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NTE INEN 0020 (1973) (Spanish): Leche.

Determinación de bacterias activas
 CDU: 637.1:351.773.137.127 AL 03.01-310

Norma Técnica LECHE. DETERMINACIÓN DE BACTERIAS ACTIVAS INEN 20

Ecuatoriana
1973-06

1. OBJETO
Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN – Casilla 17-01-3999 – Baquerizo Moreno E8-29 y Almagro – Quito-Ecuador – Prohibida la reproducción

1.1 Esta norma tiene por objeto establecer el método para determinar el número de
bacterias activas en la leche.

2. ALCANCE

2.1 Esta norma se aplica a los siguientes tipos de leche:

a) Leche fresca.
b) Leche pasteurizada o esterilizada.
c) Leche descremada o semidescremada.

3. TERMINOLOGÍA

3.1 Bacterias activas. Son las bacterias capaces de formar colonias cuando se promueve su
desarrollo un medio de cultivo adecuado.

3.2 Otros términos relacionados con esta norma están definidos en la norma INEN 3.

4. DISPOSICIONES GENERALES

4.1 Deberán cumplirse las disposiciones establecidas en la norma INEN 17.

5. RESUMEN

5.1 Se coloca la muestra de leche (diluida o no) en un medio sólido de cultivo, se la incuba
en condiciones adecuadas, y se cuenta el número de colonias producidas.

(Continúa)

-1-
NTE INEN 20 1973-06

6. INSTRUMENTAL

6.1 Cajas de Petri, de 10 cm de diámetro y 1 cm de altura; estériles.

6.2 Estufa de cultivo, con regulador de temperatura, ajustada a 38°± 1°C.

6.3 Autoclave,
3
6.4 Pipetas aforadas del cm ; estériles.

6.5 Frascos de vidrio, apropiados para efectuar las diluciones; estériles.

6.6 Aparato para recuento de colonias, provisto de un lente de tres aumentos y campo
iluminado desde abajo con luz blanca difusa.

6.7 Tubos de ensayo, estériles.

6.8 Baño María.

7. REACTIVOS

7.1 Extracto de carne, adecuado para análisis microbiológico.

7.2 Peptona, adecuada para análisis microbiológico.

7.3 Dextrosa, reactivo para análisis.

7.4 Agar, adecuado para análisis microbiológico.

7.5 Agua destilada.

7.6 Medio de cultivo. Mezclar en un recipiente adecuado, 3 g de extracto de carne, 5 g de peptona, 1

g de dextrosa, 15 g de agar y la cantidad suficiente de agua destilada para conseguir un volumen
3
de 1000 Cm . Calentar la mezcla a ebullición para disolver los ingredientes y luego verterla en
3
tubos de ensayo en cantidad aproximadamente igual a 12 cm por cada tubo. Tapar los tubos con
algodón y esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 120º C. El pH final debe estar comprendido
entre 6,8 y 7,0, caso contrario debe repetirse la preparación.

(Continua)

-2-
NTE INEN 20 1973-06

8. PREPARACION DE LA MUESTRA

8.1 Mezclar completamente la leche, sacudiendo el recipiente que la contiene por 25 veces
en un período de aproximadamente 12 segundos.

8.2 Preparar la muestra para ensayo diluyendo la leche en condiciones asépticas, con agua
destilada estéril en proporciones de 1/10, 1/100, 1/1000 y otras que se consideren
convenientes. Cada proporción debe conseguirse mediante diluciones sucesivas, (ver nota 1).

9. PROCEDIMIENTO

9.1 La determinación debe efectuarse por triplicado sobre la misma muestra preparada y
para cada grado de dilución.
3
9.2 En condiciones asépticas, transferir 1 cm de la muestra (diluida o sin diluir según
convenga) a la caja de Petri. (Puede usarse una sola pipeta para la misma muestra si las tres
cajas de Petri son tratadas inmediatamente una a continuación de otra).

