Manual de Prácticas de Microbiología General

Práctica N°11
Acción de los agentes antimicrobianos
OBJETIVO. -

Conocer y ensayar las pruebas de sensibilidad microbiana más comunes en el laboratorio de microbiología.

INTRODUCCIÓN. -

El principio fundamental de la quimioterapia es la toxicidad selectiva. Los agentes antibióticos

(quimioterápicos y antibióticos) no actúan directamente sobre el huésped, sino que se combinan
químicamente con determinados sistemas de los microorganismos, enfocando así la acción sobre los
microorganismos más que sobre el huésped.
De acuerdo a su origen los antimicrobianos se denominan:
Antibiótico: Sustancia química que es producida por microorganismos vivos y que tienen capacidad de
inhibir el desarrollo de otros organismos vivientes que le son sensibles.
Quimioterápico: Es un compuesto químico sintético que actúa en forma bactericida o bacteriostática sobre
los microorganismos, inhibiendo una serie de funciones vitales.

ACCIÓN DE LOS ANTIBIÓTICOS. -

- Inhibición de síntesis de pared celular: por ej. Penicilina, Cefalosporina, Bacitracina, Vancomicina,
Ristocetina, Novobiocina, Cicloserina.
- Alteración de permeabilidad de membrana celular: Anfotericina B, Colistina, Nistatina, Polimixina.
- Inhibición de síntesis proteica: Aminoglucósidos (Kanamicina, Tobramicina, Amikacina, Estreptomicina),
Tetraciclinas, Cloramfenicol, Macrólidos (Eritromicina, Oleandomicina), Lincomicinas (Lincomicina,
Clindamicina).
- Inhibición de síntesis de ácidos nucleicos: Acido Nalidíxico, Novobiocina, Pirimetamina, Sulfonamidas,
Trimetoprim, Rifampicina.
Químicamente, los antibióticos se pueden clasificar en 3 grupos:
a) Derivados de aminoácidos: Penicilinas, Cloramfenicol, Bacitracina, Polimixina, Cicloserina.
b) Derivados del acetato: Tetraciclinas, Griseofulvina, Eritromicina y los polienos conjugados.
c) Derivados de azúcares (aminoglucósidos): Kanamicina, Estreptomicina, Neomicina.

Relación de algunos Antibióticos

• PENICILINAS: grupo de compuestos semejantes con actividades y propiedades ligeramente diferentes.
Estructura: están formadas por el núcleo de un anillo TIAZOLIDINA unida a un anillo BETA-
LACTAMICO, al cual se adhiere a su vez una cadena lateral que determina algunas de las propiedades
de las penicilinas.
Origen: se obtiene a partir de cultivos de Penicillium notatum, otras 22 especies del mismo género y 7
de Aspergillus. Existen penicilinas naturales y sintéticas, siendo las últimas más eficaces
• ESTREPTOMICINA Y DIHIDROESTREPTOMICINA: se extraen de Actinomicetales y Streptomyces.
• CLORAMFENICOL: se obtuvo inicialmente de Streptomyces venezuelae, en la actualidad es el único
antibiótico que se obtiene en gran escala por síntesis. Es de amplio espectro.
• TETRACICLINAS: se conocen 3 miembros principales de esta familia de antibióticos -Clorotetraciclina
(Aureomicina), Oxitetraciclina (Terramicina) y Tetraciclina (Acromicina)-. Origen: se obtienen de un
Streptomyces. También se prepara sintéticamente por reducción catalítica de la Clorotetraciclina. Es de
amplio espectro.
• ERITROMICINA: se obtiene a partir de un cultivo de Streptomyces erythraeus.
• BACITRACINA: se obtiene a partir de un cultivo de Bacillus polimyxa.

~ 90 ~
 Manual de Prácticas de Microbiología General

Aplicación de los agentes quimioterápicos

a. Para el tratamiento de enfermedades infecciosas.
b. Para la conservación de alimentos.
c. Como complementos alimenticios de algunos animales.

