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Manual Electroforesis Yabar
Manual Electroforesis Yabar
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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS
DE ELECTROFORESIS PARA
PROTEÍNAS Y ADN
Serie de Normas
Técnicas N° 38
Serie de Normas Técnicas N° 39
Lima - 2003
Serie de Normas
Técnicas N° 38
Lima - 2003
MINISTERIO DE SALUD Subcomité Editor
Ministro
Dr. Álvaro Vidal Rivadeneyra Presidente
Dra. Aída Palacios Ramírez
Viceministro
Econ. Carlos Rodríguez Cervantes
Secretario técnico
Dr. César Cabezas Sánchez
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
Jefe
Dr. Luis Fernando Llanos Zavalaga Miembros
Q.F. Zulema Arévalo Chong
Subjefe Dr. Jorge Barnaby Rodríguez
Dra. Aída Cecilia Palacios Ramírez Dr. Zuño Burstein Alva
Lic. Iván Gómez-Sánchez Prieto
Centro Nacional de Salud Pública Dr. Alfredo Guillén Oneeglio
Dra. Susana Zurita Macalupú Dr. César Náquira Velarde
Directora General Q.F Rosa Mendoza Yanavilca
Dra. Frine Samalvides Cuba
Centro Nacional de Alimentación y Nutrición Dr. Víctor Suárez Moreno
Dr. Napoleón Chávez Villanueva
Director General
Secretaria
Centro Nacional de Salud Intercultural Srta. Rocío Solís Agurto
Dr. Carlos del Águila Campos
Director General
Dirección:
Instituto Nacional de Salud
Cápac Yupanqui 1400. Lima 11, Perú.
Telf.: (051-1)471-9920 Anexo 162
E-mail: revmedex@ins.gob.pe
ARTES & DISEÑOS LASER S.R.LTDA. Página web: www.ins.gob.pe
Calle Las Turquesas 263-265-269 - Balconcillo - Lima 13
Teléfono: 265-8320 Telefax: 266-0075 Editor: Dr. Leonid Lecca García
e-mail: artesydisenoslaser@hotmail.com E-mail: llecca@ins.gob.pe
ELABORACIÓN:
AGRADECIMIENTO:
Blgo. Roger Calderón Espinoza
Blgo. Carlos Padilla Rojas
Blgo. Christian Baldeviano Vidalón
Blgo. Omar Cáceres Rey
Blga. Gisely Hijar Guerra
Blga. Elizabeth Sánchez Romaní
CONTENIDO
INTRODUCCIÓN ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ V
SECCIÓN 1: GENERALIDADES 1
1.1 Objetivo ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 1
1.2 Campo de aplicación ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 1
1.3 Abreviaturas y definiciones ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 1
BIBLIOGRAFÍA ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
41
ANEXOS ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
43
INTRODUCCIÓN
La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del análisis de los ácidos nucleicos y proteínas.
Y así como el microscopio permite visualizar microorganismos y estructuras similares, la electroforesis nos ayuda a
observar los ácidos nucleicos y proteínas al final del procedimiento.
El principio básico de la electroforesis consiste en la migración de las moléculas a través de un gel u otro tipo de
matriz de naturaleza porosa, en el cual, por acción de un campo eléctrico, serán separadas de acuerdo a su tamaño
o peso molecular. Para controlar el avance de la separación de las moléculas en la matriz y establecer un patrón de
fragmentos, las moléculas deberán ser teñidas con diferentes colorantes. Estos pasos facilitan la visualización de
las moléculas a manera de simples bandas las cuales serán posteriormente analizadas e interpretadas.
En biología molecular, la mayoría de los estudios básicos y aplicados requieren el uso de la electroforesis; sin
embargo, este procedimiento presenta variaciones de acuerdo al tipo de estudio que se piensa ejecutar. En la
electroforesis de tipo vertical, se analizan tanto moléculas de ADN como proteínas, mientras que en la electroforesis
horizontal generalmente se trabaja con ADN o ARN. De otro lado, existen otros métodos electroforéticos que presentan
ciertas modificaciones, así tenemos la electroforesis en campo pulsado, mayormente usada para separar fragmentos
muy grandes de ADN (ADN genómico), la electroforesis bidimensional para un análisis más sofisticado de las
proteínas etc.
Es importante señalar que la electroforesis en asociación con otras técnicas tales como PCR, e hibridación, brinda
una gran ayuda en el campo de la salud. Gracias a esta técnica es posible visualizar las bandas de ARN o ADN de
patógenos, detectar cambios o mutaciones a nivel genético, visualizar una nueva proteína, entre otros.
SECCIÓN 1
GENERALIDADES
1.1 OBJETIVO
Establecer los procedimientos de la técnica de electroforesis de ADN y proteínas para ser difundidas
en la red de laboratorios.
1.3.12 ácido desoxirribonucleico: molécula compuesta de un anillo de desoxiribosa, una base nitrogenada
y un grupo fosfato que en su conjunto forman una estructura de doble hebra tipo helicoidal. Constituye
el material genético de todo tipo de células y virus de ADN, y tiene como función transmitir la información
genética de una generación a otra.
1.3.13 ácido ribonucleico: molécula compuesta de un anillo de ribosa, una base nitrogenada y un grupo
fosfato. Presenta un rol informativo, estructural y enzimático a nivel de ADN y durante la síntesis de
proteínas.
1.3.14 aminoácido: pequeñas moléculas conformadas por un grupo amino y otro carboxilo y que en su
conjunto forman la estructura de las proteínas.
1.3.15 anfoterismo: propiedad de las proteínas para adaptarse al pH del medio y cambiar de carga,
dependiendo del pH y su punto isoléctrico (pI).
1.3.16 densidad óptica: unidad de medida de absorción de la luz, definido como el logaritmo de la intensidad
de luz de entrada entre la intensidad de luz de salida.
1.3.18 electroforesis: técnica utilizada para separar partículas coloidales tales como proteínas o ácidos
nucléicos a través una matriz sólida (gel de agarosa o poliacrilamida) de acuerdo a su tamaño y
carga eléctrica mediante la aplicación de un campo eléctrico (IUPAC, NHLBI, DOE).
1.3.19 enfoque isoeléctrico: técnica en gradiente de pH montada entre un ánodo y un cátodo, de donde
éste último tiene un pH más alto que el primero.
1.3.20 estructura cuaternaria: se refiere a la estructura tridimensional compleja adoptada por la proteína
compuesta de varios monómeros o polipéptidos.
1.3.21 estructura primaria de proteínas: se refiere a la estructura lineal formada por la unión secuencial
de aminoácidos.
1.3.23 estructura terciaria de proteínas: se refiere a la estructura tridimensional adoptada por la proteína
estabilizada por enlaces covalentes y no covalentes.
1.3.24 grado biología molecular: alto grado de pureza (ausencia de contaminantes externos como
nucleasas, proteasas o pirógenos) que presentan algunos reactivos que son utilizados en pruebas
moleculares.
1.3.25 kilodalton: unidad de medida referente al peso molecular de las proteínas en general.
1.3.26 marcador estándar de peso molecular: fragmentos de ADN de peso molecular conocido utilizados
para determinar el tamaño de una molécula de ADN de interés por comparación después de una
electroforesis.
1.3.27 pares de bases: cada par de nucleótidos complementarios que en conjunto forman una doble hebra
de ADN.
1.3.28 PCR: polimerase chain reaction o reacción en cadena de la polimerasa; reacción enzimática in vitro
por el cual mediante múltiples ciclos de denaturación, alineamiento y extensión se sintetizan grandes
cantidades de una región genética específica.
1.3.29 plásmido: moléculas de ADN circular que se encuentran en la mayoría de bacterias y otros organismos
procariontes y que pueden llevar información genética para el organismo que lo alberga.
1.3.30 polimerización: acción química por el cual las moléculas de acrilamida y bisacrilamida forman un
entramado a manera de malla por la acción de catalizadores (TEMED y APS) generando una sustancia
gelatinosa.
1.3.31 producto de amplificación: Moléculas de ADN sintetizadas en múltiples copias in vitro a partir de
ADN molde mediante el uso de PCR.
SECCIÓN 2
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
2.1 Algunos reactivos utilizados en los procedimientos descritos en este manual tienen la característica
de ser tóxicos, irritantes, corrosivos, cancerígenos, mutagénicos y neurotóxicos, por lo tanto el
investigador siempre deberá usar guantes, mascarillas, lentes protectores y mandil para evitar un
contacto directo o accidental con ellos (Ver más adelante lista de estos reactivos).
2.2 La luz ultravioleta (UV) empleada para la visualización de ADN a 385 nm de longitud de onda con 8W
de potencia ocasiona graves daños oculares y epiteliales, por lo tanto, el investigador deberá contar
con una lámina de policarbonato transparente ubicada entre la lámpara y el punto de observación.
Además, deberá usar lentes de protección contra rayos UV del mismo material.
2.3 El voltaje utilizado para la electroforesis puede generar quemaduras por descarga eléctrica. Aunque
la mayoría de cámaras de electroforesis han sido diseñadas para evitar el contacto directo con la
electricidad, el operador deberá asegurarse de mantener la fuente poder apogada o desconectada al
momento de manipular el equipo.
2.4 El proceso de ebullición de las proteínas en baño maría a 100ºC deberá realizarse con extremo
cuidado para evitar quemaduras. En este sentido, se recomienda utilizar envases de vidrio resistentes
a altas temperaturas (por ejemplo: Pyrex) y gradillas flotantes de polipropileno para colocar los viales.
