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NTE INEN 0021 (1985) (Spanish): Leche

pasteurizada. Contaje de bacterias
coliformes
 CDU 637.127.6 AL 03.01-311

Norma LECHE PASTEURIZADA INEN 21

Ecuatoriana CONTAJE DE BACTERIAS COLIFORMES Primera revisión

1. OBJETO

Esta norma establece un método para realizar el contaje de bacterias coliformes en la leche
Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN, Casilla 3999 - Ave. Colón 1663 – Quito-Ecuador – Prohibida la reproducción

1.1
pasteurizada y en los productos lácteos.

2. TERMINOLOGIA

2.1 Bacterias coliformes. Son basilos gram negativos, aerobios facultativos, no formadores de esporas que
fermentan la lactosa con producción de ácido y gas, y pertenecen comúnmente a los géneros Escherichia
Aerobacter, Klebsiella. Una fuente de estos organismos es el tracto intestinal de los animales de sangre
caliente.

3. DISPOSICIONES GENERALES

3.1 Deberán cumplirse las disposiciones establecidas en la norma INEN 17.

3.2 El contaje deberá realizarse por duplicado sobre la misma muestra preparada.

4. FUNDAMENTO

4.1 El método se basa en colocar la muestra de leche en un medio de cultivo sólido y

selectivo (agar-bilis-rojo-violeta), incubarla en condiciones adecuadas y estimar la cantidad
de bacterias coliformes en base al número de colonias rojas obscuras que se desarrollen.

5. INSTRUMENTAL

5.1 Estufa, con regulador de temperatura, ajustada a 32° ± 1°C.

3
5.2 Pipetas volumétricas de 2 cm .

3 3
5.3 Pipetas de 25 cm , con graduaciones de 0,1 cm

5.4 Cajas de Petri, de vidrio o plástico, de 10 cm de diámetro; estériles.

5.5 Aparato para recuento de colonias, provisto de un lente de tres aumentos y campo
iluminado con luz blanca difusa.

(Continúa)

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 INEN 21

5.6 Baño de agua, ajustado a 45° ± 1º C.

3
5.7 Matracas Erlenmeyer de 250 cm .

6. REACTIVOS

6.1 Medio de cultivo (agar-bilis-rojo-violeta). Mezclar los siguientes ingredientes:

Extracto de levadura 3g
Peptona 7g
Sales biliares 1,5 g
Lactosa 10,0g
Cloruro de sodio 5,0 g
Rojo neutro 0,03 g
Cristal violeta 0,002 g
Agar 15,0 g

Homogeneizar la mezcla y guardarla, protegida de la humedad, hasta el momento de su uso.

Todos los ingredientes deben ser adecuados para trabajo microbiológico. Podrá también
usarse medio de cultivo deshidratado preparado especialmente para este fin en forma comercial.

6.2 Agua destilado estéril.

6.3 Coloración de Gram según Hucker.

Solución A
Cristal violeta 2,0 g
Alcohol Etílico al 95% 20,0 cm3

Solución B

Oxalato de amonio monohidratado 0,2 g

Agua destilada 20,0 cm3

Mezclar en partes iguales la solución A con la solución B.

6.3.1 Solución de lugol (modificación de Gram’s).

Cristales de yodo 1,0 g

Yoduro de potasio 2,0 g
Agua destilada 300 cm3

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Disolver los cristales de yodo y el yoduro de potasio en el agua destilada

6.3.2 Colorantes de contraste.

Safranina 2,5 g
Alcohol etílico 95% 100 cm3

Disolver la safranina coloreada en 100 cm3 del acohol etílico al 95%. Tomar 10 cm3 de esta solución y
llevar a 100 cm3 con agua destilada.

6.4 Agar eosina azul de metileno (EMB) (Modificación de Levine).

Peptona 10,00 g
Lactosa 10,00 g
Fosfato dipotásico (K2HPO4) 2,00 g
Agar 15,00 g
Eosina Y 0,40 g
Azul de metileno 0,065 g
Agua destilada 1 litro

Disolver completamente los ingredientes en el litro de agua destilada, mediante ebullición, por dos minutos
máximo. Ajustar el pH a 7,1, colocar en recipientes apropiados y esterilizar en autoclave a 121°C por 15
minutos, el pH, después de esterilizado, será 7.1. Se produce decoloración del medio durante la
esterilización, la misma que se recupera al enfriarse.

7. PREPARACION DE LA MUESTRA

7.1 Mezclar completamente la leche o producto lácteo, agitando suavemente, varias veces, el recipiente
que la contiene, hasta que la muestra esté homogénea.

