Inmunodeficiencia

Adquirida
&
Laboratorios Diagnostico
en
Infecciones HIV

MARIA DE LOS A. OLIVERAS DIAZ, MHSA, MT (ASCP)

PROFESORA CONFERENCIANTE
UAGM- CAROLINA
Infección HIV

Objetivos
1. Describe el sistema de clasificación utilizado para HIV.
2. Explicar las condiciones bajo la cual ocurre transmisión de HIV.
3. Describir la estructura de la partícula del HIV.
4. Describir la respuesta inmune para HIV y los efectos.
5. Describir las manifestaciones clínicas.
6. Discutir el ensayo ELISA y sus respectivas generaciones de la prueba.
7. Discutir el principio y uso clínico de la prueba rápida para HIV.
8. Describir el principio de la prueba Western Blot y su interpretación.
9. Discutir el principio y uso clínico de citometría de flujo para la enumeración de células T-CD4+.
10. Diferenciar entre RT-PCR, qRT-PCR, y “branched DNA (bDNA) para pruebas acido nucleicos de HIV.
Inmuno def primaria- scid, prueba newbor- trec, scid es congnita
Inmunodeficiencia Adquirida

Inmunodeficiencia Secundaria
• Puede resultar de un proceso de enfermedad que causa defecto en la
función inmune normal.
• Inmunidad defectuosa Temporera o Permanente de uno o varios componentes
del Sistema inmune.
• Pacientes con inmunodeficiencia secundaria es mucho mas común que la
inmunodeficiencia primaria.
• Igualmente son susceptibles a infecciones
Agentes inmunosupresores- personas con cancer
En los quemados el sist inmunese afecta

Inmunodeficiencia Adquirida

Las causas principales para inmunodeficiencia secundarias, además enfermedades:

• Agentes Inmunosupresores – variedad en grado según como afecta el agente
inmunosupresor afecta cada componente del sistema inmune.
• Quemaduras- complicación común de pacientes quemados es la Septicemia
• Daño Termal: Daño piel
• Interferencia con fagocitosis
• Deficiencias de Inmunoglobulinas en Suero y en los niveles de complemento.
HIV es por un virus- mas agresivo
HIV (Virus de Inmunodeficiencia Adquirida Humano)
HIV 2es mas en africa

HIV Agente etiológico para SIDA (AIDS)

• Identificado independientemente por:
• Los laboratorios Luc Montagnier(Francia 1983)
• Robert Gallo y Jay Levy (Estados Unidos 1984)
• Los aislamientos de HIV- 1 han sido clasificado dentro de cuatro grupos:
• Grupo M– mayoría de las infecciones HIV-1
• Grupo O
• Grupo N
• Grupo P
HIV y HIV2 se diferecian por envoltura
HIV (Virus de Inmunodeficiencia Adquirida Humano)

HIV-2 – también cauda AIDS, menos prevalencia

• Descubrió 1986
• Oeste África
• Menos patogénico
• Menos infeccioso
• Se diferencia notablemente del HIV-1 en su envoltura
Screening tien los 2 HIV
 HIV (Virus de Inmunodeficiencia Adquirida Humano)
Una de las pruebas prenatales es HIV, si es positiva al bebe se le da medicamento contra HIV, para evitar que se contamin y se salva a l bebe

Transmisión HIV
Rutas:
• Contacto sexual– 85% de los casos
• Contacto Sangre y/o Fluidos corporales
• Contaminación de agujas por uso de drogas intravenosas
• Perinatal
• Mama infectada transmite a su bebe. Parto/Alimentación pecho.
• Se ha reducido marcadamente por screening HIV prenatal
• Se administra drogas antirretrovirales y leche en formula
Retrovirus- RNA, la transcriptasa reversa lo convierte en DNA, la incorpora y luego hace la
sintesis de proteina para su virus. HIV
Nm-10 ^-9

Clasificación de HIV
• Familia Retroviridae

• Género: Lentivirinae Retrovirus

• Contiene únicamente RNA en su ácido nucleico

• Única enzima: Transcriptasa Reversa

• Transcribe RNA en DNA -- paso necesario ciclo vida del virus

El core tambien llamado capside
Glico-azucart, glicoproteinas son las que hacen el contacto….molecula CD4
HIV

Clasificación de HIV
• Partícula esférica de 100 – 200 nm en diámetro

• Core interno con dos copias de RNA de simple cadena

• Rodeada por una cubierta de proteína o Cápside.