SECCIÓN 3
3.1 El investigador deberá usar guantes de látex mientras se encuentre trabajando con ADN y proteínas.
Este paso ayudará a evitar la degradación de las biomoléculas por acción de las nucleasas o proteasas
presentes en la superficie de las manos. Asimismo, el uso de guantes evitará que el laboratorista se
exponga ante algún posible riesgo de intoxicación por material infeccioso.
3.2 El material biológico debe ser conservado a bajas temperaturas. El ADN genómico y los productos
de amplificación pueden ser almacenados a 4°C, mientras que el ADN plasmídico a - 20°C. Las
proteínas deben ser conservadas a -80°C o en su defecto a -20°C. Todas las muestras biológicas
deben ser repartidas en alícuotas y en volúmenes pequeños para evitar etapas de descongelamiento
o congelamiento drásticos que ocasionarían un eventual deterioro de las moléculas.
3.3 Debido a la importancia que tiene la medición de volúmenes en los procedimientos de electroforesis,
se sugiere que los insumos destinados para tal fin, las micropipetas y puntas de 10, 20, 200 y 1000
µl, viales de 0,5 y 1,5, tubos de 15, 50 y 250 mL y los equipos de laboratorio, cuenten con un
certificado que acredite la calidad del producto (Ejm: certificado ISO 9000, ISO 8655, DIN 12650).
3.4 Se recomienda que las puntas que se insertan en las micropipetas y que tienen contacto directo con
las moléculas de ADN sean nuevas y estériles, a fin de evitar una posible contaminación de la muestra
con nucleasas. Es importante señalar que es posible trabajar con puntas previamente usadas, siempre
y cuando estén libres de restos orgánicos y hayan sido previamente esterilizadas en autoclave (121°C
a 1,5 psi). Con respecto a la manipulación de las proteínas, no se exige el uso de puntas nuevas
pero sí se recomienda esterilizarlas previamente.
3.5 Se recomienda que los equipos empleados para los procedimientos descritos en este manual cuenten
con un certificado de calidad que garantice su precisión y calibración (Ejm. ISO9000, ISO 8655, DIN
12650).
3.6 Los reactivos a usarse durante los procesos de extracción y purificación de ácidos nucleicos y proteínas
deben tener grado "biología molecular" para asegurar el éxito del procedimiento. El uso combinado
de reactivos de diferente grado de pureza puede llevar a un fracaso del experimento.
SECCIÓN 4
4.1 OBJETIVO
4.2 MATERIALES
4.2.7 Puntas descartables de polipropileno con capacidad para 20, 200 y 1000 µL.
4.3.1 El procedimiento para el ensamblaje de la cámara de electroforesis varía de acuerdo al modelo del
equipo, en consecuencia el investigador deberá seguir las instrucciones que recomienda el fabricante.
4.3.2 Debido a que la mayoría de las cámaras de electroforesis parten del mismo principio técnico, hemos
representado gráficamente un modelo que permite orientar al investigador en el ensamblaje de este
equipo (Figuras N° 1-4).
4.3.3 En general, una cámara de electroforesis vertical puede tener los siguientes componentes:
4.3.3.1 Dos placas de vidrio del mismo grosor y anchura, de acuerdo al fabricante. En algunos modelos, la
altitud de los vidrios es diferente (uno con mayor altitud que el otro). En general, el tamaño de los
vidrios es variable, dependiendo de la dimensión de la cámara.
4.3.3.2 Dos espaciadores, que son dos placas largas de iguales dimensiones hechas de un material flexible
pero resistente (generalmente poliestireno o teflón). La función de los espaciadores es determinar el
grosor del gel.
4.3.3.3 Un peine, cuyos dientes pueden variar en número, tamaño y grosor. Tiene el mismo grosor de los
espaciadores y está confeccionado del mismo material. Sirve para moldear los pocillos donde se
colocarán las muestras
4.3.3.4 Un soporte o base: dispositivo que sirve para permitir el ensamblaje de los vidrios con los espaciadores,
a través de unas serie de prensas que ejercen presión y mantiene fijo todo el sistema
4.3.3.5 El tanque de electroforesis: recipiente que contiene el buffer de corrida superior e inferior. En algunos
sistemas, este tanque contiene electrodos permanentes a lo largo de sus bases listos para ser
conectados. En otras cámaras existe una tapa que contiene los electrodos, de tal manera que el
investigador ya no tiene contacto directo con el buffer durante el proceso de electroforesis.
4.3.3.6 Fuente de poder: aparato que tiene por función proveer de energía eléctrica a la cámara de
electroforesis. El voltaje, el amperaje y el tiempo, pueden ser regulados de acuerdo a las necesidades
del investigador.
Es importante señalar que la cámara de electroforesis ya ensamblada deberá estar ubicada sobre
una superficie totalmente plana y nivelada. Este paso es importante en el momento en el que se
vierte la solución del gel dentro de la cámara, ya que se evita el derrame de la solución y la generación
de matriz desnivelada. Esta última podría generar la distorsión del perfil de las bandas de las proteínas
al final de la electroforesis.
4.4.1 La electroforesis de proteínas descrito en este manual corresponde al sistema discontinuo denaturante.
Es discontinuo porque está conformado por dos geles de poliacrilamida de resolución y empacamiento
que presentan diferente concentración, composición y pH. Ambos geles se encuentran unidos pero
limitados por una fase de separación visible al trasluz. Debido a que en estado líquido ambos geles
pueden mezclarse fácilmente, deben ser preparados por separado esperando la total polimeración
del primero para continuar con la polimerización del otro. El gel de empacamiento generalmente se
localiza en la parte superior del sistema formando los pocillos donde se depositarán las muestras. El
gel de resolución por su parte forma el cuerpo del gel por donde migrarán y se separarán las proteínas.
Cátodo Anodo
Vidrio grande
Peine
Vidrio chico
Tanque de electroforesis
vertical
Espaciadores
Voltímetros
Ganchos o prensas
Reguladores de
voltaje
Base de jebe
Electrodos Interruptor
Peine
Peine
Vidrio
grande
Área para el gel
Vidrio chico
de resolución
Figura N° 2. Modo de ensamblar los vidrios y los espaciadores de una cámara de electroforesis vertical
Ganchos o
prensas
Soporte
Presión
Base de jebe
2. Añadir gel de resolución 5. Colocar peine y dejar polimerizar
Peine
3. Añadir butanol
Dejar gelificando
6. Retirar el peine. Colocar sobre mesa nivelada
Cátodo Ánodo
Buffer de
electroforesis
Fuente de poder
Tanque de electroforesis
vertical
El gel de resolución es la matriz de poliacrilamida donde las moléculas de ADN o proteínas, van a
migrar generando un perfil de bandas o patrón electroforético. Dicho patrón varía de acuerdo al peso
molecular de cada una de las moléculas y a la concentración del gel mismo.
4.5.2 Procedimiento
4.5.2.2 Marcar el límite hasta donde la matriz de acrilamida será vertida, trazando una línea horizontal en el
vidrio con un marcador indeleble. Para saber la ubicación exacta de la línea, colocar el peine entre
ambos vidrios y medir entre uno y cinco centímetros (dependiendo del tamaño de la cámara) por
debajo de los dientes del peine (Figura N° 2)
4.5.2.3 Realizar la preparación del gel de resolución a una concentración de acuerdo a las necesidades,
mezclando los componentes en el orden que se indica en el Anexo A.
4.5.2.4 Aproximadamente 5 mL de solución deberán ser preparados en caso de trabajar con geles pequeños
de aproximadamente 8 - 10 cm de ancho por 5 - 7 cm de largo y un espesor de 0,7 - 0,8 mm. La
concentración de poliacrilamida a usar dependerá de las necesidades del operador.
4.5.2.5 Una vez finalizada la preparación de la solución, añadir los catalizadores APS y TEMED uno por uno,
tratando de mezclar cada reactivo de manera uniforme en todo el volumen.
4.5.2.6 Agregar un volumen de la solución de poliacrilamida entre las placas de vidrio hasta la línea trazada.
Posteriormente, añadir una capa de butanol-agua (aproximadamente 100 µL) sobre la solución de
poliacrilamida para evitar el ingreso de moléculas de oxígeno que retarden la polimerización.
4.5.2.7 Dejar polimerizar a temperatura ambiente por 15 a 30 minutos, usando como control polimerización
la solución de poliacrilamida remanente.
4.5.2.8 Una vez formado el gel, descartar la capa de butanol y lavar la parte superior del gel varias veces con
agua destilada hasta eliminar completamente los restos de acrilamida no polimerizada y butanol.
El gel de empacamiento es la matriz de poliacrilamida que tiene como característica retener a las
proteínas manteniéndolas uniformes antes que ellas migren hacia el gel de resolución. Este proceso
permite mejorar la resolución de las proteínas en la electroforesis.
4.6.2 Procedimiento
4.6.2.3 Una vez finalizada la preparación de la solución, agitar moderadamente sin hacer burbujas a fin de
asegurar que el TEMED y el APS se distribuyan uniformemente en todo el volumen de la solución.
4.6.2.4 Agregar la poliacrilamida entre los vidrios de la cámara y sobre el gel de resolución ya polimerizado.
Inmediatamente después, colocar el peine entre ambos vidrios secando con papel toalla los restos
de poliacrilamida que lleguen a derramarse.
4.6.2.5 Dejar polimerizar la poliacrilamida a temperatura ambiente por 15 a 30 minutos usando como control
de la polimerización la solución de poliacrilamida que quedó remanente en el tubo.
4.6.2.6 Una vez formado el gel, retirar el peine cuidadosamente y lavar todos los pocillos ya formados con
chorro suave de agua destilada.
4.7.1 Objetivo
Someter las muestras de proteínas a procesos químicos y físicos que permitan su óptimo
fraccionamiento en la electroforesis vertical.