Relación de algunos quimioterápicos

• Sulfonamidas: compuestos procedentes de la anilina. Tienen acción sobre microorganismos
Grampositivas. Las verdaderas sulfonamidas son aquellas que se parecen estrechamente en su estructura
molecular al Acido p-Aminobenzoico (PABA). Su acción se debe al bloqueo de uno o más sistemas
enzimáticos esenciales.
• Acido p-aminobenzoico (PABA): metabolito esencial en muchas células vivas que inhiben la acción de las
sulfonamidas. Esta inhibición es contrarrestada no sólo por el PABA, sino también por varios antagonistas
secundarios, entre los que se encuentran el ácido fólico (ácido pteroilglutámico), metionina, serina,
tiominas, purinas y otros. Se ha localizado el punto de acción de las sulfonamidas en la conversión
enzimática del PABA a ácido fólico (APG).
• Derivados de las Sulfonamidas: Sulfadiazina, Sulfamerazina, Sulfadimetoxina, Sulfametoxipiridazina.
• Ácido p-aminosalicílico (PAS): es una de las más eficaces drogas antituberculosas. Se administra con
antibióticos como la Isoniazida o la Estreptomicina. Uno de los derivados más eficaces es el fenil-p-
aminosalicílico.
• Sulfonadiaminodifenil (DDS): es una droga que se emplea para el tratamiento de la lepra y no en la
tuberculosis por su gran toxicidad.

RESISTENCIA A LOS ANTIMICROBIANOS

Existen muchos mecanismos que conducen a un microorganismo a ser resistente a los antimicrobianos, ya
sea porque producen enzimas tendientes a inactivar el antibiótico o cambiar su permeabilidad a éste por
mutación a nivel de proteínas de membrana (proteína S-10 a nivel de biosíntesis proteica). Estos
mecanismos pueden ser de origen genético o no; en este caso la naturaleza puede ser cromosómica
mediante mutaciones (frecuencia 10-12) o extracromosómica mediante los elementos llamados
PLASMIDOS, que codifican los genes de resistencia a uno y/o más antibióticos. Algunas veces parte del
plásmido R puede integrarse al cromosoma llevando algunos marcadores R, haciendo difícil su
reconocimiento genético como tal aún por análisis moleculares. Estos genes codifican las enzimas nece-
sarias para inactivar, codificar o destruir a los antimicrobianos, mediante adenilación, acetilación y fosforila-
ción, dependiendo de la complejidad estructural del antibiótico; así por ejemplo, los plásmidos codifican la
enzima acetiltransferasa que destruye el cloramfenicol, haciendo al microorganismo resistente a dicho
antibiótico. El peligro de la resistencia extracromosómica de los microorganismos inicialmente susceptibles,
mediante los procesos de conjugación, transducción y transformación haciéndolos resistentes.
El fenómeno se manifiesta principalmente en ambientes nosocomiales, dando origen al surgimiento de
cepas epidémicas que aparte de ser patógenas de etiología conocida, pueden adquirir este carácter los
patógenos oportunistas que pueden ser causa de brotes septicémicos.

DETERMINACIÓN DE LA SENSIBILIDAD DE LOS MICROORGANISMOS A LOS ANTIBIÓTICOS Y

QUIMIOTERÁPICOS

I. MÉTODO DE LOS DISCOS DE ANTIBIÓTICOS (M. KIRBY-BAUER)

MATERIAL. -

- Cultivos de 18 h. de cepas de St. aureus y E. coli en caldo nutricio.

- Una placa de agar Mueller-Hinton.
- Discos de antibióticos de diversas concentraciones, de acuerdo a la cepa que se va a analizar.
- 2 pipetas graduadas de 1 mL.
- Espátula de Drigalski o torunda estéril.
- Asa de siembra, lápiz graso, mechero.

~ 91 ~
 Manual de Prácticas de Microbiología General

PROCEDIMIENTO. -

1. Depositar en las placas de Mueller-Hinton 0.2 mL de los cultivos bacterianos de 18 h. de incubación y

extender el inóculo por diseminación con la espátula de Drigalski.
2. Colocar asépticamente mediante una pinza, los discos de antibióticos y quimioterápicos, sobre la
superficie de la placa, procurando ubicarlas en forma equidistante.
3. Rotular datos; registrar la clave de los discos de antibióticos.
4. Incubar los cultivos a 37°C por 24 h.