• Una envoltura externa de glicoproteínas

• Incrustado en doble capas de lípidos

• Las glicoproteínas son estructuras como perillas

• Envueltas en el enlace entre HIV con la célula huésped

Integrasa- integra el acido nucleico, el DNA en la celula huesped
Glicoproteinas inducen inmunogenos- inducen respuesta inmunologica anticuerpo

ESTRUCTURA VIRIÓN HIV

24 un Ab contra una proteina especifica- una proteina que cubre el acido nucleico del core
IMPORTANTE- LEER ESTE SLIDE, VIENE PARA EXAMEN . Lo importante es lo azul
HIV

Estructura de Genes - El genoma de HIV incluye tres genes principales

• Gag- codifica para p55 (precursor de p6, p9, p17 y p24 (capsida))
• ENV- glicoproteínas envoltura gp160, gp120, gp41
• Pol – codifica para enzimas necesarias para replicación
• Transcriptasa Reversa (p51),
• Ribonucleasa(Rnasa H;p66), enzima degrada RNA original HIV.
• Integrasa p31- enzima cual media la integración del DNA viral dentro genoma célula huésped
• Proteasa p10- rompe precursores de proteínas en pequeñas unidades activas para hacer viriones maduros

• El HIV-2 se diferencia grandemente del HIV-1 en los genes de la envoltura.

Receptor CD4 le gusta mucho al HIV
Langerhans- le gusta el CD4 HIV
CD4 y gp. 120 son los que e tienen que unir

Replicación Viral
1. Atarse Célula Huésped
• Célula Target: Celulas T Ayudantes (Th Cells) – cepas HIV T-Trópica (cepa X4)

• También Macrófagos, Células Dendríticas, Monocitos, Células Langerhans

(Células Precursora y Presentadoras Ags) – pueden tener algo CD4 en su superficie

• Si infecta ambos tipos de células: Cepas HIV M-trópicas o Cepas R5

• Mediada por Ag CD4 en la Célula Huésped – Receptor – Glicoproteína gp120

 Gp41 es del virus
HIV
Replicación Viral
2. Entrar Dentro de la Célula Huésped
• Fusión envoltura HIV con la membrana plasmática

• Co-receptores: receptores para quimioquinas de WBC (función WBC en inflamación)

• Promueven la fusión de la envoltura HIV con la membrana plasmática de la célula huésped.

• Induce cambio gp41.

• Los co-receptores: CXCR4- entrar a los linfocitos T CCR5- entrar Macrófagos

• Individuos con mutaciones genéticas en CCR5- resisten infección HIV

Una celula inactiva ,latente sin replicarse estapa provirus
HIV

Replicación Viral
3. Provirus
• Entra partículas del virus – expone genoma viral
• Enzima Transcriptasa Reversa produce complementariamente un DNA doble del
RNA viral .
• La Enzima Integrasa incorpora este DNA viral dentro del genoma de la célula
huésped – Provirus
• Estado latente por mucho tiempo -- no replicación del virus
 HIV

Replicación Viral
4. Expresión Genes Virales
• Inducidos por citoquinas o enlace de antígenos que activan célula infectada.

• DNA viral dentro del núcleo de la célula huésped transcribe RNA.

• Un mRNA pasa al citoplasma.

• La translación mRNA ocurre con la producción de proteínas precursoras y ensamblaje

de partículas virales.
 HIV

Replicación Viral
5. Brote de Viriones Intacto fuera Célula Huésped
• Los viriones brotan fuera de la célula huésped
• Adquiere su envoltura durante el proceso.
• Las proteínas precursoras son rotas por proteasas virales.
• Se producen Partículas de Virus Maduros.
HIV
 HIV
Replicación Viral
5. Brote de Viriones Intacto fuera Célula Huésped
• Replicación viral es rápida,
• La enzima transcriptasa reversa pierde actividad de corrección de prueba que causa un
alto rate de mutaciones genéticas, y por lo tanto una variación antigénica.
HIV diversidad
Extraordinaria el nivel de variación antigénica en un individuo es mayor que la
diversidad de todo el virus de Influenza aislado a través del mundo entero.
• Impide al huésped una respuesta inmune efectiva
 HIV

Respuesta Inmune al HIV

1. Replicación Inicial del Virus
• Hay presencia Ag p24 / virus RNA en sangre en el paciente
• Inicialmente ocurre un burst de replicación del virus

•Luego es seguido por “slowing down” con la respuesta inmune.