4.7.2 Materiales
4.7.2.3 Guantes.
4.7.4 Procedimiento
4.7.4.1 Mezclar la proteína con el buffer de la muestra concentrada por cuatro veces (4x) en proporción 3:1
(tres partes de la muestra y una de buffer).
4.7.4.2 Asegurar la tapa de los tubos con lámina extensible de parafina y someter la muestra a una temperatura
de 100° C durante 5 minutos. Para tal efecto colocar los viales en una gradilla para microtubos dentro
de un recipiente o vaso de precipitación con agua hirviendo.
4.7.4.4 Finalizado el procedimiento, retirar los tubos del vaso de precipitación y centrifugarlos por diez segundos
a 12 000 rpm. Mantenerlos en una gradilla para microtubos dentro de un recipiente con hielo hasta
el proceso de electroforesis.
4.8 ELECTROFORESIS
4.8.1 Objetivo
Fraccionar las proteínas de acuerdo a su peso molecular en una matriz de poliacrilamida usando un
campo eléctrico.
4.8.2 Materiales
4.8.2.5 Guantes.
4.8.4 Procedimiento
4.8.4.1 Todo el procedimiento requiere el uso de guantes a fin de evitar la degradación de las moléculas por
la acción de las proteasas presentes en la mano.
4.8.4.2 Sumergir el sistema contiendo los geles polimerizados en un tanque conteniendo buffer de
electroforesis o de resolución para proteínas 1X. Dicho tanque lleva dos electrodos: uno positivo y
otro negativo (frecuentemente representados por colores rojo y negro, respectivamente) que serán
conectados a una fuente poder (Figuras N° 1 y 5). Al momento de sumergir los geles en el tanque,
asegurarse que los pocillos del gel estén totalmente cubiertos por el buffer.
4.8.4.4 Considerar el uso de un marcador estándar de proteínas para la medición del peso molecular de la
muestra. Dicho marcador debe ser sometido a los mismos tratamientos de la proteína, excepto cuando
se trate de un marcador previamente teñido en que el que se obviará el uso del buffer de la
muestra.
4.8.4.5 Una vez finalizada la colocación de las proteínas en cada pocito del gel, cubrir el tanque con la tapa
y conectar los cables correspondientes de los electrodos en la fuente de poder.
4.8.4.7 Para el cálculo del voltaje es importante conocer la distancia en centímetros del gel desde la parte
superior hasta la parte inferior de la matriz. La distancia multiplicada por voltios (8V - 15 V) permitirá
determinar el voltaje total. El voltaje óptimo dependerá de la naturaleza de la molécula de ADN que
se piensa separar, en consecuencia, se recomienda estandarizar este procedimiento.
4.8.4.8 El valor del amperaje o corriente eléctrica (medida en amperios o miliamperios) dependerá de la
fuerza iónica del buffer. En el caso de trabajar con buffer Tris-Glicina 1X (Ver solución stock, Anexo A),
el valor recomendado es de 25 a 30 miliamperios.
4.8.4.9 Realizar la electroforesis hasta que el frente de corrida (visualizado como una línea azul por el colorante
del buffer) haya llegado a los límites de la parte inferior del gel.
4.8.4.10 Finalizada la electroforesis proceder al desmontaje del equipo empezando con desconectar los
electrodos de la fuente de poder ya apagada y removiendo el sistema que contiene el gel de
poliacrilamida.
4.8.4.11 Levantar lentamente uno de los espaciadores de tal manera que se vaya realizando la separación de
los vidrios que contienen el gel.
4.8.4.12 Separar el gel de empacamiento del gel de resolución realizando un corte transversal.
4.8.4.13 Hacer una pequeña muesca en una de las esquinas del gel, a fin de que sirva de orientación para
ubicar el orden en que fueron cargadas las muestras.
4.8.4.14 Remover el gel. Para realizar este proceso se requiere de mucho cuidado pues el gel es muy frágil
y puede romperse con facilidad especialmente cuando se seca o es de baja concentración. Para
desprender el gel del vidrio remojarlo nuevamente con buffer de electroforesis o agua destilada y
usar uno de los espaciadores a manera de espátula para levantarlo por una de las puntas. Coger el
gel cuidadosamente (usar guantes) y luego sumergirlo en un envase conteniendo el colorante azul
brillante de coomasie.
4.8.4.15 El buffer de electroforesis puede ser devuelto a su frasco original para su posterior uso, pudiendo ser
reciclado hasta cinco veces, después de los cuales se deberá preparar una nueva solución dado que
puede afectar el tiempo de corrida de la prueba.
4.8.4.16 Los vidrios, los espaciadores y el tanque deberán ser lavados con abundante agua y detergentes
especiales que puedan ser fácilmente removidos. Posteriormente, enjuagarlos con agua destilada y
secarlos a temperatura ambiente o en una estufa a 37°C.
CÁTODO ÁNODO
e- e-
e- e-
a
Buffer de
resolución
c Gel de
b d empacamiento
e
e- Gel de
e- resolución
Buffer de
resolución
e- e- e- e- e- e- e- e- e-
e-
Figura N° 5. Interior de una cámara de electroforesis vertical en operación: a) Durante la colocación de la muestra en el pocillo del
gel, b) Después de aplicar un voltaje determinado el cual genera el empacamiento uniforme de las proteínas, c, d y e) las proteínas
migran hacia el ánodo y se distribuyen en el gel a manera de bandas.
(e-)= electrones
4.9.1 Objetivo
4.9.2 Materiales
4.9.2.8 Guantes.
El proceso de coloración se basa en la atracción electrostática del enlace peptídico de las proteínas
sobre grupos de ácido sulfónico que son los que tiñen la proteína de color azul. Asimismo, las fuerzas
de Van der Waals y las interacciones hidrofóbicas participan en este proceso de unión mecánica.
Este paso permite la visualización de proteínas en un rango de sensibilidad entre 0,5 µg y 2 µg.
4.9.4 Procedimiento
4.9.4.1 Todo el procedimiento requiere el uso de guantes a fin de evitar algún tipo de contacto con los
reactivos.
4.9.4.2 Sumergir el gel de poliacrilamida en un envase de vidrio o teflón, conteniendo solución de trabajo de
azul brillante de coomasie en un volumen que permita cubrir completamente el gel. Dejar incubando
con un suave movimiento rotatorio por 15 a 20 minutos. Es importante precisar que el tiempo de
incubación dependerá del grado de sensibilidad requerida en la prueba, de la concentración del gel y
de la sensibilidad del azul brillante de coomasie propiamente dicho. En ese sentido, una máxima
sensibilidad de coloración puede ser obtenida incubando por ejemplo un gel al 5% en 1 hora y un gel
al 10% por 2 horas.
4.9.4.3 Evitar la coloración del gel por más de dos horas, debido a que el colorante puede quedar retenido
fuertemente en el gel generando un fondo oscuro por sobretinción que impediría la visualización de
las proteínas.
4.9.4.5 Cubrir el gel teñido con solución de decoloración rápida e incubar por 30 minutos. Eliminar la solución
decolorante rápida y añadir un segundo volumen de la misma solución hasta apreciar las primeras
bandas. Acto seguido, eliminar la solución de decoloración rápida y añadir la solución decolorante
lenta. Dejar destiñendo a movimiento constante por lo menos una hora, cambiando la solución por
una nueva cuantas veces sea necesario. Seguir destiñendo hasta que las bandas de las proteínas
puedan ser apreciadas claramente.
4.9.4.6 Finalizada la remoción del azul de coomasie, descartar el decolorante usado y lavar el gel. Para
poder analizar los resultados es recomendable secar el gel usando un equipo secador a vacío o
manualmente.
4.9.5.1 Remojar el gel teñido en el reactivo glicerol-metanol por 2 horas con un movimiento de rotación
suave.
4.9.5.3 Cubrir el gel con un segundo celofán previamente remojado en agua y presionar el sistema tipo
"sandwich" con grapas en todos los lados. Dejar secar por 2 días.
4.9.5.4 Remover las grapas y desprender de la placa de vidrio el celofán que contiene el gel.
4.10.1 Las proteínas fijadas en geles de poliacrilamida y teñidas con azul brillante de coomasie se observan
como bandas azules de diferentes pesos moleculares.
4.10.2 El peso molecular de una proteína se mide en kilodaltons (Equivalente a 1 000 Daltons) y puede ser
determinado comparando la banda con un patrón de proteínas estándar de peso conocido denominado
marcador de peso molecular.
4.10.3 La distribución de las proteínas depende de la concentración del gel, por lo tanto, el operador deberá
seleccionar el marcador de peso molecular más adecuado.
4.10.4 Algunas proteínas suelen migrar anómalamente y muchas veces aparecen con un mayor peso del
esperado; ello se debe a que algunas de ellas presentan modificaciones postraduccionales en su
estructura como residuos de glicosilación, fosforilación y acetlización, las cuales podrían retardar la
migración de las muestras.
4.10.5 Las proteínas degradadas (desnaturalización de las proteínas por causa de un agente químico
catalizador, ejm: proteasas) suelen dejar manchas difusas en todo el frente de corrida y a veces
suelen confundirse con proteínas de menor peso molecular (Figuras N° 6 y 7)
1 2 3 4 5 6 7
Figura N° 6. Electroforesis de proteínas totales del virus de la fiebre amarilla en geles de poliacrilamida al 10%. Carril 1 al 5:
concentraciones de 1, 2, 3, 4 y 5 µg de proteína. Carriles 6 y 7: proteínas degradadas.
