TEMA 1 TÉCNICAS DE CULTIVO DE CÉLULAS

ANIMALES Y VEGETALES. MEDIOS Y MÉTODOS DE

SELECCIÓN, CRECIMIENTO Y MANTENIMIENTO

CULTIVOS CELULARES ANIMALES

Los cultivos celulares constituyen una herramienta básica de aplicación fundamental
en el diagnóstico viral, en el campo Médico o en el Veterinario, en la investigación y
en la industria farmacéutica.

El desarrollo de los cultivos celulares ha sido el punto de partida para el desarrollo de

la virología, permitiendo la replicación y el conocimiento de este tipo de agentes y
logrando el desarrollo de medidas preventivas, a través de la producción de vacunas
y también de diferentes proteínas, lo cual ha facilitado la obtención de compuestos
terapéuticos. Lo anterior ha implicado un desarrollo biotecnológico al nivel industrial y
el interés y la capacitación de profesionales del campo pecuario, para liderar esta
importante área del conocimiento.

El aporte que los cultivos celulares han dado a todos los campos de la biología, es
semejante a la injerencia de los anestésicos en las prácticas quirúrgicas. La
investigación en biología celular, biología molecular y virología así como los estudios
en cáncer, han dependido de técnicas de cultivo de células.

Con el cultivo de células in vitro se ha logrado el desarrollo de un determinado tipo de

célula, con una alta reproducibilidad. Igualmente el cultivo de grupos de células o de
estructuras celulares, ha sido importante en el establecimiento de relaciones
estructurales y funcionales en algunos organismos.

Con el advenimiento de los cultivos de células se logró la reproducibilidad de los

agentes virales, permitiendo de esta forma su estudio estructural y bioquímico, básico
en la elaboración de biológicos que han servido para prevenir la presentación de
enfermedades, así como en el desarrollo de técnicas diagnósticas utilizadas en la
detección de un agente en particular.

Los cultivos celulares han servido para la producción de una amplia variedad de
proteínas como los compuestos químicos de la sangre, hormonas, anticuerpos
monoclonales, y de sustancias de gran significancia a nivel terapéutico, como el
interferón producido a partir de cultivos continuos transformados (líneas celulares),
permitiendo el surgimiento de una industria biotecnológica altamente competitiva.
Establecer un cultivo de células conlleva un grado de complejidad determinado por su
adaptación a condiciones similares a las que se tienen in vivo, siendo fundamental
para los medios utilizados su suplementación con suero, aminoácidos y antibióticos.
Se puede afirmar que el desarrollo de los cultivos de tejidos ha sido de gran impacto
en el desarrollo de las ciencias biológicas. Con éstos se ha logrado determinar y
clasificar tanto tumores humanos como animales, así como la detección temprana de
desórdenes genéticos a nivel embrionario.

Igualmente han sido básicos en el diagnóstico viral y en la producción a gran escala

de antígenos para la elaboración de vacunas. Mediante los cultivos celulares se
pueden valorar los efectos tóxicos de diferentes pesticidas usados en la actividad
agrícola y pecuaria.

Existen investigaciones que no se podrían realizar sin el soporte de los cultivos

celulares, como en el caso de animales transgénicos, donde se pretende que
organismos desarrollados expresen genes nuevos, mediante la inserción de genes
extraños en células receptoras.

Producir células implica un alto grado de preparación por parte del recurso humano
especializado, para dar el adecuado manejo a los conceptos básicos de esterilidad,
así como destreza en la detección de problemas (requerimientos de un cultivo en
particular, estabilidad de algunos reactivos) y la identificación de algunos virus a
través del tipo de efecto citopático que pueden generar en un determinado cultivo
celular.

Teniendo en cuenta la trascendencia del tema y su actualidad, en éste tema se

presentan algunas consideraciones sobre los cultivos de tejidos, la infraestructura
básica, las clases de cultivos, sus principales aplicaciones y algunos desarrollos
logrados en nuestro medio

EN QUE CONSISTE UN LABORATORIO DE CULTIVOS CELULARES

Un laboratorio de cultivo celular debe contar con una infraestructura básica en la cual
se disponga de áreas independientes para llevar a cabo la preparación y
esterilización de medios y reactivos, un espacio independiente para el proceso de
lavado y preparación de material y un área propiamente destinada al trabajo con
cultivos celulares.

Dentro de la infraestructura física básica se debe contar con sistemas de refrigeración

y congelación, incubadoras, centrífugas, balanzas, microscopios y cabinas de flujo
laminar.

