II.

Enzimas y Cinética enzimática

Al finalizar el tema, el estudiante debe conocer los fundamentos teóricos referidos a:

Aspectos moleculares de las reacciones enzimáticas: sustrato, sitio activo, grupos prostéticos,
coenzimas.

Medida de la actividad enzimática: Definición de enzima, métodos de medida, definición de

unidades.

Cinética de las reacciones enzimáticas: Cinética química. Velocidad inicial de reacción (v0),
dependencia de la velocidad inicial de la concentración de enzima y sustrato. Formación del
complejo enzima-sustrato. Ecuación de Michaelis-Menten. Representaciones gráficas. Significado de
Vmax, KM, y constante catalítica kcat. Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad enzimática.
Gráfico de doble recíproca, para determinación de Vmax y KM. Inhibidores.

Control de la Actividad Enzimática: Modulación alostérica, covalente y mediada por proteólisis.

Enzimas alostéricas: velocidad en función de la concentración de sustrato, efecto de los
moduladores.

Concepto teórico sobre la velocidad catalizada por una enzima con cinética del tipo Michaeliana:

1. A continuación se presenta un modelo simplificado de una reacción catalizada por una

enzima con un solo complejo intermedio donde (E) es enzima, (S) el sustrato y (P) el
producto de la reacción. El modelo asume que al inicio de la reacción la v-2 es despreciable
porque [P] es muy baja.

a) Indique qué es ES.

b) Plantee las ecuaciones de velocidad para cada uno de los pasos de la reacción
catalizada por la enzima (v1, v-1 y v2).

Recuerde que para una reacción del tipo: A + B ↔ C, la velocidad de formación de C es: v1 =
k1 [A][B] y la velocidad de formación de A + B, v-1 = k-1 [C]

c) Indique cuál es la ecuación de velocidad para la reacción de formación de producto por la

enzima. ¿Qué ocurre cuando la enzima se encuentra saturada?
d) Plantee la ecuación de Michaelis-Menten y analice de qué depende la velocidad de una
reacción enzimática.

e) ¿Qué ocurre con la velocidad de la reacción si aumenta la [E]? ¿Qué ocurre con la
velocidad de reacción si aumenta la [S]?

a) ES representa el complejo enzima-sustrato (enzima unida al sustrato). Mientras que E es la

enzima libre, S el sustrato y P el producto de la reacción.

En ausencia de enzima, la reacción sería: S → P

b) 𝑣1 = 𝑘1[𝑆][𝐸]

𝑣−1 = 𝑘−1[𝐸𝑆]

𝑣2 = 𝑘2[𝐸𝑆]
𝑣1 es la velocidad de formación del complejo ES.

𝑣−1 es la velocidad de descomposición de ES para volver a formar E y S.

𝑣2 es la velocidad de descomposición de ES para dara E y P.

En condiciones de estado estacionario la velocidad de desaparición de ES (v-1 + v2) es la igual a la

velocidad de formación (v1 ) de ES.

𝑣1 = 𝑣2 + 𝑣−1

c) En este caso, la ecuación de velocidad para la formación de producto es 𝑣2 = 𝑘2[𝐸𝑆], es decir que
la velocidad de formación de producto depende de la constante de velocidad 𝑘2 y de la
concentración del complejo enzima-sustrato ([ES]).

La velocidad es máxima cuando la enzima está saturada, es decir que toda la enzima (Et) está unida
al sustrato formando el complejo enzima-sustrato (ES). En estas condiciones [ES] = [Et] por lo tanto
𝑉𝑚𝑎𝑥 = 𝑘2[𝐸𝑡].

La constante catalítica 𝑘𝑐𝑎𝑡 es la constante del paso limitante de la velocidad, por eso
𝑉𝑚𝑎𝑥 = 𝑘𝑐𝑎𝑡[𝐸𝑡].

d) Ecuación de Michaelis -Menten:

𝑉𝑚𝑎𝑥. [𝑆]
𝑣𝑜 = 𝐾𝑚 + [𝑆]
Si analizamos la ecuación vemos que la velocidad inicial de la reacción catalizada (𝑣𝑜) depende de la
concentración inicial de sustrato ([S]), la constante de Michaelis-Menten (𝐾𝑚), y de la velocidad
máxima (𝑉𝑚𝑎𝑥).