1 2 3 4 5
97,4 -
66 -
45 -
31 -
21,5 -
Los principales factores que afectan la migración de las proteínas durante la electroforesis son las
siguientes:
Es la fuerza que determina el movimiento o migración de la proteína a través del campo eléctrico. Su
unidad de medición es voltios/cm y es por esa razón que la tasa de migración de una proteína puede
ser alterada cambiando tanto la distancia comprendida entre los electrodos (cm) como el potencial
eléctrico del sistema (Voltaje). Del mismo modo, los valores de E dependen de la fuerza direccional
(Fa) y de la carga neta de la molécula (Q). Puede ser calculada a través de la siguiente fórmula:
E = Fa/Q
E= v/d
Donde:
Fa = Fuerza direccional.
v = voltios.
d = distancia de los electrodos (en centímetros)
Q = carga en (coulomb)
4.11.2 Temperatura
Figura Nº 8. Gel de electroforesis en SDS-PAGE para proteínas mostrando el efecto "sonrisa" o smiling. Figura extraída de Internet.
(http://www.cas.vanderbilt.edu/bsci11a/protein-electro/protein-electro.htm).
a que en la electroforesis, las muestras son sometidas a un determinado campo eléctrico, la migración
de las proteínas en el gel dependerá básicamente de su carga y no de su peso molecular. Para evitar
este efecto, es importante igualar la carga neta de todas las proteínas aprovechando sus propiedades
anfotéricas. En ese sentido, el SDS evita el efecto de diferencias de carga entre las proteínas, a fin de
favorecer la separación de ésta únicamente por su peso molecular.
4.11.4.1 Las proteínas tienen características moleculares que actúan como factores intrínsecos durante la
electroforesis alterando su migración y generando bandas de diferentes tamaños, que no
necesariamente van acorde al peso molecular real del polipéptido. Ciertas modificaciones
postraduccionales, multimerización y formación de complejos con otro tipo de moléculas generan
modificaciones en el tamaño de la proteína dando pesos moleculares aparentes en el momento del
análisis.
SECCIÓN 5
Conocer los procedimientos básicos del proceso de electroforesis horizontal y vertical para ADN.
5.2.1 Objetivo
5.2.2 Materiales
5.2.2.9 TEMED.
El modo de ensamblar una cámara de electroforesis vertical fue detallado en la sección 4.3. Sin
embargo, toda cámara de electroforesis vertical viene acompañada de una serie de especificaciones
técnicas de los fabricantes, en tal sentido recomendamos leer el manual del equipo.
5.2.4.1 El sistema de electroforesis vertical para ADN corresponde al sistema continuo no denaturante. Este
sistema, a diferencia de la electroforesis para proteínas, no utiliza un gel de empacamiento y los
componentes del gel de resolución son totalmente diferentes.
5.2.4.2 Procedimiento
b. No será necesario marcar el límite hasta donde será vertida la poliacrilamida, debido a que el gel
usado es continuo.
d. Aproximadamente 5 mL de la solución deberán ser preparado en caso de trabajar con geles pequeños
(aproximadamente 8 - 10 cm de ancho x 5 - 7 cm de largo y un espesor de 0,7 - 0,8 mm). La
concentración de poliacrilamida para ADN dependerá de los objetivos de trabajo del operador.
e. Una vez finalizada la preparación de la solución, agitar moderadamente sin hacer burbujas a fin de
asegurar que el TEMED y el APS se distribuyan uniformemente en todo el volumen.
f. Agregar un volumen de la solución de poliacrilamida entre las placas de vidrio hasta el tope.
Inmediatamente después, colocar el peine de teflón entre ambos vidrios secando con papel toalla los
restos de poliacrilamida que se lleguen a derramar.
g. Dejar polimerizar la poliacrilamida a temperatura ambiente por 15 - 30 minutos, usando como control
la solución de poliacrilamida que quedó remanente en el tubo.
h. Una vez formado el gel, retirar el peine cuidadosamente y lavar todos los pocillos ya formados con
chorro suave de agua destilada.
5.3.1 Objetivo
Separar las moléculas de ADN de acuerdo a su peso molecular a través de geles de poliacrilamida.
5.3.2 Materiales
5.3.2.5 TEMED.
5.3.2.9 Guantes.
5.3.4 Procedimiento
5.3.4.1 Asegurarse de usar guantes durante la manipulación de las muestras, los reactivos y el equipo.
5.3.4.2 Sumergir el sistema conteniendo los geles polimerizados en su tanque correspondiente. Existen dos
tanques de electroforesis y cada uno de ellos lleva dos electrodos: uno de polo positivo y otro de polo
negativo que serán conectados a una fuente de poder. Asimismo, contiene el buffer de electroforesis
para ADN, en este caso el buffer TBE 1X (Figura N° 9). Al momento de sumergir los geles en el
tanque, asegurarse que los pocillos del gel estén totalmente saturados de buffer.
5.3.4.3 Para colocar el ADN en los pocillos es importante mezclar cinco volúmenes de solución que contiene
el ácido nucleico con un volumen del buffer de la muestra de ADN concentrada 6 veces o buffer de
muestra 6X. Añadir un volumen de buffer de la muestra repartidos en alícuotas, de acuerdo al número
de muestras que se colocarán en los pocillos, sobre un pedazo de lámina extensible de parafina
(Figura N° 10). Acto seguido, añadir cinco volúmenes de cada una de las muestras de ADN sobre las
alícuotas de buffer de la muestra y mezclar totalmente.
5.3.4.4 Mediante el uso de puntas de 20 µl proceder a cargar cuidadosamente la muestra en los pocillos
evitando la contaminación del pocillo contiguo (Figura N° 9).
CÁTODO ÁNODO
e- e- Punta de la
e- micropipeta
e- depositando la
muestra en el pocillo
A
B C D E
Buffer de
resolución
Banda de ADN
e- Gel de resolución
e-
e- e- e- e- e- e- e- e- e-
e-
Figura N° 9. Interior de una cámara de electroforesis vertical para ADN en operación. A: Durante el depósito de la muestra de ADN
mezclado con el buffer de muestra. B-D: Aplicación del voltaje y migración del ADN a través del gel poliacrilamida. E: Las moléculas
de ADN se agrupan en la matriz formando una banda que puede ser visualizada por fluorescencia tiñiendo el ADN con bromuro de
etidio y aplicando luz ultravioleta.
Micropipeta
Lámina extensible
de parafina
Alícuotas de buffer
de la muestra
Figura N° 10. El ADN es mezclado con el buffer de la muestra usando una lámina extensible de parafina antes de colocar las
muestras en el gel de electroforesis.
5.3.4.5 Considerar el uso de un marcador de peso molecular estándar de ADN para la determinación del
peso molecular de la muestra. Preparar el marcador de acuerdo a las intrucciones del fabricante.
5.3.4.6 Una vez finalizada la colocación del ADN en los pocillos, cubrir el tanque con la tapa y conectar los
cables correspondientes de los electrodos en la fuente de poder.
5.3.4.7 Encender la fuente de poder y proceder a seleccionar el voltaje adecuado. El voltaje dependerá
principalmente de las necesidades del operador y del tipo de ADN que es utilizado. Para el caso de
productos de PCR, el voltaje puede estar comprendido entre 75 a 100 voltios. Es importante señalar
que en la electroforesis de ADN el valor del voltaje debe ser constante, a diferencia del valor del
amperaje que dependerá principalmente del valor del voltaje.
5.3.4.8 Luego de seleccionar las condiciones de voltaje, iniciar el proceso de la electroforesis. Durante el
proceso se evidenciarán dos frentes de corrida de diferente color y distancia de migración. Ambos
colores, azul oscuro y azul claro corresponden a los colorantes azul de bromofenol y xilene cianol,
respectivamente, que conforman el buffer de la muestra. El xilene cianol en geles de poliacrilamida
al 8% migra de manera similar a un fragmento de ADN de 160 pb, mientras que el azul de bromofenol
a esta misma concentración de poliacrilamida es equivalente a un fragmento de 45 pb (Anexo B1.3).
5.3.4.9 Detener la electroforesis hasta que ambos frentes de corrida se localicen en la posición deseada por
el operador (este proceso debe ser estandarizado).
5.3.4.10 Finalizada la electroforesis proceder al desmontaje del equipo empezando con la desconección de
los electrodos de la fuente de poder, removiendo el sistema que contiene el gel de poliacrilamida.
5.3.4.11 Levantar lentamente uno o ambos espaciadores a la vez, de tal manera que se vaya realizando la
separación de los vidrios que contienen el gel.
5.3.4.12 Remover el gel de uno de los vidrios. Para realizar este proceso se requiere de mucho cuidado, pues
el gel es muy frágil y puede romperse con facilidad. Para desprender el gel del vidrio, remojarlo
nuevamente con buffer de electroforesis y usar uno de los espaciadores a manera de espátula para
levantarlo por una de las puntas. Desplazar el gel hacia un envase limpio para su respectiva tinción
en bromuro de etidio o en nitrato de plata ( Anexo C).
5.3.4.13 Los vidrios, los espaciadores y el tanque deberán ser lavados con abundante agua y detergente que
no deje residuos. Posteriormente enjuagarlos con agua destilada y secarlos a temperatura ambiente
o en una estufa a 37° C.
5.4.1 Objetivo
5.4.2 Materiales
Nota: Para la preparación del gel es importante tener completamente ensamblada la cámara de
electroforesis ubicándola sobre una superficie totalmente plana asegurando que no presente algún
tipo de declive.
5.4.3.3 Licuar la agarosa y posteriormente enfriarla en baño maría hasta que alcance una temperatura entre
50ºC y 60°C.