Adicionalmente, se debe disponer de un buen suplemento de material plástico y de

vidrio y con sistemas de esterilización apropiados para los diferentes tipos de
reactivos y material utilizados.

Desde el punto de vista de los sistemas de esterilización se pueden citar los

siguientes:

Calor Húmedo: Mediante el empleo de autoclaves los cuales proporcionan una

temperatura de 121oC y una presión de 15 lb. Utilizados para la esterilización de
soluciones cuyos componentes no se degradan por éste método, material plástico y
de vidrio y equipos de filtración.

Calor Seco: lo constituye el uso de hornos a temperatura de 200oC por espacio de 3

horas. Es empleado para la esterilización de material de vidrio particularmente.
Filtración: A través del uso de equipos con membrana de nitrocelulosa o acetato de
celulosa con poro de 0.22 ó 0.1 u de diámetro, mediante la aplicación de presión
positiva o negativa. Por éste sistema se esterilizan la mayor parte de los medios de
cultivo, suero, solución de antibiótico-antimicótico y suplementos.

CLASES DE CULTIVOS CELULARES ANIMALES

Los cultivos celulares son el producto de la colección de células animales de

diferentes órganos, colocadas en condiciones especiales propicias para su
sobrevivencia y multiplicación, manteniendo para esto todas sus funciones
metabólicas de una manera semejante a las que tenía en el huésped.

Los cultivos de células animales se han clasificado de acuerdo a su capacidad de

anclaje (adherencia), y así han sido aisladas recientemente de un órgano
determinado o si provienen de células que han sufrido modificación.

De acuerdo a su capacidad de adherencia o no a una superficie determinada pueden

crecer formando monocapa o en suspensión respectivamente, lo que está muy
asociado con el tipo de célula de la cual derivan: por lo general las células
provenientes de órganos, crecen en monocapa; igualmente existen células que
pueden crecer indistintamente tanto en monocapa como en suspensión, ejemplo son
las células HeLa que son células transformadas derivadas de cultivos en monocapa.

Cuando el cultivo proviene de células que han sido disgregadas de un tejido original
tomado de un órgano de un animal recién sacrificado, reciben el nombre de Cultivo
Primario; cuando éste cultivo primario es sometido a procesos de transformación que
le confiere capacidad ilimitada de multiplicaciíon, reciben el nombre de Líneas
Celulares.

CULTIVOS EN MONOCAPA

Las células exhiben una variedad de "comportamientos sociales", lo que hace que su
multiplicación sea inhibida cuando establecen contacto entre sí, permitiendo la
formación de una monocapa que cubrirá la correspondiente superficie de crecimiento.
Las células provenientes de cultivos primarios son las que mejor crecen en ésta
condición, dada su estabilidad genética y su naturaleza diploide normal.

Los recipientes para el cultivo de células estacionarias son cajas de Petri, frascos
para el cultivo de tejido (T-25, T-75), entre otros, que pueden ser de material de
plástico o de vidrio previamente tratado y su desprendimiento para transferirlas a
superficies mayores se realizan con agentes proteolíticos como la tripsina.

Cuando se requiere la producción de éste tipo de cultivo en una escala mayor, se

debe incrementar el área de la superficie de crecimiento, siendo ideal utilizar botellas
en rotación (roller). Mediante éste sistema, las células pueden crecer en toda la parte
interna de la pared de la botella, usando un aparato que permite la rotación del roller
a una baja velocidad; de esta forma un roller de 1 litro que requiere 100 ml de medio,
confiere una superficie de crecimiento de 500 cm2.
Otra forma de aumentar el número de células adherentes por volumen de frasco, es
utilizando microperlas (microportadores), que son compuestos en base a dextranos o
a vidrio, las que flotan cuando se emplean en cultivos con agitación, lo que le da una
mayor disponibilidad de superficie para el crecimiento celular: con 100 ml de medio de
cultivo, se logra una superficie de 0.24 m2. La relación superficie-volumen para los
rollers es de 0.2-0.7, mientras que para los microportadores es de 122-153.

Existen otras consideraciones que influyen en la utilización de sistemas en monocapa

a pesar de las ventajas que tienen los cultivos en suspensión, entre las que están la
flexibilidad para desarrollar cultivos primarios o de líneas heteroploídes, la facilidad
para la remoción del medio gastado antes de infectar las células y la alta
concentración que se obtiene del producto, como en el caso del virus de la Fiebre
Aftosa.

