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Aislamiensto, purificación y Caracterización de Enzimas

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1. INTRODUCCIÓN 24 hours after which time 4.23 g of dry latex was
obtained. The latex was then mixed with 14.6 g of
phosphate buffer solution, homogenized with a GAST
pump for 30 minutes. The protein concentration was then
determined by means of the spectrophotometer,
calibrated, the blank was passed and adjusted as
reference. A 1:13 dilution of the enzyme-substrate was
performed at concentrations of (3, 5, 8) mg / mL, a sample
of each was placed in the spectrophotometer every 15 s
for 3 minutes. For the concentration of the enzymatic
activity was adjusted to 348 nm, with a dilution of 1: 5
Aislamiento, Purificación Y and again the data were taken every 15 s for 3 minutes.
The extracted latex yielded 0.04%, while the protein
Caracterización de Enzimas concentration was 28.86 mg per mL of solution. At the
substrate concentrations 0.016 and 0.044 mM, an
Galárraga Marco; Martínez Katherine; Sandoya Dayuma
enzymatic activity of 0.029 and 0.032 (U / mL * s)
Escuela Politécnica Nacional, Facultad de Ingeniería Química y
respectively was obtained. The Michaelis-Menten
Agroindustrial, Quito, Ecuador constant obtained was -2.341 * 10-3 and its maximum
velocity was 0.019 (U / mL * s). It is established that the
Resumen: En el presente informe se determina la constante enzymatic activity observed during the experimentation
de Michaelis-Menten y la velocidad máxima de la enzima was effective.
papaína para analizar la afinidad de la misma con el sustrato.
Para ello se extrajo el látex de babacos inmaduros. El látex Keywords: Papain, substrate, Michaelis-Menten constant,
fue pesado y llevado a la estufa por 24 horas transcurrido maximum rate and enzymatic activity.
dicho tiempo se obtuvo 4,23 g de látex seco. Luego se Las enzimas son proteínas actúan como biocatalizadores de
realizó una mezcla del látex con 14, 6 g de solución tampón origen biológico que ayudan a la cinética de las reacciones
fosfato, se homogenizó con una bomba GAST por 30 bioquímicas, estas participan en mecanismos de regulación
minutos. A continuación se determinó la concentración de por lo que permiten que el metabolismo se adapte a las
proteína por medio del espectrofotómetro, se calibró el condiciones (Koolman & Rohm, 2004).
mismo, se pasó el blanco y se ajustó como referencia. Se
realizó una disolución de 1:13 de la enzima-sustrato a Gonzáles (2013) indica que existen diferentes tipos de
concentraciones de (3, 5, 8) mg/mL, una muestra de cada enzimas y estas son:
una se colocó en el espectrofotómetro cada 15 s por 3  Oxidorreductasas (catalizan reacciones redox)
minutos. Para la concentración de la actividad enzimática se  Transferasas ( transferencia de grupos funcionales)
ajustó a 348 nm, con una dilución de 1:5 y nuevamente se  Hidrolasas ( reacciones de hidrólisis)
tomaron los datos cada 15 s por 3 minutos. El látex extraído  Liasas (adicion de los dobles enlaces)
obtuvo un rendimiento de 0,04%, mientras que la  Isomerasas (adición de los dobles enlaces)
concentración de proteína fue de 28,86 mg por mL de  Ligasas (forma enlaces con escisión)
solución. En las concentraciones de sustrato 0,016 y 0,044
mM se obtuvo una actividad enzimática de 0.029 y 0.032 Gonzáles (2004) indicaque las proteasas, peptidasas o
(U/mL*s) respectivamente. La constante de Michaelis- enzimas proteolíticas rompen enlaces peptídicos de cadenas
Menten obtenida fue de -2.341*10 -3 y su velocidad máxima protéicas por hidrólisis obeniendo aminoácidos libres o
de 0.019 (U/mL*s). Se establece que la actividad enzimática péptido de menor tamaño.
observada durante la experimentación fue eficaz
Según Acosta (2011), la papaina es una peptidasa que se
Palabras clave: papaína, sustrato, constante de Michaelis- obtiene del látex que se encuentra en frutos verdes de papaya
Menten, velocidad máxima y actividad enzimática (Carica papaya), babaco (Vasconcellea x heiborni) y
chamburo (Vasconcellea pubescens). Esta enzima posee un
Cleavage, Purification, and peso molecular de 23 kDa y está formada por una cadena
peptídica de 211 residuos de aminoácidos.
Characterization of Enzymes
La papaina es activada por diferentes agentes reductores entre
Abstract: The present report determines the Michaelis- esos están la cisteína y el cianuro de sodio o sulfitos y se
Menten constant and the maximum rate of the papain inactiva por la acción de agentes oxidantes en ciertos casos
enzyme to analyze the affinity of the same with the por el oxígeno atmosférico y más comúnmente por metales
substrate. For this the latex was extracted from immature pesados (Sinche, 2009).
sluts. The latex was weighed and carried to the stove for
Álvaro, et al (2002) indican que la actividad de la papaina
1marco.galarraga@epn.edu.ec, katherine.martinez@epn.edu.ec,
puede ser determinada por la velocidad de hidrólisis de un
lita.sandoya@epn.edu.ec

