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Rinitis, sinusitis y alergia ocular

El acetato de ácidos grasos de cadena corta administrado por las vías

respiratorias aumenta la inmunidad antiviral durante la infección
por rinovirus

Krist Helen Antunes, PhD,a,b Aran Singanayagam, MD, PhD,c Lily Williams, BSc,d Tasnim Syakirah Faiez, BSc,c Ana Farias, PhD,b Millie M. Jackson,
BSc,c Fatima K. Faizi, BSc ,c Julia Aniscenko,b Tatiana Kebadze, MD,b Punnam Chander Veerati, PhD,d Lisa Wood, PhD,d Nathan W. Bartlett,
PhD,b,d Ana Paula Duarte de Souza, PhD,a,b* y Sebastian L Johnston, MBBS, PhDb,e* Porto Alegre, Brasil; Londres, Reino Unido; y Newcastle, Australia

GRÁFICAMENTE ABSTRACTO

Antecedentes: se reconoce que la microbiota desempeña un papel importante
en la regulación de la inmunidad a través de la liberación de metabolitos
inmunomoduladores como los ácidos grasos de cadena corta (AGCC).
Los rinovirus (RV) inducen enfermedades del tracto respiratorio superior y
precipitan las exacerbaciones del asma y la enfermedad pulmonar
obstructiva crónica a través de mecanismos poco conocidos.
Interacciones locales entre los SCFA y la inmunidad antiviral.
las respuestas en el tracto respiratorio no han sido investigadas
previamente.
Objetivo: Intentamos investigar si la manipulación de metabolitos
pulmonares a través de la administración de SCFA por vía pulmonar puede
modular la inmunidad antiviral a la infección por RV.
Métodos: Estudiamos los efectos de la administración intranasal de los AGCC
acetato, butirato y propionato en la expresión basal.

De a
el Laboratorio de Inmunología Clínica y Experimental – Pontificia Católica el Instituto Recibido para publicación el 2 de noviembre de 2021; revisado el 3 de agosto de 2022; aceptado para pub
b
Universidad de Rio Grande do Sul, Porto Alegre; Nacional del Corazón y los Pulmones el publicación el 9 de septiembre de 2022.
y C
Centro de Bacteriología Molecular e Infecciones, Departamento de Infecciosas d la Disponible en línea el 7 de octubre de 2022.
Enfermedad, Imperial College London, Londres; y Facultad de Ciencias Biomédicas Autor para correspondencia: Ana Paula Duarte de Souza, PhD, Escuela de Ciencias de la Salud y de
Farmacia, Universidad de Newcastle, Newcastle; y Mecanismos Centro de Asma del Reino Unido en
Es
la Vida, PUCRS, Porto Alegre 90610­000, RS, Brasil. Correo electrónico: ana.duarte@pucrs.br. O:
Alérgicos del Asma, Londres. Sebastian L. Johnston, MBBS, PhD, Instituto Nacional del Corazón y los Pulmones, Imperial College
*Estos autores contribuyeron igualmente a este trabajo. London, London W2 1PG, Reino Unido. Correo electrónico: s.johnston@imperial.ac.uk.
Este estudio fue apoyado por una beca de doctorado en el extranjero de la Coordenac¸~ao de El símbolo CrossMark notifica a los lectores en línea cuando se han realizado actualizaciones en
Aperfeic¸oamento de Pessoal de Nıvel Superior (CAPES, Brasil, código financiero 001) para el artículo, como erratas o correcciones menores.
KHA y profesor visitante en AS (CAPES Print 2020). WHRD P70587 y P79107 Reino Unido a SLJ 0091­6749
Declaración de posible conflicto de interés: Los autores declaran no tener ningún conflicto de 2022 Los autores. Publicado por Elsevier Inc. en nombre de la Academia Estadounidense de
interés relevante. Alergia, Asma e Inmunología. Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia CC BY
(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). https://
doi.org/10.1016/j.jaci.2022.09.026