CULTIVOS EN SUSPENSION

Las Líneas celulares que provienen de cultivos primarios con requerimiento de

anclaje a superficies, tienen la propiedad de crecer de manera estacionaria o en
suspensión después de un período de adaptación.

Existe evidencia experimental que los sistemas en suspensión también requieren de

matrices que son macromoléculas, que sirven de protectores a la superficie celular;
éstas macromoléculas se encuentran en el suero, el cual contribuye igualmente con el
medio de cultivo, proporcionando un sistema balanceado de nutrientes. Dentro de
éstas matrices está el Methocel, esencial para el crecimiento de cultivos en
suspensión.

Aunque el cultivo estacionario es ideal cuando se busca la elaboración de productos

extracelulares, el cultivo en suspensión es deseable cuando los productos son
intracelulares o cuando se presentan problemas con la capacidad de anclaje de un
determinado tipo de célula.

El proceso de cultivo continuo ofrece factores económicos decisivos (utilización de

mejores equipos, reducida manipulación) cuando se trata de producir cultivos a una
mayor escala de operación.

CULTIVOS PRIMARIOS

Los cultivos primarios tienen características especiales que los diferencian de las
líneas celulares: conservan la morfología de las células del órgano del que fueron
aisladas, sus cromosomas tienen un número diploide (2n), su crecimiento in vitro es
limitado y hay inhibición por contacto.

El estar más cercanas a las células que las originaron, se ve reflejado en una mejor
actividad y funcionalidad similar a su ambiente natural, por lo que en aislamientos
primarios de cepas virales éstas tienen mayor sensibilidad que una Línea Celular ya
establecida. Igualmente para la producción de vacunas los cultivos primarios son
recomendables por tener una baja probabilidad de que se transformen en malignos.
Dentro de las desventajas está la de una mayor probabilidad de presentar virus
adventicios o latentes, lo que implica el desarrollo de la adecuada tecnología para el
control de calidad.

LINEAS CELULARES

Las Líneas Celulares continuas están formadas por células que se diferencian
genética y morfológicamente de las células de las cuales se originaron. Pueden
provenir de células que se derivan de tumores o de un proceso de transformación de
un cultivo primario mediante transfección con oncogenes o con tratamiento con
carcinogenéticos, lo que les confiere un nuevo fenotipo.

Este tipo de cultivo tiene la característica de ser aneuploides, de no tener inhibición

por contacto y de crecer de manera indefinida. El paso de un cultivo primario a línea
se denomina transformación.

Una transformación puede inducirse fisiológicamente (interacción celular, polaridad) a

través de hormonas como la hidrocortizona o utilizando inductores no fisiológicos
como el DMS.

CULTIVOS TRIDIMENSIONALES

Son aquellos que buscan mantener la característica o arquitectura del tejido in vivo.
Los sistemas tridimensionales permiten estudiar la proliferación y morfología epitelial
y su interacción con otras células como son las del tejido conectivo; igualmente con
ellos se puede evaluar el efecto de sustancias que pueden influenciar en tales
interacciones intercelulares. Actualmente se producen Kits dérmicos comerciales con
base en cultivos, que permiten evaluar la citotoxicidad de componentes químicos
presentes en lociones, preservativos, detergentes, perfumes, shampoos y solventes
entre otros.

Los intentos de producción de éste tipo de cultivo van desde el uso de telaraña
(Harrison, 1914), pasando por el crecimiento de explantes en esponja de celulosa,
(Leighton, 1951), así como la utilización de fibras de sílica (Curtis y Varde, 1964) o de
mallas de colágeno hidratado (Elsdale y Bard, 1972).

El método desarrollado por Bergenholtz (1977) es uno de los que mayor información
han dado en cuanto a visualización de morfología celular. Mediante éste sistema, se
colocan trocitos de superficie epitelial sobre una membrana de Millipore, sistema que
se deposita sobre una plataforma y ésta en una caja de Petri con medio de cultivo.

El cultivo in vitro de tejidos vegetales ha sido visto como la opción para

producir metabolitos secundarios (Balandrín et al., 1985). Sin embargo, con
excepción de contados casos, la desdiferenciación de los tejidos vegetales,
para producir callos o células en suspensión, se ve acompañada de una
disminución en su capacidad para producir estos compuestos (Barz et al.,
1977, Aird et al., 1988).

