Paper Grupo 3 Atracurio - Traducido

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com
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Recibido: 23 de julio de 2020 Revisado: 2 de marzo de 2021 Aceptado: 26 de abril de 2021
DOI: 10.1111/acel.13381
PAPEL ORIGINAL
La inhibición del receptor neuromuscular de acetilcolina

con atracurio activa la longevidad inducida por
FOXO/DAF-16
Rebecca L. McIntyre1 | Simone Denis1| Rashmi Kamble1| Marte Molenaars1| Michael Petr2|
Bauke V. Schomakers1,3| Mizanur Rahman4 | Siddhartha Gupta5 |
5 4,5 6 2
Marton L. Toth | Siva A. Vanapalli | Aldo Jongejan | Morten Scheibye-Knudsen | Riekelt H.
Houtkooper1| Georges E. Janssens1
1
Laboratorio de Enfermedades
Metabólicas Genéticas, Abstract
Gastroenterología, Endocrinología y o
Metabolismo de Amsterdam, Ciencias
Cardiovasculares de Amsterdam,
La detección de fármacos basada en transcriptomas está surgiendo como una herramienta
UMC de Amsterdam, Universidad de poderosa para identificar compuestos geroprotectores para intervenir en enfermedades relacionadas
Ámsterdam, Ámsterdam, Países Bajos
2
con la edad. Nuestra hipótesis es que, al imitar la firma transcripcional de la intervención de
Centro para el Envejecimiento
Saludable, Departamento de Medicina longevidad altamente conservada de la sobreexpresión de FOXO3 (daf-16 en gusanos), podríamos
Celular y Molecular, Universidad de identificar y reutilizar compuestos con efectos posteriores similares para aumentar la longevidad.
Copenhague, Copenhague, Dinamarca
3 Nuestra evaluación in silico, utilizando la base de datos de transcriptomas LINCS de intervenciones
Core Facility Metabolomics,
Amsterdam UMC, Universidad de genéticas y compuestas, identificó varios compuestos aprobados por la FDA que activan objetivos
Amsterdam, Amsterdam, Países Bajos
4
posteriores de FOXO en células de mamíferos. Estos incluyeron el bloqueador neuromuscular
Departamento de Ingeniería Química,
Texas Tech University, Lubbock, TX, atracurio, que también extiende considerablemente la esperanza de vida y la salud en
EE. UU. Caenorhabditis elegans. Esta longevidad depende tanto de la señalización de daf-16 como de la
5
NemaLife Inc, Lubbock, Texas, EE. UU.
inhibición de la subunidad neuromuscular del receptor de acetilcolina unc-38. Descubrimos que unc-
6
Laboratorio de Bioinformática,
Amsterdam UMC, Universidad de 38 RNAi mejora la esperanza de vida y la salud y estimula la localización nuclear de DAF-16, de
Amsterdam, Amsterdam, Países Bajos forma similar al tratamiento con atracurio. Finalmente, utilizando la transcriptómica RNA-seq,
Correspondencia identificamos la activación por atracurio de los efectores posteriores de DAF-16. En conjunto, estos
Georges E. Janssens, Laboratorio datos demuestran la capacidad de imitar las intervenciones genéticas a lo largo de la vida con
Enfermedades metabólicas genéticas,
Gastroenterología, endocrinología y medicamentos y, al hacerlo, revelan que el receptor neuromuscular de acetilcolina regula la vía de
metabolismo de Ámsterdam, Ciencias longevidad altamente conservada FOXO/DAF-16.
cardiovasculares de Ámsterdam, UMC
de Ámsterdam, Universidad de
Ámsterdam, Meibergdreef 9, 1105 AZ PALABRAS
CLAVE
Ámsterdam, Países Bajos.
acetilcolina, envejecimiento, atracurio, DAF-16, FOXO, longevidad, unión
Correo
electrónico:gejanssens@amsterdamumc.nl neuromuscular
Información de financiación
ZonMw, Número de
subvención/adjudicación:
09150161810014 y 91715305; H2020
Consejo Europeo de Investigación,
número de subvención/premio: 638290;
Velux Stiftung, Número de
subvención/premio: 1063
Este es un artículo de acceso abierto bajo los términos delAtribución de Creative CommonsLicencia, que permite el uso, distribución y reproducción en cualquier medio,
siempre que se cite correctamente la obra original.
© 2021 Los Autores. Aging Cell publicado por la Anatomical Society y John Wiley & Sons Ltd.
Envejecimiento celular. wileyonlinelibrary.com/journal/acel |1 de 16

2021;20:e13381.
https://doi.org/10.1111/acel.13381
Commons aplicable.
14749726, 2021, 8, Descargado de https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/acel.13381 por Cochrane Chile, Wiley Online Library el [31/08/2023]. Consulte los Términos y condiciones (https://onlinelibrary.wiley.com/terms-and-conditions) en Wiley Online Library para conocer las reglas de uso; Los artículos OA se rigen por la licencia Creative
2de 16 | MCINTYREET al .
Aunque los modelos de envejecimiento comúnmente utilizados,

1 |INTRODUCCIÓN
como el nematodo Caenorhabditis elegans, tienen una
esperanza de vida relativamente corta en comparación con los
El envejecimiento es un importante factor de riesgo de enfermedad
mamíferos, probar compuestos a gran escala sigue siendo difícil.
y, en los últimos años, se han descubierto constantemente vías e
Una alternativa al cribado in vivo a gran escala es el cribado de
intervenciones celulares que influyen en el proceso de
fármacos in silico basado en transcriptomas. Aquí, la mayor parte
envejecimiento. Éstas se clasifican como características del
del proceso de selección se realiza computacionalmente, lo que
envejecimiento (López-Otín et al., 2013), que van desde
reduce considerablemente la lista de candidatos de compuestos
alteraciones intracelulares, como vías desreguladas de
que requieren validación. Este método, cuando se aplica a la firma
señalización de nutrientes, hasta alteraciones de la comunicación
transcripcional del
intercelular (López-Otín et al., 2013). . Se han identificado muchas
intervenciones genéticas para retardar la progresión de los
procesos de envejecimiento y, por tanto, la progresión de la
enfermedad (Figura 1a). La identificación de medios
farmacológicos para abordar este riesgo sería de gran beneficio
para la sociedad (Figura 1a) (Partridge et al., 2020).
El sello distintivo de la señalización desregulada de
nutrientes incluye muchas vías de longevidad bien descritas,
como el objetivo mecanicista de la rapamicina (mTOR) y la
fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) (Houtkooper et al., 2010).
Integrada con ambos está la intervención de longevidad
genética altamente conservada: activación o sobreexpresión de
la familia de factores de transcripción Forkhead Box O (FOXO).
Se ha demostrado que la sobreexpresión de FOXO y sus
ortólogos en levaduras, gusanos y moscas aumenta la
esperanza de vida (Figura 1b) (Hwangbo et al., 2004; Kwon et
al., 2010; Lin et al., 1997; Postnikoff et al., 2012). En la hidra,
se cree que FOXO es crucial para la inmortalidad (Boehm et al.,
2012), y en ratones, es necesario para los efectos de la
restricción dietética que prolongan la vida útil (Figura 1b)
(Shimokawa et al., 2015). . En humanos, la variante FOXO3a
está específicamente asociada con la longevidad (Figura 1b)
(Martins et al., 2016; Morris et al., 2015).
Otra característica distintiva del envejecimiento, la
comunicación intercelular alterada, se analiza con mayor
frecuencia en relación con la inflamación. Sin embargo, más
recientemente ha comenzado a surgir el papel de otras formas
de comunicación intercelular en el proceso de envejecimiento.
Uno que es particularmente relevante para este estudio es la
señalización de acetilcolina (ACh) en la unión neuromuscular
(NMJ). En Caenorhabditis elegans, se ha demostrado que la
suplementación con ACh mejora la tolerancia al estrés
(Furuhashi
y Sakamoto, 2016). Sin embargo, se demostró que una mayor
transmisión colinérgica acelera los fenotipos neurodegenerativos en
ratones (Sugita et al., 2016). Actualmente hay conocimientos
limitados sobre el papel específico de la señalización de ACh NMJ
en el envejecimiento y la longevidad, pero puede haber una
conexión.
La identificación de geroprotectores, compuestos que
pueden retardar el proceso de envejecimiento para retrasar la
aparición de enfermedades relacionadas con la edad, es un
campo relativamente nuevo. A pesar del desarrollo de algunos
métodos de alto rendimiento, la detección de estos compuestos
lleva mucho tiempo debido a la necesidad de evaluar la vida útil
completa de los organismos modelo (Moskalev et al., 2016).
MCINTYREET al . | 3de 16
que imitan transcripcionalmente la sobreexpresión de FOXO3

Una intervención de longevidad bien conocida, la restricción
(Figura 1d; Tabla S1). Para categorizar los puntos en común
dietética (DR), identificó la alantoína mimética de DR (Calvert et
dentro de esta lista, que contenía tanto medicamentos aprobados
al., 2016). De manera similar, los miembros de nuestro grupo
por la FDA como compuestos desarrollados para uso en
aplicaron algoritmos de aprendizaje automático entrenados en
investigación, utilizamos las descripciones de los medicamentos
conjuntos de datos de transcriptomas del envejecimiento humano
asociados con cada compuesto para realizar un análisis de
a transcriptomas de respuesta a fármacos. Este método permitió
enriquecimiento. Esto nos permitió ver qué fármaco
la identificación de inhibidores de HSP90, incluidos monorden y
tanespimicina, como geroprotectores (Janssens et al., 2019).
Aquí, utilizando una prueba de detección de fármacos in
silico basada en transcriptómica centrada en la intervención de
longevidad genética conservada de la sobreexpresión de
FOXO3, identificamos una serie de geroprotectores aprobados
por la FDA. A partir de ahí, nos centramos en el bloqueador
neuromuscular, el atracurio, que activó objetivos FOXO en
cultivos de células de mamíferos y extendió tanto la vida como
la salud de los gusanos. Esta extensión dependía de FOXO
(daf-16 en gusanos) y del antagonismo del receptor de
acetilcolina (AChR). En conjunto, estos resultados demuestran
una cascada de longevidad conservada en la que la inhibición
del AChR por atracurio conduce a la activación de FOXO/DAF-
16 y, por lo tanto, a una longevidad prolongada.
2 |
RESULTADO
S
2.1 |La detección de fármacos in silico

identifica compuestos que imitan la firma
transcripcional de la sobreexpresión de FOXO3
Para identificar compuestos que producen efectos similares a la