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448 ANTUNAS ET AL
de firmas antivirales y de acetato en un modelo de ratón de infección por RV
y en líneas de células epiteliales de pulmón infectadas por RV.
Además, evaluamos los efectos del acetato, el butirato y el propionato
en la infección por RV en células epiteliales bronquiales primarias humanas
diferenciadas.
Resultados: administración de acetato intranasal inducida basal
regulación positiva de IFN­b, un efecto no observado con otros SCFA.
Expresión de RIG­I inducida por butirato. El tratamiento con acetato intranasal
de ratones aumentó el gen estimulado por interferón y la expresión de IFN­1
durante la infección por RV y redujo las cargas de virus pulmonares 8
horas después de la infección. Acetato mejoró las respuestas proinflamatorias
inducidas por virus con mucina pulmonar atenuada y expresión de IL­6
observada en el día 4 y 6 después de la infección. Este efecto potenciador
del interferón del acetato se confirmó en bronquios y alveolos humanos.
líneas de células epiteliales. En células epiteliales bronquiales primarias
diferenciadas, el tratamiento con butirato moduló mejor la expresión génica de
IFN­b e IFN­1 durante la infección por RV.
Conclusiones: Los SCFA aumentan la inmunidad antiviral y reducen la
carga viral y las respuestas proinflamatorias durante la infección por RV.
(J Allergy Clin Immunol 2023;151:447­57.)
Palabras clave: Rinovirus humano, interferones tipo I y tipo III, acetato,
respuesta antiviral, butirato, ácidos grasos de cadena corta, microbiota
Las comunidades residentes de bacterias presentes en las superficies de
las mucosas (microbiota) desempeñan un papel central en la homeostasis
inmunitaria y dictan la respuesta a afecciones inflamatorias e infecciosas,
como asma, colitis e infecciones bacterianas y virales.1­5 Metabolitos
bacterianos como los ácidos grasos de cadena corta (SCFA), principalmente
acetato, butirato y propionato, son ahora un vínculo bien reconocido entre
la microbiota intestinal y las células huésped.6,7 Estas moléculas se generan
a través del metabolismo de las fibras dietéticas por componentes de la
microbiota intestinal. Los SCFA tienen efectos tanto locales como sistémicos.
Modulan la activación y la función de las células inmunitarias a través de
mecanismos que incluyen la activación de los receptores acoplados a
proteína G (es decir, Gpr41, Gpr43 o Gpr109a) y la inhibición de las histonas
desacetilasas, y se ha demostrado que promueven la homeostasis de la
mucosa y la tolerancia oral.
Más recientemente, se ha descrito la existencia de microbiota dentro del
tracto respiratorio inferior, y la evidencia emergente indica que los comensales
respiratorios también son organismos metabólicamente activos capaces de
producir metabolitos con capacidad inmunomoduladora como los SCFA.8
Por lo tanto, los SCFA liberados localmente por los pulmones microbiota o
derivados de la microbiota intestinal pueden desempeñar un papel destacado
en la regulación de la inmunidad. Sin embargo, se desconoce el efecto
antiviral de los SCFA contra los rinovirus (RV).
Los vehículos recreativos son responsables de una enorme carga de
enfermedades infecciosas en todo el mundo, provocando resfriados leves
que remiten espontáneamente en personas sanas y precipitando
exacerbaciones en personas con enfermedades pulmonares crónicas como
el asma o la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Estas
enfermedades suponen costes económicos significativos para las
infraestructuras sanitarias de todo el mundo. Actualmente no existen terapias
efectivas o vacunas autorizadas para los RV, porque la gran variedad de
serotipos/cepas ha planteado desafíos importantes para la investigación.9
Por lo tanto, se necesita con urgencia el desarrollo de nuevos enfoques
preventivos y terapéuticos para las infecciones por RV. El microbioma
intestinal se puede manipular terapéuticamente para ofrecer un beneficio
clínico para las enfermedades infecciosas intestinales (p. ej., Clos tridium
difficile). El potencial para la administración de comensales respiratorios o
metabolitos asociados para aumentar de manera similar la inmunidad antimicrobiana
College
J ALLERGY CLIN IMMUNOL
FEBRERO 2023
Abreviaturas utilizadas
ALI: interfaz aire­líquido
LBA: lavado broncoalveolar
BEC: célula epitelial bronquial
EPOC: enfermedad pulmonar obstructiva crónica
ISG: gen estimulado por interferón
RSV: Virus sincitial respiratorio
RV: rinovirus
SCFA: Ácido graso de cadena corta
TCID50: 50 % de dosis infectiva de cultivo tisular
Hemos demostrado previamente que la administración de una dieta alta
en fibra o acetato, butirato y propionato de SCFA protegió a los ratones de la
infección por el virus respiratorio sincitial (RSV).5 La administración oral de
acetato indujo la producción de IFN­b y aumentó la expresión de interferón
estimulado. genes (ISG) en el pulmón durante la infección por RSV. Además,
encontramos que el acetato administrado directamente en las vías
respiratorias protege contra la infección por RSV a través del aumento de la
expresión de ISG en el pulmón.11 Por lo tanto, planteamos la hipótesis de
que la administración directa de acetato en el tracto respiratorio, para
aumentar las concentraciones locales de metabolitos microbianos, tendría
un beneficio similar. efectos protectores sobre la infección por RV. Aquí,
mostramos que la administración in vivo de acetato en ratones aumenta los
interferones antivirales tipo I y tipo III (IFN), reduce la replicación del RV y
atenúa la inmunopatología inducida por el virus. Al considerar la respuesta
antiviral in vitro de tipos de células específicas a una gama más amplia de
SCFA, encontramos que estos compuestos no afectan las respuestas de
IFN de los macrófagos alveolares y tienen efectos diferenciales en el epitelio,
con un efecto de refuerzo antiviral más prominente observado con butirato.
en comparación con otros SCFA, lo que sugiere que los efectos in vivo
pueden deberse a interacciones célula­célula más complejas. Estos datos
sugieren que la manipulación del medio de metabolitos microbianos
pulmonares podría representar un enfoque novedoso para la prevención o
el tratamiento de infecciones virales respiratorias.
MÉTODOS
Declaración de Ética
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Ley de animales de
1986 y las pautas de investigación con animales: informes de experimentos in vivo (ARRIVE),
siguiendo el protocolo aprobado por las pautas del Ministerio del Interior del Reino Unido
(licencia de proyecto del Reino Unido PPL no. P07D80C24).
Propagación y cuantificación de RV Para los estudios de líneas
celulares humanas y de ratón, se cultivó el serotipo A1 de RV del grupo menor (RV­A1) en
células Ohio HeLa (Colección Europea de Cultivos Celulares). Las células infectadas se
recolectaron después de 24 horas, y el virus se concentró y purificó y se realizó un ensayo
TCID50 (50 % de la dosis infectiva del cultivo de tejidos) para evaluar el título viral como se
describió anteriormente.12 Para los estudios de células epiteliales bronquiales primarias (BEC)
humanas , RV­A1 se propagó en células RD­ICAM­1 de un stock interno aislado de muestras
clínicas y se secuenció para confirmar la identidad. El RV­A1 se tituló infectando células RD­
ICAM­1 con RV­A1 diluido en serie, seguido de observaciones de los efectos citopáticos y el
ensayo TCID50 para evaluar el título viral.
Estudio con ratones
Se adquirieron ratones BALB/c hembra de seis semanas de edad en Harlan Laboratories
(Derby, Reino Unido) y se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos en el Imperial
pulmonar
sigue
de Londres (Reinosin explorarse.10
Unido). Los ratones fueron pretratados por vía intranasal con 50 mL de sodio
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J ALLERGY CLIN IMMUNOL ANTUNAS ET EN 449
VOLUMEN 151, NÚMERO 2