No obstante esta dificultad, los cultivos de células y órganos derivados de

plantas productoras de metabolitos secundarios son cada vez más utilizados
como modelos para estudiar la biosíntesis de compuestos con actividad
farmacológica, así como los mecanismos que regulan su síntesis (Kutchan et
al., 1991).
El cultivo de órganos permite la ampliación de un cultivo de células de tejido
no disgregadas a un cultivo tridimensional que muestre en algo o en todo las
características histológicas de los tejidos in vivo, para esto se utiliza un medio
con interfase líquido gaseosa.

USOS DE LOS CULTIVOS CELULARES

Para el estudio
de células
específicas, cómo
crecen, qué
necesitan para su
crecimiento, cómo y
cuando dejan de
crecer, como es su
bioquímica.
Para
investigaciones
sobre el ciclo celular,
el control del crecimiento de células tumorales y la modulación de la expresión
genética.
Para la búsqueda de modelos experimentales para estudios de la biología del
desarrollo y la diferenciación celular.
Técnicas de cultivo celular para la inserción de genes extraños en las células
receptoras (animales transgénicos).
La tecnología de la fusión celular y los ensayos de citotoxicidad son técnicas
de cultivo celular.

Métodos de disgregación de células en placa

La disociación tisular y el subcultivo celular representan dos aplicaciones en las que

es necesario separar las células entre sí y de un sustrato manteniendo la viabilidad
celular. Para conseguirlo es necesario romper la malla de proteínas que forman la
matriz extracelular que las mantiene unidas mediante procesos que separen las
moléculas proteicas de la matriz extracelular (por ej. secuestrando los iones calcio
que permiten la unión), o bien rompiendo proteolíticamente (mediante la acción de
proteasas) las mismas proteínas.

Generalmente los métodos empleados se pueden clasificar en tres categorias :

• mecánicos (por ejemplo cortar, picar, cribar, rascar, etc..). En cultivos celulares
se emplean con frecuencia los métos de rascado ('scarpping') de la placa para
arrancar las células adheridas.
• químicos. Generalmente se trata de la adición de soluciones en las que no hay
iones divalentes o bien de agentes quelantes de estos iones. En cualquier caso
se reduce la concentraciones de los iones que estabilizan las uniones de las
proteínas de la matriz extracelular y de éstas con los receptores celulares.
• enzimáticos. Tratamiento del tejido o del cultivo celular con soluciones de
proteasas activas (colagenasa, dispasa, tripsina, elastasa, papaína, pronasa,
hialuronidasa, etc...)

Sin embargo en la práctica se suelen emplear técnicas que combinan dos o tres
métodos. La elección de uno u otro procedimiento dependerá fundamentalmente de la
naturaleza y cantidad de tejido o cultivo disponible y del uso previsto de las células
obtenidas.

CONSERVACIÓN/CONGELACIÓN

Es importante disponer de alícuotas congeladas de las células con el fin de minimizar

la acumulación de cambios genéticos en las líneas continuas, evitar la senescencia y
la transformación en las líneas finitas, y evitar la pérdida accidental de una línea por
muerte o contaminación.

En la actualidad el mejor método de almacenamiento es la congelación en nitrógeno

líquido. Las células crecidas hasta un 70-80% de confluencia (fase logarítmica del
cultivo) se resuspenden según alguno de los métodos clásicos. La suspensión celular,
idealmente de alta concentración celular, debe ser congelada lentamente (descenso
de aproximadamente 1ºC/min) en presencia de un agente preservante como el
glicerol o el dimetilsulfóxido (DMSO). Las células son transferidas rápidamente a
nitrógeno líquido (-196ºC) cuando alcanzan una temperatura inferior a -50ºC donde
se almacenan sumergidas en nitrógeno o en la fase gaseosa superior durante largos
periodos de tiempo (años) sin deterioro celular apreciable. El almacenamiento a
temperaturas tan bajas como -80ºC es posible aunque se detecta deterioro de las
células a las pocas semanas y/o meses.

La descongelación de los stocks congelados se ha de realizar rápidamente, diluyendo

la suspensión y eliminando el agente preservante con la máxima rapidez.

Existen muchas soluciones de congelación de células. Nuestra experiencia

recomienda el uso de 10% DMSO en suero bovino fetal (FCS), aunque algunas líneas
continuas se congelan con la misma eficacia en 10% DMSO en medio completo
(usualmente DMEM 10% FCS). Otros tipos celulares como los hepatocitos se
congelan bien en soluciones de sales de alginato.