sobreexpresión de FOXO3, utilizamos la biblioteca de firmas
celulares basadas en redes integradas (LINCS), una base de
datos y un paquete de software que contiene firmas
transcripcionales de líneas celulares humanas tratadas con
fármacos y perturbaciones genéticas ( Keenan et al., 2018;
Subramanian et al., 2017). LINCS incluye las firmas
transcripcionales de 2837 compuestos, muchos de los cuales
están aprobados por la FDA, y se originan a partir de un
conjunto central de ocho líneas celulares (PC3, VCAP, A375,
HA1E, HCC515, HT29, MCF7 y HEPG2).
Con la firma transcripcional de sobreexpresión de FOXO3
disponible en esta base de datos, utilizamos el software en línea
disponible en LINCS para buscar compuestos que produzcan los
efectos transcripcionales más similares a la sobreexpresión de
FOXO3 (Figura 1c). Para cada compuesto, se generó una
puntuación estandarizada que varió desde
−100 (firma transcripcional muy opuesta al candidato de consulta) a 100 (firma
transcripcional muy similar al candidato de consulta), y se generó una puntuación
resumida que consolida los datos de la línea celular para cada compuesto. Se
utilizaron puntuaciones resumidas superiores a 90 como criterio de corte para
designar compuestos con firmas transcripcionales similares, según lo
recomendado por LINCS, y los resultados clasificados se descargaron para una
evaluación adicional (Tabla S1).
Este enfoque generó una lista de 129 fármacos candidatos
Commons aplicable.
Las clases fueron las más frecuentes en nuestra lista, en relación Como es más sencillo reutilizar medicamentos que ya se
con todo el conjunto de datos. Descubrimos que tanto los utilizan en un entorno clínico que desarrollar otros nuevos,
inhibidores de mTOR como los inhibidores de PI3quinasa estaban continuamos la investigación con nuestros cinco resultados
fuertemente enriquecidos como clases de fármacos que coincidían principales de la pantalla que ya contaba con la aprobación de la
con la firma de ARNm de sobreexpresión de FOXO3 (Figura 1e). FDA (Figura 1f). Estos compuestos incluyeron dos controles
Debido a que se sabe que los inhibidores de mTOR y PI3quinasa positivos que se sabe que extienden la vida útil del organismo
aumentan la esperanza de vida y actúan dentro de la vía de modelo: el antagonista de la serotonina ciproheptadina
longevidad FOXO (Babar et al., 1999; Hay, 2011), concluimos que (clasificado en primer lugar en el subconjunto aprobado por la
nuestro enfoque podría identificar compuestos que se sabe que FDA; clasificado en el cuarto lugar en general) (Petrascheck et al.,
extienden la vida útil a través de la vía de señalización FOXO. 2007) y el inhibidor de mTOR rapamicina (segundo lugar en el
ranking de la FDA). aprobado; 14º en general) (Robida-Stubbs et
al., 2012)
(a) (b) (C
Joven genes
Gen FOXO en la ) Biblioteca de red integrada
Droga longevidad
s
Levadura La sobreexpresión de los ortólogos FOXO FKH1 y firmas celulares basadas
FKH2 da como resultado una extensión de la vida útil (LINCOS)
Hidra del 30% (Postnikoff et al., 2012). 5+ líneas celulares
Se cree que el ortólogo único de FOXO es crucial para
Enferm autorrenovación y capacidad inmortal (Boehm et al., 2012).
edad
incidenci El ortólogo FOXO (daf-16) puede funcionar para 2837 Drogas
Gusa
a duplicar la vida útil (Lin et al., 1997, Kwon et al., 2010). 3799 Derribos
no
El ortólogo FOXO (dFOXO) extiende la vida útil 2160 Sobreexpresiones FOXO3
aproximadamente un 33% cuando se sobreexpresa
Volar (Hwangbo et al., 2004).
RatónFoxo3 es necesario para que la restricción dietética
Viejo prolongue la vida en M. musculus (Shimokawa et al.,
2015).
HumanoLos estudios de población vinculan FOXO3A con la
longevidad y la salud (revisado en Morris et al., 2015 y
Martins et al., 2016).
(d) (F) (gramo)

(m
i)
FOXO3equipo 12.5 Inhibidor de
original mTOR Inhibidor Células ciproheptadina
miméticos 6
de PI3K cardíacas
Puntuación Droga de ratón
ARNm (cambio de
HL1
valor p ajustado (-log10)
99,22 tipifarnib 10.0 *

Padj< 0,05
98,73 XAV-939 Ran Droga(FDA)Ci *
98,63 BRD-K36038115 Sig. no
98,59 ciproheptadina
7.5 significativa. 24
go proheptadina 4 * *
inhibidor de nucleofosmina clase de Rapamicina
veces)
98,54 KUC103904N 4
98,33 droga cultura Atracurio *
avrainvillamide- 5.0 inhibidor de PLK 14
98,27 analógico-4 TGX-221 Inhibidor de proteína quinasa de las Sildenafil
Porcentaje de clase 20 2
98.20 ataluren dependiente de ADN drogas Zidovudina
2.5 de medicamento 21
98.20 AM-281 cubierta
98.13 avrainvillamide- Inhibidor de la quinasa ATR 28
0.0 25 0
98.06 analógico-3 HG-5-88-01
97,96 avrainvillamide- 50
75 Genes diana
97,78 analógico-5 AZD-8055 4 8 12 100 qPCR Foxo3
97,64 sirolimus
Golpes
97,43 estiripent
ol
(h) (i) (j) (k)

rapamicina atracurio Sildenafil Zidovudina
4 3 o 3
* * 3 * *
ARNm (cambio de
ARNm (cambio de
ARNm (cambio de
3 *
ARNm (cambio de
2 * 2
*
2
* * *
2 *
*
veces)
veces)
veces)
1 * 1 1
veces)
0 0 0 0
F I G U R A 1 La detección de fármacos in silico identifica compuestos que imitan la firma transcripcional de la sobreexpresión de
FOXO3. (a) Esquema que representa la mayor incidencia de enfermedades a lo largo del proceso de envejecimiento. Se han
descrito muchas intervenciones genéticas (naranja) que intervienen en el proceso de envejecimiento para promover la salud y
aumentar la esperanza de vida. Las intervenciones farmacológicas (azul) son menos frecuentes, pero aquí describimos los
esfuerzos para identificar compuestos capaces de producir los mismos efectos. (b) El papel conservado de FOXO en la regulación
de la longevidad en todo
El árbol filogenético. FOXO y sus ortólogos regulan directamente, o están asociados con, el envejecimiento en organismos tan
lejanamente relacionados como la levadura y los humanos. (c) La biblioteca de firmas celulares integradas basadas en redes (LINCS),
una base de datos que contiene un conjunto central de firmas transcripcionales de al menos cinco líneas celulares diferentes de uso
común. Firmas transcripcionales para más de 2500 medicamentos, más de 3500 eliminaciones de genes y
Hay más de 2000 expresiones genéticas disponibles. Utilizamos la firma transcripcional de sobreexpresión FOXO3 presente en LINCS para
consultar
para compuestos miméticos. (d) Los 15 resultados principales que imitan la sobreexpresión de FOXO3 de los compuestos centrales de
LINCS y su puntuación resumida que integra los resultados de todas las líneas celulares analizadas. Todos los resultados compuestos se
pueden encontrar en la Tabla S1. (e) El enriquecimiento de las clases de fármacos en la lista de candidatos muestra los inhibidores de
mTOR y PI3K como clases de fármacos altamente enriquecidas por su potencial para imitar la sobreexpresión de FOXO3 entre los
fármacos candidatos. Los nombres de las clases de fármacos solo se muestran si pasan la importancia del enriquecimiento (p ajustado <
0,05, eje Y). El número de aciertos de la clase de droga se representa en el eje X, mientras que los tamaños de los puntos en el diagrama
de dispersión indican qué porcentaje de la clase de droga fueron aciertos (es decir, 5
aciertos de una clase de 10 denotarían una cobertura del 50%). (f) Esquema del método de validación in vitro para probar medi camentos
candidatos. Se cultivaron células cardíacas de ratón HL1 con compuestos durante 24 h de exposición. FOXO3 y la expresión del gen diana
se evaluaron mediante qPCR (nivel de ARNm normalizado con respecto al gen de referencia Gapdh). Para las pruebas se utilizaro n los 5
compuestos mejor clasificados de la lista de candidatos (figura d) que también tenían estado de aprobación de la FDA. ( g – k ) Los niveles
de expresión de Foxo3 y sus genes diana (Gadd45a, Ccng2, Hspa1b, Cat, Bcl6, Scp2 evaluados mediante qPCR) en células de contr ol
(gris) o células tratadas con fármacos candidatos (azul): ciproheptadina ( g), rapamicina (h), atracurio (i), sildenafil (j) y zidovudina (k).
Todos los fármacos se evaluaron a una concentración de 50 µM, excepto la rapamicina que se evaluó a 10 µM para evitar toxicidad. El
asterisco indica una expresión significativamente mayor para cada gen (p <0,05, prueba t) con el fármaco en relación con el c ontrol.
Commons aplicable.
(a) (b)
100 100
Zidovudina 50 µM**** Atracurio 50 µM****
Porcentaje de
supervivencia
Porcentaje de
supervivencia
75 Vehículo DMSO 75 Vehículo acuático
50 50
25 25
N2 N2
0 0
0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50
Días Días
(C) (d)
100 100
Zidovudina 50 µM**** Atracurio 50 µM*
Porcentaje de
supervivencia
Porcentaje de
75
supervivencia
75 Vehículo DMSO Vehículo acuático
50 50
25 25
daf-16(mu86) daf-16(mu86)
0 0
0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50
Días Días
(mi) (F)
100 Atracurio 500 µM**** ns
20 Día 10
* Atracurio 50 µM ***
** ****
Porcentaje de
supervivencia
75 ns
15 *
Velocidad media
Atracurio 5 µM
50 Vehículo acuático
10
(AU)
5 25
0 0 N2
vehículo 5 µM 50 µM 500 µM 0 10 20 30 40 50
acuático Días
atracurio
F I G U R A 2 La zidovudina y el atracurio prolongan la vida útil en Caenorhabditis elegans, pero sólo el atracurio depende del daf -16. (a)
Curvas de supervivencia que muestran que la zidovudina (50 μM) prolonga la vida útil en C.elegans de tipo salvaje (N2). (b) Curvas de
supervivencia que muestran que el atracurio (50 μM) prolonga la vida útil en N2 C.elegans. (c) Curvas de supervivencia que muestran
que la zidovudina (50 μM) prolonga la vida útil en la cepa daf-16 (mu86). (d) Curvas de supervivencia que muestran que el atracurio (50
μM) no puede prolongar la vida útil en la cepa daf-16 (mu86). (e) Movilidad de gusanos N2 tratados con atracurio el día 10 de la edad
adulta. El atracurio mejora la esperanza de vida de forma dosis-dependiente (5 μM, 50 μM, 500 μM). Para cada condición, n = ~70–100
mediciones de ~50 gusanos. La significación estadística se determina mediante un ANOVA unidireccional y los valores p represe ntados
se comparan con el vehículo acuático. Consulte la Tabla S3 para conocer las estadísticas de salud. (f) Curvas de supervivencia que
muestran una extensión significativa de la vida útil con atracurio en dosis crecientes (5 μM, 50 μM, 500 μM). Si bien parece haber algún
efecto dosis-efecto, y todas las dosis extienden significativamente la vida útil en relación con el tratamiento con vehículos acuáticos, las
diferencias entre las concentraciones no son estadísticamente significativas. Todas las comparaciones estadísticas de las cur vas de
supervivencia son
determinado mediante pruebas de rango logarítmico. Para cada condición, n = 100 gusanos. Consulte la Tabla S2 para conocer las
estadísticas de vida útil. ****p < 0,0001, ***p < 0,001, **p < 0,01,
*p < 0,05, ns—no significativo
y el inhibidor nucleósido de la transcriptasa inversa (INTI) zidovudina

