversidad microbiana de los

manglares (Yan et al., 2022; Zamprogno et al., 2021). En nuestro contexto particular

(Garcés-Ordóñez, Espinosa, et al., 2020) ha encontrado una alta concentración de

microplásticos en los suelos de ecosistemas marino costeros del caribe colombiano

principalmente por plásticos de empaques como el PET. El problema de los microplásticos

de PET requiere una evaluación funcional estricta, que permita comprobar una posible

biodegradación en los suelos de manglar. Los resultados estadísticos de este estudio

superan con una baja significancia el umbral del test de Kruskal Wallis (0.05) con un q-value

promedio de 0.046. Esto indica que aunque no existen unos grandes cambios en la

diversidad (comparado con los microcosmos control) la presencia de partículas de PET

25
modifica levemente la estructura microbiana de los suelos de manglar después de 90 días

de contacto con el polímero. Esto puede generar que la presencia de microplásticos en el

suelo puede tener implicaciones co-evolutivas teniendo un impacto directo en la estructura

del suelo, actividades enzimáticas y masa microbiana, su diversidad y función (Diego Javier

Jiménez et al., 2022)

Sería prudente en el futuro aproximarse a estudiar los efectos de microplásticos

como un problema “complejo”. Ya que: primero, los microplásticos son contaminantes que

difieren fuertemente de otros como los metales pesados y aceites al ser “partículas”, esto

ocasiona que, dependiendo de su estructura tridimensional o “forma” (partículas, perlas,

fibras, etc.), estas pueden afectar la agregación del suelo afectando su estabilidad a una

escala muy pequeña generando así una problemática ambiental bastante inusual, donde las

hipótesis apuntan a que mientras más disímiles sean estas partículas en un suelo, en

particular como las fibras, efectos más severos serán visibles, como por ejemplo mayor

producción de gases de efecto invernadero (Rillig & Lehmann, 2020); segundo:

dependiendo del polímero y su técnica de fabricación, estos tendrán diferentes aditivos

(químicos agregados a los plásticos) que al degradarse o separarse de estas partículas,

pueden ser altamente tóxicas. (Rillig, Kim, et al., 2021), y tercero: es bastante complejo

determinar procesos ecológicos cómo la sucesión ecológica, crecimiento y desarrollo de

diversas microorganismos que son afectados por diferentes tipos de microplásticos, que al

presentar diferentes aditivos pueden generar cambios en procesos ecosistémicos (Rillig &

Waldman, 2022).

Respecto a los tiempos de evaluación, se observaron cambios de las comunidades

microbianas en una ventana de tiempo de tres meses, pero, estudios sobre el efecto de

polímeros en suelos de (Carr et al., 2020) y (Lal et al., 2021) indican que ellos pueden

generar una grán multiplicidad de cambios a lo largo del tiempo, y que principalmente estos

cambios están determinados por el tipo de polímero, su forma y los aditivos que se hayan

26
utilizado en su fabricación. Esto destaca que el problema de los polímeros podría ser

cambiante es series de tiempo largas, en donde la tridimensionalidad de los contaminantes

puede cambiar y generar nuevas complicaciones (Rillig & Lehmann, 2020). Así mismo, este

último estudio permite entender porqué la biodiversidad de microcosmos con PET no varía

significativamente, esto puede deberse a su forma, ya que en el experimento se agregaron

partículas bastante similares a la conformación del suelo (perlas), y esto puede no afectar

mucho su estructura, algo que se espera varíe gradualmente al usar fibras de poliéster u

otros polímeros de telas.

En este estudio se encontró que la beta diversidad de los tratamientos con

microplásticos fueron claves numerosos ASVs del género Hallomarinas, de las cuales hasta

ahora no se han reportado estudios o proteínas en bases de datos que indiquen una

capacidad de degradación de microplásticos de algún tipo.