MANTENIMIENTO DE LINEAS CELULARES

Requerimientos nutricionales

1. Medios de cultivo: composición de nutrientes esenciales balanceados

cuantitativamente.
Aminoácidos: síntesis de proteínas y ácidos nucleicos
Hidratos de carbono: fuente de energía
Iones inorgánicos
Vitaminas, etc

2. Suero: composición no cuantitativa de diferentes componentes con actividad

promotora del crecimiento celular.

Requerimientos fisiológicos

 Temperatura (gral. 37º C)

 pH óptimo (gral. 7.2-7.4)
 CO 2 (gral. 5%)
 Presión osmótica
 Humedad cercana a saturación

Tipos de medio de cultivo

Definidos (sin suero): compuesto por elementos cuya composición química y

concentración están perfectamente determinados. Medio solo o con agregados de
formulaciones especiales.
Ejemplos:
♦ MEM: medio esencial mínimo, 27 factores esenciales para el crecimiento celular.
♦ DMEM: medio esencial mínimo modificado.
♦ HamF12: MEM + albúmina, transferrina, insulina y piruvato de sodio.

No definidos (con suero o hidrolizados proteicos): tienen componentes cuya

composición química y concentración no están determinados.
Ejemplos:
♦ Medios de mantenimiento: células con metabolismo basal (MEM + 2% de suero)
♦ Medios de crecimiento: activación del ciclo celular (MEM + 10% de suero)

El papel de suero, especialmente fetal bovino en el establecimiento y mantenimiento

de líneas y cultivos celulares, es fundamental; cuando estos se han establecido en
medios libres de suero, el crecimiento celular requiere, la suplementación con
hormonas y otros factores de crecimiento que están involucradas en transporte de
nutrientes, mantenimiento de balance de energía celular, control de síntesis de
macromoléculas y factores que estimulan la formación del producto deseado. Muchos
de los factores suplementados son purificados del mismo suero, lo cual hace que
cultivos a gran escala con medio libre de suero no sean rentables.
Uno de los inconvenientes que presentan los laboratorios de investigación y
diagnóstico es el del alto porcentaje de cultivos contaminados por el virus de la DVB.
Como consecuencia de la infección intrauterina de los bovinos donantes del suero,
las líneas celulares y los cultivos primarios se pueden contaminar con el virus cuando
son suplementados con el suero contaminado. El porcentaje de contaminación del
suero fetal comercial oscila entre el 10y el 70%.
Las células afectadas, alteran su eficiencia en la replicación, y en la producción de
metabolitos específicos. Como una alternativa para prevenir este probloma se ha
optado por la radiación de los lotes de suero; se han evaluado otros métodos de
inactivación, a través del uso de sustancias tales como el BEI (etilenimina binaria), la
cual ofrece ventajas comparativas, pero demanda estudios adicionales para
determinar el efecto en el tiempo, sobre la calidad de las células como substrato
biológico en pruebas diagnósticas y especialmente en el aislamiento de agentes
virales.
Sin embargo, además de buscar soluciones para el producto final, se han
desarrollado también métodos y técnicas para la detección de animales
inmunotolerantes persistentemente infectados con el virus de la DVB, usando cultivo
de células polimorfonucleares y técnicas de inmunoperoxidasa indirecta.

CULTIVOS CELULARES VEGETALES

El término genérico “cultivo de tejidos vegetales” involucra a diferentes técnicas de

cultivo de material vegetal diverso, incluyendo a los protoplastos (células desprovistas
de su pared celular), células, tejidos, órganos y plantas completas. Mediante éstas y
otras técnicas de cultivo, es posible obtener plantas libres de microbios en un medio
nutritivo aséptico (estéril) en condiciones ambientales controladas. También se lo
conoce como “cultivo in vitro de plantas” por realizarse en recipientes de vidrio (hoy
también de otros materiales).
Las primeras experiencias relacionadas con el cultivo de tejidos vegetales se
remontan a 1902, pero recién en 1922 se logró el primer experimento exitoso: la
germinación in vitro de semillas de orquídeas. Luego de la germinación, las plántulas
obtenidas se transfirieron a un medio de cultivo en condiciones asépticas, y así se
mantuvieron protegidas del ataque de patógenos (hongos, virus y bacterias).
Hoy esta técnica tiene numerosas aplicaciones, algunas de ellas se ilustran en la
Figura 1:
• Propagación masiva de plantas, especialmente para especies de difícil
propagación por otros métodos, o en vías de extinción
• Clonación de individuos de características agronómicas muy deseables durante
todo el año
• Obtención de plantas libres de virus
• Producción de semillas sintéticas
• Conservación de germoplasma (conjunto de individuos que representan la
variabilidad genética de una población vegetal)
• Obtención de metabolitos secundarios
• Producción de nuevos híbridos
• Mejora genética de plantas (incluyendo obtención de plantas transgénicas)
• Germinación de semillas.
• Producción de haploides.
• Estudios fisiológicos diversos.
Figura 1. Algunas aplicaciones del cultivo de tejidos en plantas. A la izquierda, micropropagación de violeta
africana a partir de trozos de hojas desinfectados e introducidos en condiciones de esterilidad. A la derecha,
semillas sintéticas formadas por embriones somáticos obtenidos por cultivo de células, encapsulados en una
matriz inerte (como el alginato de calcio).