y otros tres compuestos; el bloqueador neuromuscular atracurio
(quinto aprobado por la FDA; 28 en general).
(tercero aprobado por la FDA; vigésimo en general), el
vasodilatador sildenafil (cuarto aprobado por la FDA; 21 en general)
A continuación, intentamos investigar la capacidad de estos

compuestos individuales para activar la vía FOXO in vitro. Debido a que
FOXO ha estado implicado durante mucho tiempo en el envejecimiento
cardíaco (Wong y Woodcock, 2009), cultivamos células cardíacas HL1
de ratón con cada compuesto individualmente durante 24 h y
Commons aplicable.
edad adulta, el atracurio aumentó significativamente la movilidad

evaluó la expresión genética del propio Foxo3 y de varios genes
relacionada con la edad de una manera dependiente de la dosis
diana conocidos de Foxo3 (Figura 1f). Los genes diana incluyeron
(Figura 2e; Tabla S3), lo que sugiere que el atracurio extiende no solo
Gadd45a, un gen de reparación del ADN directamente estimulado por
la esperanza de vida, sino también la salud. Luego valoramos la
la actividad de FOXO3 (Tran et al., 2002), Ccng2 y Bcl6, ambos
concentración de atracurio para determinar si había una dosis-
genes relacionados con el ciclo celular también regulados
respuesta similar en la extensión de la esperanza de vida. Cada
directamente por FOXO3 (Fernández de Mattos et al., 2004; Fu &
concentración probó una vida útil más larga en comparación con el
Peng, 2011), la catalasa Cat y el portador de esteroles Scp2, que
vehículo acuático (Figura 2f). Sin embargo, aunque concentraciones
forman parte del sistema de defensa antioxidante celular regulado por
más altas
la actividad del factor de transcripción Foxo en general (Dansen et al.,
2004; Klotz et al., 2015), y Hspa1a, que codifica una proteína de
choque térmico regulada por factores de transcripción FOXO, se
conserva en todas las especies (Webb et al., 2016). En relación con
las células no tratadas, encontramos que la mayoría de los
compuestos podrían activar significativamente la expresión de Foxo3,
así como la mayoría de los objetivos que probamos (Figura 1g-k).
Estos datos sugieren que nuestra selección de compuestos tuvo éxito
en la identificación de compuestos que imitan la sobreexpresión de
FOXO3 mediante la activación de los genes diana de Foxo3.
2.2 | La zidovudina y el atracurio prolongan la vida útil

en Caenorhabditis elegans, pero sólo el atracurio
depende del daf-16
Para probar los efectos de los compuestos identificados en la esperanza de vida,

recurrimos a C. elegans, un organismo modelo simple y bien descrito para el
envejecimiento. Como se señaló anteriormente, la ciproheptadina y la rapamicina
son conocidos prolongadores de la vida útil (Petrascheck et al., 2007; Robida-
Stubbs et al., 2012), por lo que procedimos a probar los efectos de atracurio,
sildenafil y zidovudina sobre la vida útil. De estos tres, la zidovudina y el atracurio
prolongaron de manera robusta y reproducible la vida útil a una concentración de
50 μM (Figura 2a,b; Tabla S2), mientras que el sildenafil no produjo diferencias
consistentes en la vida útil con la concentración y las condiciones que probamos
(Tabla S2). .
Debido a que nuestra prueba compuesta se basó en la
sobreexpresión de FOXO3, planteamos la hipótesis de que la
extensión de la vida útil a partir de nuestros impactos positivos
dependería de daf-16. Por lo tanto, probamos si la zidovudina y
el atracurio prolongan la vida útil en la cepa mutante daf-
16(mu86). La zidovudina mantuvo una sólida extensión de la vida
útil en el mutante (Figura 2c), mientras que la extensión de la
vida útil inducida por el atracurio fue casi completamente anulada
(Figura 2d). En conjunto, estos datos sugieren que, a pesar de
perfiles transcripcionales similares, el atracurio depende de daf-
16, mientras que la zidovudina no. Esperamos que la naturaleza
altamente conservada de FOXO/daf-16 pueda tener una
relevancia traslacional significativa y, por lo tanto, continuar la
investigación del atracurio para comprender mejor la señalización
ascendente en juego.
El envejecimiento saludable no sólo está determinado por la
esperanza de vida, sino también por la salud. Una forma de medir la
salud de los gusanos es a través de la movilidad o velocidad
promedio de gateo (Pierce-Shimomura et al., 2008). Valoramos la
concentración de atracurio para probar adicionalmente la duración
de la salud en función de las dosis-respuestas. En el día 10 de la
salvaje tratados con atracurio en comparación con los no tratados

del atracurio extendió aún más la esperanza de vida media (Tabla S2),
(Figura 3e). Sin embargo, tanto en los gusanos mutantes unc-38
las diferencias entre las distintas dosis en la supervivencia no fueron
(e264) como en unc-38 (x20), el atracurio ya no pudo prolongar la
estadísticamente significativas (Figura 2f). Por lo tanto, si bien la
vida útil (Figura 3b). Este efecto fue específico de unc-38, ya que el
esperanza de vida aumenta de manera dependiente de la dosis, no
atracurio aún pudo aumentar la esperanza de vida en los otros
podemos concluir que exista un efecto dosis-respuesta significativo en la
cuatro mutantes de NMJ probados (Figura 3b). Por lo tanto, estos
esperanza de vida con atracurio.
datos muestran que el unc-38 se requiere específicamente para las
mejoras en la salud inducidas por el atracurio.
2.3 | Atracurio prolonga la esperanza de

vida en Caenorhabditis elegans al
antagonizar el receptor neuromuscular de
acetilcolina
El atracurio es un bloqueador neuromuscular y se utiliza en el

cuidado del paciente como relajante muscular anestésico. Por lo
tanto, consideramos la posibilidad de que, si los músculos
faríngeos se relajaran mediante el tratamiento con atracurio, el
gusano sería incapaz de bombear bacterias eficientemente a su
cuerpo, lo que reduciría en consecuencia la ingesta de alimentos e
induciría un estado de restricción dietética (RD). . Por lo tanto,
probamos el bombeo faríngeo el día 1 de la edad adulta.
Contrariamente a nuestras expectativas, los gusanos tratados con
atracurio mostraron una tasa de bombeo significativamente mayor
en comparación con sus homólogos de control (Figura S1A).
También a diferencia del fenotipo DR, el atracurio aumentó el área
corporal de los gusanos en el día 10 de la edad adulta en relación
con los gusanos no tratados de una manera dependiente de la
dosis (Figura S1B). Estos datos en conjunto sugieren que la RD
no es la causa de la extensión de la vida útil del atracurio.
En condiciones fisiológicas, en la NMJ, la ACh cruza la
sinapsis para unirse al AChR, lo que provoca que el canal se
despolarice y el músculo se contraiga (Rand, 2007). El atracurio
antagoniza competitivamente el AChR (Lee, 2001; Wishart et al.,
2018), impidiendo esta contracción y permitiendo que el músculo
se relaje (Figura 3a). Nos preguntamos si el atracurio prolonga la
duración de la salud a través de esta vía o, en cambio, a través de
un efecto fuera del objetivo. El atracurio se une a una subunidad
alfa del AChR, codificada por CHRNA2 en humanos (Wishart et
al., 2018). El homólogo más cercano a esta subunidad en C.
elegans está codificado por el gen unc-38 (Figura S1C) (Fleming
et al., 1997; Harris et al., 2020). Hay varias cepas de C. elegans
disponibles con el mutante unc-38, por lo que decidimos utilizar
tanto unc-38 (e264) como unc-38 (x20). Como el sistema AChR
no es completamente homólogo entre humanos y C. elegans
(Rand, 2007), también incluimos mutantes de una variedad de
genes involucrados en la señalización de NMJ. Hay 27 genes
identificados como genes AChR en C. elegans, que se han
dividido en cinco clases de subunidades proteicas según la
similitud de secuencia (Rand, 2007). Queríamos probar las cinco
clases y, por lo tanto, incluimos mutantes para unc-29 (e193), acr-
8 (ok1240), acr-16 (ok789) y deg-3 (u662) (Figura 3b, Figura
S1C). Para determinar si los efectos que observamos con el
atracurio dependían de alguna de estas subunidades, probamos la
esperanza de vida en el día 10 de la edad adulta. Nuevamente
vimos una mayor esperanza de vida en los gusanos N2 de tipo
Commons aplicable.
(a) (b)
Acetilcolina (ACh) Día 10
25 Vehículo acuático
Atracurio *
Atracurio 50 µM
terminal
nervios 20 *** **
a
Velocidad promedio
15
***
10 ns ns
****
(AU)
ACh 5
Receptor
Múscul 0
o
N2 unc-38(x20) unc-38(e264) unc-29(e193) acr-8(ok1240) acr-16(ok789) grados-3(u662)
Atracurio de unión
a la subunidad α
de AChR
(C) (d) (mi)
100 100 100

