TEMA 8

INMOVILIZACIÓN

Dra. Paloma Santos Moriano

2021-2022
Ve más allá
TEMA 8:
INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS Y CÉLULAS

1. INTRODUCCIÓN AL CONCEPTO DE INMOVILIZACIÓN

2. TIPOS DE INMOVILIZACIÓN
3. PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Y RENDIMIENTOS
4. EFECTOS DE LA INMOVILIZACIÓN SOBRE LAS ENZIMAS
5. INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS

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 1. INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

1. INTRODUCCIÓN

Inmovilización de enzimas: Definición

Es un proceso en el que se confina o localiza a la enzima en una región

definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que:
 retienen su actividad catalítica
 pueden ser reutilizadas

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 1. INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

1. INTRODUCCIÓN
Ventajas de las enzimas frente los catalizadores convencionales
vs.

• Catalizan todo tipo de reacciones

• Alta actividad catalítica
• Gran especificidad de sustrato
• Muy activas en condiciones suaves
• Originan pocos o ningún producto secundario (selectividad)
• No alteran el medio ambiente (química verde)
• Activas en presencia de disolventes orgánicos
• La ingeniería genética ha logrado disminuir su precio

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 1. INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

1. INTRODUCCIÓN
Desventajas de las enzimas frente los catalizadores convencionales
vs.

• Selección rigurosa según el tipo de reacción: una misma enzima no vale para muchas
reacciones
• Control estricto de las condiciones de reacción
• Regeneración de cofactores
• Inhibiciones por sustratos o productos
• Su manipulación puede provocar alergias
• Poca estabilidad
• No se pueden reutilizar en ciclos consecutivos (son solubles)
• Difícil purificación del producto

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 1. INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

1. INTRODUCCIÓN

INMOVILIZACIÓN = INSOLUBILIZACIÓN

soluble insoluble

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 1. INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

1. INTRODUCCIÓN
Ventajas de las enzimas inmovilizadas
Aumento en la estabilidad de la enzima
Reutilización del derivado
Purificación de los productos
Utilización en un reactor enzimático

Inconvenientes de las enzimas inmovilizadas

Alteración de la conformación proteica
Gran heterogeneidad
Posible pérdida de actividad durante la inmovilización
Más caro que la enzima nativa soluble

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 1. INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

1. INTRODUCCIÓN
BALANCE ACTIVIDAD/ESTABILIDAD

Más flexibilidad
Más actividad
Menos interacciones
Menos estabilidad

Más rigidez
Menos actividad
Más interacciones
Más estabilidad

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 2. TIPOS DE INMOVILIZACIÓN

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 2. TIPOS DE INMOVILIZACIÓN

2.1. Unión a soportes

Soportes inórganicos
 naturales
• arcillas, bentonita, piedra pómez, sílice, etc.
 materiales manufacturados
• óxidos de metales, vidrio de tamaño de poro controlado, vidrio no poroso, alúmina, cerámicas, gel de sílice,
etc.
Soportes órganicos
 polímeros naturales
• polisacáridos (celulosa, almidón, dextranos, agarosa, etc.)
• proteínas fibrosas (colágeno, queratina, etc.)
 polímeros sintéticos
• poliolefinas (como el poliestireno)
• polímeros acrílicos (poliacrilatos, poliacrilamidas, etc.)
• otros (como el alcohol polivinílico, las poliamidas, etc)
Los soportes pueden ser porosos o no porosos

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 2. TIPOS DE INMOVILIZACIÓN

2.1. Unión a soportes

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 2. TIPOS DE INMOVILIZACIÓN

2.1. Unión a soportes

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 2. TIPOS DE INMOVILIZACIÓN

2.1. Unión a soportes

Enlaces covalentes
Se basa en la activación de grupos químicos del soporte para que reaccionen con nucleófilos de las
proteínas situados en su superficie