LAS BASES BIOLÓGICAS DEL CULTIVO DE TEJIDOS: LA

TOTIPOTENCIALIDAD CELULAR

La reproducción asexual de plantas por cultivo de tejidos es posible gracias a que, en

general, varias células de un individuo vegetal poseen la capacidad necesaria para
permitir el crecimiento y el desarrollo de un nuevo individuo completo, sin que medie
ningún tipo de fusión de células sexuales o gametas. Esta capacidad se denomina
totipotencialidad celular, y es característica de un grupo de células vegetales
conocidas como células meristemáticas, presentes en los distintos órganos de la
planta. La potencialidad de una célula diferenciada (una célula de conducción,
epidérmica, etc.) para generar tejidos nuevos y eventualmente un organismo
completo, disminuye con el grado de diferenciación alcanzado por esa célula, pero
puede revertirse parcial o completamente según las condiciones de cultivo a las que
se la someta. Las células vegetales crecidas en condiciones asépticas sobre medios
de cultivo adicionados con hormonas vegetales, pueden dividirse dando dos tipos de
respuesta:
• una desdiferenciación celular acompañada de crecimiento tumoral, que da lugar a
una masa de células indiferenciadas denominada callo, la cual bajo las
condiciones adecuadas es capaz de generar órganos o embriones somáticos
(llamados así porque son estructuras similares a un embrión, pero que no se
originaron por unión de gametas),
• una respuesta morfogenética por la cual se forman directamente órganos
(organogénesis) o embriones (embriones somáticos).
La primera respuesta se conoce como organogénesis o embriogénesis indirecta
(mediada por un estado de callo) mientras que la segunda respuesta se considera
organogénesis o embriogénesis directa.
El cultivo in vitro consiste en tomar una porción de una planta (a la que se
denominará explanto, como por ej. el ápice, una hoja o segmento de ella, segmento
de tallo, meristema, embrión, nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un medio
nutritivo estéril (usualmente gelificado, semisólido) donde se regenerarán una o
muchas plantas.
La formulación del medio cambia según se quiera obtener un tejido desdiferenciado
(callo), crecer yemas y raíces, u obtener embriones somáticos para producir semillas
artificiales.
El éxito en la propagación de una planta dependerá de la posibilidad de expresión de
la potencialidad celular total, es decir, que algunas células recuperen su condición
meristemática. A tal fin, debe inducirse primero la desdiferenciación y luego la
rediferenciación celular. Un proceso de este tipo sucede durante la formación de las
raíces adventicias en el enraizamiento de estacas, la formación de yemas
adventicias, o cuando se busca la propagación de begonias, violeta africana (ver
figura 1) o peperonias mediante porciones de hojas. Uno de los factores más
importantes a tener en cuenta para lograr la respuesta morfogenética deseada es la
composición del medio de cultivo.
No existen dudas que en todo intento de propagación vegetal, ya sea in vitro o in vivo
, el carácter del proceso de diferenciación depende del genoma de la especie, y que
está regulado por el balance hormonal propio y por el estado fisiológico del órgano,
tejido o célula puesta en cultivo. Sin embargo, también se sabe que ese balance
puede ser modificado por el agregado de compuestos que imiten la acción de las
hormonas vegetales. Estos compuestos se denominan reguladores del crecimiento, y
se emplean en los medios de cultivo para conseguir la micropropagación de una
planta.
La totipotencialidad celular es clave en el desarrollo de plantas genéticamente
modificadas o transgénicas. Una vez realizada la transformación, ya sea por
Agrobacterium o por el método de biobalística, el paso siguiente es el cultivo in vitro,
con el fin de obtener, a partir del explanto inicial transformado, plántulas que lleven el
transgén en todas sus células (Figura 2).