ns
Atracurio 50 µM*** Atracurio 50 µM Atracurio 50 µM****
Porcentaje de
Porcentaje de
Porcentaje de
supervivencia
supervivencia
75 Vehículo acuático 75
supervivencia
Vehículo acuático 75 Vehículo
acuático
50 50 50
25 25 25
N2 unc-38(x20) unc-38(e264)
0 0 0
0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50
Días Días Días
F I G U R A 3 El atracurio prolonga la esperanza de vida y la salud al antagonizar el receptor neuromuscular de acetilcolina. (a)
Representación del mecanismo canónico del atracurio en la unión neuromuscular (NMJ) relevante para este estudio. En los seres
humanos, el atracurio se utiliza para relajar los músculos y lo hace antagonizando el receptor de acetilcolina (AChR). En condiciones
normales, la acetilcolina (ACh) se une a la
receptor, provocando la despolarización del canal y la contracción del músculo. El atracurio se une al AChR en lugar de ACh, evitando esta
despolarización y contracción. ( b ) Movilidad de gusanos N2 tratados con atracurio (50 μM) y mutantes de jugadores en la señalización de
NMJ ACh en el día 10 de la edad adulta. El atracurio mejora la esperanza de vida en los gusanos N2, pero este efecto se elimina en los
gusanos con el mutante unc-38. unc-38 codifica una subunidad alfa del AChR y es el ortólogo del gusano CHRNA2 humano, que se une al
atracurio en humanos. Los otros mutantes de la vía de la ACh todavía responden al atracurio, lo que sugiere que el aumento de la esperanza
de vida depende de esta subunidad específica del AChR. Para cada condición, n = ~50–90 mediciones de ~50 gusanos. La importancia
estadística de cada mutante está determinada por un Mann-Whitney individual
Prueba U que compara tratados y no tratados. Consulte la Tabla S3 para conocer las estadísticas de salud. (c) Curvas de supervivencia de
control (realizadas en paralelo a las de los paneles (d y e) que muestran que el atracurio (50μM) extiende la vida útil en el tipo salvaje
(N2)C.elegans. (d) Curvas de supervivencia que muestran que el atracurio (50 μM) no extiende la vida útil en elCepa mutante unc-
38(x20). (e) Curvas de supervivencia que muestran que el atracurio (50 μM) no se extiendeesperanza de vida en la cepa mutante unc-
38(e264) (el atracurio acorta la vida útil ****p < 0,0001). Para cada condición, n = 100. Las estadísticas de vida útil se determinan mediante
pruebas de rango logarítmico. Consulte la Tabla S2 para conocer las estadísticas de vida útil. ****p < 0,0001, ***p < 0,001, **p < 0,01, *p <
0,05, ns - no significativo
A continuación, probamos si la ausencia de unc-38 también impedía

la extensión de la vida útil inducida por el atracurio. De hecho, a Habiendo determinado que la extensión de la vida útil inducida
diferencia del tratamiento en gusanos N2 (Figuras 2a, 3c), el atracurio por el atracurio depende del daf-16, a continuación intentamos
no pudo extender la vida útil en ninguno de estos mutantes (Figura 3d, validar que
e). De hecho, en el mutante unc-38(e264), el atracurio parecía tener
efectos perjudiciales sobre la esperanza de vida (Figura 3e). En
conjunto, estos datos sugieren que el atracurio requiere
específicamente la subunidad unc-38 del AChR para lograr mejoras en
la esperanza de vida y la salud en C. elegans, y estos efectos no se
deben a una respuesta fuera del objetivo.
2.4 |El atracurio y el ARNi unc-38 estimulan de

manera similar la localización nuclear de DAF-16
y extienden la esperanza de vida y la salud
El tratamiento con atracurio provoca la translocación física de

DAF-16 al núcleo. Para investigar la localización de DAF-16,
empleamos una cepa transgénica de C. elegans que expresa
DAF-16 etiquetado con GFP (Henderson & Johnson, 2001). El
tratamiento con atracurio durante 24 h (desde la etapa L4
hasta el día 1 de la edad adulta) provocó un aumento
significativo de la localización nuclear de DAF-16 en los
gusanos en comparación con los que no fueron tratados
(Figura 4a, b). Además, quisimos caracterizar el papel de unc-
38 en esta localización, ya que la mutación de esta subunidad
bloquea los efectos sobre la vida y la salud del atracurio
(Figura 3). Empleamos ARNi de unc-38 y observamos una
localización nuclear de DAF-16 similar con ARNi de unc-38
como con el tratamiento con atracurio (Figura 4a, b). La
combinación de unc-38 RNAi y el tratamiento con atracurio no
condujo a ningún aumento adicional de la localización nuclear
en comparación con los tratamientos individuales (Figura 4a,
b).
Como parecía que unc-38 RNAi causaba una estimulación
similar de la localización nuclear de DAF-16 como el
tratamiento con atracurio, intentamos
Commons aplicable.
Vector vacío (EV) EV + Atracurio 50 µM

(a)
unc-38 ARNi unc-38 ARNi + Atracurio 50 µM
(b) (C) Día 12

(d)
vehículo
Día 1 Localización del 25 eléctrico *
acumulación nuclear
DAF-16 **** EV + Atracurio

***
DAF-30::GFP
ns unc-38 ARNi
Estrés por calor 20 **** 100
unc-38 ARNi ****
Velocidad promedio
unc-38 ARNi + Atracurio

15
Porcentaje de
supervivencia
+ Atracurio 75
unc-38 ARNi
10 50
(AU)
EV + Atracurio
5 25
Vector vacío (EV) N2
0 0
0% 20% 40% 60% 80% 100% 0 10 20 30 40
Días
F I G U R A 4 El atracurio y el unc-38 RNAi estimulan de manera similar la localización nuclear de DAF-16 y extienden la esperanza de vida y
la salud. (a) Imágenes representativas de gusanos adultos del día 1 que expresan DAF-16::GFP al alimentarse con un vector vacío o con
bacterias unc-38 RNAi HT115, y tratamiento con vehículo acuático o atracurio (50 μM). El panel izquierdo de cada condición muestra
imágenes fluorescentes de la localización nuclear de DAF-16::GFP, mientras que el panel derecho muestra una superposición de imágenes
fluorescentes de DAF-16::GFP con imágenes de campo brillante de gusanos. Escala
medidas de la barra 25μM y se puede aplicar a todas las imágenes. (b) Cuantificación de A.n = ~20–30 animales diferentes, agrupados a partir
de dos experimentos independientes. Los tratamientos se comparan con estrés por calor a 35°C durante 3 h como control positivo. Se realizó
una prueba de independencia de chi-cuadrado para evaluar la importancia de las diferencias en los niveles de enriquecimiento nuclear DAF-
16 entre cada uno de los tratamientos. Tanto el tratamiento con atracurio como el ARNi unc-38 aumentan significativamente la proporción de
gusanos con DAF-16 localizado en el núcleo en comparación con la condición de vector vacío no tratado (p <0,0001). No existe una
diferencia significativa entre los gusanos alimentados con ARNi unc-38 con y sin atracurio. (c) Movilidad de los gusanos N2 al alimentarse
con vector vacío o ARNi unc-38, y tratamiento con vehículo acuático o atracurio (50µM) al día12 de edad adulta. Tanto el atracurio (50µM)
yunc-38 RNAi mejora la esperanza de vida en gusanos tratados con vectores vacíos. Para cada condición, n = ~85 –110 mediciones de
~50 gusanos. La significación estadística se determina mediante ANOVA unidireccional. Las estad ísticas de salud se pueden encontrar
en la Tabla S3.
( d ) Curvas de supervivencia que muestran que tanto el atracurio (50 μM) como el ARNi unc-38 extienden la vida útil en gusanos N2, pero el
atracurio acorta la vida útil cuando se combina con ARNi unc-38. Para cada condición, n = 120. Las estadísticas de vida útil se determinan
mediante pruebas de rango logarítmico. Consulte la Tabla S2 para conocer las estadísticas de vida útil. ****p < 0,0001, ***p < 0,001, *p < 0,05, ns -
no significativo
UNC-38 con atracurio, o la eliminación de unc-38 usando ARNi,

determinar si también beneficiaría la salud y la esperanza de vida.
causan la localización nuclear de DAF-16 a través de una vía
De hecho, unc-38 RNAi dio como resultado una mejor salud, sin
similar para mejorar la salud y la esperanza de vida de los gusanos.
ningún beneficio adicional cuando los gusanos también fueron
tratados con atracurio (Figura 4c). El ARNi de unc-38 también
extendió la vida útil, aunque observamos una vida útil más corta
con el tratamiento combinado de ARNi de unc-38 y atracurio
(Figura 4d). En conjunto, estos datos sugieren que la inhibición de
2.5 |La secuenciación de ARN demuestra la

inducción de respuestas protectoras al estrés y la
remodelación metabólica mediante efectores
posteriores FOXO/DAF-16
Habiendo llegado a la conclusión de que el atracurio causa la

localización nuclear de DAF-16, quisimos examinar los efectos
transcripcionales posteriores. Por lo tanto, realizamos la
secuenciación de ARN en gusanos tratados durante 24 h
(desde la etapa L4 hasta el día 1 de la edad adulta) con
atracurio en comparación con los no tratados. Los dos grupos
de tratamiento
Commons aplicable.
(a) Atracurio (b) (C

Regulado al pág-13 ) Clústeres regulados a la Clústeres regulados al alza
Vehículo
alza Regulado
acuático baja
a la baja
espermatogénesis Reducción de oxidación
PLS-DA 7.5 Respuesta inmune Unión de
20 innata
valor p ajustado (-log10)

estructura de la nucleótidos
0 sodh-1 chip- cutícula
35B2 Metabolismo del
carbono
Unión de Actividad motora miosina-actina
C08D8.1 chip- carbohidratos
Ciclo de ATC
10 5.0 chip-35B1 35B3
Variante X 2
0 RCP-4 Biosíntesis de aminoácidos

T28C12.4 fmo-2 F58B4.5 Metabolismo del piruvato
gst-5
(19%)
swt-3 C01G12.5
0 pgp −14 proteostasis
F54F7.2 alh-5 chip-33C6
Retículo endoplásmico
2.5 dod-24 cyp-33C5
irg-5 mio-1 Cadena de transporte de
−100 W03G1. electrones Interacción
T13F2.9 5
R05D8.9 proteína-proteína
Metabolismo de los ácidos grasos
yo-2 hsp-70 T10B5.8
0.0 clec-169 nhr-17 C06B8.2 icl-1 Oxidación de aldehídos
−100 −50 0 50 −10 0 10 20 -20 -15 -10 -5 0 5 10 15 20

Variante X 1 (25%) cambio de plegado (-log2) Puntuación de enriquecimiento
(d) (mi) (gramo)

Genes de estrés oxidativo (p<0,01) Genes de proteostasis
(p<0,01)
atracurio
64 ARNm (cambio de
ARNm (cambio de
32
dieciséis UNC-38
acetilcolina
8
4
ACh
veces)
1
veces)
2 Receptor
Músculo NMJ
0,25
0,5
Respuesta al estrés
(F oxidativo
Proteostasis
) Genes metabólicos
(p<0,01) 16 DAF-16 Metabolismo y actividad.
Vehículo acuático
8
ARNm (cambio de
Atracurio 50 µM
4
2
veces)
Longevidad
1
0,5
Aminoácidos ciclo de ATC gluconeogénesis Ácido graso
F I G U R A 5 La secuenciación de ARN demuestra la regulación positiva del atracurio de los objetivos posteriores de DAF -16. (a)
Análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) que muestra la separación de grupos basada en genes expresados
diferencialmente en gusanos adultos del día 1 tratados con atracurio (50 μM) en comparación con gusanos de control con vehículos
acuáticos. (b) Análisis diferencial que muestra genes significativamente regulados hacia arriba y hacia abajo (utilizando val ores
ajustados
valor p < 0,05). Los resultados de RNA-seq se pueden encontrar en la Tabla S4. (c) Agrupación de anotaciones funcionales de
significativamente (utilizando datos no ajustados)
valor p <0,01) genes regulados hacia arriba y hacia abajo realizados utilizando l a base de datos de bioinformática DAVID con una
puntuación de enriquecimiento> 1,3. (d-
f) Respuesta al estrés oxidativo regulada por DAF-16 (d), proteostasis (e) y genes metabólicos (f) conocidos que están regulados
positivamente con el tratamiento con atracurio, como lo indica RNA-seq. Para cada cambio de pliegue mostrado, el valor p no
ajustado es <0,01. (g) Mecanismo hipotético de la longevidad mediada por atracurio. Hemos demostrado que el atracurio requier e la
subunidad AChR UNC-38 para extender la esperanza de vida y la salud, antagonizando así competitivamente al receptor y esta
inhibición provoca una extensión de la vida mediada por DAF-16. La longevidad probablemente sea causada por la activación DAF-16
de genes que se sabe que inducen la longevidad, como los implicados en las respuestas protectoras del estrés oxidativo y la
proteostasis, así como en la remodelación metabólica.
de la familia del citocromo P450 (Figura 5b).