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sustrato de bajo peso molecular como estéres o derivados de indicando que estas reacciones de catálisis ocurren en dos
aminoácidos. etapas:

Esta enzima tiene diferentes usos en diferentes campos de 1. Formación del complejo enzima-sustrato
aplicación como en la parte industrial para el procesamiento 2. Complejo enzima-sustrato da lugar a la formación del
de fibras textiles y cueros de procedencia animal, como producto
ablandador de carne, para pruebas de enfriamiento en la
industria cervecera, tratamiento de efluenetes industriales
entre otros (Glibota, et al., 2000).

Para la purificación de las enzimas se deben considerar


ciertos factores de estabilidad que presentan, las principales Ec. 1.3.
técnicas son las de baja resolución y las de alta resolución. Se En
debe combinar ambas técnicas para tener una pureza
significativa (Chávez, 1990)

Para la determinación de la concentración de proteínas y donde k1, k2, k3 sn constantes cinéticas individuales de cada
enzimas contenidas en una solución se utiliza el proceso tomando el nombre de constantes microscópicas
espectrofotómetro, ya que al ajustar el equipo a un rango de por lo que:
luz visible de 348 nm para enzimas y 240 nm de longitud de
onda para proteínas se tiene como objetivo y se tiene lectura
 v1= k1 [E] [S] ( enzima y sustrato individuales)
específica de proteínas y de enzimas que es lo que indica la
 v2 = k2 [ES] ( complejo enzima sustrato)
ecuación de Lambert -Beer (Yánez, 2006)
 v3 = k3 [ES] ( complejo enzima sustrato)
 Concentración total de la enzima [ET]
A=ε∗c∗l
Ec. 1.1.
Se puede adaptar al modelo cinético a un estado estacionario
Donde : en donde la velocidad del de formación de productos es
A= absorbancia constante y por tanto se puede obtener la siguiente ecuación
(mg)/ml−1 −1
ε =coeficiente de extinción , cm 1.4.
c=la concentracion de sustancia absorbente en
mg V max∗[ S ]
muestra ( )
ml
v=
K M +[ S ]
l=la distancia que la luz atraviesa por Ec. 1.4.
la muestra , en cm
KM: es la constante de Michaelis-Menten característica del
Esta ley indica que existe una relación de tipo exponencial comportamiento de una enzima en un sustrato. . Refleja la
entre la transmisión de luz de una sustancia y la afinidad de la enzima por ese substrato. Km es
concentración de la sustancia en la solución, de igual manera numéricamente igual a la concentración de substrato a la cual
como la relación entre la transmisión y la longitud del cuerpo la velocidad de reacción es la mitad de la Vmax (Km=
que la luz atraviesa (Sinche, 2009) Vmax/2). Este parámetro, Km no varía con la concentración
de enzima.
La actividad específica, el grado de purificación y el
rendimiento son indcadores que permiten evaluar la Relación de la velocidad con la concentración de enzima: la
efectividad de la purificación enzimática, al relacionar la velocidad de la reacción es directamente proporcional a la
actividad enzimática con la concentración prtéinca como se concentración de la enzima a cualquier concentración de
indica en la Ec. 1.2. substrato. Por ejemplo, si la concentración de enzima es
disminuida a la mitad, la velocidad inicial de la reacción (v0)
actividadenzimtica es reducida también a la mitad de la original (Vásquez,
Actividad específica=( ) 2003).
concentración protéica
Ec. 1.2. Según UPO (2015) Para la obtención de la constante se usa
usualmente el método gráfico por la representación de
Para la caracterización de las enzimas se debe realizar un Lineweave-Burk en donde se realizan arreglos matemáticos y
estudio enzimático y determinar KM y Vmáx que son los se representa el eje X con el valor de -1/ KM y el eje Y con el
parámetros cinéticos según a ecucación de Michaelis y valor de 1/ Vmax, por tanto se obtendría una pendiente con el
Menten. valor de KM/ Vmax como se puede observar en la siguiente
gráfica:
Vélez (2012) indica que la cinética de Michaelis y Menten
explica la relación observada entre la velocidad inicial de
catálisis de una enzima y la concentración inicial del sustrato,