7.2 Si se forma grumos de crema, y estos no se dispersan, calentar la muestra en baño de agua, a una
temperatura entre 35°C. Mezclar cuidadosamente e incorporar cualquier partícula de crema adherida al
recipiente, y enfriar rápidamente a 18° ± 2°C.

7.3 Para la preparación de muestras de productos lácteos, específicos, ver INEN 4. Leche y productos
lácteos. Muestreo.

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8. PROCEDIMIENTO

8.1 Preparación del medio de cultivo. Pesar 4,15 g de medio de cultivo (ver 6.1) y pasarlo
3 3
a un matraz Erlenmeyer de 250 cm que contenga 100 cm de agua destilada estéril y fría.
Agitar cuidadosamente para suspender homogéneamente el polvo; dejar en reposo unos
pocos minutos; mezclar la suspensión íntimamente y ajustar el pH a 7,4. Calentar la
suspensión con agitación, hervirla durante 2 min para completar la disolución y enfriarla
inmediatamente hasta 45° ± 1ºC. Esta preparación debe realizarse poco antes de hacer la
inoculación, y el medio de cultivo preparado debe mantenerse a 45° ± 1ºC colocándolo en el
baño de agua (ajustado a tal temperatura) hasta el momento de su uso (ver 8.2).

3
8.2 Inoculación en las cajas de Petri. En condiciones asépticas, transferir 2 cm de muestra
3 3
a cada caja de Petri (ver 3.2). Añadir de 10 cm a.15 cm de medio de cultivo a 45° ± 1ºC
(ver 8.1) y, con movimientos circulares horizontales, mezclar cuidadosamente el medio de
cultivo con la muestra. Dejar solidificar dejando la caja de Petri en reposo durante 5 a 10 minutos sobre una
superficie horizontal. Inmediatamente, usando la misma pipeta con medio de cultivo, esparcir sobre la
3
superficie solidificada aproximada mente 4 cm de medio de cultivo a 45° ± 1ºC para formar una capa
delgada (que inhiba el desarrollo superficial de otros microorganismos) y dejarla enfriar hasta completa
solidificación.

8.3 Incubación de los cultivos. Incubar cultivos colocando las cajas de Petri en posición
invertida dentro de la estufa regulada a 32° ± 1ºC. y manteniéndolas allí durante 24h ± 2h (ver nota 1).

8.3.1 Puede ocurrir que algunas capas de microorganismos no coliformes (levaduras, hongos) puedan
producir colonias similares en color y tamaño parecidos a los coliformes, entonces se procederá a su
identificación morfológica y confirmativa, para lo cual se usará la prueba Coloración Gram de Hucker.

8.4. Prueba confirmativa

8.4.1 Transferir el inóculo con el asa de platino, al porta objeto y realizar un frotis, luego de secado y fijado
el frotis a la llama, hacer actuar la solución coloreada de cristal violeta amonio (ver 6.3) por un minuto.
Lavar el frotis con agua para evitar exceso de reactivo y hacer luego actuar la solución de lugol (ver 6.3.1).
Lavar con agua, secar, decolorar con alcohol etílico por 30 segundos, (o hasta que resulte incoloro) lavar
con agua, secar, poner el colorante de contraste (ver 6.3.2) durante 10 segundos, nuevamente lavar con
agua, secar y examinar.

8.4.2 Células decoloradas que admiten el colorante contraste son gram negativas. Células que no
decoloran pero retienen la solución cristal violeta-amonio son gram positivas.

_____________________________
NOTA 1. Es importante no prolongar la incubación por períodos superiores al especificado, porque ciertos
organismos pueden desarrollarse y perturbar el recuento

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8.5 Prueba complementaria.

8.5.1 Del medio positivo y con prueba confirmativa, transferir el cultivo a cajas de agar eosina azul de
metilo (EMB) (ver 6.4). Incubar a 37 ± 1°C por 48 horas, y observar la presencia de colonias nucleadas,
obscuras, con brillo verde metálico, será Escherichia coli, y las que presentan un centro gris marrón sin
brillo metálico será Enterobacter Aerógenes.

8.6 Recuento de las colonias. Ayudándose del aparato para recuento de colonias (ver 5.5), contar el
número de colonias de color rojo obscuro (ver nota 2 ) desarrolladas en cada cultivo.

