UNIVERSIDAD NACIONAL

AGRARIA LA MOLINA

CURSO:

CULTIVOS DE CÉLULAs

Y TEJIDOS VEGETALES

Tema:

Principales diferencias en la
composición de medios para la
Clonación y regeneración de especies
herbáceas y leñosas

Profesora:

Dra. Antonietta Gutiérrez Rosati

Alumnos:

● Carazas Coronado, David Fernando

● Gonzales Medina, Ingrid

● Morón Guerra, Laura

● Zapata Chumbe, Isavo Maricielo

Fecha de entrega:

22 de Noviembre del 2022

 Índice

Introducción 3
Clonación 3
Regeneración 3
Leñosas vs. Herbáceas 4
Objetivo 4

Medios de cultivos para la regeneración de especies herbáceas 5

1. Murashige y Skoog (MS) 5
Descripción 5
2. B5 modificado por Dunstan y Short (BDS) 5
Descripción 5
3. BDS modificado (BABI) 6
Descripción 6
Aplicación 6
4. Composición Nutricional de MS, BDS y BABI 6

Medios de cultivos para la regeneración de especies leñosas 8

1. Woody Plant (WPM) 8
Descripción 8
2. Driver y Kuniyuki Walnut (DKW) 8
Descripción 8
3. MS modificado o 1/2 MS (MMS) 8
Descripción 8
4. Composición Nutricional de MMS, WPM y DKW 8
5. Aplicación 9

Medios de cultivos para la clonación y regeneración de especies herbáceas y leñosas

11
1. Gamborg B5 11
Descripción 11
Composición Nutricional 11
Aplicación 12

Conclusiones 13

Referencias bibliográficas 13
Introducción

El cultivo de tejidos vegetales es un método empleado en la biotecnología que utiliza

estrategias y técnicas in vitro para cultivar células vegetales vivas en condiciones
controladas (Gulzar et al. 2020). Plantas completas se pueden regenerar in vitro usando
tejidos, células o una sola célula, al cultivarlas en un medio nutritivo y estéril.

El éxito del cultivo de tejidos radica en la composición del medio de crecimiento, las
hormonas y las condiciones de cultivo como la temperatura, el pH, la luz y la humedad.
Asimismo, el medio de crecimiento es una composición de minerales y vitaminas esenciales
que son necesarios para el crecimiento y desarrollo de una planta; para ello, todo, incluido
el azúcar, que la planta necesita para prosperar, debe estar en condiciones estériles.
Además, éste puede ser de consistencia líquida o sólida (Cardoza, 2008), y su composición
también puede depender del tejido que se vaya a emplear.

Clonación

Es la producción de plantas genéticamente idénticas a través de métodos no sexuales. Se

propagan a partir de partes vegetativas como injertos de yemas, esquejes de tallos, bulbos,
tubérculos y estolones. Asimismo, La producción de plantas a través de la
micropropagación es un proceso de cuatro pasos: (1) cultivo de explantes, (2) proliferación
de brotes, (3) enraizamiento y (4) endurecimiento de la planta y transferencia al suelo
(Ahloowalia, 2003).

Regeneración

Se puede regenerar una planta completa a partir de un tejido u órgano adulto, una masa de
callos desorganizados o incluso una sola célula. La regeneración de plantas se refiere a la
renovación fisiológica, reparación o reemplazo de tejido en las plantas. Para ello, existen
dos vías de regeneración de plantas en cultivo de tejidos: La embriogénesis somática y
organogénesis de novo (Long et al. 2022).

a. Organogénesis: Es la formación de órganos, ya sean brotes o raíces, la cual

depende del balance de auxinas y citoquininas presentes en el medio. Para este
caso, existen dos vías:

i. O. Indirecta: Se da la formación de órganos a través de una fase de callo

(fase intermedia). La inducción de plantas mediante esta técnica no asegura
la fidelidad clonal, pero podría ser un sistema ideal para seleccionar variantes
somaclonales de los caracteres deseados y también para la multiplicación
masiva. La inducción de plantas a través de una fase de callo se ha utilizado
para la producción de plantas transgénicas en las que el callo se transforma
y las plantas se regeneran o el explante inicial se transforma y el callo y
luego los brotes se desarrollan a partir del explante.