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obteniéndose un valor de 0,04%, mientras que, en un trabajo


muy similar Acosta (2011) reporta rendimientos de 2,54% de
gramos de látex por número de babacos utilizados. Estos
valores no pueden ser comparados debido a que las frutas
empleadas poseían diferentes tamaños, sin embargo, Acosta
(2011) detalla que los mayores rendimientos son de frutos
inmaduros en comparación a babacos amarillos lo cual
justifica el uso de frutos verdes en este experimento.
(UPO, 2015).
3.2. Concentración de Proteína
2. MARCO TEÓRICO/METODOLOGÍA
Para el cálculo de la concentración de proteína (enzima
Para la extracción de la enzima papaina se inició con la papaína) se utilizó una solución de látex con factor de
extracción del látex de babacos que aún no llegaban a estado dilución 13 y mediante la absorbancia se obtuvo 28,86 mg de
de madurez organoléptico y su corteza era de color verde, proteína por mL de solución (cálculos en Anexos). Aun
para la extracción se eligieron los babacos y fueron pesados cuando el babaco es ampliamente usado para la extracción de
obteniendo los pesos de 2 444 g para el grupo 1, 1 504,7 g papaína, Gutiérrez et al (2016) obtuvo 35 mg de proteína por
para el grupo 2, 3 683 g para el grupo 3, 1 458 g para el mL de solución de una planta conocida como Mito
grupo 4 y 982 g para el grupo 5; luego se realizó varios cortes (Vasconcellea candicans), lo cual significa que para la
a lo largo de la fruta con una profundidad de máximo 2 mm, obtención a nivel industrial de papaína se recomendaría el
se recogió en cajas Petri, se pesó y se llevó a la estufa por uso de Mito. En la Tabla 3.2.1. se muestran los valores
aproximadamente 24 horas. descritos en un amanera comparativa.

Al siguiente día las muestras secas en las cajas Petri fueron Tabla 3.2.1. Concentración de papaína
Babaco (Carica pentagona) Mito (Vasconcellea candicans)
pesadas nuevamente en una balanza, se raspó con una 28,86 mg/mL 35 mg/mL
espátula toda la muestra y se pesó obteniendo 4,23 g de látex (Gutiérrez et al, 2016)
seco de los 5 grupos.
3.3. Actividad Enzimática (AE)
Luego se realizó una mezcla del látex con una solución
tampón fosfato para la cual se utilizó 14, 6 g de fosfato; y se La actividad enzimática se obtuvo mediante la medida de
se agregó 100 ml de solución tampón con los 4,23 g de látex, absorbancia durante 3 minutos tal como se describen los
se agitó y homogenizó con una bomba GAST modelo DOA- cálculos en Anexos. En las siguientes tabla y figura, se
P704-AA de 115 AMP y 60 Hz por 30 minutos. presentan los valores obtenidos de actividad enzimática a
diferentes concentraciones de sustrato:
Para la determinación de la concentración de proteína la
muestra fue llevada al espectrofotómetro en donde se inició Tabla 3.3.1. Actividad enzimática
por ajustar la absorbancia de 240 nm la longitud de onda para Sustrato (mg/mL) Sustrato (mM) AE (U/mL*s)
proteína, se inició pasando el blanco en una celda de 1 cm y 3 0,016 0,029
ajustando como referencia, después se realizó una solución 5 0,027 0,013
de 1:13 se colocó la solución en la celda y se prosiguió a 8 0,044 0,032
poner la muestra por 3 minutos y tomar lectura de la
absorbancia cada 15 s.
Sustrato vs AE
Para la determinación de la concentración de la actividad 0.04
enzimática se ajustó a 348 nm la longitud de onda, se pasó el 0.03
blanco con la muestra de la solución tampón y se realizaron 0.03 f(x) = 0.19 x + 0.02
mediciones de absorbancia hasta llegar a una lectura de esta 0.02 R² = 0.07
en donde la sensibilidad del espectrofotómetro no se vea 0.02
0.01
afectada. La dilución fue de 1:5 con el sustrato en 0.01
proporciones de 3, 5 y 8 para cada prueba y se agregó a la 0
celda y de nuevo se tomaron los datos cada 15 s por 3 0.01 0.02 0.02 0.03 0.03 0.04 0.04 0.05 0.05
minutos. Figura 3.3.1. Concentración de sustrato vs actividad enzimática