 HIV

Respuesta Inmune al HIV

2. Célula infectadas- MHC-I presenta Antígeno – estimula respuesta linfocítica

3. Crea respuesta especifica por Th CD4+-- humoral y mediada por células.

4. Linfocitos B producen anticuerpos - 6 semanas después infección.

• Primero- Anti-gp-41

• Anticuerpos del gag: Anti p24

• Finalmente, anticuerpos contra: La Envoltura, Pol, Proteínas Regulatorias

 HIV

Respuesta Inmune al HIV

5. La mayoría de las proteínas inmunogénicas están en la envoltura viral.
• Se obtiene la producción de anticuerpos neutralizantes.
• Aparecen 2 – 3 meses después de la infección
• Previenen que el virus continúe infectando células vecinas.
• Los anticuerpos contra proteínas de la envoltura también se enlazan a receptores en
las células NK por la porción Fc.
• Participan en matar células infectada con HIV mediadas por ADCC.
NATURAL KILLER
 HIV

Respuesta Inmune al HIV

• También estos anticuerpos participan en la Patogénesis HIV

• Facilitan endocitosis por células no infectadas mediada por virus enlazado por Abs
y mediante el receptor Fc (virus opsonizados).

• Mas la glicosilación densa de las proteínas de la envoltura pueden enmascarar

epítopos importantes y la diversidad enorme del virus ponen en gran reto al huésped
en producir una respuesta de anticuerpos que protejan.
 HIV
Respuesta Inmune al HIV
6. La Inmunidad Mediada por Celulas T
• Muy importante como en otras infecciones virales:

• Los linfocitos T citotóxicos (CD8+) ( CTLs), aparecen en semanas luego de la

infección.

• Están asociados a la disminución de la cantidad de HIV en la infección aguda.

• Los Anticuerpos pueden atar a viriones circulando libremente fuera de células huésped.

• Sin embargo, CTLs pueden atacar células huésped albergando el virus internamente.
 HIV
Respuesta Inmune al HIV
6. La inmunidad mediada por Celulas T
• CTLs contiene receptores específicos Ag HIV
• Asociados con moléculas MHC I en la superficie de células huésped.
• Son estimuladas a desarrollar clones maduros y activos a través de citoquinas efectoras y liberadas por
Células T ayudantes CD4 . – respuesta común
• Luego CTLs se enlaza a célula infectada, se liberan enzimas citotóxicas por sus gránulos y destruyen la
célula target.
• Los viriones son liberados y pueden enlazarse a los anticuerpos.
• CTLs también suprime replicación y dispersión por producir citoquinas (Interferón –y) que tiene
actividad anti-viral.
 HIV

Manifestaciones Inmunológicas
7. La Defensa Inmune Innata
• Es responsable en la etapa temprana.

• Las células NK se activan y media citólisis de las células huésped.

• Las células dendríticas reconocen el componente viral a través de receptores

reconocimientos (PRRs) resultando en liberación de citoquinas proinflamatorias que
tiene efectos antivirales y pueden activar otras células del sistema inmune.
 HIV

Efectos de Infección HIV en el Sistema Inmune

HIV ha desarrollado mecanismos que logra escapar de la respuesta inmune.

Aunque la respuesta inmune reduce su replicación, no la elimina completamente.

• Habilidad del virus a mutaciones genéticas – altera antígenos – Abs inefectivos

• HIV baja y regula la molécula MHC Clase I. – CTLs no reconocen

• Numerosas células albergan el virus por muchos años. – Provirus Silente

Efectos de Infección HIV en el Sistema Inmune HIV
Infección persistente y destruye el Sistema inmune
• Th CD4 son las más afectadas y disminuye esta población.
• Hallmark de infección HIV
• Sistema inmune Gastrointestinal (GALT) es afectado.
• En etapa temprana, HIV disminuye rápidamente las células T CCR5+ CD4+ de memoria.

• Celulas Th17 – importantes en la homeostasis de las células epiteliales de la mucosa del

intestino y las defensinas antimicrobianas son también afectadas y disminuidas.