fueron fácilmente distinguibles y separables mediante análisis
discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA; Figura Para formar una visión más completa de los procesos
5a). El análisis diferencial mostró una cantidad de aciertos cambiantes, investigamos más a fondo los genes expresados
significativos después de corregir por pruebas de hipótesis diferencialmente, utilizando el recurso bioinformático Base de datos
múltiples (Figura 5b; Tabla S4). Observamos que muchos de los para anotación, visualización y descubrimiento integrado (DAVID)
genes significativamente regulados positivamente son objetivos (Huang et al., 2009). Realizamos agrupación de anotaciones
posteriores de FOXO, por ejemplo, la alcohol deshidrogenasa funcionales, utilizando un método menos estricto.
sodh-1, la proteína de choque térmico hsp-70 y varios miembros

límite de significancia (p < 0,01 sin ajustar). Los grupos de

anotaciones enriquecidos incluyeron categorías funcionales,
términos GO, características de la vía KEGG y dominios de
proteínas (Tabla S5). Los grupos regulados al alza incluyeron
respuestas protectoras al estrés, por ejemplo las relacionadas
con el estrés oxidativo y la proteostasis, así como una serie de
procesos metabólicos, como el metabolismo del carbono y el
ciclo de TCA (Figura 5c).
2.6 |El atracurio activa los genes diana DAF-16,

dependiente de
unc-38
La activación de las respuestas al estrés oxidativo y la

proteostasis, así como la modulación de los procesos
metabólicos, también son efectos posteriores clave.
Commons aplicable.
14749726, 2021, 8, Descargado de https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/acel.13381 por Cochrane Chile, Wiley Online Library el [31/08/2023]. Consulte los Términos y condiciones (https: //onlinelibrary.wiley.com/terms-and-conditions) en Wiley Online Library para conocer las reglas de uso; Los artículos OA se rigen por la licencia Creative
de la movilidad relacionada con la edad observado con el

de la activación de DAF-16, y también se sabe que la mayoría de
tratamiento con atracurio (Figura S2C). Además, al igual que la
los genes dentro de los grupos que identificamos están regulados
abrogación de la vida útil que vimos con la mutación daf-16
positivamente por DAF-16 (Harris et al., 2020; Honda & Honda,
(Figura 2d), no hubo extensión de la vida útil con atracurio sobre
1999; Webb et al., 2016). Para cuantificar esto, comparamos los
el ARNi de daf-16 (Figura S2D). De manera similar, no hubo una
genes expresados diferencialmente en nuestro conjunto de datos de
extensión de la vida útil con skn-1 RNAi (Figura S2E). En
secuenciación de ARN con un conjunto de datos previamente
conjunto, estos datos sugieren que los efectos sobre la
descrito de genes objetivo DAF-16 (Webb et al., 2016). Al hacerlo,
esperanza de vida y la salud inducidos por el tratamiento con
vimos una superposición significativa de genes expresados
atracurio no solo dependen de daf-16, sino también de skn-1.
diferencialmente en atracurio con aquellos descritos como
regulados por DAF-16 (Figura S2A).
Los genes de respuesta al estrés oxidativo con regulación
positiva significativa incluyeron los genes de catalasa ctl -1 y ctl-
3, y miembros de las familias de citocromo P450 y glutatión S-
transferasa (Figura 5d), todos los cuales son objetivos de DAF-
16 (Webb et al. ., 2016). De manera similar, varias proteínas de
choque térmico dependientes de DAF-16 se regularon
positivamente, así como genes adicionales involucrados en el
andamiaje de proteínas y la respuesta de proteínas desplegadas
(Figura 5e). Finalmente, varios aspectos del metabolismo celular
aumentaron con el tratamiento con atracurio, incluidos los genes
dependientes de DAF-16 involucrados en el metabolismo de los
aminoácidos, el ciclo del TCA, la gluconeogénesis y el
metabolismo de los ácidos grasos (Figura 5f). Para determinar si
estos efectos transcripcionales dependían, como la esperanza
de vida y la esperanza de vida, de unc-38, probamos la
expresión de ARNm de varios objetivos de DAF-16, es decir,
sodh-1, cbs-1 y cysl-2, tanto en N2 como en Gusanos mutantes
unc-38(x20). Estos genes estaban significativamente regulados
positivamente en los gusanos N2 tras el tratamiento con
atracurio. Sin embargo, en los gusanos mutantes unc-38 (x20),
esta diferencia tras el tratamiento fue abolida (Figura S2B). En
conjunto, estos datos confirman que la longevidad inducida por
el antagonismo competitivo del AChR por parte del atracurio
está mediada por la activación de DAF-16, probablemente a
través de la remodelación metabólica y la inducción de
respuestas protectoras al estrés (Figura 5g).
2.7 |Los aumentos de la esperanza de vida y la

salud con atracurio dependen de daf-16 y skn-1,
pero no de la proliferación de células germinales
El análisis a término de nuestro conjunto de datos de

secuenciación de ARN proporcionó no solo evidencia de la
participación de DAF-16, sino también posibles otros
mecanismos o interacciones. En primer lugar, nuestro grupo
regulado al alza más enriquecido estaba relacionado con el
estrés oxidativo. Si bien DAF-16 está altamente relacionado
con este proceso (Honda y Honda, 1999), SKN-1 puede
considerarse el factor de transcripción canónico relacionado
con el estrés oxidativo (Blackwell et al., 2015). Por lo tanto,
realizamos ARNi de daf-16 o skn-1 para determinar cómo esto
influyó en la esperanza de vida y la salud en combinación con
el tratamiento con atracurio. Observamos que la eliminación de
cualquiera de los factores de transcripción impidió el aumento
durante el tratamiento. La eliminación de unc-38 parecía imitar

Por último, el grupo de términos GO más grande regulado
genéticamente la intervención farmacológica del tratamiento con
negativamente en nuestra secuenciación de ARN fue la
atracurio, estimulando la localización nuclear de DAF-16, así
espermatogénesis. Por lo tanto, intentamos determinar si la
como beneficios en la vida y la salud. La secuenciación de ARN
proliferación de células germinales desempeñaba un papel en
reveló una expresión diferencial de genes que se sabe que
la extensión de la vida útil que observamos con el atracurio.
están regulados por la señalización de DAF-16 y que modulan el
En primer lugar, probamos si el compuesto 5-fluorouracilo
envejecimiento.
(5FU), que altera la progenie, utilizado en todos los demás
Elegimos basar nuestra evaluación in silico en la sobreexpresión
experimentos sobre la vida útil para evitar la eclosión de los
de FOXO3, ya que es una de las intervenciones genéticas más
huevos, era necesario para esta extensión realizando la vida
reconocidas y conservadas para promover la longevidad (Martins et
útil en un novedoso dispositivo de microfluidos que no
al., 2016). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que los
requiere tratar a los gusanos con 5FU. En ausencia de 5FU, el
compuestos que imitan este transcriptoma, particularmente
atracurio aún prolongó significativamente la vida útil (Figura
activando el propio FOXO/DAF-16,
S2F). Además, probamos si iniciar el tratamiento con atracurio
en varios momentos influiría en sus efectos. Cuando el
tratamiento comenzó en el día 1 y el día 3 de la edad adulta,
como nuestro tratamiento normal que comienza en L4, el
atracurio extendió significativamente la vida útil (Figura S2G).
Sin embargo, esa extensión de vida ya no fue significativa
cuando el tratamiento comenzó en el día 5 de la edad adulta
(Figura S2G). La eliminación de las células precursoras de la
línea germinal durante el día 1 de la edad adulta puede
activar DAF-16 y prolongar la vida útil de los gusanos
(Arantes-Oliveira et al., 2002). Debido a que el atracurio
prolonga la vida útil cuando el tratamiento comienza el día 3,
después de que se haya producido la mayor parte de la
proliferación de células germinales, concluimos que la
interrupción de la proliferación de células germinales no es
directamente responsable de la extensión de la vida útil que
observamos.
3 | DISCUSIÓN
Cada vez hay más pruebas que demuestran que ralentizar la

progresión de los procesos de envejecimiento con compuestos
geroprotectores puede tratar enfermedades relacionadas con
la edad, por lo que es necesario descubrir y comprender mejor
los geroprotectores (Moskalev et al., 2016; Partridge et al.,
2020). Hemos utilizado una estrategia de detección de
fármacos in silico para identificar compuestos que imitan el
transcriptoma de sobreexpresión de FOXO3. Al hacerlo,
identificamos una serie de compuestos aprobados por la FDA,
tanto conocidos como desconocidos anteriormente, que
retrasan el envejecimiento. Los cinco compuestos principales
de la pantalla activaron al menos algunos objetivos de Foxo3
en cultivos de células de mamíferos. Cuando probamos los
efectos de la longevidad in vivo, tanto el NRTI zidovudina
como el bloqueador neuromuscular atracurio prolongaron
considerablemente la vida útil en C. elegans, pero sólo el
atracurio dependió de FOXO/daf-16. El atracurio prolongó no
sólo la vida útil, sino también la salud de los gusanos.
Descubrimos que estos efectos sobre la duración de la salud
dependían de la subunidad AChR codificada por unc-38, el
homólogo de gusano más cercano al CHRNA2 humano, que
codifica la subunidad que se sabe que se une al atracurio
Commons aplicable.
señalización alterada de la NMJ puede influir en el envejecimiento.