ii. O Directa: Se da la producción de yemas o brotes directos a partir de un

tejido sin callo intermedio. Este tipo de práctica se usa para mejorar las tasas
de multiplicación, la producción de plantas transgénicas y la propagación
clonal (Cardoza, 2008).
 b. Embriogénesis somática: Es un proceso de desarrollo no sexual que produce un
embrión bipolar con un sistema vascular cerrado a partir de tejidos somáticos de una
planta. La embriogénesis somática puede ocurrir de manera directa o indirecta (fase
de callo). La embriogénesis somática indirecta a veces se usa en la selección de
variantes somaclonales deseadas y para la producción de plantas transgénicas. Una
ventaja de la embriogénesis somática es que los embriones somáticos pueden
germinar directamente en plantas viables sin organogénesis; por lo tanto, imita el
proceso de germinación natural (Cardoza, 2008).

Leñosas vs. Herbáceas

Las plantas leñosas presentan tallos duros donde sus paredes celulares están compuestas
por celulosa y lignina. Asimismo, algunos materiales son más fáciles de regenerar in vitro
que otros, pero en general, los tejidos juveniles responden mejor a las condiciones in vitro;
mientras que los tejidos de árboles maduros de la mayoría de las especies de árboles
forestales siguen siendo muy difíciles de propagar mediante tecnología in vitro.

Dado que el ciclo reproductivo de las plantas leñosas es muy largo y los factores que
influyen son complicados, toma mucho tiempo obtener resultados de estudios sobre
variaciones genéticas en árboles, por lo que existen muy pocos informes sobre variaciones
genéticas (Chen & Ahuja, 1993).

Se ha observado que, las especies leñosas, a menudo producían más raíces por brote, pero
éstas estaban subdesarrolladas, con una actividad limitada del cambium vascular
secundario, que se reanudó sólo después de un trasplante extra vitrum.

Por otro lado, las plantas herbáceas presentan tallos verdes, suaves y flexibles, pues las
paredes celulares de éstas están compuestas solamente de celulosa. Generalmente la
inducción de raíces en este caso es más fácil, a comparación del material leñoso (George et
al. s.f.). Además, se pueden utilizar para el almacenamiento de germoplasma y pueden
ayudar en el mantenimiento del stock en condiciones controladas.

Objetivo

- Realizar una revisión de los medios de cultivos utilizados para la clonación y

regeneración de plantas herbáceas y leñosas teniendo en cuenta su composición y
aplicación de las mismas.
Medios de cultivos para la regeneración de especies herbáceas

1. Murashige y Skoog (MS)

Descripción

El medio Murashige and Skoog (MS) fue formulado por Murashige y Skoog en 1962
para optimizar la producción de callos para el estudio de las citoquinas. Desde
entonces, es ampliamente utilizado para la micropropagación, cultivo de órganos,
cultivo de callos y cultivo en suspensión. La formulación es una mezcla de nutrientes
de sales inorgánicas, vitaminas y aminoácidos. Murashige y Skoog Medium (MS)
proporcionan todos los macroelementos y microelementos esenciales.

El dihidrógeno fosfato de potasio sirve como fuente de fosfato. Los microelementos

como el boro, el manganeso, el molibdeno, el cobre y el zinc juegan un papel vital en
el metabolismo de las plantas. El boro juega un papel clave en el metabolismo de los
carbohidratos. La tiamina, el ácido nicotínico, la piridoxina y el inositol actúan como
cofactores enzimáticos en vías universales que incluyen la glucólisis y el ciclo de
TCA junto con el metabolismo primario y secundario en las plantas. La glicina sirve
como fuente de aminoácidos.

El medio MS es apto para la mayoría de las especies, por lo que es de amplia

utilización, excepto para las más sensibles a la salinidad ya que se caracteriza por
tener una elevada concentración salina. En esos casos puede recurrirse a otros
medios o simplemente utilizarlo diluido como sería la utilización del medio MS/2.

La formulación de MS se optimizó para el cultivo de tejidos de tabaco, pero se usa

ampliamente ya que muchas otras especies de plantas crecen bien con este medio.

MS es ampliamente utilizado tanto para dicotiledóneas como para monocotiledóneas, y

es un buen medio para la regeneración vegetal, debido a los altos niveles de nitrógeno
presente en nitrato como en amonio. Sin embargo, a veces el medio MS no es el mejor
medio para un crecimiento óptimo, precisamente porque contiene altos niveles de iones
de amonio.