5.4.3.4 Añadir agarosa en un volumen dependiente del tamaño de la cámara (20mL-25 mL son suficientes
para dimensiones de L x A x H del gel: 8 x 6 x 0,5 cm) asegurando tener los peines debidamente
insertados (Figura N° 11). Luego dejar enfriar por espacio de 20 minutos.
5.4.3.5 Después que la agarosa haya quedado completamente solidificada, añadir el buffer de electroforesis
TAE 1X entre 0,5 y 1 cm por encima del gel (Figura N° 12). Posteriormente empezar a colocar las
muestras (Figuras N° 10,13 y 14).
Agarosa
Buffer de
Pocillo
electroforesis
0.5 - 1 cm.
Tanque 1 Tanque 2
Gel de agarosa
Electrodos
Figura N° 12. Corte sagital de un sistema de electroforesis de ADN en geles de agarosa. En la figura se
indica el nivel del buffer con respecto al gel de agarosa.
Cámara de
electroforesis
Fuente de
poder
ÁNODO
Buffer de corrida
CÁTODO
5.5.1 Objetivo
Separar las moléculas de ADN de acuerdo a su peso molecular a través de geles de agarosa.
5.5.2 Materiales
5.5.2.5 Guantes.
5.5.4 Procedimiento
5.5.4.1 Asegurarse de usar guantes durante la manipulación de las soluciones, las muestras y el equipo.
5.5.4.2 Mezclar cinco volúmenes de solución conteniendo ADN con un volumen del buffer de muestra 6X.
Para realizar la mezcla, añadir 1 volúmen de buffer de muestra, repartidos en alícuotas de acuerdo al
número de muestras a cargar, sobre un pedazo de lámina extensible de parafina (Figura N° 10).
Añadir cinco volúmenes de cada una de las muestras de ADN sobre las alícuotas de buffer de la
muestra y mezclar totalmente.
5.5.4.3 Mediante el uso de puntas de 20 µL proceder a cargar cuidadosamente la muestra en los pocillos,
evitando la contaminación del pocillo contiguo (Figuras N° 13 y 14).
5.5.4.4 Considerar el uso de un marcador estándar de ADN para la medición del peso molecular de la muestra.
Dicho marcador también debe ser mezclado con buffer de la muestra excepto cuando ya se encuentra
previamente mezclado con el buffer.
5.5.4.5 Una vez finalizada la colocación del ADN en los pocillos, cubrir el tanque con la tapa y conectar los
cables correspondientes de los electrodos en la fuente de poder.
5.5.4.7 Aplicar un voltaje de acuerdo al peso molecular de las moléculas de ADN que se va a separar. Para
el caso de productos de PCR (entre 100 pb a 1,5 kb), se recomienda usar voltajes comprendidos
entre 75 a 100 voltios. Para muestras de ADN genómico y plasmídico (>2kb) se recomienda aplicar
valores entre 25 y 75 voltios. Los criterios para aplicar un determinado voltaje son explicados en la
sección 5.8.
5.5.4.8 Calibrar el tiempo de electroforesis de acuerdo a la posición adoptada por los indicadores azul de
bromofenol y xilencianol en la matriz de agarosa. Esta posición permitie que el investigador tenga
una idea de la ubicación aproximada de su muestra de ADN en el gel. Sin embargo, es importante
que el nvestigador estandarice el tiempo de electroforesis a fin de conseguir la mejor resolución de
ADN.
5.5.4.9 Luego de seleccionar las condiciones de voltaje iniciar la electroforesis. Durante el proceso se definen
dos frentes de corrida de diferente color y distancia de migración. Ambos colores, azul y verde
corresponden a los colorantes azul de bromofenol y xilene cianol respectivamente que conforman el
buffer de la muestra. En geles de agarosa dentro del rango de 0,5 a 1,4% el xilene cianol migra de
manera similar a un fragmento de ADN de 4 Kilopares de bases (Kb), mientras que el azul de bromofenol
se comporta como un fragmento de 300 pb.
5.5.4.10 Detener la electroforesis hasta que ambos frentes de corrida se localicen en la posición deseada por
el investigador.
5.5.4.11 Finalizada la electroforesis proceder al desmontaje del equipo empezando con desconectar los
electrodos de la fuente de poder ya apagada y removiendo el sistema que contiene el gel de agarosa.
5.5.4.12 El buffer de electroforesis puede ser devuelto a su frasco original para su posterior uso en un siguiente
procedimiento. Limpiar la cámara de electroforesis con chorro suave de agua destilada. Secar a
temperatura ambiente.
5.6.1 Objetivo
5.6.2 Materiales
5.6.2.2 Transiluminador.
5.6.2.3 Guantes.
El proceso de coloración de ADN se basa en la propiedad del bromuro de etidio para intercalarse
entre las bases del ADN y posteriormente fluorecer frente a la exposición con rayos ultravioleta. Su
sensibilidad es de aproximadamente 30 pg de ADN por banda, dependiendo del grosor de la matriz
en el que se esté visualizando.
5.6.4 Procedimiento
5.6.4.2 Sumergir el gel de poliacrilamida o agarosa en un envase de teflón conteniendo bromuro de etidio a
una concentración de 1µg/mL y dejar incubando por 5 minutos en reposo.
5.6.4.3 Devolver la solución de bromuro de etidio en su frasco original y lavar el gel cuidadosamente con
abundante agua.
5.6.4.4 Trasladar el gel hacia un cuarto oscuro donde se encuentre un transiluminador de luz UV.
5.6.5.1 Las moléculas de ADN son visualizadas indirectamente cuando son coloreadas con bromuro de
etidio, fluoreciendo como bandas de un color naranja frente a la luz UV. Las moléculas de ADN que
son más grandes, generalmente migran más retardadamente que las moléculas de menor peso
(Figura N° 15).
1 2 3
4000-
1000-
500
Figura N° 15. Resultado de una electroforesis horizontal de ADN en gel de agarosa. Carril 1:marcador de peso molecular. Carril 2
y 3: moléculas de ADN del gen ial de Bartonella baciliformis.
5.6.5.2 Para determinar el peso molecular del ADN es necesario usar un marcador estándar de peso molecular
conocido, el cual al ser comparado con la muestra problema permite determinar de manera aproximada
el número de pares de bases de la molécula a analizar. Estos marcadores comerciales además
pueden ser útiles como controles positivos del sistema de visualización del ADN, principalmente
cuando se piensa evaluar la calidad del bromuro de etidio de la matriz (agarosa o poliacrilamida), o
para determinar la intensidad del ADN que estamos evaluando (cálculos cualitativos de concentración
de ADN), etc.
5.6.6.1 Cubrir el fondo de un embudo con capacidad para 100 mL de solución con papel filtro Whatman N° 1.
5.6.6.2 Añadir 300 mg de carbón activado sobre el papel filtro y filtrar la solución de bromuro usado sobre el
carbón.
5.6.6.5 Eliminar el carbón de un año de antigüedad así como los geles de agarosa teñidos con bromuro de
etidio en bolsas de plástico de bioseguridad.
5.6.6.6 Incinerar.
5.7.1.1 De manera alternativa, es posible visualizar ADN en geles de poliacrilamida a través del método de
tinción con plata. La ventaja de este método es que es de dos a cinco veces más sensible que el
bromuro de etidio (detecta desde 0,1 a 0,001 ng de ADN por banda) y es menos tóxico. Del mismo
modo, puede teñir ADN precoloreado con bromuro de etidio sin interferir en el resultado final.
5.7.1.2 Entre las desventajas que tiene este método es que también utiliza reactivos peligrosos, como el
formaldehído, y requiere el uso de solución de nitrato de plata en cantidades moderadamente altas
que con el tiempo resultaría muy costoso.
5.7.1.3 Es importante señalar que el método de tinción con plata también puede ser aplicado para la
visualización de proteínas usando un protocolo similar que no será descrito en este manual. Para el
caso de las proteínas, la sensibilidad del método es de 10 a 50 veces más alto que usando azul
brillante de coomasie (Puede detectar de 0,1 a 1,0 ng de polipéptido).
5.7.1.4 En general, el proceso de tinción con plata surge como una buena alternativa para la visualización de
ADN y proteínas; sin embargo, el procedimiento demanda mucho tiempo y esfuerzo, y en muchos
casos es necesario estandarizar las condiciones.
5.7.2 Materiales
5.7.2.1 Guantes.
5.7.3. Procedimiento
5.7.3.2 Colocar el gel de poliacrilamida en una bandeja conteniendo solución de fijación e incubar en agitación
constante durante 30 minutos. Alternativamente, el gel puede dejarse en solución de fijación, en
reposo durante toda la noche.
5.7.3.3 Retirar el gel de la solución de fijación y colocarlo en un recipiente con agua destilada.
5.7.3.4 Lavar el gel con agua destilada agitando constantemente durante dos minutos, repetir esta operación
tres veces.
5.7.3.5 Retirar el gel del recipiente (dejar secar sobre una lámina de plástico o placa petri por 10 a 20
segundos).
5.7.3.6 Colocar el gel en la solución de tinción y dejar en agitación constante durante 30 minutos.
5.7.3.7 Retirar el gel de la solución de tinción y lavar en agua destilada durante 5 segundos.
5.7.3.9 Inmediatamente colocar el gel en la solución de revelado (Anexo A) y dejar en agitación constante
hasta que empiecen a aparecer las bandas.
5.7.3.10 Cuando las bandas hayan alcanzado la intensidad deseada, agregar una solución fría (4°C -8°C) de
reactivo de parada o detención y dejar en agitación hasta que no aparezcan más burbujas.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Figura N° 16. Gel de poliacrilamida teñido con plata para la visualización de moléculas de ADN. Carril1: Marcador de peso molecular.
