Taller BCM 2023: Enzimas y cinética enzimática

II. Enzimas y cinética enzimática

Al finalizar el tema, el estudiante debe conocer los fundamentos teóricos referidos a:

Cinética de las reacciones enzimáticas: Cinética química. Velocidad inicial de reacción (v0) y
dependencia de la concentración de enzima y la concentración de sustrato. Ecuación de
Michaelis-Menten Significado de los parámetros cinéticos Vmax, KM, y constante catalítica kcat.
Representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten. Gráfico de Lineweaver-Burk
(doble recíproco) para la determinación de Vmax y KM. Inhibidores de la actividad enzimática
Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad enzimática.

Medida de la actividad enzimática: Métodos de medida, definición de unidades.

Regulación de la actividad enzimática: Mecanismos de regulación de la actividad

enzimática: Modulación alostérica, modulación covalente, clivaje proteolítico unión a
proteínas, síntesis y degradación de enzimas.

Cooperatividad y alosterismo: Cooperatividad en la unión al sustrato. Definición de

modulador alostérico. Efecto de los moduladores alostéricos sobre los parámetros cinéticos
de la enzima

Problemas a resolver:

1. A continuación se presenta un modelo simplificado de una reacción catalizada por una

enzima con un solo complejo intermedio donde (E) es enzima, (S) el sustrato y (P) el
producto de la reacción. El modelo asume que al inicio de la reacción la v-2 es despreciable
porque [P] es muy baja.

a) Indique qué es ES.

b) Plantee las ecuaciones de velocidad para cada uno de los pasos de la reacción
catalizada por la enzima (v1, v-1 y v2).
Recuerde que para una reacción del tipo: A + B ↔ C, la velocidad de formación de C es: v1 =
k1 [A][B] y la velocidad de formación de A + B, v-1 = k-1 [C]

c) Indique cuál es la ecuación de velocidad para la reacción de formación de producto por la

enzima. ¿Qué ocurre cuando la enzima se encuentra saturada?
d) Plantee la ecuación de Michaelis-Menten y analice de qué depende la velocidad de una
reacción enzimática.
e) ¿Qué ocurre con la velocidad de la reacción si aumenta la [E]? ¿Qué ocurre con la
velocidad de reacción si aumenta la [S]?

2. En el laboratorio se realiza un ensayo para determinar la velocidad de una reacción

catalizada por una enzima. La enzima cataliza la reacción de transformación de A en B.

Observando el gráfico indique:

a. ¿Qué se grafica?
b. ¿Cómo se calcula la
velocidad inicial de la reacción
(vo)? ¿Por qué se mide la
velocidad inicial (vo) de la
reacción en vez de la velocidad
en otro intervalo de tiempo
(por ej. al final)?
c. Determine en forma
aproximada la vo de la
reacción para el tubo 1 y para
el tubo 2.
d. ¿Cuál puede ser la
diferencia entre el tubo 1 y 2?
e. Represente sobre el mismo gráfico lo que se observaría poniendo la mitad de
[enzima] que en el tubo 2. ¿Cuál sería la vo en este caso?
f. ¿Cómo sería el gráfico si se midiera la concentración del compuesto A en función del
tiempo?
 3. A continuación se presenta un gráfico de velocidad en función de la concentración
de sustrato o gráfico de Michaelis-Menten.

a) ¿Cómo se construye el gráfico de velocidad inicial (vo) en función de [S] a partir del
gráfico del ejercicio 2?
b) Al gráfico le faltan las unidades, ¿qué unidades pueden tener la velocidad inicial y la
concentración de sustrato?
c) Indique qué información puede obtener de un gráfico como este.
d) Plantee esquemáticamente el gráfico de doble recíproco o gráfico de
Lineweaver-Burk, indique qué información puede obtener y las ventajas de realizar
un gráfico de este tipo.