ACTIVACIÓN DEL SOPORTE UNIÓN COVALENTE

Soporte H2N— Enz

Enz
x Enz
x Lavado x x

Lys
Soporte epoxidado
Cys
Ser
+

Soporte glioxilado

Lys
+

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 2. TIPOS DE INMOVILIZACIÓN

2.1. Unión a soportes

Enlaces covalentes

VENTAJAS

 Unión fuerte: la enzima no se soltará del soporte

 Los enlaces covalentes: rigidifican la estructura  más estabilidad

INCONVENIENTES

 Los enlaces covalentes: rigidifican la estructura  pérdida de actividad

 Condiciones de inmovilización para formar enlaces: pérdida de actividad
 Irreversible: no se puede reciclar el soporte

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 2. TIPOS DE INMOVILIZACIÓN

2.1. Unión a soportes

Enlaces covalentes por puentes disulfuro

ACTIVACIÓN DEL SOPORTE UNIÓN COVALENTE

Enz
Soporte Hs— Enz Enz
SH
SH Lavado SH

VENTAJAS
 Unión fuerte: la enzima no se soltará del soporte
 Los enlaces covalentes: rigidifican la estructura  más estabilidad
 Dirigida: solo a través de cisteínas  se pueden introducir en lugares concretos por mutagénesis dirigida
 Reversible

INCONVENIENTES
 Los enlaces covalentes: rigidifican la estructura  pérdida de actividad
 Condiciones de inmovilización para formar enlaces: pérdida de actividad
 No todas las proteínas tienen cisteínas libres ni se les pueden introducir
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 2. TIPOS DE INMOVILIZACIÓN

2.1. Unión a soportes

Enlaces no covalentes

• Adsorción física: estrategia más sencilla

• Enlace iónico: depende de las cargas del soporte y la enzima
• Unión por afinidad: moléculas concretas (anticuerpos-antígenos, dominios de unión)
• Quelación: enlaces de coordinación de metales (niquel-histidina)

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 2. TIPOS DE INMOVILIZACIÓN

2.1. Unión a soportes Interacción

iónica (1)
Interacción
iónica (2)
Enlaces iónicos
- + + +
+ -- -
Hay que controlar el pH del medio de inmovilización para que - + + + - -
tanto soporte como enzima tengas las cargas concretas para - E + + - E -
- +
+ + -- -
interaccionar S S + -
- +
+ +
+ - -
- + + - E -
Int. catiónicos Int. aniónicos - +
E
+ +
+ -- -
CM-celulosa DEAE-celulosa DEAE-sephadex
CM-sefarosa QAE-celulosa QAE-sephadex
S-sefarosa
Intercambiadores iónicos

CM-celulosa

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 2. TIPOS DE INMOVILIZACIÓN

2.1. Unión a soportes

Enlaces iónicos

VENTAJAS
 Muy sencillo
 Coste relativamente bajo (sobretodo adsorción)
 Uniones débiles: no se rigidifica la enzima  menos pérdida de actividad

INCONVENIENTES
 Uniones débiles se puede desprender (lixiviación)
 Condiciones muy concretas de inmovilización (pH): pueden afectar a la enzima

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 2. TIPOS DE INMOVILIZACIÓN

2.2. Entrecruzamiento
La enzima es el propio soporte
Se unen unas enzimas a otras con la utilización de reactivos bifuncionales:
• Diminoésteres, Diisocianatos, Sales de bisdiazonio,…
• Dialdehídos: glutaraldehído

H2N—Enz — NH2

Enz — N=CH-CH -CH -CH -CHO Enz — N=CH-CH -CH -CH -CH=N—
Enz — NH
H2N—Enz — NH2 H2N— 2 2 2 H2N— 2 2 2 2

[H]
H2N—Enz — NH2

H2N—Enz — NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH—
Enz — NH2

[H]

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 2. TIPOS DE INMOVILIZACIÓN

2.2. Entrecruzamiento
Para entrecruzarlas primero hay que aproximarlas: tres estrategias

Solución
de
enzima

Precipitar Reticular en
Purificar,
y reticular una emulsión
cristalizar
(A/O)
y
reticular