Figura 2. Cultivo de tejidos y transformación vegetal. En la figura se observan explantos que, luego del
proceso de selección, han perdido coloración y aquellas células transformadas exitosamente que se han
desdiferenciado y rediferenciado para dar origen a un brote.
 PASOS NECESARIOS PARA GENERAR PLANTAS A PARTIR DE
EXPLANTOS AISLADOS

En los protocolos utilizados durante el cultivo in vitro se pueden distinguir las

siguientes etapas (sintetizadas en la Figura 3):
1) Elección de la planta y/o tejido donante de explantos.
2) Establecimiento, que consiste en la desinfección de los explantos (generalmente
con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptación al medio artificial de modo de
inducir callo, brote, raíz o embrión somático según se desee
3) ultiplicación, para generar una masa vegetal suficiente para la regeneración del
número de plantas necesarias.
4) Enraizamiento, en la que se busca la formación de raíces con el fin de convertir
los brotes o embriones somáticos en plántulas completas.
5) Rusticación, que es la aclimatación de las plántulas obtenidas in vitro a las
condiciones ambientales ex vitro (suelo o algún sustrato inerte)

El éxito de la técnica depende de muchos factores, entre ellos la edad de la

planta (a mayor edad, menor potencial de regeneración), el genotipo y las
condiciones ambientales.
Entre las ventajas del cultivo in vitro de material vegetal, se pueden incluir los
tiempos más cortos, y la posibilidad de ocupar un espacio mucho más pequeño que
si se desea propagar material en tierra.

Figura 3. Etapas de la regeneración in vitro del maíz.

 ELEMENTOS NECESARIOS PARA EL CULTIVO DE TEJIDOS
VEGETALES

Figura 4. Flujo laminar para el cultivo de tejidos. Se observa uno de los modelos de flujo laminar que puede
usarse para preservar la esterilidad de las muestras.
Para llevar adelante este trabajo, se necesitan equipamientos que generen las
condiciones necesarias de esterilidad, como los flujos laminares, que son estaciones
de trabajo que hacen circular aire filtrado y estéril, protegiendo así a la muestra con la
que se desea trabajar (Figura 4).
Además, se necesita un soporte para el explanto, que puede ser sólido o líquido, y
que está conformado por algún agente gelificante inerte (agar, gelrite, etc.), macro y
micronutrientes esenciales para la supervivencia de la planta, nutrientes (hidratos de
carbono, vitaminas), agentes reguladores del crecimiento y hormonas vegetales (ver
Tabla 1) que ayudarán a obtener una planta o un órgano en particular, a partir del
explanto elegido. Algunos de los elementos mencionados pueden ser reemplazados
por mezclas poco definidas en su composición (jugo de tomate, agua de coco, etc.),
que pueden dar buenos resultados y generalmente resultan más económicas. La
acidez de los medios de cultivo para plantas suele variar entre pH=5 y 6,5. Luego se
regulan las condiciones de temperatura y de fotoperíodo (relación de horas luz y
horas oscuridad).

Segun sea el balance hormonal y otras condiciones de cultivo, se puede propiciar la

regeneración de distintos órganos o formaciones vegetales. Por ej., si el balance de
citoquininas/auxinas (ver Tabla 1) es mayor que 1, se favorece la generación de
brotes; si es menor que 1, la generación de raíces; y si es igual a 1, la formación de
callos.
Tabla 1. Composición de medios de cultivo para células vegetales

Componentes Características y ejemplos

Agua destilada Representa el 95% del medio nutriente

Generalmente se usa sacarosa. La fuente de carbono se

necesita porque los explantos no son completamente
Fuente de carbono
autótrofos, y no pueden cubrir sus necesidades con la
fotosíntesis que pueden realizar in vitro

Macroelementos (N, P, K, Ca, Mg, S) y microelementos

Sustancias inorgánicas (Fe, Co, Zn, Ni, B, Al, Mn, Mo, Cu, I), en una proporción
adecuada según la planta elegida.

Vitaminas B1, B2, B6, vitamina H, vitamina E, ácido fólico,

Vitaminas
ácido nicotínico, entre otras.

Auxinas: promueven la elongación celular, la formación de

callos y raíces adventicias, inhiben la formación de brotes
Hormonas y reguladores del axilares adventicios y, a veces, inhiben la embriogénesis.
crecimiento Citoquininas: promueven la división celular, regulan el
crecimiento y el desarrollo de los tejidos vegetales.
Otras: giberelinas, ácido abscísico, etileno.

Mezclas de sustancias poco definidas Extracto de levadura, extractos vegetales.