• Esto resulta en daño a la barrera epitelial intestinal y produce que productos microbianos entre al
plasma. Ex lipopolisacáridos (LPS).

• También produce un estado general de activación inmune.

Efectos de Infección HIV en el Sistema Inmune HIV
Infección persistente que destruye el Sistema inmune
Celulas CD4 son destruidas o no-funcionales por varios mecanismos:
• Perdida de la membrana plasmática por brote HIV

• Destrucción por CTL / Inducción de apoptosis viral

• Las células TCD4 se infectan más rápido que su reemplazo.

• El reducir células T causa anormalidades en funciones Th y deterioro de las células memorias.

• La desregulación del sistema inmunes es evidente cuando proteínas HIV estimula la poli
clonación células B defectuosas en su maduración y función:

• Aumentos de Igs, complejos inmune y autoanticuerpos.

 HIV
Efectos de Infección HIV en el Sistema Inmune
Infección Persistente que Destruye el Sistema Inmune
• Se observa producción alterada de citoquinas y quimiotaxias en etapa temprana.
• Progresa enfermedad: Declina los niveles de IL-2 y de Interferón gama(y)
• Cambio (Shift) en el perfil de citoquinas de las Th1 a las Th2 – desarrolla AIDS
• Daño extensivo al tejido linfoide con perdida centros germinales y de células dendríticas
folicular.
• Inhabilidad para activar células linfocitos T y B
• Defectuoso la Presentación del Antígeno.
• Defectuoso Burst Oxidativo por los monocitos y los macrófagos
• Disminuye la actividad NK
 HIV

Síntomas Clínicos
HIV es una infección crónica que es caracterizada por un decline progresivo del sistema inmune.
Curso clínico: Infección aguda/ latencia clínica/ AIDS
1. Estado agudo o temprano de infección
• Explosión rápida de la replicación del virus – viremia – disemina órganos linfáticos
• Síndrome retroviral agudo - flux/ mononucleosis / Sistema inmune comienza a activarse
• Aparecen síntomas 3 – 6 semanas luego comenzar infección y resuelve dentro 7 días a pocas semanas.
• Puede estar asintomáticos.
• Hay una reducción CD4 pero regresan a la normalidad.
• Cuando los anticuerpos específicos HIV comienza a desarrollarse, cortan la replicación y entra en un
periodo de latencia.
 HIV
Síntomas Clínicos
Curso Clínico: Infección aguda/ latencia clínica/ AIDS
2. Periodo de Latencia Clínica
• Disminución de la viremia y de síntomas clínicos.
• Estudios indican presencia de carga viral
• Aunque en Niveles bien bajo en plasma y en tejido linfático.
• CD4 permanece estable
• Una pequeña porción de Individuos infectados por HIV tiene contaje normal de células TCD4 o
ligeramente disminuidos y a una baja carga viral
•No- progresa (LTNP) – Long-Term NonProgressors
•Asintomático (mas 10 años sin terapia antiretrovirales)
•Factores que influyen: poseen ciertos tipos genes HLA/ genes no-HLA y Cepa HIV R5
 HIV
Síntomas Clínicos
Curso Clínico: Infección aguda/ latencia clínica/ AIDS
3. AIDS
•Profunda Inmunosupresión y bien bajo números Celulas CD4
•Resurge la viremia
•Infecciones oportunistas y malignidad
•Síntomas neurológicos –HIV infecta cerebro.
• Los pacientes HIV positivos son clasificados dentro de cinco estados
•Basado a su contaje CD4 en sangre periferal.
•Estado 0, 1, 2, 3 y desconocido.
•El estado del paciente puede cambiar en cualquier dirección.
 Parámetros Celulas TCD4
Utilizados en Clasificar Estadía HIV

Niños < un (1) año Niños 1 – 5 años 6 años o mas

Estadía Celulas % Celulas % Celulas %
1 >1,500 > 34% >1,000 > 30% >500 >26%

2 750 – 1,499 26-33% 500 – 999 22–29 % 200 – 499 14-25%

3 <750 <26% < 500 < 22 <200 < 14 %

 HIV
Enfermedades Oportunistas Indicativas de AIDS
Enfermedades oportunistas indicativas de AIDS Estadio 3 Infección HIV
Infecciones bacterianas múltiples o recurrentes
Candidiasis de bronquios, tráquea, pulmones, esófago
Cáncer cervical