acetato, butirato o propionato (Sigma­Aldrich, St Louis, Mo) bajo anestesia ligera con
isofluorano. En algunos experimentos, los ratones se infectaron posteriormente por vía
intranasal con 50 ml de RV (5 x 106 TCID50) 24 horas más tarde. La dosis de tratamiento
con acetato fue de 20 mM según nuestro estudio previo utilizando el mismo abordaje.11
El tratamiento con acetato se administró por vía intranasal cada 24 horas después de la infección.
PCR cuantitativa en tiempo real El ARN total
del pulmón (100 mg de tejido pulmonar) y el lisado celular se extrajeron utilizando el kit
RNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Alemania) según las instrucciones del fabricante. El ADNc
se sintetizó utilizando cebadores de hexámeros aleatorios (kit OmniscriptRT, Qiagen). Se
usó ADNc de primera cadena para cuantificar copias de IFN­b, IFN­1, Viperin, MuC5AC
(ratón y humano), OAS1, RIG­I (Ddx58), MAVS, MDA­5 (ratón) y RV usando ensayos
Taqman con cebadores y sondas, como se informó anteriormente.13 Para la cuantificación
absoluta, cada gen se normalizó al nivel de ARNr 18s y las copias exactas del gen de
interés se calcularon utilizando una curva estándar generada por amplificación de ADN
plasmídico. Alternativamente, se usó 2­DDCt (cambio de pliegue) para calcular la expresión
génica. Las condiciones de PCR siguieron los protocolos TaqMan Universal PCR Master
Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass). El ensayo de expresión génica se realizó
utilizando StepOne (Applied Biosystems, Waltham, Mass).
Estudios in vitro en líneas celulares epiteliales
Se compraron BEC humanas (BEAS­2B) y células epiteliales pulmonares humanas
(A549) de ATCC (Manassas, Va) y se cultivaron como se describió anteriormente . .
Veinticuatro horas después de la siembra, las células se trataron con acetato de sodio 400
mM (Sigma­Aldrich) durante 24 horas más. Posteriormente, las células se infectaron con
RV­A1 (Multiplicidad de infección [MOI] 2) durante 1 hora, después de lo cual se eliminó
el virus, se lavaron las células y se añadió nuevo medio suplementado con FBS al 5%. Se
añadió más tratamiento con acetato (400 mM) inmediatamente después de la infección y
cada 24 horas hasta la recolección de células.
Recopilación de BEC primarios y aprobación ética
Se recolectaron BEC de un no fumador sano de cepillados bronquiales durante la
broncoscopia, con consentimiento informado por escrito. Todos los experimentos se
realizaron de acuerdo con las aprobaciones del Comité de Ética del Servicio de Salud
del Área de Hunter New England (08/05/10/3.09) y el Comité de Seguridad de la
Universidad de Newcastle (H­163­1205).