𝐾𝑚 es una constante que depende de la constantes de velocidad de cada paso (𝑘1, 𝑘−1 y 𝑘2).

𝑉𝑚𝑎𝑥 = 𝑘𝑐𝑎𝑡[𝐸𝑡], por lo tanto la velocidad de la reacción (𝑣𝑜) también depende de la concentración
total de enzima ([Et])

e) Si aumenta la concentración de enzima [Et] aumenta la Vmax, por lo tanto aumenta 𝑣𝑜. Si
aumenta la [S] también aumenta 𝑣𝑜.

2. En el laboratorio se realiza un ensayo para determinar la velocidad de una reacción

catalizada por una enzima. La enzima cataliza la reacción de transformación de A en B.

Observando el gráfico indique:

a) ¿Qué se grafica?
b) ¿Cómo se calcula la velocidad inicial
de la reacción (vo)? ¿Por qué se mide
la velocidad inicial (vo) de la reacción
en vez de la velocidad en otro intervalo
de tiempo (por ej. al final)?
c) Determine en forma aproximada la vo
de la reacción para el tubo 1 y para el
tubo 2.
d) ¿Cuál puede ser la diferencia entre el
tubo 1 y 2?
e) Represente sobre el mismo gráfico lo que se observaría poniendo la mitad de [enzima]
que en el tubo 2. ¿Cuál sería la vo en este caso?
f) ¿Cómo sería el gráfico si se midiera la concentración del compuesto A en función del
tiempo?

a) En este caso se grafica la concentración de producto ([P]) en función del tiempo. La

concentración de producto aumenta a medida que transcurre la reacción.

b) La velocidad de una reacción se define como la variación en la concentración de

productos (o de reactivos) en el tiempo.
 ∆𝑃 −∆𝑆
𝑣 = ∆𝑡
= ∆𝑡

Podemos determinar la velocidad inicial (vo) de la reacción calculando la pendiente de una

recta tangente a la curva en el tiempo 0. Alternativamente, podemos tomar el tramo inicial
de la curva, donde la velocidad se mantiene constante y el gráfico tiene un comportamiento
lineal. En este tramo se ha consumido menos del 10% del sustrato, a tiempos mayores la
velocidad comienza a disminuir porque disminuye la concentración de sustrato.

Gráficos: Concentración de producto (izquierda) o de sustrato (derecha) en función del tiempo. La pendiente
de la región lineal de este gráfico cercana al tiempo 0, marcada con una línea roja, corresponde a la velocidad
inicial.

c) En el tubo 2 la vo es aproximadamente 1 mM/min. En el tubo 1 vo es

aproximadamente 0.1 mM/min.

d) Las diferencias entre los tubos pueden ser varias, por ejemplo la concentración de
enzima, la concentración de sustrato, la temperatura, el pH, la presencia de un inhibidor
de la enzima.

e) La velocidad de una reacción es directamente proporcional a la concentración de

enzima. Por lo tanto, si la concentración de enzima disminuye a la mitad la velocidad será
la mitad, aproximadamente 0.5 mM/min.
En el gráfico a. Se observa como la pendiente inicial (velocidad inicial) disminuye a la
mitad.
 f) La concentración inicial de sustrato baja a medida que se va consumiendo en el tiempo, la
velocidad de consumo de sustrato es igual a la velocidad de generación de producto.

La velocidad inicial corresponde con la pendiente inicial del tramo recto

3. A continuación se presenta un gráfico de velocidad en función de la concentración

de sustrato o gráfico de Michaelis-Menten.

a) ¿Cómo se construye el gráfico de velocidad inicial (vo) en función de [S] a partir del
gráfico del ejercicio 2?
 b) Al gráfico le faltan las unidades, ¿qué unidades pueden tener la velocidad inicial y la
concentración de sustrato?
c) Indique qué información puede obtener de un gráfico como este.
d) Plantee esquemáticamente el gráfico de doble recíproco o gráfico de
Lineweaver-Burk, indique qué información puede obtener y las ventajas de realizar
un gráfico de este tipo.

