PRÁCTICA 2.

PROCEDIMIENTO GENERAL DE ACTUACIÓN

➢ Antes de entrar al laboratorio nos lavamos las manos, para no contaminar

nuestra muestra. Técnicas asépticas.

➢ Hacemos uso de los EPIS, como la bata o guantes. Recomendable tener el

pelo recogido.

➢ Comprobamos que él área de trabajo esté limpia y ordenada.

➢ Colocamos el material que vamos a utilizar en nuestra área de trabajo, es

importante dedicar un tiempo prudencial (10min aprox), a organizar las
cosas que vayamos a usar y establecer un orden, para proceder de la manera
correcta, reducir el riesgo de equivocarnos y agilizar el trabajo en el
 laboratorio. Detenerse un momento a leer el fundamento y protocolo de la
práctica.

➢ El material necesario para esta práctica: El portaobjetos y cubreobjetos,

mechero de alcohol, asa de siembra, medio de cultivo sólido o líquido con
muestra, agua destilada, pipeta pasteur, microscopio óptico y aceite de
inmersión.

PROCEDIMIENTO DE UN EXAMEN EN FRESCO

➢ Una vez preparados los materiales en nuestra área de trabajo, lo primero que
hacemos es abrir la tapa del mechero y asegurarnos que la mecha está en el
centro y lo encendemos.

➢ Cogemos el portaobjetos, y lo colocamos sobre la mesa, cerca del área estéril

que crea la llama del mechero para que no se nos estropee/contamine
nuestra muestra.

➢ Con la ayuda de una pipeta pasteur, suspendemos una o dos gotas de agua
destilada en el portaobjetos.

➢ Esterilizamos el asa de siembra, y comprobamos su temperatura al ver ese

color rojo candente que nos indicará que ya está esterilizada.

➢ Cogemos nuestra muestra, en este caso, un medio de cultivo sólido en placa

petri, colocada boca abajo. La cogemos y con el asa de siembra retiramos una
colonia del medio. La volvemos a tapar.

➢ Homogeneizamos la muestra con el asa de siembra en el agua destilada

haciendo movimientos circulares en el portaobjetos.

➢ Una vez terminado este paso, volvemos a esterilizar el asa de siembra hasta
que adquiera de nuevo ese color rojo candente.

➢ Cogemos el cubreobjetos y en un ángulo de 90º aprox, lo dejamos caer sobre

la muestra, evitando la formación de burbujas que nos dificulte visualizar la
muestra.

➢ En el momento que tenemos nuestro examen en fresco preparado,

apagamos el mechero, comprobando que lo hemos apagado bien. (Volvemos
a destaparlo para asegurarnos)

➢ Añadimos una gota de inmersión sobre el cubreobjetos y cuando esté listo el

portaobjetos, llevamos nuestra muestra al microscopio para visualizarla.
 ➢ El aceite de inmersión nos ayudará a poder ver la muestra en contacto con la
lente del objetivo de 100x, y así apreciar mejor los movimientos de los m.o.

❖ Dejamos todo recogido antes de irnos y nos lavamos nuevamente las

manos antes de salir del laboratorio.

Movimientos observados:

• Movimiento de corriente: Se ve cómo los m.o caen, en el campo que estamos

visualizando. El flujo de partículas como si estuviesen en una corriente, debido
al movimiento del medio líquido.
• Movimiento Browniano: Se ve a las partículas como en estado de vibración,
por el hecho de estar suspendida en un medio acuoso.

Estos dos movimientos fueron los únicos que fui capaces de observar al microscopio, ya
que no logré distinguir, el movimiento característico de cada bacteria.

❖ Para sobrevivir algunas bacterias se desplazan y colonizan nuevos lugares,

ese movimiento es crucial para la supervivencia de las bacterias. Es
importante saber si se se mueven o no, porque nos va a ayudar en su
identificación, por la presencia de sus flagelos. Saber si tienen la capacidad
o no de moverse y sus tipos de flagelos, van a agilizar el trabajo en el
laboratorio en su resolución y posteriores pruebas, proporcionando el mejor
tratamiento para la enfermedad.
PRÁCTICA 2.2
PROCEDIMIENTO GENERAL DE ACTUACIÓN

➢ Nos lavamos las manos antes de entrar al laboratorio para evitar contaminar la
muestra, y también nos ponemos la bata, EPIS. El pelo preferiblemente recogido.