2. B5 modificado por Dunstan y Short (BDS)

Descripción

El medio basal BDS (Gamborg's B5 modificado por Dunstan y Short, 1977) se ha

utilizado con éxito para la regeneración de cebolla, ajo y, más recientemente, arroz.
Basándose en la literatura, Dunstan y Short (1977), encontraron que las
concentraciones de amonio y fosfato en la B5 eran subóptimas para la cebolla. Por
lo tanto, las modificaciones al B5 de Gamborg consistieron en amonio y fosfato
adicionales en forma de nitrato de amonio y fosfato de amonio.

Los medios BDS también contienen un nivel más alto de nitrato de potasio que la
MS, que es beneficioso para la regeneración de plantas como el algodón y la soja.
 Sin embargo, la concentración de MS de nitrato de amonio es mucho más alta que
BDS.

3. BDS modificado (BABI)

Descripción

BABI es una modificación del BDS en donde se le aumenta la concentración de

calcio presente en el medio, pasa de tener 150 mg/L a 440mg/L de CaCl2, igual que
en el medio MS. Este calcio agregado hace que en tenga un mejor rendimiento que
BDS durante la regeneración de las plantas (Phillips & Garda, 2019).

Aplicación
La investigación hecha por Greenway et al. (2012), hizo la comparación de 4 medios
de cultivo (MS, B5, BDS y BABI) en diferentes cultivos, arroz, maíz, soja, algodón,
cebolla, tabaco. Donde se aprecia que los medios basales BDS y BABI son
comparables a, y a menudo mejor que, los dos medios más utilizados (MS y B5)
para el crecimiento de callos, regeneración de plantas y micropropagación en la
mayoría de los sistemas de plantas probados (Greenway et al., 2012).

Tabla 1.
Resumen de regeneración vegetal, crecimiento de callos y micropropagación en los
medios de cultivo probados.

Tomado de (Greenway et al., 2012)

4. Composición Nutricional de MS, BDS y BABI

Tabla 2.
Nutrientes presentes en los medios de cultivo de MS, BDS y BABI.
Basal medium MS BDS BABI
Macronutrient components (mg L−1)
KNO3 1900 2500 2500
NH4NO3 1650 320 320
NH4H2PO4 - 230 230
 NaH2PO4·H2O - 150 150
(NH4)2SO4 - 134 134
MgSO4·7H2O 370 250 250
KH2PO4 170 - -
CaCl2·2H2O 440 150 440
Micronutrient components (mg L−1)
H3BO3 6.2 3 3
KI 0.83 0.75 0.75
MnSO4·H2O 16.9 10 10
ZnSO4·7H2O 10.6 2 2
CuSO4·5H2O 0.025 0.039 0.039
Na2MoO4·2H2O 0.25 0.25 0.25
CoCl2·6H2O 0.025 0.025 0.025
FeSO4·7H2O 27.8 27.8 27.8
Na2EDTA 37.3 37.3 37.3
Vitamins and organics (mg L−1)
Myo-inositol 100 100 100
Nicotinic acid 0.5 1 1
Pyridoxine HCl 0.5 1 1
Thiamine HCl 0.1 10 10
Glycine 2 - -
Sucrose (g/L) 30 20 30
pH 5.8 5.6 5.5

Adaptado de Phillips & Garda (2019)

Medios de cultivos para la regeneración de especies leñosas

Los medios de cultivos para especies leñosas, generalmente, tienen menor contenido de
sales de macronutrientes (Phillips & Garda; 2019).

1. Woody Plant (WPM)

Descripción
El medio de cultivo woody plant fue propuesto por Lloyd y McCown en 1980 para la
micropropagación de Kalmia latifolia. Este medio cultivo tiene bajas concentraciones
de sales, es decir presenta menor concentración de nitrógeno total y de amonio.
Además, es utilizado para plantas leñosas que presentan toxicidad a altas
concentraciones de sales (Phillips & Garda; 2019)
2. Driver y Kuniyuki Walnut (DKW)

Descripción

Este medio de cultivo fue propuesto por Driver y Kuniyuki en 1984 para la
micropropagación de Juglans. Tiene una mayor proporción de amonio a nitrato
similar al medio basal MS, pero menor concentración de nitrógeno total. El medio
DKW usa diferente recurso de sales, lo cual resulta en un incremento de la
concentración de sulfatos, para algunas plantas este alto contenido de sulfatos
puede ser beneficioso (Phillips & Garda; 2019).