CLEA ESFEREZIMAS
CLEC (Spherezymes)
(Cross-Linked Enzyme Crystals) (Cross-Linked Enzyme
Aggregates)
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 2. TIPOS DE INMOVILIZACIÓN

2.2. Entrecruzamiento

glutaraldehído

Cristales de enzima
CLEC St Clair et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114: 7314-7316

Enzima en
solución
agente
precipitante glutaraldehído
agregados
CLEA
Cao et al. (2000) Org. Lett. 2: 1361–1364

agente glutaraldehído
precipitante

coagregados
CLEA
BSA Enzima en
presencia de BSA Shah et al. (2006) Anal. Biochem. 351: 207-
213

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 2. TIPOS DE INMOVILIZACIÓN

2.2. Entrecruzamiento
Ejemplo: inmovilización de lipasas por entrecruzamiento

Emulsión (W/O)
H2O aceite

H2O

Lipasa Lipasa

Tapadera abierta y
Tapadera cerrada centro activo
accesible
Superficie hidrofílica
Superficie hidrofóbica

H2O H2O

Brady et al. (2008) BMC Biotechnol. 8: 8

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 2. TIPOS DE INMOVILIZACIÓN

2.2. Entrecruzamiento

VENTAJAS
 No aumenta el coste por añadir un soporte
 Uniones fuertes: rigidificación  aumenta la estabilidad

INCONVENIENTES
 Se necesita una gran cantidad de enzima
 Se puede modificar la enzima por los enlaces covalentes
 Cristalizar: difícil y caro
 Las enzimas que quedan en el centro: problemas de difusión

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 2. TIPOS DE INMOVILIZACIÓN

2.3. Atrapamiento

La enzima queda confinada dentro de una matriz porosa rígida (atrapamiento en redes) o dentro de
una membrana semipermeable (microencapsulación).
No hay ninguna unión entre la enzima y el soporte.

Se disuelve la enzima con una molécula soluble y se induce la polimerización:

- Por temperatura
- Por adición de algún compuesto (sales de calcio, entrecruzantes…)

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 2. TIPOS DE INMOVILIZACIÓN

2.3. Atrapamiento
En redes poliméricas

• Retención física de la enzima en las cavidades interiores de una matriz sólida porosa
• Tipos de matrices poliméricas:
• Sintéticas:
 Geles de poliacrilamida
 Resinas de poliuretano
 Geles de alcohol polivinílico (PVA)
• Naturales:
 Hidrogeles iónicos
 Alginato, carragenato, pectato, quitosano,…
 Termogeles
 Agar, agarosa, gelatina, …

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 2. TIPOS DE INMOVILIZACIÓN

2.3. Atrapamiento
En membranas

La enzima está rodeada de membranas semipermeables que permiten el paso de moléculas de sustrato y
producto, pero no de enzima

S
Enz
Enz
Enz
Enz P
Enz Enz
Enz
Enz Enz
Enz
Enz
Enz
Enz Enz Enz

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 2. TIPOS DE INMOVILIZACIÓN

2.3. Atrapamiento
En membranas
Biorreactor de membrana: no hace falta inmovilizar la enzima previamente

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 2. TIPOS DE INMOVILIZACIÓN

2.3. Atrapamiento

VENTAJAS
 El atrapamiento en redes poliméricas es barato
 La enzima no se modifica, simplemente queda atrapada
 Requiere poca cantidad de enzima para obtener biocatalizadores inmovilizados
activos

INCONVENIENTES
 No es adecuado si la enzima es más pequeña que los poros
 No es adecuado si el sustrato o el producto son más grandes que los poros

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 2. TIPOS DE INMOVILIZACIÓN

Se pueden combinar varios métodos de inmovilización:

Entrecruzamiento Unión a soportes

+ +
atrapamiento entrecruzamiento

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 2. TIPOS DE INMOVILIZACIÓN

No existe un método universal ideal.