Reprogramación condicional de BEC y cultivos de interfaz aire­

líquido
Líquido de lavado broncoalveolar Los ratones se
Los BEC se reprogramaron condicionalmente con inhibidor de proteína quinasa
sacrificaron con una sobredosis de administración intraperitoneal de solución de
asociado a rho (concentración final 10 mM) y en combinación con fibroblastos NIH­3T3
pentobarbitona y se canularon las tráqueas. Los pulmones se lavaron 3 veces con PBS
irradiados en cultivos de monocapa como se describió anteriormente. (glucosa alta 1 L­
estéril. El líquido de lavado broncoalveolar (BAL) se centrifugó, el sobrenadante se recogió
glutamina)/Ham's F12 suplementado con FCS al 5 %, hidrocortisona (400 ng/ml), insulina
para medir el ADN de doble cadena y los sedimentos se suspendieron para el recuento
(5 mg/ml), factor de crecimiento epitelial humano recombinante (10 ng/ml), toxina del
diferencial y de células totales. Para el recuento diferencial de células, los portaobjetos de
cólera (8,4 ng/ml) mL), adenina (23,9 mg/mL) y penicilina estreptomicina al 0,2% . ALI)
citospín se tiñeron con May Grunwald­Giemsa y un investigador experimentado realizó el
durante 25 días como se describió previamente.17 Los experimentos se llevaron a cabo
procedimiento de recuento a ciegas.
con n 5 4 repeticiones biotécnicas. Se realizó tinción con azul alcián estándar, pH 2,5 y
ácido peryódico de Schiff en secciones de ALI de 5 mm de espesor para visualizar el
epitelio pseudoestratificado (consulte la Fig. E1 en el repositorio en línea de este artículo
en www.jacionline.org ) .
Medición de ADN de doble cadena El ADN de doble cadena se
midió en el fluido BAL utilizando el reactivo de ADN de doble cadena Quant­iT
PicoGreen (Invitrogen, Carlsbad, California) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Análisis histológico
Después del BAL, los pulmones se perfundieron con PBS a través del corazón y se Tratamiento SCFA en cultivo BEC
inflaron con paraformaldehído al 4 %, y luego el pulmón izquierdo se fijó en
Antes de la infección, los cultivos ALI se trataron basalmente con 100, 400 o 1600 mM
paraformaldehído al 4 % durante 24 horas. Posteriormente, las piezas se incluyeron en
de acetato, butirato o propionato durante 24 horas en 600 ml de medio final ALI compuesto
bloques de parafina y se cortaron en secciones de 5 mm, teñidas con hematoxilina y
por medio base epitelial bronquial y medio Eagle modificado por Dulbecco (proporción
eosina. El infiltrado inflamatorio se midió en micrómetros y se realizaron 10 mediciones,
50:50) que contenía hidrocortisona (0,1 %), insulina bovina (0,1 %), epinefrina (0,1 %),
comenzando desde el final del epitelio bronquial o vascular hasta el final del infiltrado
transferrina (0,1 %), extracto de hipófisis bovina (0,4 %) y etanolamina (80 mM), MgCl2
inflamatorio utilizando el software Olympus CellSens Standard (Olympus Corporation,
(0,3 mM), MgSO4 (0,4 mM ) , BSA (0,5 mg/ml), anfotericina B (250 mg/ml), ácido retinoico
Tokio, Japón). Todo el conteo se realizó ciego a las condiciones experimentales.
todo trans (30 ng/ml), penicilina/estreptomicina (2 %) y factor de crecimiento epitelial
humano recombinante (0,5 ng/ml) . El día de la infección, se reemplazó el medio basal
con nuevo medio final ALI y tratamiento SCFA, que se dejó hasta el análisis de punto final.

Citometría de flujo
Las células se aislaron del pulmón mediante perfusión con PBS y luego se digirieron
en medio RPMI 1640 complementado con 1 mg/ml de colagenasa IV (Invitrogen­Gibco,
Waltham, Mass). Las células aisladas del pulmón y BAL se incubaron con Mouse Fc Block
Infección por RV y muestreo Los cultivos de
(#553141 BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) durante 20 minutos. Las células se lavaron
ALI­BEC se infectaron apicalmente con RV­A1. Inicialmente, el stock de RV­A1 se
y tiñeron con anticuerpos de superficie anti­CD45 (1:200, #557235, clon 30­F11, BD
diluyó para obtener una MOI de 0,1 y se añadió a la superficie apical de los cultivos
Biosciences). Para la tinción intracelular, las células se fijaron con cytofix/cytoperm (BD
durante 2 horas en 50 ml de medio base epitelial bronquial con suplementos, insulina­
Bio sciences) y con anti­RIG­I (1:50, #35H2L48, ThermoFisher Scientific, Waltham, Mass)
transferrina­selenio al 1 % y ácido linoleico al 0,5 %. El medio de infección luego se
y después de la incubación, las células se marcaron con anticuerpo secundario anticonejo
reemplazó con 500 ml de medio base epitelial bronquial fresco (con suplementos) durante
de cabra. IgG H&L Cy3 conjugado (1:1000, # ab97075, Abcam, Cambridge, Mass). Las
el resto del experimento. Se recogieron muestras de lavado apical (100 ml de PBS) y de
muestras fueron adquiridas en el citómetro de flujo BD FACS Canto­II (BD Biosciences).
medios basales a las 8 y 48 horas después de la infección y se almacenaron a 280°C.
Los datos se analizaron en el software FlowJo (versión 10, Tree Star, Inc, Ashland, Va).
Las células se almacenaron en 350 ml de tampón RLT (Qiagen) que contenía 2­
mercaptoetanol al 1% a 280°C para análisis de expresión génica mediante PCR cuantitativa
en RT.
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450 ANTUNAS ET AL J ALLERGY CLIN IMMUNOL
FEBRERO 2023