Es importante resaltar que en este estudio no se evaluó el proceso de

transformación del PET, pero es un paso importante en futuros trabajos para poder develar

una transformación de los microplásticos en diferentes series de tiempo.

La ausencia de agua y la salinidad son factores externos claves en la diversidad

microbiana de los suelos de manglares

Aunque comprender el efecto de la presencia de diferentes polímeros fue el principal

objetivo de este estudio, los resultados mostraron que la presencia de agua de mar junto

con el tiempo de incubación son factores muy relevantes en la modulación de la

biodiversidad de los suelos de manglar. Estos resultados concuerdan con la hipótesis inicial,

en donde el agua tendría un efecto importante sobre la diversidad del suelo, y esto se ve

reflejado en beta diversidad, donde los tratamientos con agua se segmentan siempre aparte

de aquellos que no lo tenían, en algunos casos siendo mucho más diferentes. Esto se

puede deber a que el agua juega con otros factores importantes presentes en los

27
ecosistemas de manglares, por ejemplo (Alongi, 2005) afirma que el agua genera una red

compleja y transversal para el sostenimiento de la biodiversidad de los manglares. Por otro

lado, el agua lleva consigo una gran cantidad de nutrientes por todo el bosque y permite

mantener el equilibrio químico del suelo, donde las interacciones entre microorganismos se

ven altamente beneficiadas. Aún así, esta es una variable compleja, ya que se tiene el flujo

constante de dos tipos de agua (salada y dulce) y un factor adicional, como lo son las

mareas. Adicionalmente, se ha comprobado que la falta de agua sobre todo en las

temporadas de sequía, aumenta la salinidad en los suelos que en caso de ser demasiado

prolongadas puede generar una pérdida del balance ecológico generando zonas donde el

manglar muere, el suelo se deseca y se fragmenta (INVEMAR & CVS, 2009). Este último,

es un efecto concordante con lo observado en este estudio, ya que se observó con los

Biplot que los principales taxones en el mediano plazo del experimento eran Halobacterias,

características de ambientes con altas concentraciones de sal (Cortes-Tolalpa et al., 2018).

En el presente estudio, también se observó que la ausencia de agua afectó más riqueza y

equitatividad de los hongos generando que estos bajaran su biodiversidad, especialmente

en aquellos tratamientos que contenían lignocelulosa. Esta pérdida de biodiversidad de

hongos, puede estar relacionada a la pŕesencia del aporte de lignocelulosa sumado a la

ausencia de agua, aún así, sus consecuencias pueden ser un tanto más preocupantes ya

que en el estudio de Zuo y colaboradores en 2002 se identificó que las comunidades de

hongos en los suelos de manglares eran bastante resistentes a variaciones espacio

temporales (Zuo et al., 2022), lo que indica que la lignocelulosa y la ausencia de agua es un

potencial factor de pérdida de biodiversidad de hongos en los manglares de Colombia.

La desecación no deja de ser un problema complejo pero interesante, ya que a

pesar de que en este estudio se encontró que la ausencia de agua altera grandemente las

comunidades microbianas en especial las de hongos, pero el estudio de (Tavares et al.,

2021) se realizaron esfuerzos para caracterizar la biodiversidad de manglares en zonas

28
áridas de Brasil y se comparó con otros manglares en zonas geográficas más húmedas.

Curiosamente se encontró que los manglares áridos tienen una riqueza y equidad mucho

más alta en comparación con las zonas más húmedas. Esto sugiere que en estos

manglares pueden contener estrategias únicas de resistencia al cambio climático asociado

a la complejidad de la biodiversidad del suelo de estos manglares. Aún así, al ser un

contexto biogeográfico diferente, la respuesta a presiones ambientales fuertes puede ser

diferente en los manglares del caribe Colombiano. Igualmente hay que tener en cuenta que

los datos obtenidos en nuestro estudio provienen de microcosmos controlados, mientras

que los resultados de este estudio (tavares et al 2021) provienen de análisis de microbioma

in situ en donde podrían existir otros factores asociados a estos cambios de diversidad.