Carril del 2 al 12: ADN ribosomal de mosquito Aedes aegypti.
Existen diferentes factores que tienen una marcada influencia sobre la distribución de las moléculas
de ADN. Generalmente, estos factores suelen confundir los resultados finales, por lo que se recomienda
al investigador estandarizar algunos parámetros importantes que en la práctica suelen pasar
desapercibidos. Estos factores pueden ser:
Generalmente la tasa de migración del ADN es inversamente proporcional al log10 del número de
pares de bases que conforman la molécula. Esto significa que las moléculas de ADN más grandes
generalmente migran más lentamente que las más pequeñas.
Una molécula de ADN migrará y se distribuirá de modo diferente a medida que varíe la concentración
de la matriz de agarosa o poliacrilamida. Este fenómeno se puede explicar matemáticamente mediante
la siguiente fórmula:
Existen moléculas de ADN que a pesar de presentar el mismo peso molecular adoptan conformaciones
estructurales diferentes. Un ejemplo de ello son los plásmidos que en la mayoría de los casos generan
estructuras superenrrolladas, formas lineales o formas circulares menos enrolladas o relajadas. En
la electroforesis, estos plásmidos migran de manera no uniforme y se distribuyen en la matriz de
agarosa de tal manera que dan la impresión de tratarse de moléculas de diferente peso molecular.
Sin embargo, estas diferencias pueden ser alteradas variando algunos parámetros físicos como la
fuerza iónica del buffer, el voltaje aplicado o la concentración misma de agarosa (Figura N° 17).
Este parámetro es muy importante en la electroforesis ya que permite la movilización de las moléculas
de ADN de un polo a otro. Es de resaltar que a medida que aumenta la fuerza del campo eléctrico
(aumento de voltaje), se incrementa la movilidad de las moléculas de ADN de alto peso molecular
pero de manera indistinta. Ello genera que las moléculas no se separen completamente unas de
otras pese a aumentar la velocidad de la electroforésis. En consecuencia, se recomienda no aplicar
más de 5V/cm para moléculas de ADN mayores de 2 Kb.
23130-
9416-
6557-
4361- ADN circular
relajado
ADN circular
2322- enrollado
2027- ADN
superenrollado
Figura N° 17. Electroforesis de ADN plasmídico de E. coli fraccionado en agarosa a diferentes concentraciones. Carril 1: Marcador
de peso molecular Lambda Hind III en agarosa al 1,5% Carril 2: Plásmido en agarosa al 1,5%, Carril 3: Plásmido en agarosa al 1%.
Carril 4: Plásmido en agarosa al 0,8% . Las flechas indican las distintas conformaciones estructurales del ADN plasmídico. En el
carril 3 se puede apreciar una menor concentración de ADN.
Durante una electroforesis normal, las moléculas de ADN migrarán a través de una determinada
dirección influenciada por un campo eléctrico. Esta dirección tiene singular repercusión sobre la tasa
de migración de una molécula de ADN. Mientras este factor permanezca constante, la dirección de
la migración del ADN se mantendrá inalterable. Sin embargo, existe la posibilidad de alterar la dirección
del campo eléctrico y con ello es posible cambiar el curso de la migración del ADN. En ese sentido, si
consideramos fraccionar dos grandes moléculas de ADN que miden entre 50 y 100 kb (por ejm. ADN
genómico) bajo un campo eléctrico de una sola dirección el resultado final será la presencia de una
sola banda difusa en el que se encuentren ambos fragmentos. Pero, si realizamos un cambio en la
dirección del campo eléctrico, las moléculas más grandes de 100 kb se autoalinearán, alterarán su
migración y se podrán separar en dos fragmentos completamente distinguibles. Este tipo de
electroforesis es conocido como electroforesis de campo pulsado (PFGE o Pulse Field Gel
Electrophoresis), y es bastante usado para la separación de moléculas de ADN de grandes tamaños
(por encima de 100 kb).
En geles de agarosa, la composición de las bases del ADN y la temperatura no son factores que
influyen sobre la migración del ADN. En ese sentido no existen diferencias de migración de las
moléculas de ADN desde 4° C a 30° C. Sin embargo, en concentraciones de ADN por debajo del
0,8%, un eventual aumento de temperatura por encima de 50°C (cambio que puede ocurrir al aumentar
el voltaje de electroforesis o por la alta fuerza iónica del buffer) puede generar la licuación del gel y en
consecuencia la pérdida de la muestra del ADN.
Algunos investigadores prefieren mezclar el ADN con el bromuro de etidio antes de realizar la
electroforesis. Ello genera que el bromuro de etidio se intercale entre las bases del ácido nucleico
produciendo una alteración del peso molecular del ADN y reduciendo su movilidad durante la
electroforesis, en aproximadamente un 15%. Para evitar este problema se recomienda realizar primero
la electroforesis y posteriormente la tinción del gel de agarosa con bromuro de etidio a fin de evitar
distorsiones en la migración del ADN.
La migración del ADN es afectada por la composición y la fuerza iónica del buffer de electroforesis.
En un caso hipotético en que por error se llevase a cabo la electroforesis usando agua en lugar de
buffer, la conductividad eléctrica disminuiría drásticamente por la falta de iones y, en consecuencia,
la migración del ADN sería casi nula. Si la concentración de iones fuera excesivamente alta, la
conductividad eléctrica sería muy eficiente y se generaría un sobrecalentamiento del buffer. El calor
excesivo podría causar la licuación de la agarosa o la denaturación del ADN.
Actualmente se dispone de distintos buffers para electroforesis de ADN de doble hebra. Los más
usados son el buffer TAE (Tris, ácido acético y EDTA) y el TBE (Tris Borato EDTA). La ventaja de usar
TAE es que es menos costoso y a diferencia del TBE permite que las moléculas de ADN migren 10%
más rápido. El TBE por su parte es un buffer muy eficiente y no se sobrecalienta fácilmente a grandes
voltajes. Por esta razón, este buffer es usado para la resolución de grandes fragmentos de ADN en
matrices poco concentradas.
SECCIÓN 6
VARIANTES DE ELECTROFORESIS
Nuevos protocolos y técnicas basadas en la electroforesis de ADN y proteínas, han venido apareciendo
en los últimos años. Mencionaremos brevemente los más importantes:
6.1.1 Es un proceso de separación e identificación de proteínas en dos dimensiones, orientando los frentes
de corrida en ángulo recto uno de otro. En tal sentido, las moléculas primero son separadas por su
carga o punto isoeléctrico (pI) por la técnica de enfoque isoeléctrico o IEF (Isoelectric Focusing).
Posteriormente, las proteínas son separadas de acuerdo a su tamaño o peso molecular por
electroforesis en SDS PAGE (Figura N° 18).
6.1.2 A diferencia de la electroforesis en una dimensión en el que se puede resolver cerca de 50 bandas,
la electroferesis de dos dimensiones permite resolver 2500 manchas de polipéptidos.
Figura N° 18. Electroforesis en dos dimensiones de proteínas totales de Caenorhabditis elegans (Tomado de: http://www.aber.ac.uk/
parasitology/Proteome/Tut_2D.ht).
6.2.1 Como su nombre lo indica este tipo de electroforesis se lleva a cabo en finos capilares de sílica
fundida cubierta con poliamida. Los tubos de sílica tienen una longitud de 30 a 100 cm con un diámetro
de 25 a 100 µm y presentan radicales oxidrilo que al disociarse confieren una carga neta negativa.
6.2.2 El proceso se realiza en condiciones de alto voltaje y de campo eléctrico, donde el calor generado es
eficientemente disipado gracias a la acción de los pequeños capilares. Para este propósito, el buffer
utilizado en el sistema Tris 0,02 M pH = 8,6 pasa por los capilares removiendo los H+ de los radicales
oxidrilos. Con ayuda de corriente eléctrica se generará un flujo de protones hacia el cátodo, proceso
conocido como flujo endo-osmótico.
6.2.3 Este tipo de electroforesis permite separar una gran variedad de moléculas entre las cuales tenemos:
proteínas, péptidos, aminoácidos, ácidos nucleicos, iones inorgánicos, bases orgánicas, ácidos
orgánicos y células en general.
6.2.4 En este sistema el tiempo de separación es relativamente corto (5 a 10 minutos), mientras que la
eficiencia de separación es muy alta (Figura N° 19).
Detector
Fuente de luz
280 nm
Buffer Buffer
Foto-receptor
Computadora
con registrador
E = V/d
Figura N° 19. Esquema representativo de un modelo de electroforesis capilar (E= campo eléctrico, V = voltaje, d= distancia). La
figura es una versión modificada de http://ntri.tamuk.edu/ce/ce.html
Es una técnica diseñada especialmente para la separación de ADN de alto peso molecular (>100
kilopares de bases). PFEG (Pulsed-Field Electrophoresis Gel) opera alternando dos diferentes campos
eléctricos sobre una matriz de agarosa; de esta manera es posible alterar la migración del ADN hacia
diferentes direcciones facilitando la separación de dos grandes moléculas de ADN.
SECCIÓN 7
7.1 GENERALIDADES
7.1.1 Se recomienda que los equipos utilizados en biología molecular cuenten con un certificado de calidad
avalado por sus propios fabricantes, a fin de asegurar el óptimo funcionamiento de las pruebas
moleculares.
7.1.2 Asimismo, los reactivos que se empleen deberán ser de grado biología molecular a fin de asegurar
resultados satisfactorios después de cada experimento. Para el caso de algunos reactivos que
exigen mantenerse en refrigeración, deberán ser evaluados por el propio investigador que los adquirió
antes de realizar cualquier experimento. Para el caso del TEMED, el cual es adquirido en condiciones
de refrigeración, el control de calidad se realiza preparando geles de poliacrilamida. Generalmente,
la polimerización no debe demorar más de media hora.