FIG 1. El tratamiento con acetato in vivo a corto plazo induce IFN­b y reduce la carga viral y aumenta la expresión de IFN­b,
ISG e IFN­1 en el pulmón después de la infección por RV. A, Diseño experimental. B, Expresión de Ifnb1 en el homogeneizado
de pulmón detectada por PCR en tiempo real. C, niveles de proteína IFN­b en el homogeneizado de pulmón medidos por ELISA.
D, Diseño experimental. E y F, expresión de Ifnb1 detectada por qPCR en tiempo real (Fig. 1, E) y niveles de proteína IFN­b
en el BAL medidos por ELISA a las 8 horas posteriores a la infección (Fig. 1, F). G, expresión del gen Viperin y 2'­5' Oas en el
pulmón detectada por qPCR a las 8 horas después de la infección. H e I, expresión de Ifnl2 detectada por qPCR en tiempo real
(Fig. 1, H) y niveles de proteína IFN­1 en el BAL medidos por ELISA a las 8 horas posteriores a la infección (Fig. 1, I). J, RV
RNA en el pulmón detectado por qPCR en tiempo real a las 8 y 24 horas posteriores a la infección. K y L, expresión Ifnb1
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J ALLERGY CLIN IMMUNOL ANTUNAS ET AL 451
VOLUMEN 151, NÚMERO 2

Experimentos in vitro con macrófagos alveolares de ratón
Los ratones vírgenes se sometieron a un lavado broncoalveolar después del sacrificio,
como se detalla anteriormente pero con la adición de EDTA 2,5 mM. Las células recuperadas fueron
se resuspendió en medio RPMI al 10% y se sembró en placas de 96 pocillos a una densidad
de 5 x 104 células por pocillo. Las células se incubaron a 37° C con CO2 al 5% durante 2 horas
para permitir la adherencia de los macrófagos. Las células se trataron con acetato, butirato y
propionato de sodio a concentraciones de 100 y 400 mM durante 24 horas antes de infectarse
con RV­A1 (MOI 1,0). Se tomaron lisados celulares a las 8 y 24 horas para el análisis de
expresión génica corriente abajo.
Análisis estadístico Todos los
datos se presentan como media 6 SEM, y se consideró significativa una p inferior a 0,05.
Las comparaciones múltiples se realizaron mediante la prueba de Kruskal­Wallis (con la prueba
de comparación múltiple de Dunn como post hoc), y se aplicó la prueba de Mann­Whitney para
comparar 2 grupos experimentales. Los datos se analizaron usando las pruebas estadísticas
indicadas usando el software Prism 8.0 (GraphPad by Dotmatics, San Diego, California).
RESULTADOS
La administración de acetato, pero no de butirato o
propionato, mejora la expresión de IFN­b pulmonar basal en
estado estacionario en ratones
Determinar si la administración de SCFA in vivo tiene efectos
En función del tono inmunitario basal y la expresión del mediador antiviral en
estado estacionario, inicialmente administramos concentraciones equimolares
de acetato, butirato y propionato por vía intranasal en ratones (Fig. 1, A).
Encontramos que la administración de acetato aumentó la concentración de
proteína BAL IFN­b y también mostró una tendencia no significativa (P 5 0,052)
producción aumentada inducida por RV de concentraciones de IFN­12/3 en BAL
(tanto en estado estacionario como después de la infección por RV) (Fig. 1, I).
Este efecto potenciador antiviral temprano del acetato se acompañó de
cargas virales pulmonares reducidas en el mismo momento (Fig. 1, J). El
aumento antiviral fue transitorio, con efectos sostenidos observados solo para
la expresión de Ifnl2, pero no en IFN­b, ISG o cargas de virus (Fig. 1, KO) a las
24 horas posteriores a la infección. Esto puede deberse a la reducción inicial en
las cargas de virus a las 8 horas, lo que lleva a una reducción en la inducción
subsiguiente de IFN/ISG.
La inflamación de las vías respiratorias y la producción de moco pueden
impulsar la gravedad de la infección por RV.18,19 Por lo tanto, evaluamos si el
acetato tenía algún efecto posterior sobre las respuestas proinflamatorias
inducidas por virus en ratones. El tratamiento con acetato no tuvo un efecto
significativo sobre la inflamación celular de las vías respiratorias (células totales
de BAL, neutrófilos, macrófagos o linfocitos) a las 8 o 24 horas posteriores a la
infección (Fig. 1, P y Q). Tampoco hubo efecto del acetato sobre la quimiocina
de neutrófilos CXCL1, la citocina proinflamatoria IL­6 o las concentraciones de
ADN de doble cadena derivado de neutrófilos en BAL a las 8 o 24 horas
posteriores a la infección (Fig. 1, RU), lo que sugiere que las respuestas
inflamatorias iniciales no se ven afectados por el acetato.
Sin embargo, observamos una atenuación de las respuestas proinflamatorias
en puntos de tiempo posteriores, con una expresión reducida de IL­6 (ARNm y
concentraciones de proteína) en el día 4 después de la infección (Fig. 2, AC).
De acuerdo con nuestros hallazgos previos de que el IFN tipo I regula
negativamente la expresión principal de Muc5ac de la mucina de las vías
respiratorias durante la infección viral,13 también observamos que el acetato
redujo la inducción de Muc5ac por RV­A1 (Fig. 2, D) y también muestra una
tendencia hacia la expresión general de Muc5ac. infiltrado inflamatorio pulmonar
(Fig 2, EG). Sin embargo, no hubo efectos discernibles del acetato en los