➢ En esta práctica no es estrictamente obligatorio ponerse los guantes, porque no

estamos manipulando con una muestra de riesgo biológico. Aunque si queremos
evitar mancharnos con los colorantes o una mayor seguridad, podemos hacer uso de
de ellos.

➢ Colocamos el material que vamos a utilizar en nuestra área de trabajo, es

importante dedicar un tiempo prudencial (10min aprox), a organizar las cosas que
vayamos a usar y establecer un orden, para proceder de la manera correcta, reducir
el riesgo de equivocarnos y agilizar el trabajo en el laboratorio. Detenerse un tiempo
a leer el fundamento de la práctica.

➢ Material a utilizar: portaobjetos, mechero de alcohol, muestra en medio de cultivo

sólido (placa petri), colorantes (azul metileno, cristal violeta, safranina), especie
mordiente [lugol] y alcohol 96º, papel de filtro, asa de siembra, bandeja con gradilla,
pipeta pasteur, agua destilada.
TINCIÓN SIMPLE:
➢ Preparamos el material que vayamos a utilizar en nuestra área de trabajo.

➢ Abrimos la tapa del mechero, nos aseguramos de que la mecha esté en el centro y lo
encendemos.

➢ Colocamos nuestro portaobejtos sobre la mesa, cerca del área estéril que crea la
llama del mechero, para no contaminar la muestra durante el proceso.

➢ Suspendemos una gota de agua destilada en el portaobejtos con una pipeta pasteur.

➢ Se esteriliza el asa de siembra hasta que adquiera ese color rojo candente y
enfriamos el asa en una esquina nuestro medio de cultivo.

➢ Cogemos la placa petri, colocada boca abajo y recogemos una zona significativa de
las poblaciones, no solo nos quedaremos con una única colonia si no que
recogeremos varias.

➢ Se inocula en el portaobjetos homogeneizando la muestra con el asa de siembra en

el agua destilada, en movimientos circulares (si se llegase a formar un grumo lo
arrastramos hasta una esquina del portaobjetos donde no interfiera)
➢ Esterilizamos otra vez el asa una vez acabemos.
➢ Fijación de frotis en llama, en este paso tenemos que tener cuidado de no destruir
la muestra, se puede realizar por calor (llama o estufa) o metanol. En nuestro caso,
llama.
➢ Aplicamos calor con la llama del mechero de alcohol en el portaobejtos para fijar la
muestra por la parte inferior sin tocarla directamente, 3 veces por la llama
comprobando la temperatura en una parte de la mano/muñeca y lo repetimos
tantas veces hasta que la muestra se quede totalmente seca (Fijada).
➢ Cogemos el bote de nuestro colorante, en este caso el azul de metileno.

➢ Se apaga la llama del mechero ya que los colorantes pueden ser inflamables y no
queremos que haya contacto entre ambas cosas. Nos aseguramos de que está bien
apagado.

➢ Se coge un poco de colorante con una pipeta Pasteur y cubrimos toda la superficie
del portaobjeto con azul de metileno, sin que rebose. Se deja actuar 1 minuto y 15
segundos sobre la bandeja/soporte. A temperatura ambiente.

➢ Se lava con agua destilada por la cara inferior a la muestra hasta retirar el exceso de
colorante. Se escurre el portaobejtos sobre el papel de filtro.
 ➢ Se recomienda dejar el portaobjetos en la estufa previamente calentada para secar
la muestra, ya que algunos colorantes se pueden evaporar al exponerlos a la llama,
lo hacemos para agilizar en tiempo.
➢ De manera rudimentaria, encendemos la placa calefactora y con nuestra mano
tocando la placa esperamos a que caliente en torno a unos 50-60º, apagamos y la
desechunfamos directamente y apoyamos el portaobjetos por la parte inferior,
esperamos hasta que seque.

➢ Luego visualizamos al microscopio con el objetivo de 10x, 40x y 100x usando aceite
de inmersión, con la intención de diferenciar morfologia, bacilos o cocos, o sus
agrupaciones, estafilococos o estreptococos, por ejemplo.

TINCIÓN DIFERENCIAL:

➢ Preparamos el material que vayamos a utilizar, en nuestra área de trabajo.

➢ Abrimos la tapa del mechero y nos aseguramos de que la mecha está centrada, y lo
encendemos.

➢ Colocamos nuestro portaobjetos sobre la mesa dentro del área estéril, cerca del
mechero, para proteger nuestra muestra.

➢ Con una pipeta pasteur, suspendemos unas cuantas gotas de agua destilada sobre el
portaobjetos.