a) Este es un gráfico de Michaelis-Menten, muestra cómo varía la velocidad inicial de la reacción (vo)
en función de la concentración de sustrato ([S]). Para construir un gráfico como este se debe
determinar la vo en diferentes tubos de reacción, cada uno con una [S] diferente y la misma [E]. En
cada caso debemos medir el aumento en la [P] (o la disminución en la [S]) en el tiempo, realizar una
gráfico como el anterior (ejercicio 2), y determinar la pendiente al inicio de la curva para determinar
la vo a cada [S].

b) En el eje de las abscisas (x) se encuentra la [S], por lo tanto las unidades serán de concentración,
por ejemplo M, mM, μM, nM. En el eje de las ordenadas (y) se encuentra la velocidad inicial (vo) que
tiene unidades de concentración por unidad de tiempo, por ejemplo mM/min, mM/s, μM/min.
Recordemos que:

c) A partir de este gráfico se pueden estimar la velocidad máxima (Vmax) y la Km. La Km es la

concentración de sustrato a la cual la velocidad es la mitad de la Vmax. Vmax y Km son parámetros
cinéticos de la enzima.

d) En el gráfico de Lineweaver-Burk (o gráfico de doble recíproco) se grafica 1/Vo en función de 1/[S].

1 𝐾𝑀 1 1
𝑣0
= 𝑉𝑚á𝑥
· [𝑆]
+ 𝑉𝑚á𝑥

La ventaja de este gráfico es que se obtiene una recta de la cual se pueden obtener fácilmente los
parámetros cinéticos de la enzima. El corte con el eje de las ordenadas es 1/Vmáx y la pendiente
corresponde a Km/Vmáx.

4. Se estudia la actividad de una enzima con cinética Michaeliana en un preparado de

hígado. Se observa que la velocidad máxima (Vmax) es de 100 μM/min y el KM 5 μM.
Indique:

a) La velocidad inicial (v0) de la reacción para los siguientes valores de concentración de

sustrato [S]= 0.5 μM, 5 μM, 50 μM, 500 μM. ¿Cómo es el aumento de la v0 cuando las
concentraciones de sustrato son 50 y 500 uM? ¿A qué se debe esto?
b) La concentración de sustrato ([S]) necesaria para alcanzar una velocidad inicial (v0) de 20
μM/min.
c) La constante catalítica de la enzima si la concentración de enzima total ([Et]) es 1 nM.
d) La Vmax si la concentración de enzima total ([Et]) aumenta 10 veces.
a) El KM si la si la concentración de enzima total ([Et]) aumenta 10 veces.

a) Utilizando la ecuación de Michaelis-Menten podemos conocer la vo para cada

concentración de sustrato.

𝑉𝑚𝑎𝑥. [𝑆]
𝑣𝑜 = 𝐾𝑚 + [𝑆]

100𝑢𝑀/𝑚𝑖𝑛 𝑥 0.5 𝑢𝑀
Si [S]= 0.5 uM entonces vo= 5 𝑢𝑀 + 0.5 𝑢𝑀
= 9.1 uM/min.

Si [S]= 5 uM entonces vo= 50 uM/min

Si [S]= 50 uM entonces vo= 90.9 uM/min
Si [S]= 500 uM entonces vo= 99 uM/min

Como podemos ver, al aumentar 10 veces la concentración de sustrato (de 50 uM a 500 uM)
el incremento en la velocidad inicial es muy pequeño, esto se debe a que la enzima se
encuentra saturada con el sustrato y por lo tanto funciona prácticamente a su velocidad
máxima.

b) Utilizando la ecuación de Michaelis-Menten podemos conocer la [S] necesaria para

alcanzar cada vo:
100𝑢𝑀/𝑚𝑖𝑛 𝑥 [𝑆]
Si vo= 20 uM/min entonces 20 𝑢𝑀/𝑚𝑖𝑛 = 5 𝑢𝑀 + [𝑆]

En este caso debemos despejar la [S]:

100 + 20 [S] = 100[S]
100 = 80 [S]
[S] = 1.25 uM

c) Recordamos que Vmax = kcat [Et]