hacia el aumento de la expresión de Ifnb1 pulmonar (Fig. 1, B y C).
Por el contrario, el butirato y el propionato no afectaron la expresión de ARNm
o proteína de IFN­b (Fig. 1, B y C). Estos datos indicaron que el acetato tiene
un efecto potenciador sobre la expresión de IFN de tipo I basal que no se
observa para otros SCFA.
recuentos de células de las vías respiratorias totales o diferenciales (células
totales de BAL, neutrófilos, macrófagos o linfocitos) a los 4 días posteriores a la
infección (Fig. 2, H) y tampoco ningún efecto sobre los mediadores inmunitarios antivirales o
(Fig. 2, IK), lo que sugiere que los efectos tempranos en estos parámetros
pueden conducir a consecuencias posteriores retrasadas.

El tratamiento con acetato in vivo aumenta la expresión de IFN,
reduce la replicación viral y atenúa la inflamación pulmonar.
MUC5AC durante la infección por RV en ratones
Habiendo observado que el acetato induce IFN tipo I en estado estacionario,
a continuación estudiamos los efectos antivirales de la administración de acetato
en las vías respiratorias en un modelo de ratón con infección por RV que, según
informamos anteriormente, recapitula fielmente la respuesta innata a la infección
humana.12 Los ratones recibieron acetato . (20 mM) por vía intranasal 24 horas
antes y durante la infección con RV­A1 (5 3 106 TCID50), e inicialmente nos
enfocamos en la respuesta innata temprana a las 8 y 24 horas (Fig. 1, D).
Aunque el acetato no tuvo ningún efecto significativo sobre la inducción de RV
del ARNm de Ifnb1 de pulmón o la proteína BAL IFN­b (Fig. 1, E y F), sí
observamos que el acetato potenció la inducción de ISG Viperin, con tendencias
hacia la mejora de OAS1 e Ifnl2. ARNm (Fig. 1, G y H). También encontramos
que el acetato
El tratamiento con acetato aumenta la respuesta antiviral que afecta la
carga viral de RV­A1 en líneas celulares epiteliales pulmonares humanas.
A continuación, investigamos
si el acetato tenía efectos similares en células epiteliales respiratorias
cultivadas, el sitio principal de la replicación viral inicial. Las células epiteliales
alveolares A549 se trataron con acetato en concentraciones conocidas por
reducir la replicación de otros virus (RSV)5 y se infectaron con RV­A1 (consulte
la figura E2, A, en el repositorio en línea de este artículo en www.jacionline.org).
El tratamiento con acetato aumentó la expresión del ARNm de IFNB1 4 horas
después de la infección pero no tuvo efecto sobre IFNL2 (IL­28A) o el gen
Viperin estimulado por IFN (Fig. E2, B). El efecto del acetato fue de corta
duración y no se observaron diferencias a las 8 horas (Fig. E2, B). El aumento
de IFNB1 por acetato ocurrió solo con virus replicantes vivos, porque no se
observó ningún efecto cuando RV­A1 inactivado con ultravioleta

=
detectado por qPCR en tiempo real (Fig. 1, K) y niveles de proteína IFN­b en el BAL medidos por ELISA a las 24 horas
posteriores a la infección (Fig. 1, L). Expresión del gen M, Viperin y 2'­5' Oas en el pulmón detectada por qPCR a las 24
horas después de la infección. N y O, expresión de Ifnl2 detectada por qPCR en tiempo real (Fig. 1, N) y niveles de
proteína IFN­1 en el BAL medidos por ELISA a las 24 horas posteriores a la infección (Fig. 1, O). P y Q, número total de
células y recuento diferencial de células presentes en el BAL. R, Cuantificación de dsDNA en el sobrenadante de BAL. S,
niveles de proteína CXCL1/KC en el LBA medidos por ELISA a las 8 y 24 horas después de la infección. T y U, expresión
de IL­6 detectada por qPCR en tiempo real (Fig. 1, T) y niveles de proteína IL­6 en el BAL medidos por ELISA a las 24
horas posteriores a la infección (Fig. 1, U). dsDNA, ADN de doble cadena; qPCR, PCR cuantitativa. Los datos se presentan
como media 6 SEM. Los datos en la Fig. 1, AC, son de 1 experimento (n 5 4). Los datos en la Fig. 1, DI y P, son de 1
experimento (n 5 5). Los datos en la figura 1, JU, son de 2 experimentos independientes (n 5 10). La significancia
estadística entre grupos se determinó con la prueba de Kruskal­Wallis. *p < 0,05. **P < 0,01.
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452 ANTUNAS ET AL J ALLERGY CLIN IMMUNOL
FEBRERO 2023