En bibliografía se indica que la actividad enzimática aumenta


3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN conforme aumenta la concentración de sustrato hasta alcanzar
una actividad enzimática constante. Este fenómeno
3.1. Rendimiento concuerda con las concentraciones de sustrato 0,016 y 0,044
mM (como se aprecia en la figura). Sin embargo, a la
El látex se lo extrajo de frutos de babaco inmaduros (corteza concentración 0,027 mM se observa un descenso en la AE lo
verde) y el cálculo del rendimiento (Anexos) se lo realizó en cual podría significar un error de medición por parte del
base al peso de látex seco y peso de la fruta utilizada, equipo o un error al momento de realizar la dilución.

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Chávez, M. (1990) “Temas de enzimolgía”, 2,, ENPES, La Habana, pp. 25-


3.4. Constante de Michaelis-Menten y Velocidad Máxima 30, 35-39, 60- 63.

La constante de Michaelis-Menten y la velocidad máxima Gilbota, G., Garro, O., Judis, M. (200) “actividad proteolítica de restos de
obtenidas pueden se ilustran en la siguiente tabla: fruto de Carica papaya”. Comunucaciones científicas y tecnológicas.
Recuperado de: http://www.unne.edu.ar/Web/cy/cyt/cyt/2001/cyt/.htm
Tabla 3.4.1. Constante de Michaelis-Menten y velocidad máxima (Mayo, 2017)
Km (mM) Velocidad máxima (U/mL*s)
Gutiérrez, A., Nolasco, O. & Santa Cruz, C. (2016). Purificación y
−2,341∗10−3 0,019 caracterización preliminar de proteasas del látex de Vasconcellea candicans
(A. Gray) A. DC (Mito). Scientia Agropecuaria 8 (1): 7– 17 (2017).
Estos valores van a depender de varios factores como
Gonzáles, J. (2004) “Tema 11: Enzimas”, Departamento deBioquímica y
concentración de sustrato, concentración de enzima, pH, Biología de la Universidad del País Vasco, España, Recuperado de:
temperatura, entre otros descritos en bibliografía. Sin Http//www.ehu.es/biomoléculas/enzimas/tema11/htm. (Mayo, 2017)
embargo, la actividad enzimática observada durante la
experimentación fue sobresaliente. Gonzáles, M. (2013). Clasificación de las enzimas. Recuperado de:
http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz13.htm (Mayo,2017).

4. CONCLUSIONES SINCHE, M., 2009, "Aislamiento, purificación parcial y caracterización


cinética de las proteasas presentes en el látex de los frutos de una planta del
El látex que se extrajo de frutos de babaco, obtuvo un género Vasconcella", EPN, Quito, Ecuador. Recuperado de:
http://bibdigital.epn.edu.ec/bitstream/15000/1661/1/CD-2218.pdf (Mayo,
rendimiento de 0,04%. 2017)

La concentración de proteína obtenida mediante la UPO (2015) “Cinética Enzimática”. Recuperado de:
absorbancia fue de 28,86 mg de proteína por mL de solución. https://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/miembros/Web_Sofia/GRU
POS/Tema%207.pd (Mayo, 2017)