Coccidiodomicosis, diseminada o extrapulmonal

Crytoccosis, extrapulmonal (Cryptococcus neoforman)
Sarcoma de kaposis
Linfoma de Burkitt
Micobacterium
Pneumocystis jirovecii ( Pneumocystis carinii), pulmonía
Toxoplasmosis
 HIV
Laboratorios Pruebas Screening
• Serológicas
• Diagnóstico inicial
• Mayoría de los individuos desarrollan anticuerpos dentro 1-2 meses después de exposición.
• Donación Sangre --- desde 1985
• Estudios epidemiológicos – información de la extensión de la infección en poblaciones de alto riesgo.

• ELISA- método estándar para métodos de screening test

• Prueba Rápida – nuevas pruebas que pueden detectar anticuerpos en minutos
 HIV

Laboratorios Pruebas Confirmatorias

Realizadas en muestras que son positivas en Pruebas Screening test
• Western Blot – Menos Sensitiva/ Expertos para Interpretación/ Mucho Indeterminados
• Prueba estándar como prueba confirmatoria por años.

• Reemplazada por Nuevos Métodos.

• Las Pruebas serológicas para Antígeno p24

• y las Pruebas de Ácidos Nucleicos RNA HIV

• Se ha incorporado dentro del esquema inicial para pruebas de HIV.

 ALGORITMOS DE PRUEBAS

CDC y la Asociación de los Laboratorios de Salud Publica

• Desarrollan algoritmos que utilizan una combinación de pruebas de
laboratorios realizadas en secuencia para escriniar la infección de HIV y
resolver discrepancias en los resultados.

• Estos algoritmos se revisan según mejora las pruebas de laboratorio.

HIV
Laboratorios Algoritmos
1989
• ELISA– Anticuerpos para HIV- 1 – sensitiva

• Muestra positiva se debía repetir doble

• Luego se confirma con:

• WESTERN BLOT para HIV-1

• menos frecuente: Inmunofluorescencia IFA

• 1992– Prueba inicial ELISA HIV-1/HIV-2

HIV

Laboratorios Algoritmos
2004
• Prueba Rápida – sensitiva
• Muestra positiva se debía repetir doble

• Luego se confirma con WESTERN BLOT o IFA

HIV

Laboratorios Algoritmos
2014
• El CDC recomendó que el screening inicial
debe ser realizado con una combinación de
inmunoensayo que detecte anticuerpos para
HIV-1 y HIV-2 como también el Antígeno P24
del HIV-1
• Todas las muestras positivas deben
discriminarse con inmunoensayos rápidos
para HIV-1 y HIV-2.
• Cualquier muestra que son reactiva en una
prueba inicial y no-reactiva en una prueba
segunda debe confirmarse con pruebas de
ácidos nucleicos (NAT) para resolver
discrepancias.
 HIV
Laboratorios – Principio de las Pruebas
ELISA – sensitiva, especifica, fácil de realizar, maneja volumen de muestras
• Primera generación - fase solido con lisado viral cell cultivadas/ indirecta/ detecta anticuerpos solo HIV -1
• Propenso falsos positivos por reacción con Antígenos HLA.
• Segunda generación – indirecto / recombinante altamente purificados o sintético/ HIV-1/HIV-2
• Mejora sensitividad y especificidad. Pierde sensitividad a cierto subtipos HIV
• Tercera generación – Técnica sándwich / anticuerpo enlazarse a mas de un antígeno. /Quimioluminicencia
• Fase solida con recombinantes proteínas HVI-1/HIV2 + suero paciente
• Lavar
• Ánade enzima o quimioluminiscencia- Ag HIV-1/ HIV-2 / luego sustrato / 100% sensitividad/ 99.9% especificidad
• Cuarta generación – detecta HIV-1/HIV-2/ Ag p24. recombinante Ag HIV-1/HIV-2/ anti-p24 fase solida
• Quinta generación – parecida 4ta generación pero se puede diferenciar anticuerpos de HIV-1 y HIV-2.
 HIV
Laboratorios – Principio de las Pruebas
Rapid Test – sensitiva, especifica, fácil de realizar, maneja volumen de muestras
• Detecta HIV-1 o ambos / sensitiva y especifica
• Pueden ser utilizados en suero, plasma, sangre completa(venosa/ fingerstick) Kit- ORAL Fluid
• Inmunoensayo de flujo Lateral o Flow-through que produce reacción colorimétrica.
• Lateral- un solo paso que la muestra migra a través strip por acción capilar.
• Flow –through – múltiples pasos: muestra y reactivos se añade a una fase solida.
• Muestra de paciente se aplica donde strip o membrana tiene los Ag HIV.
• El complejo Ag-Ab se enlaza al conjugado enzima o Ab que enlaza proteína A y son detectado por
reacciones colorimétricos que producen línea de color o dot .
• Visual / no requiere instrumentación. Falsos positivos pueden ocurrir
 HIV
Laboratorios – Principio de las Pruebas
Western Blot – Método Confirmatorio hasta 2014
• Inmunoblot – técnicamente demandante– “mucho expertise”