Vmax= 100 uM/min
[Et] = 1 nM = 0.001 uM
Sustituimos en la ecuación: 100 uM/min = kcat 0.001 uM
Despejamos: kcat = 100 uM/min / 0.001 uM
kcat= 100000 1/min

d) La Vmax es directamente proporcional a la [Et]. Si la [Et] aumenta 10 veces la Vmax

aumenta 10 veces.
Vmax = 1000 uM/min
e) El Km no depende de la [Et]. Si la [Et] aumenta 10 veces el Km no cambia.
Km = 5 uM

5) Cinética de Michaelis-Menten y cinética no Michaeliana (sigmoide)

a) Describa el tipo de cinética para cada una de las enzimas.

b) ¿A qué se deben las diferencias en la cinética de estas enzimas?
c) ¿Qué se señala con la línea punteada?
d) ¿A qué corresponden los
puntos A, B y C.
a) El gráfico correspondiente a la enzima 1,
es una hipérbola rectangular que corresponde a
una enzima con cinética de Michaelis-Menten (o
Michaeliana). El gráfico correspondiente a la
enzima 2 es una curva sigmoide, por lo tanto
esta enzima presenta una cinética no
Michaeliana (o cinética sigmoidal).
b) La enzima 2, que presenta una gráfica
sigmoide de Vo en función de [S] esto indica que
presenta cooperatividad en la unión al sustrato.
Las enzimas con este comportamiento deben
tener al menos dos sitios activos. En estas
enzimas, la unión del sustrato a un sitio activo afecta la afinidad de los otros sitios activos por el
sustrato. Las enzimas que presentan cooperatividad en la unión al sustrato responden con mayor
sensibilidad a los cambios en la [S].
La enzima 1 presenta una cinética Michaeliana. En este caso no importa cuántos sitios activos tenga
la enzima. La unión de un sustrato a un sitio activo no afecta la unión de la siguiente molécula de
sustrato, no existe cooperatividad.

c) La línea punteada señala el valor de velocidad máxima (Vmax). En este caso ambas enzimas
tienen la misma Vmax.

d) El punto A corresponde a la mitad de la velocidad máxima (Vmax) para ambas enzimas. El

punto B indica la concentración de sustrato a la cual la enzima 1 alcanza la mitad de la Vmax. Como la
enzima 1 presenta una cinética michaeliana este valor se denomina KM. El punto C indica la
concentración de sustrato a la cual la enzima 2 alcanza la mitad de la Vmax. Como la enzima presenta
una cinética no Michaeliana se denomina K0,5.
6. Se desea determinar el efecto de una molécula J sobre los parámetros cinéticos de la enzima (E)
que cataliza la reacción de A→ P. A continuación se muestra el gráfico de doble recíproco obtenido
en presencia y ausencia de una concentración de [J] = 0,25mM.

a) Determinar KM y Vmax en las condiciones del estudio en ausencia y en presencia de J.

b) ¿Cuál es el efecto de J sobre los parámetros cinéticos evaluados? ¿A qué tipo de modulador
corresponde J?

c) ¿Cuál sería el efecto de aumentar la concentración de J sobre la Vmax? ¿Qué sucede si se

aumenta la concentración de sustrato y se mantiene J?

a) La figura muestra el gráfico de dobles recíprocos (1/vo versus 1/[S]). A partir de esta gráfica
se puede determinar la Vmax y el KM.

1 𝐾𝑀 1 1
Recordemos que:
𝑣0
= 𝑉𝑚á𝑥
· [𝑆]
+ 𝑉𝑚á𝑥

y = a. x + b

1 1
En presencia de J: ⇒ 𝑉 = 𝑏 (𝑜𝑟𝑑𝑒𝑛𝑎𝑑𝑎 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑜𝑟𝑖𝑔𝑒𝑛)
= 0,683
= 1. 46 𝑚𝑀/𝑚𝑖𝑛
𝑚á𝑥

⇒ 𝐾𝑀 = 𝑎 (𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒) · 𝑉𝑚á𝑥 = 0. 887 · 1. 46 = 1. 30 𝑚𝑀

1 1
En ausencia de J: ⇒ 𝑉 = 𝑏 (𝑜𝑟𝑑𝑒𝑛𝑎𝑑𝑎 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑜𝑟𝑖𝑔𝑒𝑛)
= 0,689
= 1. 45 𝑚𝑀/𝑚𝑖𝑛
𝑚á𝑥