FIG 2. La exposición prolongada al acetato reduce la producción de IL­6 y la expresión del ARNm de Muc5AC en el pulmón
durante la infección por RV. A, Diseño experimental. B y C, expresión de Il6 detectada por qPCR en tiempo real (Fig. 2, B)
y niveles de proteína IL­6 en el BAL medidos por ELISA el día 4 después de la infección (Fig. 2, C). D, Expresión de ARNm
de Muc5ac en el pulmón detectada por qPCR en los días 4 y 6 posteriores a la infección. E, hematoxilina representativa y
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J ALLERGY CLIN IMMUNOL
VOLUMEN 151, NÚMERO 2
se administró (Fig E2, C). De acuerdo con los efectos inmunológicos antivirales
aumentados, el acetato tendió a reducir el número de copias de ARN viral (Fig.
E2, D) y redujo las cargas de virus vivos (Fig. E2, E) a las 48 horas posteriores a
la infección. En células BEAS2B, una línea BEC, observamos que el tratamiento
con acetato aumentó la expresión de ARNm de IFNB1 a las 8 horas después de
la infección y de ARNm de IFNL2 a las 4 y 8 horas después de la infección ( Fig.
E2, F). No hubo un efecto significativo sobre la expresión de Viperin (Fig. E2, F).
En contraste con los efectos sobre las cargas de virus observados en las células
A459, no hubo efecto del acetato sobre el ARN viral o la cuantificación de TCID50
en las células BEAS2B (Fig. E2, G y H).
Efecto del tratamiento con SCFA sobre las respuestas antivirales en
Cultivos infectados con ALI­BEC
Habiendo observado un efecto potenciador del acetato en las líneas de células
epiteliales pulmonares, a continuación buscamos evaluar los efectos en un modelo
de células epiteliales primarias diferenciadas en ALI (un sistema experimental que
recapitula más fielmente las células in vivo). La diferenciación celular y la
morfología se confirmaron mediante la formación de células goblet (tinción con
ácido peryódico de Schiff) (Fig. E1).
El acetato aumentó significativamente IFNB1 e IFN12/3 (IL28) en BEC
infectadas con RV en comparación con las células no infectadas (Fig. 3, B y D),
pero no hubo diferencia en comparación con las células infectadas con RV no
tratadas. El acetato tendía a reducir el ARN viral a las 8 horas oa las 48 horas
después de la infección con RV­A1 (Fig. 3, A y B).
Dado que el acetato tenía efectos potenciadores menos claros sobre la inducción
del RV de respuestas de IFN tipo I en células epiteliales diferenciadas primarias,
ampliamos nuestras investigaciones para determinar si la tasa de butilo o el
propionato tenían efectos perceptibles. El butirato y el propionato también
aumentaron la expresión del ARNm de IFNb, IFN12/3 (IL28) e IFN11 (IL29) en
comparación con las células no infectadas ( Fig. 3, F, G, H y L). El tratamiento con
butirato aumentó la expresión de IFNB1, IL28 e IL29 a las 48 horas después de la
infección por RV en comparación con las células infectadas por RV no tratadas,
aunque este efecto no fue suficiente para tener un impacto en la carga viral (Fig.
3, I, J , K , y yo). No encontramos ningún efecto supresor sobre la expresión de
MUC5AC inducida por RV en ninguna dosis de tratamiento con SCFA (consulte la
Fig. E3, AC, en el repositorio en línea de este artículo en www.jacionline.org ). En
conjunto, estos datos indican que, en contraste con los datos en ratones y líneas
celulares humanas, los SCFA tienen efectos más limitados sobre la inmunidad
antiviral en células epiteliales primarias diferenciadas.
Ningún efecto de los SCFA en las respuestas de IFN tipo
I en macrófagos alveolares
Para investigar si el efecto antiviral del acetato y/u otros SCFA se debió a la
modulación de los macrófagos alveolares (una de las principales células de
respuesta temprana durante las infecciones virales y una fuente clave de IFN tipo
I), evaluamos el efecto de la administración de SCFA sobre los antivirales ex vivo.
respuestas en macrófagos estimulados con RV A1. Encontramos que la
administración de SCFA no tuvo un efecto significativo en la inducción de Ifnb1,
Viperin u OAS1 por RV, lo que indica que
=
Imágenes de tejido pulmonar teñidas con eosina (H&E). Las puntas de flecha negras apuntan al infiltrado de células
inflamatorias. Barras de escala 5 10 mm. F y G, puntaje inflamatorio peribronquial y perivascular de portaobjetos de histología
pulmonar. H, Número total de células y recuento diferencial de células presentes en el BAL. Expresión génica de I y J, Ifnb1 y
Viperin en el pulmón detectada por qPCR en tiempo real el día 4 después de la infección. K, RV RNA en el pulmón detectado
por qPCR en tiempo real en los días 4 y 6 posteriores a la infección. qPCR, PCR cuantitativa. Los datos se presentan como
media 6 SEM. Los datos son de 2 experimentos independientes (n 5 5­10). La significancia estadística entre grupos se
determinó con la prueba de Kruskal­Wallis. *p < 0,05. **P < 0,01.
ANTUNAS ET AL 453
los efectos de estimulación inmunológica de los SCFA no se producen a través
de los efectos sobre los macrófagos alveolares (consulte la figura E4, AC, en el
repositorio en línea de este artículo en www.jacionline.org).
Los receptores de detección de IFN­b y virus aumentados de SCFA administrados
por vía aérea antes de la infección por RV Para obtener una
visión mecánica adicional de las vías antivirales involucradas en la mejora del
IFN tipo I por SCFA, a continuación investigamos los efectos de estos compuestos
en los genes de detección de vías antivirales. Nuevamente administramos por vía
intranasal los 3 SCFA (acetato, butirato y propionato) a concentraciones de 20
mM, durante 24 horas (Fig . 4, A). No encontramos ningún efecto de ninguno de
los SCFA sobre la expresión del sensor de ARN viral citosólico MDA 5 o su
molécula adaptadora MAVS (Fig. 4, B y C). Por el contrario, la administración de
butirato (pero no otros SCFA) aumentó la expresión del ARNm de RIG I (Fig. 4,
D). Se encontró que el efecto de aumento del butirato en la expresión de RIG­I
estaba específicamente dentro de las células epiteliales/estromales de pulmón
(CD452), sin que se observara ningún efecto dentro de las células inmunitarias
hematopoyéticas (CD451) (Fig. 4, EI). En conjunto, estos datos indicaron que
diferentes SCFA pueden estar actuando a través de vías específicas de detección
antiviral para regular la inmunidad innata.
DISCUSIÓN
Este estudio brinda una nueva perspectiva sobre el beneficio potencial de
administrar metabolitos microbianos directamente en las vías respiratorias para
aumentar la inmunidad innata pulmonar. Las fibras dietéticas y los SCFA derivados
de la microbiota intestinal se han asociado durante mucho tiempo con efectos
beneficiosos sobre la salud pulmonar. Un ensayo aleatorio controlado con placebo
mostró que el uso de prebióticos (fibras) en bebés prematuros previno las
infecciones por RV en el primer año de vida.20 Las fibras dietéticas son
polisacáridos no digeribles que pueden degradarse a SCFA por fermentación
microbiana. Los estudios también han encontrado que los SCFA pueden modular
la microbiota intestinal sana.21 Nuestro estudio destaca que la administración de
SCFA en el tracto respiratorio también puede tener efectos beneficiosos locales
directos sobre las respuestas del huésped.
Hemos identificado un mecanismo distinto de los efectos mediados por la dieta en
la microbiota que involucra la estimulación pulmonar directa de la inmunidad
antiviral innata por SCFA.
Nuestros datos muestran que la administración del acetato SCFA
aumenta la expresión basal de mediadores inmunitarios antivirales en estado
estacionario. Esto encaja conceptualmente con el papel del acetato en la
preparación de los pulmones para una liberación temprana más robusta de IFN.
Esto fue respaldado por nuestros hallazgos de que la administración de acetato
también impulsó la inducción de IFN e ISG en respuesta a la infección por RV en
ratones. Esto se asoció con cargas de virus reducidas y una supresión posterior
de las respuestas proinflamatorias y la producción de moco.
Todos estos efectos se considerarían beneficiosos en el contexto de una infección
viral aguda. Nuestros datos concuerdan con un cuerpo de literatura que muestra
que el acetato se ha implicado en proporcionar una amplia gama de beneficios
para la salud, como la mejora de la función cardíaca, la mejora de la generación
de glóbulos rojos y la memoria inmunológica.
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454 ANTUNAS ET AL J ALLERGY CLIN IMMUNOL
FEBRERO 2023