3. MS modificado o 1/2 MS (MMS)

Descripción

El medio de cultivo Murashige y Skoog modificado contiene la mitad de

concentración de macronutientes, lo cual resulta la mitad de concentración de
amonio que el medio basal MS. Dicha modificación parece no inducir toxicidad por
amonio en las plantas leñosas (Phillips & Garda; 2019).

4. Composición Nutricional de MMS, WPM y DKW

Tabla 3.

Nutrientes presentes en los medios de cultivo de MMS, WPM y DKW.

Basal medium MMS WPM DKW

Macronutrient components (mg L−1)
KNO3 950 - -
K2SO4 - 990 1559
NH4NO3 825 400 1416
Ca(NO3)2·4H2O - 556 1948
NH4H2PO4 - - -
NaH2PO4·H2O - - -
(NH4)2SO4 - - -
MgSO4·7H2O 185 370 740
KH2PO4 85 170 265
CaCl2·2H2O 220 96 149
Micronutrient components (mg L−1)
H3BO3 6.2 6.2 4.8
KI 0.83 - -
MnSO4·H2O 16.9 22.3 33.5
ZnSO4·7H2O 10.6 8.6 -
Zn(NO3)2·6H2O - - 17
CuSO4·5H2O 0.025 0.25 0.25
 Na2MoO4·2H2O 0.25 0.25 0.39
CoCl2·6H2O 0.025 - -
NiSO4·6H2O - - 0.005
FeSO4·7H2O 27.8 27.8 33.8
Na2EDTA 37.3 37.3 45.4
Vitamins and organics (mg L−1)
Myo-inositol 100 100 100
Nicotinic acid 1 0.5 1
Pyridoxine HCl 1 - 0.5
Thiamine HCl 10 1.6 2
Glycine - - 20
L-Glutamine - - 250
Sucrose (g/L) 30 20 30
pH 5.8 5.6 5.5

Adaptado de Phillips & Garda (2019)

5. Aplicación

En un estudio de Olea europea “Olivo” que tuvo como objetivo desarrollar y optimizar
un protocolo eficiente para la regeneración de explantes de brotes nodales,
concluyeron que el medio WPM resultó el más adecuado para iniciar los procesos de
propagación a partir de explantes de nodal de Olivo y obtuvieron una mejor
regeneración de brotes si dicho medio se encuentra suplementado con 4 mg/L de
6-benciladenina (BA). Mientras que el medio DKW no obtuvo resultados
significativos (Meltem et al., 2019).

Figura . Regeneración in vitro de brotes de Olea europea: a) explantes del nodal y b)

regeneración del explante de nodal en medio WPM.Fuente: Meltem et al., (2019)
Medios de cultivos para la clonación y regeneración de especies herbáceas y leñosas

1. Gamborg B5

Descripción
El medio Gamborg B5 ha sido establecido y estudiando por Gamborg O.L en el año
1968 en su publicación “NUTRIENT REQUIREMENTS OF SUSPENSION
CULTURES OF SOYBEAN ROOT CELLS” y fue desarrollado para el cultivo de
callus y suspensión de células en la especie Glycine max, familia Fabaceae. Este
medio es ampliamente utilizado en el cultivo de órganos in vitro, establecimiento de
callos, células vegetales en suspensión, germinación del embrión y
micropropagación de plantas herbáceas y leñosas (Anis & Ahmad, 2016)

Este medio de cultivo, Gamborg B5, es una mezcla de sales inorgánicas, vitaminas y
carbohidratos y su composición está establecida tanto en su concentración como en
los nutrientes escogidos para un óptimo crecimiento de la planta escogida. Por
ejemplo, el nitrato de potasio sirve como fuente única de nitrato en este medio, pero
se sabe también que cantidades de sulfato de amonio mejora el crecimiento celular
en combinación con nitrato de potasio. Esto se observa claramente en callo de raíz
de soja, siendo beneficioso.