También inducen efectos de longevidad conservada.
En los gusanos, la mutación del gen del canal de potasio slo-1,
Específicamente, la expresión de FOXO3 se ha asociado con
que inhibe la liberación sináptica de las neuronas motoras,
poblaciones humanas de larga vida en varias cohortes
también condujo a una mayor esperanza de vida y salud en los
independientes (Broer et al., 2015; Morris et al., 2015;
gusanos, dependiente de DAF-16 (Li et al., 2019). Curiosamente,
Soerensen et al., 2015), lo que sugiere que la activación de esta
el ARNi de slo-1 mejoró la esperanza de vida y la salud cuando se
vía es una de las rutas más prometedoras para beneficiar las
inició el día 5 o el día 7 o en la edad adulta, pero este efecto no
enfermedades humanas relacionadas con la edad. Nuestros
estuvo presente cuando el ARNi se inició el día 1 o el día 3.
cinco principales compuestos miméticos de FOXO3 produjeron
Cuando se combina con nuestros hallazgos de que el tratamiento
efectos variados tanto en el cultivo de células de mamíferos
con atracurio
como en la vida útil de los gusanos. Esto proporciona un
recordatorio importante de que perfiles transcripcionales
similares no siempre reflejan un modo de acción específico y no
siempre conducen a resultados fisiológicos similares. Un claro
ejemplo de este hecho lo demostró la zidovudina, que extendió
considerablemente la vida útil, pero no dependía de daf-16, lo
que sugiere que sus efectos sobre la expresión genética (que
induce un transcriptoma similar a la sobreexpresión de FOXO)
son causados por factores distintos activación directa del propio
factor de transcripción. Los efectos de los NRTI se han
estudiado previamente en C. elegans y se plantea la hipótesis
de que inhiben la función de la polimerasa γ del ADN
mitocondrial (ADNmt), lo que provoca un agotamiento del
ADNmt y una disminución de la respiración mitocondrial debido
a la falta de subunidades de la cadena respiratoria. (Brinkman et
al., 1998). Sin embargo, C. elegans expuesto a zidovudina tiene
reducciones relativamente modestas en el ADNmt y, sin
embargo, simultáneamente experimenta una disminución del
consumo de oxígeno y alteraciones en la morfología
mitocondrial (de Boer et al., 2015). El deterioro de la función
mitocondrial es un mecanismo de extensión de la vida útil bien
establecido (van der Rijt et al., 2020), por lo que esperamos que
este sea también el mecanismo por el cual la zidovudina
prolonga la vida útil en los gusanos. Si bien este mecanismo no
es el foco de nuestro estudio actual, seguimos intrigados por el
hecho de que la firma de longevidad de FOXO se activa
potencialmente a través de otros medios. Sería interesante en el
futuro utilizar zidovudina como modelo para el potencial de
traducción de la activación de otras vías de longevidad similares
a FOXO.
Las extensiones de esperanza de vida y de salud inducidas
por el atracurio dependieron de la subunidad AChR unc-38, lo
que demuestra que el atracurio actúa para promover la
longevidad a través de su mecanismo canónico. Aunque el papel
específico de los antagonistas de AChR no se había estudiado
previamente, se demostró que los agonistas de AChR
promueven la recuperación de la fase dauer detenida del
desarrollo (Tissenbaum et al., 2000). Este efecto depende de la
señalización neuroendocrina similar a la insulina (Tissenbaum et
al., 2000), un importante regulador de DAF-16 (Gottlieb y
Ruvkun, 1994). En ese estudio, los autores sugieren un
mecanismo por el cual la activación del AChR por ACh activa
DAF-2, que luego inhibiría la activación de DAF-16. Esto parece
estar en línea con nuestros datos, que demuestran que la
inactivación del AChR activa DAF-16.
Actualmente existe evidencia más reciente de que la
células de mamíferos y promueve la longevidad in vivo en

extiende la vida útil cuando se inicia en L4, día 1 o día 3, estos
gusanos. Utilizando atracurio, demostramos que la señalización
resultados sugieren que para los gusanos hay un punto
neuromuscular de acetilcolina actúa como un regulador de la
(aparentemente alrededor del día 5) en el que resulta
vía de longevidad FOXO conservada. Este hallazgo facilita una
beneficioso para la longevidad estimular la señalización de NMJ,
comprensión más profunda de este mecanismo de
en lugar de inhibirla.
envejecimiento y la posterior identificación de objetivos
En un modelo de ratón comparable al knockout de slo-1, los
potenciales para el tratamiento de enfermedades relacionadas
ratones con sobreexpresión del transportador vesicular de
con la edad.
acetilcolina (VAChT) permitieron el análisis de cómo el aumento
de la liberación de ACh afectó el desarrollo y el envejecimiento
(Sugita et al., 2016). En este modelo, el aumento de ACh
aceleró el envejecimiento de la UNM, medido por fragmentación,
denervación, brote de terminaciones nerviosas de axones
motores e inervación por múltiples axones motores (Sugita et al.,
2016). La degeneración de la NMJ precedió a los déficits
motores y a la atrofia muscular en los ratones con
sobreexpresión y, al cruzar ratones de este genotipo con un
modelo de ratón para ELA, el aumento del transporte de ACh
condujo a una patología acelerada y una muerte temprana
(Sugita et al., 2016). Estos datos proporcionan información
sobre el mecanismo inverso (sobreactivación del AChR como
mecanismo para el envejecimiento prematuro) y se alinean con
nuestros hallazgos de que la inhibición del AChR promueve la
longevidad.
La extensión de la vida útil causada por el atracurio también
dependió de daf-16, y el bloqueo de la señalización en la NMJ,
ya sea con atracurio o unc-38 RNAi, provocó una mayor
localización nuclear de DAF-16. Nuestros datos de
transcriptómica reforzaron este hallazgo, ya que un número
significativo de genes expresados diferencialmente en gusanos
tratados con atracurio en comparación con los controles eran
efectores posteriores conocidos de DAF-
16. En conjunto, estos datos sugieren que la inhibición de la
señalización de la acetilcolina en la unión neuromuscular provoca la
activación de DAF-16 y la transcripción de genes dentro de sus vías
que prolongan la vida útil. Sin embargo, aún no está claro cómo se
activa DAF-16 aguas abajo de la señalización de ACh. Identificar
estos pasos intermedios sería un foco interesante de estudio futuro.
Especialmente cuando imaginamos el desarrollo de agentes
farmacológicos que podrían usarse en un entorno clínico, encontrar
objetivos directamente antes de FOXO sería claramente atractivo.
Observamos la dependencia de los beneficios de vida y salud
causados por atracurio en skn-1, así como en daf-16. Se han
identificado intervenciones de longevidad adicionales que dependen
de estas dos vías simultáneamente (Robida-Stubbs et al., 2012; Wan
et al., 2020), y se ha demostrado que el propio DAF-16 activa SKN-1
(Tullet et al. ., 2017). Si bien el objetivo de nuestro estudio fue
identificar los FOXO-miméticos e intentar activar esta vía
específicamente para promover la longevidad, la posible interacción
entre estos dos factores de transcripción merece una mayor
investigación.
En conjunto, nuestros resultados demuestran el poder de
la detección de fármacos in silico, en particular el potencial de
imitar las intervenciones genéticas de longevidad con
compuestos. Al hacerlo, identificamos el bloqueador
neuromuscular atracurio como un geroprotector, un
compuesto que activa objetivos FOXO3 in vitro en cultivos de
Commons aplicable.
4 |PROCEDIMIENTOS
El aislamiento del ARNm total de las células se realizó con reactivo
EXPERIMENTALES
TRI (Sigma-Aldrich) y se transcribió inversamente 1 µg de ARN
extraído en ADNc de acuerdo con las instrucciones del fabricante
4.1 | Pantalla compuesta de base de datos
LINCS utilizando el kit de transcripción inversa QuantiTect (QIAGEN; Venlo,
Países Bajos). El análisis cuantitativo de la expresión génica se
Se accedió a la biblioteca en línea de firmas celulares realizó con el LightCyclerⓇ 480 SYBR Green I Master (Roche;
integradas basadas en redes (LINCS) (Keenan et al., 2018; Woerden, Países Bajos) y se midió con el LightCyclerⓇ 480
Subramanian et al., 2017) (septiembre de 2017) a través de la Instrument II (Roche). Se sintetizaron cebadores específicos de
plataforma de software basada en la nube CLUE genes.
(https://pista.io/). El conjunto de datos central denominado

"piedra de toque", que contiene firmas transcripcionales de ocho
líneas celulares diferentes (PC3, VCAP, A375, HA1E, HCC515,
HT29, MCF7, HEPG2) de 2837 fármacos diferentes
Se utilizaron tratamientos, 3799 eliminaciones de genes diferentes
y 2160 sobreexpresiones de genes diferentes. A partir de estos,
se utilizó la firma transcripcional FOXO3oe (Broad ID:
ccsbBroad304_00577) como base de consulta para buscar
compuestos con firmas transcripcionales similares y se
clasificaron los resultados, incluida una puntuación resumida que
consolida los datos de líneas celulares, que van desde −100
(firma opuesta ) a 100 (que imitan la firma) se descargaron como
archivos.gct (versión 1.3). Estos
Los resultados clasificados para todas las celdas y su puntuación
resumida están disponibles en la Tabla S1. Se aplicó un límite a la
lista clasificada mediante el cual se consideró que los compuestos
con una puntuación superior a 90 coincidían con la firma
transcripcional de FOXO3oe. Los cinco principales medicamentos
aprobados por la FDA dentro de esta lista se utilizaron para
evaluaciones adicionales in vitro e in vivo.
4.2 | Cultivo de
células
Los cardiomiocitos HL1 se cultivaron en matraces revestidos con

gelatina al 0,02% (Sigma-Aldrich; Darmstadt, Alemania) en medio
Claycomb (Sigma-Aldrich) suplementado con l-glutamina 2 mM
(Gibco; Dublín, Irlanda), mezcla de antibióticos de 100 U/ml de
penicilina. y 100 µg/ml de estreptomiocina (Lifetechnology;
Bleiswijk, Países Bajos),
0,25 µg/ml de fungizona (Lifetechnology) y suero bovino fetal (FBS)
al 10 % (v/v) (Bodinco; Alkmaar, Países Bajos) a 37 °C en un
Atmósfera midificada de 5%
CO2.
Las células se cultivaron durante 24 h con los compuestos
descritos.
- Sesquihidrato de clorhidrato de ciproheptadina 50 µM (Sigma-
Aldrich), rapamicina 10 µM (Selleckchem; Munich, Alemania),
besilato de atracurio 50 µM (Sigma-Aldrich), sal de citrato de
sildenafil 50 µM (Sigma-Aldrich), zidovudina 50 µM (Sigma- Aldrich)
- durante 24 h antes del aislamiento del ARN.
4.3 |Extracción de ARNm de células y

PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR)
útil.
de acuerdo con las secuencias en la Tabla S6. Los valores N0
de los genes diana se normalizaron con respecto al gen de
Los gusanos adultos grávidos se sincronizaron por edad
referencia Gapdh. Todos los experimentos fueron realizados por
utilizando un tratamiento con hipoclorito alcalino y se incubaron
triplicado. El análisis estadístico comparó el cambio en la
en tampón M9 durante la noche. Se sembraron gusanos en
expresión genética en relación con el valor medio de los
estadio larvario L1 en placas NGM y se cultivaron hasta el
controles entre las células HL1 tratadas y no tratadas utilizando
estadio L4. En la etapa L4, los gusanos se transfirieron a placas
una prueba en Graphpad Prism.
suplementadas con compuestos como se describe y 5-
fluorouracilo 10 µM (Sigma-Aldrich).
4.4 |Cepas de gusanos y

mantenimiento.
Caenorhabditis elegans cepas N2 Bristol, daf-16(mu86), unc-

38(e264), unc-38(x20), unc-29(e193), acr-8(ok1240), acr-16(ok789),
deg- 3(u662), daf-16p::daf-16a/b::GFP+rol-6(su1006) [zls356IV] y la
cepa OP50 de E. coli se obtuvieron del Caenorhabditis Genetics
Center (CGC; Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN). ,
EE.UU). Los gusanos hermafroditas se cultivaron y mantuvieron
rutinariamente en placas de agar con medio de crecimiento de
nematodos (NGM) sembradas con E. coli OP50 a 20°C como se
describió anteriormente (Brenner, 1974).
4.5 |experimentos de
ARNi
Escherichia coli HT115 (DE3) con el vector vacío (EV) L4440 se

obtuvo del Centro de Genética Caenorhabditis. Los experimentos
de alimentación de bacterias con ARNi se realizaron como se
describe (Kamath et al., 2001). Los clones de alimentación de
ARNi de E. coli utilizados fueron unc-38 (F21F3.5), daf-16
(R13H8.1) y skn-1 (T19E7.2) derivados de la biblioteca de ARNi de
Ahringer (Lee et al., 2003). Todos estos clones se confirmaron
mediante secuenciación y la eficiencia de eliminación se confirmó
mediante qPCR. En todos los experimentos de ARNi descritos en
este estudio, los gusanos fueron sometidos a bacterias de ARNi
desde el momento de la eclosión.
4.6 |tratamiento farmacológico de

Caenorhabditis
elegans
Todos los productos químicos se obtuvieron de Sigma-Aldrich.

El besilato de atracurio se disolvió en agua a una concentración
de 16,67 mM. Se disolvieron zidovudina y citrato de sildenafil en
DMSO a una concentración de 50 mM. Estos compuestos se
añadieron a las placas justo antes de verterlos en las
concentraciones descritas. A menos que se indique lo contrario,
los gusanos fueron tratados con compuestos desde la etapa L4
en adelante. Las placas se cambiaron al menos una vez por
semana para asegurar una exposición constante al compuesto.
4.7 |Análisis manual de vida

Commons aplicable.
12 de
16
| MCINTYREET al .
en tampón M9 durante la noche. Se sembraron gusanos en etapa

El tratamiento con 5-fluorouracilo 10 µM continuó durante las 2 primeras
L1 en placas NGM. Los gusanos se transfirieron a placas
semanas de vida. Todos los ensayos se realizaron a 20°C y la etapa L4
suplementadas con compuestos y 5-fluorouracilo 10 µM (Sigma-
se contó como el día 0 de vida. Por condición, se utilizaron entre 100 y
Aldrich) en el estadio larvario L4. Todos los ensayos se realizaron
120 gusanos. La supervivencia se analizó cada dos días y los gusanos
a 20°C y la etapa L4 se contó como el día 0 de vida. Las placas
se consideraron muertos cuando no respondieron a los estímulos
se cambiaron dos veces por semana para mantener la exposición
repetidos. Se censuraron los gusanos que faltaban, que mostraban
a los compuestos. Todos los ensayos funcionales se realizaron al
huevos internos para incubar, que perdían la integridad de la vulva y se
menos dos veces, una de las cuales está representada en los
enterraban en agar NGM. Los análisis estadísticos de la esperanza de
datos mostrados. Las estadísticas de todos los experimentos y
vida se calcularon mediante pruebas de rango logarítmico (Mantel-Cox)
réplicas de duración de vida se representan en la Tabla S3.
en curvas de Kaplan-Meier en GraphPad Prism.
4.8 |Análisis de la vida útil de los

microfluidos.
Se cultivaron Bristol (N2) C. elegans de tipo salvaje en placas de

Petri de 60 mm (Fisher Scientific; Austin, TX, EE. UU.) en una
fuente alimenticia estándar de E. coli OP50 y se incubaron
durante 48 h a 20 °C. Para la sincronización de edades, se cargó
una suspensión de adultos grávidos en 20 mg/ml de E. coli OP50
en chips de microfluidos (Rahman et al., 2020) (Infinity Chips,
NemaLife Inc., TX, EE. UU.) y se les permitió poner huevos.
durante 2 h (codificado como día 0). Los animales adultos del día
1 se cargaron en chips de microfluidos junto con 20 mg/ml de E.
coli OP50 en medio líquido de crecimiento de nematodos (NGM).
Se formularon 50 µM de atracurio en NGM líquido. En todas las
soluciones analizadas, la concentración del alimento se mantuvo
en 20 mg/ml de E. coli OP50.
Cada ensayo se realizó por triplicado (tres réplicas
biológicas), y cada réplica biológica consistió en dos o más
réplicas técnicas. Una réplica técnica es una población en una
cámara de crecimiento de microfluidos (con >60 para ensayos
crónicos).
El ensayo de por vida se inició cargando adultos del día 1 en
los chips de microfluidos. Después de la carga, se administraron
diariamente soluciones frescas de atracurio a la población animal
en los chips a 20°C, hasta que todos los animales murieron. Se
adquirieron videos cada día antes de alimentar con soluciones
frescas de atracurio para determinar los recuentos de animales
vivos.
Los videos se analizaron utilizando el software Infinity Code
(NemaLife Inc.) para la supervivencia y motilidad de los
animales. El número de animales vivos en la población se
determinó basándose en movimientos detectables. Por condición
se utilizaron ~150 gusanos. Los análisis estadísticos de la
esperanza de vida se calcularon mediante pruebas de rango
logarítmico (Mantel-Cox) en curvas de Kaplan-Meier en
GraphPad Prism.
4.9 |Mediciones de duración de

salud
Los gusanos adultos grávidos se sincronizaron por edad

utilizando un tratamiento con hipoclorito alcalino y se incubaron
de ARN
4.9.1 | Análisis de movilidad y tamaño
corporal.
4.11.1 | Aislamiento de ARNm de Caenorhabditis
elegans
En el día indicado de la edad adulta, se transfirieron ~50 gusanos
a placas NGM sin OP50, se estimularon golpeando la placa y se
Los gusanos se sincronizaron, crecieron y trataron con compuestos de
registraron inmediatamente durante 200 ciclos a temperatura
la etapa L4 como se describe. Veinticuatro horas más tarde, se lavaron
ambiente usando un microscopio fluorescente Leica (Ámsterdam,
los gusanos de las placas de tratamiento, 3 veces en tampón M9 y 2
Países Bajos) M205 FA y Leica. Cámara DFC 365 FX. Las
veces
imágenes se capturaron utilizando el software Leica Application
Suite X y luego se procesaron con el complemento wrMTrck para
ImageJ (Nussbaum-Krammer et al., 2015). De estos análisis
también se derivaron medidas del tamaño corporal. Los datos de
wrMTrck se analizaron y visualizaron utilizando un script
personalizado en R v3.6.3 (R Core Team, 2013). El análisis
estadístico comparó las condiciones con su control respectivo con
un ANOVA unidireccional corregido para pruebas múltiples.
4.9.2 | bombeo faríngeo
El día 1 de la edad adulta, los gusanos se visualizaron a

temperatura ambiente utilizando un microscopio fluorescente
Leica M205 FA. Las bombas se contaron visualmente durante 30
segundos y se probaron de 10 a 15 gusanos por condición. El
análisis estadístico se realizó en R v3.6.3 (R Core Team, 2013),
comparando las dos condiciones con la prueba t.
4.10 | Microscopía
Los gusanos mutantes que expresaban DAF-16::GFP se

sincronizaron, cultivaron y trataron con compuestos de la etapa
L4 como se describe. Para probar la localización nuclear de DAF-
16, los animales del día 1 se inmovilizaron durante 30 s en
levamisol 40 mM (Santa Cruz Biotech) en tampón M9 y se
montaron en almohadillas de agarosa al 2%. La localización
nuclear de DAF-16 :: GFP se visualizó utilizando un microscopio
confocal invertido Leica DMI6000 que contenía un objetivo Oil
CS2 de 40 × 1,30 y una cámara Leica TCS SP8 SMD. Las
imágenes se capturaron utilizando el software Leica Application
Suite X. Se tomaron imágenes de todas las muestras a
temperatura ambiente. Para evitar una localización sutil causada
por la inanición, las condiciones de montaje y de obtención de
imágenes, todas las fotomicrografías se tomaron dentro de los 5
minutos posteriores al montaje. Para el estrés por calor, los
gusanos fueron expuestos a 35°C durante 3 h. Se tomaron
imágenes de 20 a 30 gusanos por condición durante dos
experimentos independientes y los resultados se compilan a
partir de ambas réplicas. La cuantificación de la localización
nuclear se realizó según el procedimiento de (Lin et al., 2018) y el
análisis estadístico se realizó mediante una prueba de
independencia de chi-cuadrado.
4.11 |secuenciación
Commons aplicable.
12 de
16
| MCINTYREET al .
evaluó mediante una prueba t empírica moderada de Bayes

en agua antes de congelarlo rápidamente en nitrógeno líquido. Se
dentro del marco del modelo lineal de Limma, incluidos los pesos
cultivaron cuatro muestras, cada una de ~1000 gusanos. Para el
de precisión estimados por voom (Law et al., 2014; Ritchie et al.,
aislamiento del ARNm total, se homogeneizaron gusanos enteros
2015). Los valores de p resultantes se corrigieron para pruebas
con una perla de acero de 5 mm utilizando un TissueLyser II
múltiples utilizando la tasa de descubrimiento falso de Benjamini-
(QIAGEN) durante 5 minutos a una frecuencia de 30 veces/s. El
Hochberg. El procesamiento de datos se realizó utilizando R
ARN se extrajo según las instrucciones del RNaesy Mini Kit
v3.6.1 y Bioconductor v3.9. mínimo parcial
(QIAGEN). El ADN genómico contaminante se eliminó utilizando
RNase-Free DNase (QIAGEN). El ARN se cuantificó con un
espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific; Breda,
Países Bajos) y se almacenó a -80 °C hasta su uso.
4.11.2 | Preparación de la
biblioteca
Las bibliotecas de ARN se prepararon y secuenciaron con la

plataforma Illumina mediante Genome Scan (Leiden, Países
Bajos). Se utilizó el kit de preparación de biblioteca de ARN
direccional NEBNext Ultra II para Illumina para procesar las
muestras. La preparación de la muestra se realizó de acuerdo con
el protocolo "NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for
Illumina" (NEB #E7760S/L). Brevemente, se aisló ARNm del ARN
total utilizando perlas magnéticas oligo-dT. Después de la
fragmentación del ARNm, se realizó la síntesis de ADNc. Este se
usó para la ligación con los adaptadores de secuenciación y la
amplificación por PCR del producto resultante. La calidad y el
rendimiento después de la preparación de la muestra se midieron
con el analizador de fragmentos. El tamaño de los productos
resultantes fue consistente con la distribución de tamaño
esperada (un pico amplio entre 300 y 500 pb). La agrupación y
secuenciación de ADN utilizando NovaSeq6000 se realizó de
acuerdo con los protocolos del fabricante. Se utilizó una
concentración de 1,1 nM de ADN. Se utilizó el software de control
NovaSeq NCS v1.6.
4.11.3 | Leer mapeos, análisis estadísticos y