⇒ 𝐾𝑀 = 𝑎 (𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒) · 𝑉𝑚á𝑥 = 0. 351 · 1. 45 = 0. 51 𝑚𝑀

b. Con los valores obtenidos de los parámetros cinéticos podemos observar que Vmáx no varía
mientras que KM aumenta. Por lo tanto J es un inhibidor competitivo.

c. J es un inhibidor del tipo competitivo, por lo tanto el aumento en la concentración de J

conduce a un aumento en el KM aparente, pero no afecta la Vmax. Al aumentar la
 concentración de sustrato es posible revertir la inhibición generada por J, ya que compite
el sustrato compite con el inhibidor por la unión al sitio activo y puede desplazarlo.

TALLER COMPUTACIONAL

1. Se desea determinar la velocidad de una reacción catalizada por la Aconitasa:

A. Busque la reacción que cataliza la enzima seleccionada y busque en qué vía participa.
B. Diseñe el tubo de reacción que tendrá que preparar para estudiar la actividad (velocidad de
la enzima) para la concentración de 8 nM de enzima y 200 uM de citrato. Defina cómo puede
determinar la velocidad de la reacción de manera experimental.
C. Realice un bosquejo gráfico de cómo espera que cambie la concentración de sustrato y la
concentración de producto en función del tiempo. Defina el concepto de velocidad inicial.
D. Utilizando la siguiente hoja de cálculo (haga una copia desde Archivo):

https://docs.google.com/spreadsheets/d/1pOwoi8hVorDWBsqUwkn8aHRL4oYKX1PkU7icLB
M9QPs/edit?usp=sharing

Siga las instrucciones descritas en la hoja de cálculo y responda:

- Analice qué sucede con el gráfico de producto (cis-aconitato) para la concentración

de sustrato (citrato 200 uM) y de enzima (8 nm) en función del tiempo.
- Determine hasta qué tiempo estamos en condiciones de velocidad inicial para la
concentración de sustrato que utilizó. ¿Qué representa la pendiente de la parte
lineal del gráfico?
- ¿Qué sucede con el gráfico si en el tubo de reacción no se coloca enzima? ¿Y si se
coloca 16 nM de enzima en el tubo de reacción qué sucede con la velocidad inicial y
la pendiente del gráfico?

A. La aconitasa cataliza la reacción de isomerización de Citrato a Isocitrato, con un paso

intermedio que invoucra la formación de cis-Aconitato. Esta reacción ocurre en la
mitocondria y forma parte del Ciclo de Krebs.
 B. Para evaluar la actividad de la aconitasa, el tubo de reacción a preparar debería contener:

- Sustrato: Citrato 200 uM

- Enzima: Aconitasa 8 nM
- Buffer- solución amortiguadora a pH 7.4 (pH del medio intracelular).

Para medir la velocidad de la reacción, debemos medir la concentración de sustrato (en este caso el
citrato) o la concentración del producto ( en este caso el isocitrato) en el tiempo. En esta caso en
particular también se puede medir la concentración del producto intermedio cis-aconitato en función
del tiempo. En este caso decidimos medir la concentración de cis-aconitato, ya se puede determinar
midiendo la Absorbancia con un espectrofotómetro

Para determinar la velocidad debemos medir la [cis-aconitato] a distintos tiempos luego del agregado
de la enzima y gráficar la [cis-aconitato] en función del tiempo. La pendiente del tramo recto inicial
del gráfico corresponde con la velocidad inicial de la reacción, para esa concentración de sustrato y
de enzima.

C.

La velocidad inicial corresponde con la pendiente inicial del tramo recto

D. En la celda verde se escribió la concentración de citrato a estudiar

(200 uM), en la celda naranja la concentración de enzima 0,008 uM.

- Observamos que inicialmente la [cis-aconitato] aumenta con el

tiempo hasta que todo el sustrato [citrato] se ha convertido en
cis-aconitato.
Gráfico. Concentración de cis-aconitato en función del tiempo para una concentración de citrato de 200 uM y
de enzima de 8 nM. La pendiente de la región lineal de este gráfico, corresponde a la velocidad inicial.