Por otro lado, el dihidrógeno fosfato de sodio sirve como fuente de fosfato, mientras
que microelementos como Boro, Manganeso, Molibdeno, cobre, Hierro, y Zinc juega
un rol importante en el metabolismo de la planta. Asimismo, el micronutriente Boro
es clave para el metabolismo de los carbohidratos. Las vitaminas como la tiamina,
inositol, piridoxina, ácido nicotínico actúan como cofactores enzimáticos en las vías
universales tales como, la glucólisis, el ciclo de Krebs, entre otros que forman parte
de vías primarias y secundarias del metabolismo de las plantas.

Composición Nutricional
La composición nutricional del medio Gamborg B5 está dado según en la tabla 4,
que se muestra a continuación:

Tabla 4
Medio Gamborg B5
Macroelements mg/L mM
KNO3 2500 24.7
NaH2PO4·H2O 150 1.1
CaCl2·2H2O 150 1.02
(NH4)2SO4 134 1
MgSO4·7H2O 250 1
Fe 28 0.05
Microelements mg/L μM
MnSO4·H2O 10 59.1
7
H3BO3 3 48.5
2
 ZnSO4·7H2O 2 6.95
KI 0.75 4.52
Na2MoO4·2H2 0.25 1.03
O
CoCl2·6H2O 0.025 0.11
CuSO4 0.025 0.1
Organic mg/L μM
m-Inositol 100 555.
1
Thiamine HCl 10 29.7
Nicotinic acid 1 8.12
Pyridoxine HCl 1 4.86
Sucrose 20,00 58.4
0 3
mM
2,4-D 2 –

Adaptado de Yung-I Lee y Edward Chee-Tak Yeung.(2018). Orchid Propagation:

From Laboratories to Greenhouses Method sand Protocols

Aplicación
El gran interés en la regeneración de plantas a través de la organogénesis del
género Panax está en aumento. La gran mayoría de estos estudios está
concentrado en los explantes de la especie P. ginseng, y en los que se conoce como
PGRs (plant growth regulators), las cuales inducen organogénesis. Se menciona
además que el tratamiento con solo citoquininas suprime la formación de embriones
somáticos.

En el mismo trabajo, se menciona que el cuarenta por ciento de la formación directa

de yemas adventicias ocurrió después del tratamiento con 0.05 mg/L IBA + 5 mg/L
6-bencilaminopurina (BAP). Estas yemas formaron brotes cuando se transfirieron a
un medio con 10 mg/L de ácido giberélico (GA3). Lin et al. (2005) observaron la
proliferación de yemas y el desarrollo de inflorescencias in vitro después de plantar
yemas de brotes aislados en medio con citoquinina. Las concentraciones óptimas de
PGR incorporadas en el medio B5 para la proliferación de yemas e in vitro de la
floración fueron 0,1 mg/L de tidiazurón (TDZ) y para el crecimiento de brotes
vegetativos fueron 0,1 mg/L TDZ + 1 mg/L GA3 ( Uchendu, E. et al.,2017).

En otro estudio, en el que medios basales como MS, N6, WPM y B5 son usados
para la inducción de la formación de callo, así como la diferenciación apical, siendo
de este modo una influencia significativa para la regeneración de los tejidos en
cultivos in vitro. Sin embargo, diferentes especies o tejidos de estos requieren
distintos medios basales, y es donde se reporta que existe una mayor formación de
callo y diferenciación apical con MS en lugar de B5 durante la regeneración de la
especie Lilium longiflorum (Long et al., 2022)
Conclusiones
● El medio MS es considerado como un medio basal pues puede ser útil para
dicotiledóneas y monocotiledóneas, pero tiene una elevada concentración salina.
Asimismo tiene una alta concentración de iones amonio
● El medio BDS contiene un nivel más alto de nitrato de potasio que la MS, pero una
menor concentración de nitrato de amonio.
● El medio BABI es la modificación del BDS, con aumento de concentración de calcio
para mejor rendimiento durante la regeneración de la planta
● El medio WP tiene bajas concentraciones de sales, es decir presenta menor
concentración de nitrógeno total y de amonio.
● El medio DKW tiene una mayor proporción de amonio, nitrato y sulfatos, pero menor
concentración de nitrógeno total.
● El medio Gamborg B5 es una mezcla de sales inorgánicas, vitaminas y
carbohidratos y su composición está establecida tanto en su concentración como en
los nutrientes escogidos para un óptimo crecimiento de la planta escogida

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Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 2018