Se usan como soporte: agar, agarosa, otros polisacáridos,

Materiales inertes
lana de vidrio, papel de filtro, arena.
 EL CULTIVO IN VITRO Y LA BIOTECNOLOGÍA

• La micropropagación
La propagación de plantas in vitro es una técnica muy utilizada en cultivos de
importancia económica. Permite cultivar células, tejidos, órganos, semillas,
embriones y obtener individuos selectos en forma rápida. Los cultivos son
realizados por personal especializado en medios específicos (hormonas,
minerales, vitaminas, fuente de carbono, agente gelificante, agua, etc.) y
condiciones ambientales controladas (temperatura, humedad y luz) (Figura 5) .
Una vez ajustados los protocolos para la especie o cultivo de interés, es posible
automatizar el proceso de modo de llevarlo a mayor escala de producción.
La micropropagación (propagación clonal por cultivo in vitro) constituye uno de
los métodos biotecnológicos que mayores logros ha aportado al desarrollo de la
agricultura, ya que se la usa en la producción masiva de especies hortícolas,
aromáticas, medicinales, frutícolas, ornamentales y forestales.

Entre las ventajas de la micropropagación se pueden mencionar:

- Posibilita incrementar rápidamente nuevos materiales.
- Permite controlar las condiciones ambientales, debido a su
independencia de los mismos (luz, temperatura y humedad controlada).
- Permite estudiar diversos procesos fisiológicos.
- Evita el riesgo de contaminación con patógenos, ya que se realiza en
medios esterilizados.
- Se pueden obtener gran cantidad de individuos en espacios reducidos.
- Permite la obtención de individuos uniformes.
- Facilita el transporte del material.

• El cultivo de meristemas
En la yema apical se encuentran un grupo de células que conforman el
meristema apical (tiene un tamaño entre 0,01 y 0,3 mm), tejido embrionario que
tiene la capacidad de formar todos los tejidos de la planta. A partir de ellos se
pueden regenerar plantas completas (Figura 6).

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El cultivo de meristemas tiene numerosas aplicaciones. Una de las más
importantes es la obtención de plantas libres de virus, ya que esta pequeña
zona de tejido generalmente no es afectada por estos patógenos vegetales.
Otra muy importante es la multiplicación vegetal. La potencialidad de la técnica
se demuestra con un ejemplo: a partir de una yema apical, se pueden obtener
4.000.000 de claveles en un año. La técnica permite también multiplicar
especies de plantas con reproducción lenta o dificultosa (como las orquídeas),
o acelerar la producción de plantas bianuales.

• Cultivo de células y órganos vegetales en biorreactores

Una vez obtenidos los callos a partir de algún explanto, los mismos pueden
disgregarse para obtener una suspensión de células. Esta suspensión puede
utilizarse para generar embriones somáticos (la base de las semillas sintéticas),
o puede directamente cultivarse para producir metabolitos secundarios, que
son compuestos químicos sintetizados por las células vegetales en
determinadas condiciones, con gran utilidad para las industrias farmacéutica y
alimenticia, entre otras. Por ejemplo, son metabolitos secundarios el mentol y
las drogas anticancerígenos vincristina y taxol, y algunos edulcorantes. Los
cultivos celulares se llevan a cabo en biorreactores, que son recipientes de
distinta capacidad (de unos pocos a miles de litros), diseñados para propiciar el
crecimiento y/o la multiplicación de distintos tipos de células y/o órganos
(Figura 7).
Las raíces vegetales también pueden ser cultivadas en biorreactores,
especialmente aquellas transformadas por Agrobacterium rhizogenes, que
produce un aumento abrupto en el tamaño y ramificación de la raíz,
aumentando así la biomasa, y por ende la cantidad del producto deseado. Un
ejemplo de compuesto farmacológico producido por cultivo de raíces es el
paclitaxel, o taxol, que es utilizado como anticancerígeno.

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Figura 5. La micropropagación vegetal. A partir de una planta madre se obtienen numerosos explantos
que, sujetos a condiciones y medios de cultivo adecuados, darán lugar a nuevas plantas iguales a la
planta original, permitiendo su multiplicación

Figura 6. Cultivo de meristemas. A partir de un meristema aislado se puede obtener una planta
completa.
Adaptado de Biotecnología, UNQ 2006.

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Figura 7. Cultivo de células y órganos vegetales. A partir de un explanto se pueden establecer cultivos
de células para producir compuestos de interés, o para obtener embriones somáticos y semillas
artificiales, entre otras aplicaciones

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