➢ Se esteriliza el asa de siembra (comprobamos temperatura) cuando adquiera ese

color de rojo candente, enfriamos el asa en nuestro medio de cultivo sólido (Placa
petri).

➢ Recogemos una zona significativa de las distintas poblaciones/ colonias en el medio

de cultivo, desplazando el asa por varias zonas. De esta forma nos vamos a asegurar
de recoger suficientes bacterias gram – y gram +.
➢ Se inocula en el portaobjeto y se homogeneiza la muestra con el asa y el agua
destilada (Debemos evitar los grumos, si los hay se recogen con el asa de siembra y
se apartan a una esquina del portaobjetos). Esterilizamos otra vez el asa una vez
acabemos.

➢ Fiación de frotis en llama, en este paso tenemos que tener cuidado de no destruir la
muestra, se puede realizar por calor (llama o estufa) o metanol. En nuestro caso,
llama.

➢ Pasamos el portaobjetos 3 veces por la llama, por la parte inferior, comprobando la

temperatura en la mano o muñeca y repetimos este paso hasta que la muestra se
quede totalmente seca (Fijada). Apagamos mechero y comprobamos.
❖ Tinción
➢ Añadimos con una pipeta pasteur unas gotas de cristal violeta, y cubrimos el
portaobjetos, sin rebosar, hasta que lo cubra. Dejamos actuar 1min y 15 segundos
sobre la bandeja/ soporte.

➢ Se retira el exceso de Cristal de Violeta con agua destilada, lavándola por la cara
inferior del portaobjetos. (No se deja secar). Se escurre el sobrante en el mismo
papel de filtro con pequeños toques.

➢ Se le agrega el mordiente durante 1 minutos y 15 segundos (Lugol, que fija el cristal

violeta en las paredes de las bacterias, especialmente las gram +)

➢ Se vuelve a lavar por la parte inferior con el agua destilada y volvemos a escurrir el
sobrante. (No se deja secar)

➢ Se decolora las bacterias Gram- aplicando un chorro contundente de alcohol por la

cara inferior del portaobjetos y se lava con agua destilada (No dejando actuar el
alcohol mucho tiempo ya que puede decolorar las Gram+).

➢ Por último, teñimos con safranina cubriendo el potaobjetos con una pipeta pasteur,
sin rebosar y se deja actuar durante 1 minuto y 15 segundos (Colorante ácido que
tiñe las Gram-).

➢ Se lava con agua destilada por la cara inferior, hasta retirar el exceso de colorante y
el agua que caiga sea transparente en su totalidad. Ya está listo el portaobjetos.

➢ En nuestro caso colocamos el portaobjetos en la placa calefactora previamente

calentada para secar la muestra, ya que algunos colorantes se pueden evaporar al
exponerlos a la llama. Agilizamos en tiempo, a temperatura ambiente tardaría más.

➢ De manera rudimentaria, encendemos la placa calefactora y con nuestra mano

tocando la placa esperamos a que caliente en torno a unos 50-60º, apagamos y la
desechunfamos directamente y colocamos el portaobjetos por la parte inferior a la
muestra, hasta que seque y esté preparado para observarlo.

➢ Visualizamos al microscopio óptico nuestra muestra. Empezamos con el aumento de

10x, 40x y por último aplicamos aceite de inmersión para poder observar mejor esa
diferenciación entre las gram + y gram – con el de 100x en contacto con la lente.
IDENTIFICACIÓN EN LA TINCIÓN DE AZUL DE METILENO
❖ Como se puede ver en las imágenes, la importancia de teñir la
muestra es poder apreciar mejor aún su morfología y agrupaciones,
es decir si son bacilos o cocos. Como las bacterias son prácticamente
incoloras y no se pueden ver, necesitamos teñirlas para que
constrasten con el fondo y estudiar así sus características.

❖ De esta forma podemos dar una información complementaria sobre

sus estructuras que no podrían ser observadas en el examen en
fresco.
IDENTIFICACIÓN EN TINCIÓN DIFERENCIAL DE
GRAM + y GRAM –
❖ Pudimos observar al microscopio la diferenciación entre gram + y
gram -, por la distinta composición de sus paredes y la acción del
cristal violeta y la safranina como colorante de contraste, se pueden
clasificar ambas por sus estructuras. Mayoritariamente gram +, ya
que hay en mayor cantidad que gram -

❖ En cuanto a su morfología, se pueden observar mayoritariamente

cocos y agrupaciones de estos, gram + y -, bacilos no distinguimos.