La elección del método depende de:
• La enzima
• La reacción: sustratos y productos
• El biorreactor donde se quiera utilizar
• Las condiciones de inmovilización
• Las condiciones de reacción

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 3. PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Y RENDIMIENTOS

DEFINICIONES Y CONCEPTOS IMPORTANTES

RENDIMIENTO DE INMOVILIZACIÓN: el porcentaje de actividad enzimática total de la solución enzimática

libre que se inmoviliza

𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎 𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖
𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅 % = 100 𝑥𝑥
𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎 𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖

La ''actividad inmovilizada'' sólo puede determinarse correctamente midiendo la actividad enzimática

residual total que queda en la solución enzimática después de la inmovilización y restando esta actividad de
la actividad inicial total. Nos dice, teóricamente, la actividad que se ha inmovilizado.

Puede calcularse también referido a la cantidad de proteína, si la solución de partida es “pura” (no hay otras
proteínas)
𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝 𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖
𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅 % = 100 𝑥𝑥
𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝 𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖

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 3. PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Y RENDIMIENTOS

DEFINICIONES Y CONCEPTOS IMPORTANTES

EFICIENCIA DE INMOVILIZACIÓN: el porcentaje de actividad enzimática unida que se observa en el

inmovilizado.

𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎 𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜
𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸 % = 100 𝑥𝑥
𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎 𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖

En teoría se puede tener un rendimiento de inmovilización del 100% y una eficiencia de inmovilización del 0%
cuando toda la enzima en solución se inmoviliza pero no se encuentra actividad en el inmovilizado porque la
enzima se ha desactivado o se ha vuelto inaccesible por alguna razón durante la inmovilización

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 3. PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Y RENDIMIENTOS

DEFINICIONES Y CONCEPTOS IMPORTANTES

PORCENTAJE DE ACTIVIDAD RECUPERADA: relaciona la actividad del inmovilizado con la actividad inicial. Nos
da una idea del éxito de la inmovilización. Es un rendimiento más real.

𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎 𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜
𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎 𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟 % = 100 𝑥𝑥
𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎 𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖

CARGA DE PROTEÍNA DEL INMOVILIZADO: relación en porcentaje peso/peso de la masa de proteína y la

masa del soporte

𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝
𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 𝑑𝑑𝑑𝑑 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝 % = 100 𝑥𝑥
𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠

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 3. PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Y RENDIMIENTOS

INMOVILIZACIÓN EN SOPORTES – PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

U iniciales
Venz
ENZIMA
(U/mL)
Reacción
de Fase líquida = enzima NO unida (U/mL)
INMOVI-
LIZACIÓN
Centrifugación/filtración

Fase sólida = soporte + enz unida (U/g)

SOPORTE
(g)
(actividad observada-aparente)
U iniciales
V inmovilización
g soporte

U iniciales −U no unidas
Rendimiento de inmovilización (%) = x 100
U iniciales

Act aparente
Eficiencia de inmovilización(%) = x 100
Act teórica

Act aparente
Actividad recuperada (%) = x 100
Act inicial
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 3. PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Y RENDIMIENTOS

INMOVILIZACIÓN POR ENTRECRUZAMIENTO – PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

U iniciales
Venz
ENZIMA
(U/mL)
Reacción
de Fase líquida = enzima NO unida (U/mL)
INMOVI-
LIZACIÓN
Centrifugación/filtración

Fase sólida = enz entrecruzada (U/g)

Actividad aparente – observada

U iniciales −U no unidas
Rendimiento de inmovilización (%) = x 100
U iniciales

Act aparente
Eficiencia de inmovilización(%) = x 100
Act teórica

Act aparente
Actividad recuperada (%) = x 100
Act inicial
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 3. PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Y RENDIMIENTOS

INMOVILIZACIÓN POR ATRAPAMIENTO – PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Mezcla enzima + alginato sódico

Fase líquida = enzima NO unida (U/mL)

Filtración

Fase sólida = enz atrapada (U/g)