La biosfera rara en los microbiomas de los manglares: porque estudiarla y que nos

dice este estudio

De la biosfera rara se han realizado otros estudios en suelos de manglares. Por un lado el

estudio de (Wang et al., 2022) encontró que la biosfera rara de los suelos de manglar de

China se comportaron de forma diferente a la diversidad más común, para ello utilizaron una

biosfera rara de 0.01% a 0.001%, la cual es una proporción un poco mayor a la empleada

en este estudio, mientras que el estudio de (Liu et al., 2017) encontraron que la biosfera

rara respondía similarmente a la invasión de una especie vegetal foránea. Esto nos indica

que la biosfera rara particular de este estudio puede que no haya variado en su respuesta a

los polímeros dado que a pesar de que obtuvieron solamente especies en abundancias muy

bajas, estos taxones comprendidas aproximadamente un 75% de la riqueza total del suelo,

por lo cual se puede afirmar que el suelo de los manglares se compone en su mayoría de

biosfera rara, lo cual se ve reflejado principalmente en los análisis de beta diversidad. Aún

así, evaluando qué otros contextos si presentan cambios en la biosfera rara nos sugiere que

estos taxones raros pueden ser contexto dependiente (estacionalidades, sequías, pérdidas

29
de cobertura, contaminantes únicos, etc.) sin mencionar la estacionalidad de los manglares

tropicales, donde las temporadas de lluvias y sequías pueden perfilar según el momento del

año las respuestas de los taxones más comunes en los suelos de los manglares.

Por otra parte, con la biosfera rara se logró identificar que las presiones a las que se

sometieron los microcosmos pueden afectar de la misma forma a los taxones abundantes y

raros. Pero, se denota que la composición es diferente para explicar las beta diversidades,

por ello, sería importante aislar y evaluar las potenciales funcionalidades de estos taxones

para así realizar un mapa de cómo ocurre la sucesión de suelos en eventos de

contaminación por diferentes polímeros (Bittleston et al., 2021). Con esta información se

podría estimar qué tan resistente es una comunidad a diferentes perturbaciones

ambientales o antropogénicas, y también, se podría inferir el estadío sucesional del suelo

para delimitar a través de la funcionalidad. Es importante resaltar que en este trabajo no se

filtró la biosfera rara con ningún corte usado por otro autor. Aquí, se realizó una extracción

observando las curvas de rango abundancia y que tantas muestras habían en rangos de

abundancia relativa para así estimar los puntos de corte en las comunidades. Es importante

señalar que estimar un umbral de abundancia para todas las biosferas raras es un reto y tal

vez un punto de corte sirve para algunas comunidades y para otras no, por lo cual la mejor

guía es revisar qué dicen los datos sobre quienes son los más abundantes y quienes

pueden ser ruido en el proceso de selección.

Perspectivas

Como perspectivas futuras de este trabajo, sería de gran importancia evaluar como otros

polímeros contaminantes de diferentes orígenes y formas pueden afectar las comunidades

microbianas de manglar en intervalos de tiempo más largos. Además, es recomendable que

estos experimentos se realicen de forma controlada e in situ en el suelo del manglar. Por

otro lado, para tratar de develar qué microorganismo del suelo de manglar tiene la

capacidad para transformar plásticos, sugerimos la construcción de consorcios microbianos

30
a partir de estas muestras mediante técnicas de enriquecimiento. Además, para evaluar el

potencial funcional de las comunidades se recomendaría realizar una secuenciación por

shotgun que permita obtener metagenomas a partir de los cuales se generen MAGs

“Metagenome assembly genomes” e inferir funciones particulares de las comunidades

presentes en los diferentes microcosmos. Esto, en conjunto con análisis

metatranscriptomicos nos daría una idea de los microorganismos metabólicamente activos.