RESULTADOS. -

El diámetro de las zonas de inhibición producidas por los

discos de antibióticos se mide con una regla milimetrada que
se coloca por debajo de la placa Petri. El límite del área de
inhibición estará dado por la inhibición completa del desarro-
llo, apreciable por el ojo. En el caso de las sulfas y sus
derivados se hace una excepción, porque se puede producir
un desarrollo discreto de aspecto granular fino dentro del área
de inhibición; en estos casos, el límite de la inhibición estará
dado por las zonas de crecimiento abundante. En la
realización del antibiograma, se debe tener especial cuidado
en emplear una cepa pura y no una mezcla de
microorganismos

Interpretación del antibiograma

Los diámetros de inhibición del crecimiento (en cm) serán Figura 56 Placa con agar Mueller-Hinton
inoculada con un cultivo bacteriano y varios
llevados a una tabla estándar de sensibilidad para traducir la
discos de antibióticos, mostrando halos de
lectura en términos de sensibles, medianamente sensibles inhibición (Adaptado de Harley & Prescott,
o resistentes (confrontar sus resultados con el cuadro 2002).
adjunto).
NOTA: No debe darse el resultado en términos de mm de inhibición ni de cruces.

II. MÉTODO DE DILUCIÓN DE ANTIBIÓTICOS EN TUBOS: DETERMINACIÓN DE LA

CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (CMI)

MATERIAL. -

- Cultivo de 18 h. de incubación: St. aureus y E. coli en caldo triptosa.

- Soluciones estándar de antibióticos en concentraciones decrecientes de estreptomicina y Penicilina G.
- 2 pipetas graduadas de 1 mL.
- 6 tubos de 9 mL cada uno de BHI o Caldo Triptosa, a los que se adiciona antibióticos para obtener las
siguientes concentraciones:

Tabla 6. Preparación de las diluciones de Penicilina y Estreptomicina.

TUBO PENICILINA G (U.I./mL) ESTREPTOMICINA (µmg/mL)
1 50 400
2 25 200
3 12,5 100
4 6,25 50
5 3,125 25
6 1,56 12,5.
8 Sin antibiótico (control) Sin antibiótico (control)

PROCEDIMIENTO. -
1. Sembrar una alícuota (0.1 mL) del cultivo de 18 h.
2. Rotular e incubar a 37°C por 24 h.
3. Interpretar los resultados.

~ 92 ~
 Manual de Prácticas de Microbiología General

Figura 57 Método de Kirby – Bauer (Adaptado de Harley & Prescott, 2002).

~ 93 ~
 Manual de Prácticas de Microbiología General

RESULTADOS E INTERPRETACIÓN. -

La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de un antibiótico para un microorganismo está representada

por la máxima dilución del antibiótico que actúa inhibiendo el crecimiento microbiano.
Para saber si las concentraciones del antibiótico son bacteriostáticas o bactericidas, sembrar 2-3 asadas de
los tubos con inhibición de crecimiento a tubos con caldo nutricio o Mueller-Hinton. Incubar y anotar
resultados.

Figura 58 Serie de tubos para determinar la Concentración Mínima Inhibitoria. En la serie A,

el microorganismo de prueba es susceptible al agente antimicrobiano a partir de la
concentración presente en el tubo 8. En la serie B, el microorganismo de prueba es
resistente al agente antimicrobiano a cualquier concentración ensayada.