4. Se estudia la actividad de una enzima con cinética Michaeliana en un preparado de

hígado. Se pudo determinar que la velocidad máxima (Vmax) es de 100 μM/min y el KM 5
μM. Calcule:

a) La velocidad inicial (v0) de la reacción para los siguientes valores de concentración de

sustrato [S]= 0.5 μM, 5 μM, 50 μM, 500 μM. ¿Cómo es el aumento de la v0 cuando las
concentraciones de sustrato son 50 y 500 uM? ¿A qué se debe?
b) La concentración de sustrato ([S]) necesaria para alcanzar una velocidad inicial (v0) de 50
μM/min. ¿A qué corresponde este valor?
c) La constante catalítica de la enzima si la concentración de enzima total ([Et]) es 1 nM.
d) La Vmax si la concentración de enzima total ([Et]) aumenta 10 veces.
e) El KM si la si la concentración de enzima total ([Et]) aumenta 10 veces.
5. A continuación se presentan los gráficos de velocidad inicial en función del sustrato para
dos enzimas diferentes.

a) Describa el tipo de cinética para cada una de las enzimas.

b) ¿A qué se deben las diferencias en la cinética de estas enzimas?
c) ¿Qué se señala con la línea punteada?
d) ¿A qué corresponden los puntos A, B y C?

6. Se desea determinar el efecto de una molécula J sobre los parámetros cinéticos de la

enzima (E) que cataliza la reacción de A→ P. A continuación se muestra el gráfico de doble
recíproco obtenido en presencia y ausencia de una concentración de [J] = 0.25 mM.

a) Determinar KM y Vmax en las condiciones del estudio en ausencia y en presencia de J.

b) ¿Cuál es el efecto de J sobre los parámetros cinéticos evaluados? ¿Qué tipo de
modulador es J?
c) ¿Cuál sería el efecto de aumentar la concentración de J sobre la Vmax?
d) ¿Qué sucede si se aumenta la concentración de sustrato y se mantiene la
concentración de J?
TALLER COMPUTACIONAL

1. Se desea determinar la velocidad de una reacción catalizada por la Aconitasa:

a) Busque la reacción que cataliza la enzima seleccionada y busque en qué vía

participa.
b) Diseñe el tubo de reacción que tendrá que preparar para estudiar la actividad
(velocidad de la enzima) para la concentración de 8 nM de enzima y 200 µM
de citrato. Defina cómo puede determinar la velocidad de la reacción de
manera experimental.
c) Realice un bosquejo gráfico de cómo espera que cambie la concentración de
sustrato y la concentración de producto en función del tiempo.
d) Utilizando la siguiente hoja de cálculo (haga una copia desde Archivo):

Simulación Actividad enzimática- Taller 2- Cinética enzimática

Siga las instrucciones descritas en la hoja de cálculo y responda:

a. ¿Qué sucede con el gráfico de producto (cis-aconitato) para la

concentración de sustrato (citrato 200 µM) y de enzima (8 nm) a
medida que transcurre el tiempo?
b. ¿Hasta qué tiempo podemos considerar que estamos en condiciones
de velocidad inicial para la concentración de sustrato que utilizó?.
¿Qué representa la pendiente de la parte lineal del gráfico?
c. ¿Qué sucede con el gráfico si en el tubo de reacción no se coloca
enzima? ¿Y si se coloca 16 nM de enzima en el tubo de reacción qué
sucede con la velocidad inicial y la pendiente del gráfico?

2. Determine los parámetros cinéticos para la enzima aconitasa:

Utilizando el mismo simulador que en el ejercicio 1:

a. Describa el diseño experimental a utilizar para determinar los parámetros

cinéticos.
b. Simule y complete la tabla 3 en la hoja de cálculo para la concentración de
enzima de 8 nM. Observe el comportamiento del gráfico, describa qué tipo de
cinética cuenta la enzima.
c. Complete la tabla 4 y realice el gráfico doble recíproco. Determine los
parámetros cinéticos.
d. Escriba la ecuación de Michaelis y Menten con los parámetros cinéticos
obtenidos y determine usando la ecuación:
- La velocidad inicial para una concentración de 450 µM de citrato.
 - La concentración de citrato a la cual se obtiene una velocidad inicial de 25
µM/min?

3. En el mismo simulador (pestaña diferente) se encuentra la posibilidad de determinar los

parámetros cinéticos de las siguientes enzimas:

3A. Piruvato carboxilasa

3B. Invertasa

3C. Malato Deshidrogenasa

3D. Beta galactosidasa

Busque qué reacción catalizan y determine hasta qué tiempo se está en condiciones de
velocidad inicial para una concentración de sustrato igual a 200 µM y 8 nM de enzima.
Determine dicha velocidad.

Determine los parámetros cinéticos para su enzima:

- Realice el gráfico de velocidad en función de la concentración de sustrato para la

enzima seleccionada en el ejercicio 2 y el gráfico de dobles recíprocos.