Finalmente, este estudio puede ser propuesto como un paso importante en la

evaluación de la restauración y conservación de los ecosistemas de manglar en Colombia

dada la relevancia de la biodiversidad de las comunidades microbianas de los suelos de

estos bosques.

Conclusiones

Este estudio reveló que el suelo de un manglar en el caribe si cambia por la contaminación

por lignocelulosa y microplásticos. Definitivamente la presencia de agua en la riqueza,

equidad y composición tiene un efecto importante. Las comunidades del suelo no cambiaron

fuertemente a través del tiempo lo que permite que esta técnica funcione como un modelo in

vitro de estos ecosistemas donde se pueden estudiar otras posibles amenazas o riesgos

para la biodiversidad de los suelos de los manglares colombianos. En la conservación y

restauración de estos ecosistemas este trabajo recalca la importancia de evaluar el impacto

de polímeros en las comunidades microbianas del suelo y nos invita a investigar más sobre

el impacto de otros microplásticos, contaminantes exógenos, su impacto a mediano y largo

plazo, ya que comunidades microbianas ya que ellas son las encargadas del sostenimiento

de los servicios ecosistémicos y que al desconocer su biodiversidad se pueden poder

potenciales biotecnológicos y de biorremediación que potencien desde diferentes frentes el

cuidado de estos importantes ecosistemas. Este estudio muestra un enriquecimiento de

especies puntuales para los microcosmos de lignocelulosa y plástico, con las cuales se

31
pueden hacer estudios de bioprospección donde pueden cultivar, aislar y purificar las

enzimas encargadas de la degradación de estos contaminantes. Este estudio es importante

para Colombia, ya que estos ecosistemas a pesar de que están en peligro contienen una

biodiversidad grande y poco estudiada que se tiene que estudiar y comprender para así

trabajar y mantener estos ecosistemas.

Agradecimientos

Agradecemos a la profesora Carolina Rubiano de la Universidad Tecnológica de Bolívar por

su apoyo al proveer un laboratorio para realizar los experimentos en una época tan difícil

como lo fue la pandemia. Agradecemos a Alexander Rosado quien apoyó completamente la

secuenciación de amplicones utilizada en este proyecto la cual es el insumo primario de

nuestros análisis. Un especial agradecimiento a los servicios del departamento DSIT y

ExaCore de la Vicerrectoría de Investigación y Creación de la Universidad de Los Andes,

por servicios de computación de alto rendimiento. A la maestría en biología computacional y

a la financiación de Max Planck. Agradecemos al proyecto FAPA del profesor Diego

Jimenez que hizo posible las salidas de campo de esta investigación.

Agradezco a mi novia Angélica Pineda, mi principal bastión en la ejecución de este

proyecto, cuya compañía, moral y cariño me permitieron trabajar con gusto y emoción en el

proyecto que hoy presento. Agradezco sin quitar mérito, a mis profesores, Diego y

Alejandro, quienes me han apoyado en la vida académica como no creí que alguien me

fuera a apoyar (financiación, ejecución de proyectos, pedagogía y una buena dosis de

humor), a ellos por el haber valorado este trabajo y el profesional que quiero ser, les doy

infinitas gracias y me llevo un grato recuerdo mezclado con mucho respeto de quienes

fueron mis mentores en la universidad. Agradezco inmensamente a los integrantes y amigos

del grupo BCEM quienes han sido compañeros de trabajo e incansables maestros, quienes

con respeto y humildad me ayudaron en todo este camino, que con emoción me ayudaron a

32
recorrer. A mis compañeros de la maestría y el I118 quienes con risas y alegría fueron una

gran sorpresa a lo largo de este proceso. A mis padres, sin cuya ayuda este camino no se

habría siquiera podido comenzar, este es el resultado de una semilla inicial que ellos

plantaron con amor. ¡A todos ellos, muchas gracias!

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