- Hasta el minuto 20 aproximadamente nos encontramos en condiciones de velocidad inicial. El

gráfico es lineal y se ajusta a una recta, cuya pendiente es la vo. A tiempos mayores la pendiente
disminuye y no estamos en condiciones de vo. Si selecciona en el cuadrado rojo del simulador el
punto que corresponde con dicho tiempo (en este caso punto 7) podrá visualizar la recta que pasa
por dichos puntos y determinar la pendiente del gráfico en este intervalo.

La ecuación de una recta corresponde con Y = a x + b, siendo “a” la pendiente de la recta. Para esta
concentración de sustrato (200 uM) y de enzima (8 nM) la vo= pendiente= 4.31 uM/min.

-Para analizar lo que ocurre cuando la [E]= 0 o [E]= 16 nM = 0.016 uM, cambiamos en el cuadrado
naranja el valor de la concentración de enzima en el tubo de reacción, y obtenemos nuevos
gráficos:

Si no se agrega enzima ([E]= 0), la [cis-aconitato] no aumuenta.

Al agregar [E]= 0.016 uM obtenemos un nuevo gráfico. Se observa que hasta el minuto 15 estamos
en condiciones de vo y la gráfica tiene un comportamiento lineal. Por lo tanto en el cuadrado rojo se
elige el punto correspondiente a los 15 min (punto 5) y se obtiene una gráfica nueva:
Gráfico. Concentración de cis-aconitato(eje de las ordenadas (y)) en función del tiempo (eje de las abscisas (x))
para una concentración de citrato de 200 uM y enzima de 16 nM. La pendiente de la región lineal de este
gráfico, marcada como línea roja, se corresponde a la velocidad inicial.

Para esta concentración de sustrato (200 uM) y de enzima (16 nM) la vo= pendiente= 8.71 uM/min.

Al comparar los valores de vo obtenidos para las dos concentraciones de enzima podemos apreciar
que la velocidad de la reacción es directamente proporcional a la concentración de enzima, al colocar
en el tubo de reacción el doble de concentración de aconitasa se observa el doble de velocidad para
la misma concentración de sustrato.

V0 al utilizar 8 nM enzima: 4.3 uM/min

V0 al utilizar 16 nM enzima: 8.7 uM/min

Esto se debe a que V0= kcat.[E]. Donde kcat es la constante catalítica de la enzima.

2. Determine los parámetros cinéticos para la enzima aconitasa:

Utilizando el mismo simulador que en el ejercicio 2:

- Describa el diseño experimental a utilizar para determinar los parámetros cinéticos.

- Simule y complete la tabla 3 en la hoja de cálculo para la concentración de enzima de 8 nM.
Observe el comportamiento del gráfico, describa qué tipo de cinética cuenta la enzima.
- Complete la tabla 4 y realice el gráfico doble recíproco. Determine los parámetros cinéticos.
- Escriba la ecuación de Michaelis y Menten con los parámetros cinéticos obtenidos y
determine usando la ecuación:
- La velocidad inicial para una concentración de 450 uM de citrato.
 - ¿A qué concentración de citrato se obtiene una velocidad de 25 uM/min?

Para determinar los parámetros cinéticos (KM y Vmax ) es necesario hacer varios tubos con diferentes
[S] y todos con la misma [E], y determinar a cada uno de ellos la vo.

Para esto debemos resolver qué [S] utilizaremos. El KM de la enzima es 900 uM, por lo que debemos
evaluar valores [S] por debajo y por encima de 900 uM. Para alcanzar Vmax la [S] debe ser 10 veces
mayor (o más) que el valor de KM, es decir, que debemos elegir un valor de 9000 uM (o más) para
estar en condiciones cercanas a la velocidad máxima. Tomando en cuenta estos criterios se pueden
seleccionar varias concentraciones diferentes (no hay una única respuesta).

A continuación se muestra una ejemplo:

Se observa que para el caso de la aconitasa la gráfica de vo en función de la [citrato] tiene forma de
hipérbola rectangular, confirmando que se trata de una enzima con cinética Michaeliana.

Para obtener los parámetros cinéticos de la enzima (Vmax y KM) recurrimos al gráfico de dobles
recíprocos. Utilizando la tabla 4 para realizar este gráfico debemos de generar dos columnas en las
cuales:

En el eje de las y : 1/vo

En el eje de las x: 1/[Sustrato] por ejemplo: [S]= 10 mM, 1/[S] = 1/10 = 0.1 mM-1.