9.3 Fundir en baño María el medio de cultivo contenido en un tubo de ensayo (ver 7.6),
enfriar hasta 45°C y, en condiciones asépticas, v erterlo en la caja de Petri. El tiempo transcurrido
entre la dilución y esta operación no debe exceder de 15 minutos.

9.4 Inmediatamente mezclar bien el contenido de la caja de Petri, agitándola adecuadamente.

9.5 Luego de solidificar el medio de cultivo en la caja de Petri, invertirla, colocarla en la estufa de
cultivo e incubar durante 48 h a 38º ± 1°C.

9.6 Con ayuda del contador de colonias, examinar las cajas de Petri (correspondientes a las
diferentes diluciones), sin tener en cuenta aquellas que presenten más de 300 ó menos de 30
colonias. Si varios cultivos correspondientes a diferentes diluciones caen dentro de tal intervalo,
deberán seleccionarse aquellos que den un mayor contaje o cumplan con lo establecido en 11.
1.

____________________________

NOTA 1. Una dilución en proporción 1/100 significa un volumen de leche diluido con 99 volúmenes de
agua.

(Continua)
-3-
NTE INEN 20 1973-06

10. CALCULOS

10.1 El número de bacterias activas en la leche se calcula mediante la ecuación siguiente:

C = (n) (f)

Siendo:
3
C = número de bacterias activas, en bacterias/cm .
n = número de colonias contadas en el cultivo.
f = factor de dilución de la muestra, (inverso de la proporción de dilución).

10.2 En A.1 se indica un ejemplo de cálculo.

11. ERRORES DE METODO

11.1 La diferencia entre los resultados extremos de la determinación efectuada por triplicado
no debe exceder del 10% de la media aritmética de los tres resultados, en caso contrario debe
repetirse la determinación.

12. INFORME DE RESULTADOS

12.1 Como resultado final debe reportarse la media aritmética, aproximada a centenas, de
los tres resultados de la determinación.

12.2 En el informe de resultados debe indicarse el método usado y el resultado obtenido.

Debe mencionarse además cualquier condición no especificada en esta norma, o considerada
como opcional, así como cualquier circunstancia que pueda haber influido sobre el resultado.

12.3 Deben incluirse todos los detalles necesarios para la completa identificación de la
muestra.

(Continua)

-4-
NTE INEN 20 1973-06

ANEXO A

EJEMPLO DE CÁLCULO

A.1 Realizando tres ensayos sobre una muestra diluida en proporción 1/100 se han obtenido
los siguientes resultados:

n1 = 61
n2 = 58
n3 = 63

A.2 El factor de dilución de una muestra diluida en proporción 1/100 es:

-1
f = (1/100) = 100

A.3 El número de bacterias activas correspondientes a cada caso es:

C1 = n1f = 61 x 100 = 6 100 bacterias/cm³.

C2 = n2f = 58 x 100 = 5 800 bacterias/cm³
C3 = n3f = 63 x 100 = 6 300 bacterias/cm³.

C1 + C 2 + C 3 18200
C= = = 6066
3 3

A.4 La diferencia entre los resultados extremos de la determinación es:

R = 6300 – 5800 = 500

A.5 Puesto que R es menor que 607 (10% de la media aritmética), la determinación es válida y debe
reportarse la media aritmética aproximada a centenas como resultado final, por lo tanto:

3
C = 6 100 bacterias/cm .

(Continua)
-5-
NTE INEN 20 1973-06

APENDICE Z

Z. 1 NORMAS A CONSULTAR

INEN 3 L eche y productos lácteos. Definiciones.

INEN 17 Leche y productos lácteos. Examen microbiológico. Disposiciones generales.

Z.2 NORMAS PUBLICADAS SOBRE EL TEMA

INEN 3 Leche y productos lácteos. Definiciones.