7.1.3 La acrilamida/bisacrilamida es otro reactivo importante que en polvo puede guardarse a temperatura
ambiente; sin embargo, en estado de solución puede mantenerse en refrigeración hasta por 6 meses.
7.1.4 Es importante verificar la calidad de los reactivos y soluciones de trabajo preparados en laboratorio.
7.2.1 Tanto el buffer de electroforesis para proteínas como de ADN, deberán ser preparados adecuadamente
y renovados en forma periódica. En tal sentido, se recomienda preparar solución stock de buffer de
electroforesis concentrado 10 veces para proteínas (Anexo A) ó 50 veces para ADN (Anexo A). Este
paso permite conservar la reproducibilidad del experimento.
7.3.1 En el caso del APS es un reactivo que se caracteriza por ser altamente higroscópico, es decir, suele
hidratarse con facilidad. Por lo tanto, deberá realizarse un control periódico del frasco que lo contiene
a fin de evitar la humedad en su interior y consecuentemente la pérdida de sus propiedades químicas
durante el proceso de polimerización.
7.3.2 Para controlar la calidad de este reactivo verificar que el contenido no se encuentre endurecido ni
que se hallen gotas de agua en su interior. De otro lado, preparar geles de poliacrilamida usando
APS al 10% y verificar que la polimerización no demore por más de media hora.
7.3.3 Para evitar la hidratación del APS se recomienda guardarlo en ambientes secos asegurando la tapa
con lámina extensible de parafina.
7.4.1 La solución de trabajo (1 µg/mL) debe tener un color casi transparente. Una vez preparada la solución,
forrar el frasco con papel aluminio y rotular.
7.4.2 La calidad del bromuro de etidio puede ser verificado visualizando concentraciones de ADN desde 50
pg (Sección 6.3) en un gel de agarosa incubado durante 5 minutos. La visualización de la mínima
concentración de ADN permitirá determinar la calidad óptima del bromuro de etidio.
7.4.3 El contacto de este reactivo con la luz puede ocasionar la pérdida de sus propiedades fluorescentes
por lo que se recomienda incubar los geles en oscuridad.
7.5 AGAROSA
7.5.2 De otro lado también se recomienda, verificar la presencia de residuos extraños en la solución ya que
pueden interferir con el análisis del resultado final y con la electroforesis misma. Por lo tanto, será
necesario preparar una nueva solución a fin de superar este inconveniente.
Esta solución de trabajo debe ser renovada cada mes debido a que la constante exposición a la luz
y el cambio de temperatura fácilmente deterioran su calidad.
7.7.1 En biología molecular la calidad del agua (grado de pureza) es imprescindible para obtener óptimos
resultados en cada experimento. En ese sentido, se recomienda preparar tanto los buffers para
proteína y ADN, así como también para los geles de poliacrilamida y agarosa con agua bidestilada. Si
el investigador cuenta con un equipo de destilación asegúrese que el agua presente una resistividad
eléctrica dentro de un rango de 10 a 18 Meghoms (rango por el cual existe una mínima concentración
de iones y cationes de agua, lo cual indica un alto grado de pureza).
7.8.1 Los equipos que se usan en biología molecular deben pasar por un proceso de mantenimiento
preventivo continuo por lo menos una vez al año. Este proceso deberá ser realizado por personal
técnico altamente capacitado o de preferencia por representantes de la misma compañía fabricante.
SECCIÓN 8
REGISTROS Y ARCHIVOS
Para llevar a cabo el registro y archivo de resultados finales es importante seguir los siguientes
pasos:
8.1 Para conservar los resultados en el cuaderno de trabajo a partir de un gel de agarosa visualizado con
la luz UV, tomar una fotografía con una cámara fotográfica resistente a este tipo de luz.
8.2 En caso de no ser posible tomar una fotografía, tratar de dibujar con un lápiz el resultado lo más
parecido posible a lo que se observa. De manera alternativa, usar un forro de plástico para cuaderno,
colocarlo sobre la lámina de protección de luz UV y dibujar el gel con un marcador para vidrio.
8.3 Para la conservar los resultados a partir de geles de poliacrilamida para ADN, el proceso puede
realizarse usando una cámara fotográfica. Sin embargo, es posible recurrir a la tinción con plata y
secar el gel para su posterior análisis y registro. Para el caso de proteínas teñidas con azul brillante
de ccomasie también se recomienda secar el gel.
ESQUEMA N° 1
FECHA: _______________
OBJETIVO DEL
EXPERIMENTO: _____________________________________________________________________________
CARRIL 1: _________________________________
CARRIL 2: _________________________________
CARRIL 3: _________________________________
CARRIL 4: _________________________________
CARRIL 5: _________________________________
CARRIL 6: _________________________________
CARRIL 7: _________________________________
CARRIL 8: _________________________________
CARRIL 9: _________________________________
CARRIL 14:_________________________________
OBSERVACIONES: __________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________________________
___________________________________________
BIBLIOGRAFÍA
• Andrews, A. T. Electrophoresis of nucleic acids. In: Essential Molecular Biology. A Practical Approach.
New York: T. A. Oxford University Press Ed. Brown; 1991.
• Berg G, Garfin D. Protein and nucleic acid blotting and inmunobiochemical detection. Biotechniques
1985; 3: 276.
• BIO-RAD. Acrylamide polymerization-a practical approach. US/EG Bulletin 1156, 1989. 3 pp.
• Darnell J, Lodish H, Baltimore D. Molecular cell biology. 2nd ed. New York: Scientific American
Books; 1990.
• Instituto Nacional de Salud. Normas de Bioseguridad. 2ª ed. Lima: Instituto National de Salud.
2002. Serie de Normas Técnicas Nº 18.
• Maizel RM, Blexter ML, Robertson BD, Selkirk ME. Parasite antigens parasite genes. A laboratory
manual for molecular parasitology. Cambridge: Cambridge University Press; 1992.
• Montoya Y, León C, Nolasco O, Talledo M, Padilla C, Velarde M, et al. Guía de práctica del curso
teórico-práctico: WESTERN BLOT y ELISA. Lima: Instituto Nacional de Salud; 1999.
• Purves WK, Orians GH, Heller HC, Sadava D. Life: the science of biology. 5th ed. Massachusetts:
Sinauer Associates Inc.; 1997.
• Roitt I, Brostoff J, Male D. Immunology 3th ed. London: Ed. Consultant; 1993.
• Sambrook J. Fritsch EF, Maniatis T. Gel electrophoresis DNA and molecular cloning. In: Molecular
cloning a laboratory manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989.
• Westermeier R. Electrophoresis in practice. VHC Publishers Inc. New York. 1993. 277 pp.
ANEXOS
ANEXO A
Disolver con 100 mL de agua bidestilada. Filtrar para remover las impurezas en papel Whatman N° 1
y forrar el recipiente con papel aluminio o kraft.
Pesar 181,65 g de tris base y enrasar con agua bidestilada hasta un volumen de 1 L. Ajustar
a pH= 8,8 con HCl.
Pesar 60,55 g de tris base y enrasar con agua bidestilada hasta un volumen de 1 L. Ajustar a
pH = 6,8 con HCl.
Pesar 100 mg y diluir en un volumen final de 1 mL con agua tridestilada. Este reactivo en polvo es
altamente hidrofílico, por lo tanto, es importante mantener el envase herméticamente cerrado. Esta
preparación debe ser de 1 semana de antigüedad como máximo.
A.1.7 BUTANOL-AGUA
Mezclar un volumen de butanol más un volumen de agua destilada y mezclar. Tomar la fase superior
de la mezcla.
GEL AL 10%
Agua bidestilada 1,9 4,0 5,9 7,9
Acrilamida/bisacrilamida 30% 1,7 3,3 5,0 6,7
Tris 1,5 m pH 8,8 1,3 2,5 3,8 5,0
SDS 10% 0,05 0,1 0,15 0,2
Persulfato de amonio 10% 0,025 0,05 0,075 0,1
TEMED 0,0025 0,05 0,0075 0,01
VOLUMEN FINAL DE LA SOLUCIÓN
GEL AL 12%
Agua bidestilada 1,6 3,3 4,9 6,6
Acrilamida/bisacrilamida 30% 2,0 4,0 6,0 8,0
Tris 1,5 m pH 8,8 1,3 2,5 3,8 5,0
SDS 10% 0,05 0,1 0,15 0,2
Persulfato de amonio 10% 0,025 0,05 0,075 0,1
TEMED 0,0025 0,05 0,0075 0,01
GEL AL 15%
Agua bidestilada 1,1 2,3 3,4 4,6
Acrilamida/bisacrilamida 30% 2,5 5,0 7,5 10,0
Tris 1,5 m pH 8,8 1,3 2,5 3,8 5,0
SDS 10% 0,05 0,1 0,15 0,2
Persulfato de amonio 10% 0,025 0,05 0,075 0,1
TEMED 0,0025 0,05 0,0075 0,01
COMPONENTES DE LA SOLUCIÓN 3 mL 4 Ml 6 mL 8 mL
Agua bidestilada 1,1 2,3 3,4 4,6
Acrilamida/bisacrilamida 30% 2,5 5,0 7,5 10,0
Tris 1,5 m pH 8,8 1,3 2,5 3,8 5,0
SDS 10% 0,05 0,1 0,15 0,2
Persulfato de amonio 10% 0,025 0,05 0,075 0,1
TEMED 0.0025 0.05 0.0075 0.01
Mezclar 10 mL de ácido acético glacial con 50 mL de metanol. Llevar la solución a 100 mL con 40 mL
de agua destilada.