Esto lo podemos hacer utilizando la hoja de cálculo.

Tomar en cuenta que para [S]= 0 no hay valor en esta tabla porque 1/0 no existe.

A continuación se muestra un ejemplo de la siguiente la tabla y gráfico a obtener:

A partir de la ecuación de la recta del gráfico (Y = 36.1x + 0.0332) podemos determinar KM y Vmáx, de
la siguiente manera.

El gráfico de dobles recíprocos se corresponde con la ecuación:

1 𝐾𝑀 1 1
𝑣0
= 𝑉𝑚á𝑥
· [𝑆]
+ 𝑉𝑚á𝑥

Cuya expresión es la ecuación de una recta: y = a · x + b

𝐾𝑀 1
Donde: a (pendiente) = 𝑉𝑚á𝑥
, y b (ordenada en el origen)= 𝑉𝑚á𝑥

La ecuación de la recta obtenida de la gráfica: y = 36.1 x + 0.0332

Primero despejamos VMax de la ordenada en el origen:

1 1
b = 0.0332 = 𝑉𝑚á𝑥
⇒ 𝑉𝑚á𝑥 = 0.0332

Vmax= 30.12 uM/min

Y luego KM de la pendiente:

𝐾𝑀
a = 36.1 = 𝑉𝑚á𝑥
⇒ 𝐾𝑀 = 36. 1 ·𝑉𝑚á𝑥 = 36. 1 · 30. 12 =

KM= 1087 uM

Para la aconitasa:

- Escriba la ecuación de Michaelis y Menten utilizando los parámetros cinéticos (KM y Vmáx)
obtenidos para la enzima y determine usando la ecuación:
 𝑉𝑚𝑎𝑥. [𝑆]
𝑣𝑜 = 𝐾𝑚 + [𝑆]

Sustituyendo por los parámetros obtenidos:

30.12 𝑢𝑀/𝑚𝑖𝑛 . [𝑆]

𝑣𝑜 = 1087+ [𝑆]

- La velocidad inicial para una concentración de 450 uM de citrato.

Sustituyendo en la ecuación:

30.12 𝑢𝑀/𝑚𝑖𝑛 . 450 𝑢𝑀

𝑣𝑜 = 1087+ 450 𝑢𝑀
= 8. 8 𝑢𝑀/𝑚𝑖𝑛

- ¿A qué concentración de citrato se obtiene una velocidad de 25 uM/min?

Sustituyendo la velocidad inicial en la ecuación:

30.12 (𝑢𝑀/𝑚𝑖𝑛) .[𝑆]

25 𝑢𝑀/𝑚𝑖𝑛 = 1087 (𝑢𝑀)+ [𝑆]

Despejando,

25𝑢𝑀/𝑚𝑖𝑛 = (30. 12 𝑢𝑀/𝑚𝑖𝑛 . [𝑆])/ 1087 𝑢𝑀 + [𝑆]

25𝑢𝑀/𝑚𝑖𝑛 * (1087 + [𝑆]) = (30. 12 𝑢𝑀/𝑚𝑖𝑛 . [𝑆])

27175 + 25[𝑆] = 30, 12 . [𝑆]

27175 = − 25 [𝑆]) + 30. 12[𝑆]

27175 = 5. 12[𝑆]

[𝑆] = 27175/ 5. 12 = 5308 𝑢𝑀

3. En el mismo simulador (pestaña diferente) se encuentra la posibilidad de determinar los

parámetros cinéticos de las siguientes enzimas:

2A. Piruvato carboxilasa

2B. Beta-Galactosidasa

2C. Malato Deshidrogenasa

Busque qué reacción catalizan y determine hasta qué tiempo se está en condiciones de velocidad
inicial para una concentración de sustrato igual a 200 uM y 8 nM de enzima. Determine dicha
velocidad.
Determine los parámetros cinéticos para su enzima:

- Realice el gráfico de velocidad en función de la concentración de sustrato para la enzima

seleccionada en el ejercicio 2 y el gráfico de dobles recíprocos.

Este ejercicio se resuelve igual que el anterior.