INEN 4 Leche y productos lácteos. Muestreo
INEN 9 Leche fresca. Requisitos
INEN 10 Leche pasteurizada. Requisitos.
INEN 11 Leche. Determinación de la densidad relativa.
INEN 12 Leche. Determinación del contenido de grasa.
INEN 13 Leche. Determinación de acidez titulable.
INEN 14 Leche. Determinación de sólidos totales y cenizas
INEN 15 Leche. Determinación del punto de congelación.
INEN 16 Leche. Determinación de proteínas
INEN 17 Leche y productos lácteos. Examen microbiológico. Disposiciones generales
INEN 18 Leche. Ensayo de reductasas
INEN 19 Leche pasteurizada. Ensayo de fosfatasa
INEN 20 Leche. Determinación de bacterias activas.
INEN 21 Leche pasteurizada. Contaje de bacterias coliformes
INEN 91 Leche. Determinación del índice refractométrico

Z.3 BASES DE ESTUDIO

Norma Argentina IRAM 14056. Leche. Métodos de determinación de los números de bacterias
activas y totales, Instituto Argentino de Racionalización de Materiales, Buenos Aires, 1969.

Norma Británica BS 4285. Methods of microbiological examination for dairy purposes. British
Standards Institution, London, 1968.

-6-
 
INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA

Documento: TITULO: LECHE. DETERMINACIÓN DE BACTERIAS Código:

NTE INEN 20 ACTIVAS. AL 03.01-310

ORIGINAL: REVISIÓN:
Fecha de iniciación del estudio: Fecha de aprobación anterior por Consejo Directivo
Oficialización con el Carácter de Obligatoria
por Acuerdo No. de
publicado en el Registro Oficial No. de

Fecha de iniciación del estudio:

Fechas de consulta pública: de 1972-10-13 a 1972-11-15

Subcomité Técnico: CT 7:2* Leche y productos lácteos

Fecha de iniciación: Fecha de aprobación: 1971-07-19
Integrantes del Subcomité Técnico: CT 7:2

NOMBRES: INSTITUCIÓN REPRESENTADA:

Sr. Manuel Tobar Zaldumbide HERTOB, PROMISA, EL ANGEL

Dr. Alberto Proaño MINISTERIO DE LA PRODUCCION
Ing. Nicolás Guillén, MINISTERIO DE LA PRODUCCION
Dr. Germán Fierro y PASTEURIZADORA QUITO, ILESA, SUPER DE
Dr. Sergio Coellar GUAYAQUIL E INDUSTRIA LECHERA
CARCHI
Ing. Carlos Molina CAMARA DE AGRICULTURA DE LA 1ra. Zona
Ing. Jaime Flores González CAMARA DE AGRICULTURA DE LA 1ra. Zona
Sr. Luis González y PRODUCTOS LACTEOS GONZALEZ
Dr. Hernan Avila Orejuela PRODUCTOS LACTEOS GONZALEZ
Dr. Nelson Valle P. INSTITUTO NACIONAL DE NUTRICION
Dr. Gustavo Guerra INSTITUTO NACIONAL DE NUTRICION
Dr. Jorge Donoso DIRECCIÓN DE HIGIENE MUNICIPAL
Sr. Carlos Pazmiño Gallo INDUSTRIA LECHERA CAP
Ing. Federico Schaerer FAO
Ing. Ejvind Christensen FAO
Sr. José E. Muñoz COLEGIO DE QUÍMICOS DE PICHINCHA
Sr. Pablo Lozada INSTITUTO DE COMERCIO EXTERIOR E
Ing. José Arellano INTEGRACIÓN.
Dra. Leonor Orozco CENTRO DE DESARROLLO CENDES
INEN

Otros trámites: 4 Esta norma sin ningún cambio en su contenido fue DESREGULARIZADA, pasando de
OBLIGATORIA a VOLUNTARIA, según Resolución de Consejo Directivo de 1998-01-08 y oficializada
mediante Acuerdo Ministerial No. 235 de 1998-05-04, publicado en el Registro Oficial No. 321 del 1998-05-20
El Consejo Directivo del INEN aprobó este proyecto de norma en sesión de 1973-08-15

Oficializada como: Obligatoria Por Acuerdo Ministerial No. 822 del 1973-10-25
Registro Oficial No. 437 del 1973-11-21
___________________________
*Actualmente (AL 03.01).
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