Mezclar 10 mL de ácido acético glacial con 5 mL de metanol. Llevar la solución a 100 mL con 85 mL
de agua destilada.
Mezclar 4 mL de glicerol con 45mL de metanol. Llevarlo a un volumen de 100 mL de agua destilada.
Disolver 10 g de SDS en 80 mL de agua bidestilada, una vez disuelto se lleva a pH 7,2 con 10 N de
NaOH, finalmente se completa hasta 100 mL con agua bidestilada.
Preparar:
Preparar:
Nota: El bromuro de etidio es un agente cancerígeno y moderadamente tóxico. Usar guantes para
manipular este reactivo
Pesar 100 mg de bromuro de etidio en 10 mL de agua bidestilada. Forrar el recipiente con papel
aluminio u otro que impida el paso de la luz.
Diluir 100 µL de bromuro de etidio a partir de la solución stock en 100 mL de agua bidestilada. Forrar
el recipiente con papel aluminio u otro que impida el paso de la luz.
Disolver 3 gr de carbonato de sodio (Na2CO3) en 100 mL de agua bidestilada. Dejar enfriar Agregar
150 µL de formaldehído al 37% y 1 mg de tiosulfato de sodio pentahidratado segundos antes de ser
usado.
ANEXO B
1 mg = 10-3 g
1 µg = 10-6 g
1 ng = 10-9 g
1 pg = 10-12 g
1Kb de ADN equivale a 333 aminoácidos de capacidad codificante = 37,000 Daltons
B.1.3 Rango de movilidad del ADN, xilene cianol y azul de bromofenol por diferentes concentraciones
de geles de poliacrilamida
Acrilamida Rango de separación Xilene Azul de
(% peso/volumen) efectiva en pb Cianol FF (*) bromofenol (*)
3,5 1000 - 2000 460 100
5,0 80 - 500 260 65
8,0 40 - 200 160 45
12,0 60 - 400 70 20
15,0 25 - 150 60 15
20,0 6 - 100 45 12
(*) Los números dados son los tamaños aproximados en pares de bases de fragmentos de ADN de
cadena doble con lo cual los colorantes migran en conjunto (Fuente: Sambrook et. al., 1989)
0,3 5 - 60
0,6 1 - 20
0,7 0,8 - 10
0,9 0,5 - 7
1,2 0,4 - 6
1,5 0,2 - 3
2,0 0,1 - 2
ANEXO C
En casi todos los casos en los que se tiene contacto con los reactivos que se mencionan en la lista
adjunta, es importante seguir los siguientes pasos como medida de emergencia:
• Si el reactivo hizo contacto con los ojos, lavar con abundante agua por espacio de 15 a 20 minutos
hasta que no haya evidencia de restos del reactivo. Si el contacto fue en la piel, lavar con jabón y
abundante agua.
• Si hubo inhalación, trasladarse inmediatamente hacia un área donde haya aire fresco.
REACTIVO CARACTERISTICA
MPR-CNSP-016
una semana de antigüedad. burbujas.
Preparar nueva solución de trabajo de APS al 10%
Muestra no cae eficientemente y se difunde en el Muestras de proteínas no fueron calentadas a 100° Calentar las muestras a 100°C antes de colocarlas
buffer de electroforesis en el momento que es C antes de ser depositadas en el gel de en los pozos.
depositada en el pocillo. agarosa.Buffer de la muestra tiene baja No diluir mucho el buffer de la muestra con la
concentración de glicerol o sucrosa en el medio. muestra propiamente dicha.
Volver a preparar buffer de la muestra.
Deficiente polimerización de los geles de Solución de trabajo de persulfato de amonio (APS) Preparar nueva solución de trabajo de APSMezclar
poliacrilamida. al 10% con más de una semana de antigüedad. los componentes de tal manera que no se generen
Poliacrilamida con más de un mes de antigüedad. burbujas.
Presencia de burbujas en la solución. Preparar nueva solución de acrilamida/
bisacrilamida.
Se pierde volumen del buffer de la cámara de Fuga de buffer. Para evitar cualquier tipo de fuga del buffer localizar
electroforesis durante la corrida. el lugar de escape y untar con una capa mediana
53
de vaselina.
ANEXO D
Buffer de electroforesis se calienta excesivamente Alta concentración de sales (mayor de 1X de Medir el pH del buffer.
(por encima de los 60° C). concentración)pH del buffer menor de 8.Preparación Volver a preparar el buffer con los reactivos
del buffer de electroforesis con Tris-HCl en lugar de adecuados y si es posible volver a preparar la
Tris-Base.Buffer viejo usado varias veces solución stock 10X.
Evaluar la precisión de los instrumentos de
medición (probetas, pipetas, etc.).
Disminuir voltaje.
Preparar nueva solución de trabajo.
Manchas indefinidas o difusas de proteína/ADN a Degradación de la proteína/ADN. Manipular las proteínas en frío. Todo procedimiento
lo largo de todo el gel. Efecto "smearing". que involucre manipulación del ADN como de
proteínas debe realizarse con guantes.
PROBLEMAS MÁS COMUNES PRESENTES DURANTE LOS PROCEDIMIENTOS DE ELECTROFORESIS
Manual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN
ANEXO E
E.1.1 Preparar 500 ml de Buffer TAE 1X a partir de una solución stock de TAE 50X
Solución
Si se toma un volumen inicial de la solución stock concentrada 50X de buffer TAE para diluirla con
agua hasta obtener 500 mL de buffer TAE concentrado a 1X. ¿Cómo calcular dicho volumen?
Se tiene los siguientes datos:
Volumen inicial 1 (V1)= ? Concentración inicial 1 (C1) = 10X
Volumen final 2 (V2)= 500 mL Concentración final 2 (C2) = 1X
Solución
Calcular cuanto de agarosa debemos pesar y qué volumen de TAE 50X emplear para un volumen
final de 250 mL de agarosa al 1,5%.
V1 = 5 mL
Rp.- Pesar 3,75 g de agarosa, luego añadir 5 mL de TAE 50X y llevar toda la mezcla a un volumen de
250 mL con agua bidestilada.
Solución
V1 = 45 mL
Rp.- Usaremos 45 mL de TBE 10 X para preparar 450 mL de TBE 1X
E.1.4 Preparar 100 mL de bromuro de etidio a una concentración de 1µg/µl a partir de una solución
stock de 10 mg/mL.
Solución
10 000 µg = 10 µg/µL = C1
1000 µL
Reemplazando en (1)
V1 (10 µg/µL) = (1 µg/µL)(100 mL)
V1 = 10 mL
Rp.- Se necesita un volumen de 10 mL de stock de bromuro de etidio (10 mg/mL) para diluirlo con
990 mL de agua bidestilada.
E.1.5 Preparar 50 mL de una solución de EDTA al 0,5M. El peso molecular del EDTA es de 336,2 g/Mol
Solución
W = M x PM x V.........................(a)
Donde: W = es el peso que queremos calcular expresado en gramos, PM= corresponde al peso
molecular del compuesto compuesto en g/Mol y V = Volumen expresado en litros.
Datos:
PM del EDTA = 336,2 g/Mol.
Molaridad = M = 0,5M = 0,5 Moles/Litro.
Volumen EDTA que se quiere preparar = 50 mL. Convirtiendo 50 mL a litros (Lt):
1 Lt contiene 1000 mL
x Lt habrá en 50 mL
W = 8,405 g
Rp.- Diluir 8,405 g de EDTA en 50 mL de agua para preparar una solución 0,5 M de EDTA.
Solución
Cuando se refiere a una proporción 1:1 significa que se debe realizar una mezcla de volúmenes
proporcionalmente iguales entre ambas soluciones. Así tenemos:
Butanol = 5 mL
Agua = 5 mL
Volumen final 10 mL
E.1.7 ¿Qué volumen de una solución stock de Tris 5M pH = 8,8 se necesita para preparar un volumen
de 250 mL Tris-HCl de Buffer Tris 1,5M pH= 8,8?
Solución
E.1.8 ¿Cuánto de acrilamida y bisacrilamida se necesita para preparar 100 mL de una solución al
30% si se desea mantener una proporción de 29:1 de acrilamida:bisacrilamida respectivamente?
Solución
Así tenemos:
ANEXO F
• DNA Electrophoresis.
http://www.protocol-online.net/molbio/DNA/dna_electrophoresis.htm.
• Polyacrilamide gel electrophoresis (Page):
http://archive.uwcm.ac.uk/uwcm/mm/page.html#sds_bact
• Electroforesis vertical:
http://matematicas.udea.edu.co/~carlopez/cnq533/ELECTROFORESIS_VERTICAL.pdf
• Electrophoresis lecture notes.
http://www.tulane.edu/~wiser/methods/handouts/elect.PDF.
• Electrophoresis. Agarose gel electrophoresis of PCR products. En: Rob Cruickshank's Protocol Book.
http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/~rcruicks/pb.html
• Gustafsson J, Blomberg A, Rudemo M (2001). Warping two-dimensional electrophoresis gel images
to correct for geometric distortions of the spot pattern.
http://www.math.chalmers.se/Math/Research/Preprints/2001/73.pdf
F.1.2 BIOSEGURIDAD:
• Roe, B. Units and formulas. Department of Chemistry and Biochemistry, The University of Oklahoma,
Norman, Oklahoma 73019 broe@ou.edu.
http://www.genome.ou.edu/protocol_book/protocol_adxG.html
F.1.4 PROTEÓMICA:
Setiembre 2003
Tiraje: 3,000 ejemplares