En las concentraciones de sustrato 0,016 y 0,044 mM se Vélez, C. (2012) “ Modelo Cinético de Michaelis- Menten”. Recuperado de:
obtuvo una actividad enzimática de 0.029 y 0.032 (U/mL*s) http://www.uprm.edu/biology/profs/velez/modelo.htm (Mayo, 2017)
respectivamente.
Yanez, M. (2006) “Análisis de las proteínas”. Departamento de
Biotecnología, Universidad Autónoma Metropolitana, Mpexico, Recuperado
La actividad enzimática aumenta conforme aumenta la de;
concentración de sustrato hasta alcanzar una actividad http://docencia.itz.uam.mx/lyanez/analisis/mateiral_adicional/notasproteinas
enzimática constante. 2.ppt (Mayo, 2017)

La constante de Michaelis-Menten obtenida fue de


-2.341*10-3 y su velocidad máxima fue de 0.019 (U/mL*s).

A la concentración 0,027 mM se obtuvo un descenso en la


actividad enzimática.

La actividad enzimática observada durante la


experimentación fue eficaz.

REFERENCIAS

ACOSTA, R., 2011, "Estudio de la variación de la actividad enzimática


proteolítica del látex del babaco (Vasconcellea heilbornii) en función de la
edad del fruto", EPN, Quito, Ecuador. Recuperado de:
http://bibdigital.epn.edu.ec/bitstream/15000/3924/1/CD-3656.pdf (Mayo,
2017)

Álvaro, T., Uzcátegui, E. y Muñoz, R. (2002) “Investigacion de una


proteasas aislada de babaco Carica pentagona H”, Pliténica, 23.

ANEXOS

Cálculos

 Determinación de la Concentración de Proteína:

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2,22∗13
1 cm
[ P ]= =28,86 mg/mL
mg −1 −1
1( ) cm
mL

 Determinación de la Actividad Enzimática:

Absorbancia vs tiempo (s)


1.000
0.900
f(x) = 0 x + 0.1
0.800 R² = 1
0.700
0.600
0.500
0.400
0.300
0.200
0.100
0.000
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

∆ DO348
=m=0,0046
∆t

0,0046∗1000∗3300
AE=
5150∗1∗100

U
AE=0,029
mL∗S

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5 mg/mL sustrato
Tiempo (s) Absorbancia
0 -0,338
Absorbancia vs tiempo (s)
15 -0,302 0.1
30 -0,27 0.05
45 -0,235 0 f(x) = 0 x − 0.33
60 -0,203 0 R² = 20
1 40 60 80 100 120 140 160 180 200
-0.05
75 -0,172 -0.1
90 -0,141
-0.15
105 -0,11
-0.2
120 -0,079
-0.25
135 -0,049
150 -0,021 -0.3
165 0,008 -0.35
180 0,034 -0.4

0,0021∗1000∗3300
AE=
5150∗1∗100

U
AE=0,013
mL∗S
8 mg/mL sustrato
Tiempo (s) Absorbancia Absorbancia vs tiempo (s)
0 0,088
15 0,161 1.200
30 0,236
1.000
45 0,311 f(x) = 0.01 x + 0.08
60 0,385 0.800 R² = 1
75 0,459
90 0,530 0.600
105 0,608
120 0,686 0.400
135 0,758
0.200
150 0,838
165 0,907 0.000
180 0,996 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

0,005∗1000∗3300
AE=
5150∗1∗100

U
AE=0,032
mL∗S

 Determinación de la constante de Michaelis-Menten y la Velocidad Máxima:

Sustrato (mg/mL) Sustrato (mM) AE (U/mL*s)


3 0,016 0,029
5 0,027 0,013
8 0,044 0,032

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1/sustrato vs 1/AE
90
80
70
60
50
f(x) = − 0.12 x + 52.55
40 R² = 0.01
30
1/Sustrato (mM)-1 1/AE (mL*s/U) 20
62,5 34,48275862 10
37,03703704 76,92307692 0
22,72727273 31,25 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

y=mx+b

1
b= =52,548
V max

U
V max =0,019
mL∗s

Km
m= =−0,123
V max

Km=−2,341∗10−3 mM
 Determinación de Rendimiento

Grupo Peso fruta (g) Peso latex (g)


1 1504,7 0,6
2 2444 0,5092
3 3663 0,798
4 1458 1,5302
5 982 0,9502
Total 10051,7 4,3876

m latex
%Rendimiento= ∗100
m fruta

4,387
%Rendimiento= ∗100=0,04 %
10051,7

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