9. CALCULOS

3
9.1 El número de bacterias coliformes por cm de muestra se calcula mediante la ecuación
siguiente:

C=n/2

siendo:
3
C = número de bacterias coliformes por cm .
n = número de colonias contadas en el cultivo.

10. ERRORES DE METODO

10.1 Si en el ensayo por duplicado, el contaje de por lo menos un cultivo, es igual o mayor a 15 colonias,
verificar que el contaje más alto no sea mayor que el doble del contaje más bajo; en caso contrario, repetir
la determinación.

11. INFORME DE RESULTADOS

11.1 Como resultado final debe reportarse la media aritmética de los dos resultados de la determinación,
3
aproximada a décimas y expresada como bacterias coliformes/cm .

11.2 Si los dos resultados de la determinación son iguales a cero, reportar el resultado como
3
negativo en cm o en 1 g.

________________

NOTA 2. Los coliformes, debido a su habilidad para fermentar la lactosa, forman colonias no superficiales de color rojo
obscuro circundadas generalmente por una zona rojiza de bilis precipitada, y con diámetros de aproximadamente 0,5 mm a 2
mesa.

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11.3 En el informe de resultados debe indicarse el método usado y el resultado obtenido.

Debe mencionarse además cualquier condición no especificada en esta norma, o considerada
como opcional, así como cualquier circunstancia que pueda haber influido sobre el
resultado.

11.4 Deben incluirse todos los detalles necesarios para la completa identificación de la
muestra.

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APENDICE Z

Z.1 NORMAS A CONSULTAR

INEN 17. Leche y productos lácteos. Examen microbiológico. Disposiciones generales.

Z.2 BASES DE ESTUDIO

Norma Británica BS 4285: 1968. Methods of microbiological examination of milk products. British Standards
Institution, Londres, 1970.

Dr. D.A.A. Mossel. Control microbiológico de los alimentos. Métodos recomendados. Coloración de gram (de
acuerdo a Hucker) Lima Perú, 1967.

Walter, W. Standard Methods for the Examination of Dairy Products. 12 th, Ed., pp.77, American Public
Health Association, Inc., New York, 1967.

Norma Hindú IS: 1479 (Parte III) 1962, Methods of test for dairy industry, Part III Bacteriological analysis of
milk. Indian Standards Institution, New Delhi, 1962.

Equipment, reagents, media routine test. Gram Stain Hucker.

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 INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA

Documento: TITULO: LECHE PASTEURIZADA. CONTAJE DE Código:

NTE INEN 21 BACTERIAS COLIFORMES. AL 03.01-311
Primera revisión
ORIGINAL: REVISIÓN:
Fecha de iniciación del estudio: Fecha de aprobación anterior por Consejo Directivo 1973-08-15
Oficialización con el Carácter de Obligatoria
por Acuerdo No. 821 de 1973-10-25
publicado en el Registro Oficial No. 437 de 1973-11-21

Fecha de iniciación del estudio:

Fechas de consulta pública: de a

Subcomité Técnico: AL 03.01 Leche y productos lácteos

Fecha de iniciación: Fecha de aprobación: 1984-01-12
Integrantes del Subcomité Técnico:

NOMBRES: INSTITUCIÓN REPRESENTADA:

Ing. Anibal Saltos UNIVERSIDAD TECNICA DE AMBATO

Dra. Yolanda de Fuentes INEDECA
Dr. Marco Morán INSTITUTO DE INVESTIGACIONES
NUTRICIONALES Y MEDICO SOCIALES-
MINISTERIO DE SALUD
Dra. Mónica Sosa de Galárraga IZQUIETA PEREZ- QUITO
Dra. Catherine de Escudero PASTEURIZADORA QUITO
Dr. Alberto Proaño MINISTERIO DE AGRICULTURA
Dra. Leonor Morales de Navas IZQUIETA PEREZ-GUAYAQUIL
Dra. Magdalena Báez de Birga MINISTERIO DE SALUD
Dra. Leonor Orozco INEN

Otros trámites: 4 Esta norma sin ningún cambio en su contenido fue DESREGULARIZADA, pasando de
OBLIGATORIA a VOLUNTARIA, según Resolución de Consejo Directivo de 1998-01-08 y oficializada
mediante Acuerdo Ministerial No. 235 de 1998-05-04, publicado en el Registro Oficial No. 321 del 1998-05-20
El Consejo Directivo del INEN aprobó este proyecto de norma en sesión de 1985-02-08

Oficializada como: Obligatoria Por Acuerdo Ministerial No. 346 del 1985-05-23
Registro Oficial No. 206 del 1985-06-13
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