Tabla 7. Discos de sensibilidad propuestos para usar en los antibiogramas de rutina en laboratorios
clínicos
1. GRAM POSITIVOS 2. GRAM NEGATIVOS 3. ORINA-CULTIVOS
A. Cefalotina A. Ampicilina A. Ampicilina
B. Cloramfenicol B. Cefalotina B. Cefalotina
C. Eritromicina C. Cloramfenicol C. Cloramfenicol
D. Kanamicina D. Colistín D. Colistín
E. Lincomicina E. Kanamicina E. Doxiclina
F. Meticilina F. Neomicina F. Kanamicina
G. Neomicina G. Nitrofurantoína (orina solamente) G. Ac. Nalidíxico
H. Penicilina G H. Sulfas H. Nitrofurantoína
I. Estreptomicina I. Estreptomicina I. Penicilina G
J. Tetraciclina J. Tetraciclina J. Estreptomicina
K. Opcional: K. Opcional: K. Sulfametoxazol
Vancomicina Penicilina G L. Tetraciclina
Gentamicina Doxiclina
Doxiclina L. Opcional:
L. IDEM K Ac. Nalidíxico
Gentamicina
Polimixina B
NOTA: Las concentraciones de los discos se especifican en la tabla de interpretación de los halos o zonas de inhibi-
ción, publicadas por KIRBY, BAUER y col. que se reproduce más adelante. El empleo de 12 discos de concentración
alta en una placa Petri requiere de una colocación cuidadosa de los mismos para evitar superposiciones de los diversos
halos de inhibición.

~ 94 ~
 Manual de Prácticas de Microbiología General

Tabla 8. Test de sensibilidad de los microorganismos a los antibióticos: método del disco difusión.
Diámetros estándar de las zonas de inhibición (mm) para la interpretación de la sensibilidad a los
antibióticos
ANTIBIÓTICO O GRAM CONCENTRACIÓN DEL (A) (B) (C)
QUIMIOTERÁPICO DISCO (µmg)
Penicilina (+) 10 6-20 21-28 29- +
Ampicilina (+)(-) 10 6-20 21-28 29- +
Bacitracina (+) 10 6-8 9-12 13- +
Cefaleridina 30 6-11 12-15 16- +
Cefalotina (-) 30 6-14 15-17 18- +
Cloramfenicol (+)(-) 30 6-12 13-17 18- +
Colistina (-) 10 6-8 9-10 11- +
Eritromicina (+) 15 6-14 15-18 19- +
Gentamicina(1) (+)(-) 10 - - 18- +
Kanamicina (+)(-) 30 6-13 14-17 18- +
Meticilina (+) 5 6-9 10-13 14- +
Ac. Nalidíxico(2) (+)(-) 30 6-13 14-17 18- +
Neomicina (+)(-) 30 6-12 13-16 17- +
Nitrofurantoína(2) (+)(-) 3,000 6-8 9-12 13- +
Penicilina G (a) (-) 10 6-20 21-28 29- +
Penicilina G (b) 10 6-11 12-28 29- +
Cloxacilina (ox) (+) 10 6-10 11-13 14- +
Dicloxacilina (dx) (+) 10 6-11 12-21 22- +
Polimixina B (+) 30 6-11 10-11 12- +
Estreptomicina(2) (+) 10 6-11 12-14 15- +
Sulfonamidas(3) (+)(-) 3,000 6-12 13-16 17- +
Tetraciclinas (+)(-) 30 6-14 15-18 19- +
Vancomicina 30 6-9 10-11 12- +
NOTA: (A),(B),(C) = Diámetro del halo de inhibición (mm).
(A) = Resistente, (B) = Intermedio, (C) = Sensible
Penicilina G: (a) Contra Staphylococcus
(b) Contra otros microorganismos
(1) = Normas provisionales
(2) = Empleados sólo para las infecciones de las vías urinarias
(3) = Válidos para cualquiera de las sulfonamidas de 250-300 µmg.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. -

• Benson, HJ, AE, Smith, H (2017). Benson: Microbiological Applications Lab Manual. 14th Edition.
McGraw-Hill Education. New York, 512 pp. ISBN 125991979X 9781259919794.
• Cercenado, E, Saavedra-Lozano, J (2009). El antibiograma. Interpretación del antibiograma: conceptos
generales (I). An Ped Contin 7(4):214-217.

CUESTIONARIO. -

1. ¿Cómo se correlacionan la CMI y la prueba de difusión de Kirby Bauer?

2. ¿Cuál es la diferencia entre CMI y CMB?
3. ¿Qué nombre toman las bacterias que se vuelven resistentes a todo tipo de antibiótico?

~ 95 ~