• Proveer un perfil de anticuerpos del paciente que revelan las especificidades de los
antígenos HIV.

• Tirilla de nitrocelulosa o nilón conteniendo proteínas individuales HIV

• Pueden ser separadas por electroforesis de gel de poliacrilamida.

• Se aplica muestra del paciente/ periodo incubación /

• Se lava/ AHG-enzima (conjugado)/ lava / sustrato

 HIV

Western Blot – Método Confirmatorio hasta 2014

• Anti-p24 y p55- temprano enfermedad, pero disminuye en AIDS
• Anti-gp41, anti-gp120, y anti-gp160 – aparece más tarde
• Permanecen a través de los estados enfermedad. --Indicador presencia HIV
• Pueden detectar también proteínas pol: p51 y p66.
• Bandas son examinadas visualmente por el número y tipos de anticuerpos presentes.
• Controles positivos / negativos
• Resultado positivo: por lo menos dos de las siguientes tres bandas:
• p24, gp41, y gp120/gp160
• Indeterminado: espécimen con bandas pero no satisface los criterios para ser positivo.
WESTERN BLOT

• Resultado positivo: por

lo menos dos de las
siguientes tres bandas:
• p24, gp41, y
gp120/gp160
• Indeterminado:
espécimen con bandas,
pero no satisface los
criterios para ser positivo.
HIV

Laboratorios – Principio de las Pruebas

NATs ( qualitative Nucleic Acid) Test
• Niveles detectables del ácido nucleicos de HIV están presente.
• Screen o diagnostico
• Muy útil cuando las pruebas serológicas son inconclusas. (Etapa primaria / infantes)

• Parte integrar del algoritmo 2014 por CDC.

• Altamente sensitivo – detecta HIV RNA 10-12 días luego infección.
• PCR- para donadores
• Transcripción mediada por Amplificación (TMA) – diagnostico
 HIV
Laboratorios – Vigilando la Enfermedad
Contaje de Celulas T CD4+
• Linfopenia CD4 es la característica hallmark de AIDS
• Contaje Normal CD4: 450 – 1,500 células/ul
• Se establece estado enfermedad: bajo 200 células/ul -- estado 3 AIDS
• Vigila efectividad de la terapia antirretroviral o si es necesario drogas profilácticas
• El gold standard: Citometrías de Flujo
• % CD4 = #CD4/ Total Linfocitos X 100
• # absoluto CD4 = contaje WBC x % linfocitos x % Celulas T CD4
 HIV