Cloruro cálcico
Actividad aparente – observada

U iniciales −U no unidas
Rendimiento de inmovilización (%) = x 100
U iniciales

Act aparente
Eficiencia de inmovilización(%) = x 100
Act teórica

Act aparente
Actividad recuperada (%) = x 100
Act inicial
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 4. EFECTOS DE LA INMOVILIZACIÓN SOBRE LAS ENZIMAS

A. SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

B. SOBRE LA ESTABILIDAD ENZIMÁTICA
C. SOBRE LA ESPECIFICIDAD/SELECTIVIDAD ENZIMÁTICA

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 4. EFECTOS DE LA INMOVILIZACIÓN SOBRE LAS ENZIMAS

SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

S
S

S S

Presencia de
Pérdida total de actividad
actividad

Condiciones experimentales del proceso de inmovilización

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 4. EFECTOS DE LA INMOVILIZACIÓN SOBRE LAS ENZIMAS

SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Aumento de
actividad
S
Presencia de
actividad
Disminución
de actividad

1. Efectos difusionales
2. Efectos electrostáticos sustrato-soporte
3. Efectos estéricos o de tamaño de sustrato
4. Efectos en el microentorno

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 4. EFECTOS DE LA INMOVILIZACIÓN SOBRE LAS ENZIMAS

SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

1. Efectos difusionales
1. Resistencias difusionales externas 2. Resistencias difusionales internas

[Sr]

r [SR]
R
Soporte no cargado

Capa de Nernst [Sr]<[SR]

SOLUCIONES Sustrato
 disminuir el tamaño del biocatalizador Producto
Enzima
 aumentar la concentración de sustrato (>100 KM´)
 incrementar la agitación o el flujo en el reactor

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 4. EFECTOS DE LA INMOVILIZACIÓN SOBRE LAS ENZIMAS

SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

2. Efectos electrostáticos

----- Disminución de

+++
S S
afinidad

Soporte
cargado
negativamente Soporte
cargado
positivamente

- - - - Carga negativa

-----
Aumento de
+++

+ + + + Carga positiva
S S
afinidad
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 4. EFECTOS DE LA INMOVILIZACIÓN SOBRE LAS ENZIMAS

SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

3. Efectos estéricos

Sustrato

Disminución de
actividad

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 4. EFECTOS DE LA INMOVILIZACIÓN SOBRE LAS ENZIMAS

SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

cerca del soporte las condiciones no son las mismas que en el
seno del líquido (ej. cambio del pH óptimo)
4. Efectos de microentorno

-- + +
-+ E +
- ++ +
-
-
-

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 4. EFECTOS DE LA INMOVILIZACIÓN SOBRE LAS ENZIMAS

SOBRE LA ESTABILIDAD ENZIMÁTICA

1. Efectos del atrapamiento

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 4. EFECTOS DE LA INMOVILIZACIÓN SOBRE LAS ENZIMAS

SOBRE LA ESTABILIDAD ENZIMÁTICA

2. Efectos de los enlaces covalentes

RIGIDEZ CONFORMACIONAL: Incrementa la estabilidad
Enzima en solución

Enzima
estabilizada

Inmovilización UNIPUNTUAL Inmovilización MULTIPUNTUAL

Soporte
Soporte
poco
muy
activado
activado

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 4. EFECTOS DE LA INMOVILIZACIÓN SOBRE LAS ENZIMAS

SOBRE LA ESPECIFICIDAD/SELECTIVIDAD ENZIMÁTICA

Por distorsión del centro activo

Pérdida o ganancia de selectividad/especificidad por modificaciones en el centro activo

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 5. INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS

Muchas células forman agregados de manera natural, que se tratan como

inmovilizados la hora de modelar las cinéticas de reacción:
- Flóculos
- Pellets micelianos
- Biofilms
- Lodos activados
- Agregados de células vegetales
- Células animales en soportes tridimensionales

Además, las células que crecen en suspensión se pueden inmovilizar

básicamente por los mismos métodos que las enzimas, aunque lo más común
es el atrapamiento por su tamaño.

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