visualización de datos.
Las lecturas se sometieron a control de calidad FastQC

(Andrews, 2010) se recortaron usando Trimmomatic v0.32
(Bolger et al., 2014) y se alinearon con el genoma de C. elegans
obtenido de Ensembl (wbcel235.v91), usando HISAT2 v2.1.0
(Kim et al., 2015). Los recuentos se obtuvieron utilizando HTSeq
(v0.11.0, parámetros predeterminados) (Anders et al., 2015)
utilizando el GTF correspondiente teniendo en cuenta las
direcciones de las lecturas. Los análisis estadísticos se
realizaron utilizando los paquetes R edgeR v3.26.8 (Robinson et
al., 2010) y limma/voom v 3.40.6 (Ritchie et al., 2015). Se
mantuvieron todos los genes con más de 2 recuentos en al
menos 3 de las muestras. Los datos de recuento se
transformaron a log2 recuentos por millón (logCPM), se
normalizaron aplicando el método de media recortada de valores
M (Robinson et al., 2010) y se ponderaron con precisión
utilizando voom (Law et al., 2014). La expresión diferencial se
VIDI de ZonMw (n° 91715305) y la Velux Stiftung (n° 1063). GEJ

El análisis discriminante de cuadrados (PLS-DA) se realizó
cuenta con el apoyo de una subvención VENI de ZonMw (nº
utilizando mixómica (Rohart et al., 2017) estableciendo una
09150161810014).
puntuación de variable de importancia (VIP) superior a 1
como significativa. Los valores de p resultantes (cuando
CONFLICTO DE INTERESES
correspondía) se corrigieron para pruebas múltiples
MR, SG, MT y SAV tienen acciones en NemaLife
utilizando la tasa de descubrimiento falso de Benjamini - Inc.
Hochberg. Los genes se volvieron a anotar utilizando
biomaRt utilizando las bases de datos del genoma Ensembl
(v91). La visualización de datos se realizó mediante gplots
(Warnes et al., 2015) y ggplot2 (Wickham, 2016)
seleccionando colores de RcolorBrewer (Neuwirth, 2014). La
agrupación de anotaciones funcionales de genes expresados
diferencialmente se realizó utilizando el recurso
bioinformático DAVID con todas las configuraciones
predeterminadas (Huang et al., 2009). Grupos con una
puntuación de enriquecimiento superior a
1,3 se consideraron significativos. Los datos de RNA-seq están
disponibles en GEO con el IDGSE149944.
4.12 | Aislamiento de ARN y qPCR de

Caenorhabditis
elegans
Los gusanos se sincronizaron, crecieron y trataron con compuestos

de la etapa L4 como se describe anteriormente. Veinticuatro horas
después, se lavaron los gusanos de las placas de tratamiento, tres
veces en tampón M9 y dos veces en agua antes de congelarlos
rápidamente en nitrógeno líquido. Para cada muestra, se
recolectaron ~1000 gusanos. Para el aislamiento del ARNm total,
se homogeneizaron gusanos enteros en reactivo TRI (Sigma-
Aldrich) con una perla de acero de 5 mm utilizando un TissueLyser
II (QIAGEN) durante 5 minutos a una frecuencia de 30 veces/s. El
ARN se cuantificó con un espectrofotómetro NanoDrop 2000
(Thermo Fisher Scientific) y 1 µg de ARN extraído se transcribió de
forma inversa en ADNc de acuerdo con las instrucciones del
fabricante utilizando el kit de transcripción inversa QuantiTect
(QIAGEN; Venlo, Países Bajos). El análisis cuantitativo de la
expresión génica se realizó con el LightCyclerⓇ 480 SYBR Green I
Master (Roche; Woerden, Países Bajos) y se midió con el
LightCyclerⓇ 480 Instrument II (Roche). Los cebadores específicos
de genes se sintetizaron de acuerdo con las secuencias de la Tabla
S7. Los valores N0 de los genes diana se normalizaron con la
media geométrica de los genes de referencia ama-1 y cdc-42.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen al Centro de Genética Caenorhabditis
de la Universidad de Minnesota por proporcionar cepas de C.
elegans. El CGC está financiado por la Oficina de Programas
de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440).
Agradecemos a Perry D. Moerland por su ayuda en el análisis
de la secuenciación de ARN, y a Ron A. Hoebe, Daisy I. Picavet
y Serhii Chornyi por su ayuda en microscopía confocal. El
trabajo en el grupo Houtkooper cuenta con el apoyo financiero
de una subvención ERC Starting (n° 638290), una subvención
Commons aplicable.
14749726, 2021, 8, Descargado de https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/acel.13381 por Cochrane Chile, WileyEn líneaBiblioteca el [31/08/2023]. Consulte los Términos y condiciones (https://onlinelibrary.wiley.com/terms-and-conditions) en Wiley Online Library para conocer las reglas de uso; Los artículos OA se rigen por la licencia Creative
Koopmans, PP (1998). Efectos adversos de los inhibidores de la

CONTRIBUCIONES DE AUTOR transcriptasa inversa: toxicidad mitocondrial como vía común.
RLM, RHH y GEJ concibieron y diseñaron el proyecto. RLM, SWD, SIDA, 12(14), 1735–1744.https://doi.org/10.1097/00002030-19981
4000-00004
RK y MM realizaron experimentos. RLM, SWD y GEJ analizaron los
Broer, L., Buchman, AS, Deelen, J., Evans, DS, Faul, JD, Lunetta,
datos. MR, SG, MT y SAV realizaron, analizaron e interpretaron los KL, Sebastiani, P., Smith, JA, Smith, AV, Tanaka, T., Yu,
ensayos de vida útil de microfluidos. AJ y GEJ realizaron análisis L., Arnold, AM, Aspelund, T., Benjamin, EJ, De Jager, PL,
bioinformáticos de los datos de secuenciación de ARN. MP, BVS y
MSK ayudaron en la interpretación de los datos y brindaron
asesoramiento. RLM, GEJ y RHH escribieron el manuscrito con
contribuciones de todos los demás autores.
TATAMENTO DE DISPONIBILIDADES
DE DATOS
Los datos de secuenciación de ARN están disponibles en GEO
con el IDGSE14 9944. Todos los demás datos están disponibles en
el manuscrito o en materiales complementarios. La correspondencia
y las solicitudes de materiales deben dirigirse al autor
correspondiente GEJ.
O ID
RC
Rebecca L. McIntyre https://orcid.org/0000-0002-2863-8132
Mizanur Rahman https://orcid.org/0000-0003-4259-1497
Siddhartha Gupta https://orcid.org/0000-0001-5710-700X
Georges E. Janssens https://orcid.org/0000-0003-2104-
8145
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Warnes, GR, Bolker, B., Bonebakker, L., Gentleman, R., Liaw, A., Lumley, T.,
Maechler, M., Magnusson, A., Moeller, S., Schwartz, M. y

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La inhibición del receptor neuromuscular de acetilcolina

Envejecimiento celular. wileyonlinelibrary.com/journal/acel |1 de 16

Aunque los modelos de envejecimiento comúnmente utilizados,

que imitan transcripcionalmente la sobreexpresión de FOXO3

2.1 |La detección de fármacos in silico

Para identificar compuestos que producen efectos similares a la

(d) (F) (gramo)

99,22 tipifarnib 10.0 *

(h) (i) (j) (k)

75 Vehículo DMSO 75 Vehículo acuático

75 Vehículo DMSO Vehículo acuático

y el inhibidor nucleósido de la transcriptasa inversa (INTI) zidovudina

A continuación, intentamos investigar la capacidad de estos

edad adulta, el atracurio aumentó significativamente la movilidad

2.2 | La zidovudina y el atracurio prolongan la vida útil

Para probar los efectos de los compuestos identificados en la esperanza de vida,

salvaje tratados con atracurio en comparación con los no tratados

2.3 | Atracurio prolonga la esperanza de

El atracurio es un bloqueador neuromuscular y se utiliza en el

(C) (d) (mi)

100 100 100

A continuación, probamos si la ausencia de unc-38 también impedía

2.4 |El atracurio y el ARNi unc-38 estimulan de

El tratamiento con atracurio provoca la translocación física de

Vector vacío (EV) EV + Atracurio 50 µM

unc-38 ARNi unc-38 ARNi + Atracurio 50 µM

(b) (C) Día 12

DAF-16 **** EV + Atracurio

unc-38 ARNi + Atracurio

UNC-38 con atracurio, o la eliminación de unc-38 usando ARNi,

2.5 |La secuenciación de ARN demuestra la

Habiendo llegado a la conclusión de que el atracurio causa la

(a) Atracurio (b) (C

valor p ajustado (-log10)

0 RCP-4 Biosíntesis de aminoácidos

−100 −50 0 50 −10 0 10 20 -20 -15 -10 -5 0 5 10 15 20

(d) (mi) (gramo)

Aminoácidos ciclo de ATC gluconeogénesis Ácido graso

de la familia del citocromo P450 (Figura 5b).

sodh-1, la proteína de choque térmico hsp-70 y varios miembros

límite de significancia (p < 0,01 sin ajustar). Los grupos de

2.6 |El atracurio activa los genes diana DAF-16,

La activación de las respuestas al estrés oxidativo y la

de la movilidad relacionada con la edad observado con el

2.7 |Los aumentos de la esperanza de vida y la

El análisis a término de nuestro conjunto de datos de

durante el tratamiento. La eliminación de unc-38 parecía imitar

Cada vez hay más pruebas que demuestran que ralentizar la

señalización alterada de la NMJ puede influir en el envejecimiento.

células de mamíferos y promueve la longevidad in vivo en

plataforma de software basada en la nube CLUE genes.

(https://pista.io/). El conjunto de datos central denominado

Los cardiomiocitos HL1 se cultivaron en matraces revestidos con

4.3 |Extracción de ARNm de células y

4.4 |Cepas de gusanos y

Caenorhabditis elegans cepas N2 Bristol, daf-16(mu86), unc-

Escherichia coli HT115 (DE3) con el vector vacío (EV) L4440 se

4.6 |tratamiento farmacológico de

Todos los productos químicos se obtuvieron de Sigma-Aldrich.

4.7 |Análisis manual de vida

en tampón M9 durante la noche. Se sembraron gusanos en etapa

4.8 |Análisis de la vida útil de los

Se cultivaron Bristol (N2) C. elegans de tipo salvaje en placas de