Laboratorios – Vigilando la Enfermedad

Ensayos Cuantificando Carga Viral (Viral Load Test)
• Mide la cantidad de acido nucleico HIV circulando. Indica el progreso de la enfermedad.
• Los HIV RNA puede ser detectados sobre los 11 días luego de la infección.
• Luego la carga viral bajan a un nivel estable “Set Point”.
• Importante estos resultados antes de comenzar terapias antirretrovirales. “Baseline value”
• La meta de las terapias es lograr niveles indetectables de HIV RNA < 20 - 75 copias/ml.
• Vigilancia periódica del contaje de carga viral en los mismo ensayos para medidas secuenciales.
• Un cambio en carga viral es significativo si:
• Si el aumento/disminución es 3x (threefold) el números de copias o 0.5 log10
Laboratorios – Vigilando la Enfermedad
Ensayos Cuantificando Carga Viral (viral load Test)
Métodos de Amplificación
• PCR- Polymerase Chain Reaction --- RT-PCR – amplificación de la secuencia HIV target
• Amplificar una secuencia DNA que es complementaria a la porción del genoma HIV-RNA.
• HIV-RNA es aislado del plasma del paciente por lisis virión y se precipita con alcohol.
• El RNA se trata con una enzima termoestable DNA polimerasa que es una transcriptasa reversa y
tiene la habilidad para inicial síntesis DNA en presencia de reactivos apropiados.
• La Transcriptasa Reversa transcribe el HIV RNA en un DNA complementario (cDNA) que se
amplifica por metodología estándar de PCR.
• Desventaja:
• Rango dinámico limitado-- rango de copias HIV RNA / por ml que puede ser detectado
• Alta susceptibilidad a contaminación cruzada con acido nucleicos extraños.
PCR
PCR
PCR
Laboratorios – Vigilando la Enfermedad
Ensayos Cuantificando Carga Viral (viral load Test)
Métodos de Amplificación
• PCR- Polymerase Chain Reaction --- Real-Time: Cuantitativo
• qPCR- detecta y cuantifica productos PCR cuando se están produciendo.
• Se añade un probe fluorescente que enlaza al amplicon durante la reacción.
• Los primers target amplificados conserva regiones de los genes gag o pol del HIV-1.
• Un control interno con una secuencia de ácido nucleico diferente se amplifica
simultáneamente con cada muestra para compensar los efectos inhibidores y permite
una cuantificación exacta.
• Altamente sensitivo y puede detectar copias HIV desde 20 – 10 millones copias /ml.
PCR
 HIV

Laboratorios – Vigilando la Enfermedad

Ensayos Cuantificando Carga Viral (viral load Test)
Métodos de Amplificación
Ensayo Cadena DNA en Rama (bDNA)
• En constraste de RT-PCR que envuelve amplificación de la secuencia HIV(Target)
• bDNA amplifica la señal de detección generada en la reacción.
• Utiliza un ensayo de hibridación sándwich de fase solida
• Incorpora múltiples sets de “probe” oligonucleótidos y
• Pasos de hibridación para crear una serie de moléculas de ramas “branched”
 HIV

Laboratorios – Vigilando la Enfermedad

Ensayos Cuantificando Carga Viral (viral load Test)
Métodos de Amplificación: bDNA- amplifica la señal de detección generada en la reacción.
• RNA aislado de los viriones en el plasma es capturado en los well de los microplatos con “probes”.
• El RNA es entonces hibridado con probes amplificadores en ramas.
• Incuba con un probe marcado con enzima que se enlaza con DNA ramas.
• Finalmente se añade un sustrato quimioluminiscente.
• Este método detecta 75 – 500,000 copias HIV RNA/ml.
• Mayor reproducibilidad y alto rendimiento que RT-PCR.
• Desventaja: mayor volumen de muestra, pierde control interno y tiene mas baja especificidad.
bDNA
bDNA
 HIV

Laboratorios – Infantes Menores de 18 meses

• Pruebas Serológicas no son confiables para infantes – Anticuerpos maternales
• Mejor diagnostico es Pruebas Moleculares
• Importante la edad del bebe para su interpretación.
• PCR– cualitativo DNA HIV-1 – Método Preferido
• Detecta DNA proviral dentro de las células mononucleares y tiene:
• Sensitividad 55% nacer ---- 90% 2 – 4 semanas --- 100% 3 - 6 meses
• Especificidad: 98.8% nacer 100% mayores 1 mes

• Ensayos RNA HIV cuantitativos son menos sensitivos que DNA HIV
• Utilizarse como confirmatorio y como base de medición carga viral
 HIV

Laboratorios – Infantes Menores de 18 meses

• Las Pruebas deben realizarse en el Nacimiento en bebe con alto riesgo para HIV

• 14 – 21 días nacido; 1 – 2 meses; 4 – 6 meses

• Resultados positivos deben ser confirmados por repetir pruebas (Falsos Positivos)

• Dos o mas pruebas negativas (1ra mayor de 1 mes ; 2da mayor 4 meses) evidencia ausencia HIV

• Confirmarse con pruebas serológicas dentro los 12 – 18 meses.

• Énfasis de Screening en mujeres embarazadas – Clínica Prenatales

• Rapid Test en Sala de Partos para mujeres sin clínica Pre-natales.

• Pronta detección de infantes con HIV -- Terapias Antiretrovirales temprano mejora prognosis