FIG 3. El tratamiento con acetato no induce una respuesta antiviral en BEC primarios infectados con RV­A1. Antes de la
infección, los cultivos ALI se trataron basalmente con 100, 400 o 1600 mM de acetato, butirato o propionato durante 24 horas
en 600 ml de medio ALI. Posteriormente, los cultivos de ALI­BEC se infectaron apicalmente con RV­A1 y las muestras de
medios basales se recolectaron a las 8 y 48 horas después de la infección. A, C, E, G, I y K, niveles de ARN de RV a las 8 y
48 horas posteriores a la infección analizados por qPCR en tiempo real. B, D, F, H, J y L, expresión génica de IFNB1, IL28
(IFN1 2/3) e IL29 (IFN1 1) a las 8 y 48 horas posteriores a la infección mediante qPCR en tiempo real. qPCR, PCR cuantitativa.
Los datos se presentan como media 6 SEM. La significancia estadística entre grupos se determinó con la prueba de Kruskal­Wallis. *p < 0,05.
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J ALLERGY CLIN IMMUNOL ANTUNAS ET AL 455
VOLUMEN 151, NÚMERO 2

FIG 4. Los SCFA administrados por las vías respiratorias regulan la expresión de RIG­I de detección de virus antes de la infección
en los pulmones. A, Diseño experimental. Expresión de BD, Mavs, Ifih1 (gen MDA­5) y Ddx58 (gen RIG­I) detectada por PCR
en tiempo real. E, Estrategia de activación del aislamiento de la población de células ( células inmunitarias hematopoyéticas
CD451; células epiteliales/estromales CD452) mediante citometría de flujo. F, Gráficos representativos de citometría de flujo de
poblaciones de CD451RIG­I1 . G, porcentaje e intensidad de fluorescencia mediana de RIG­I dentro de las células CD451. H,
Gráficos representativos de citometría de flujo de poblaciones de CD452RIG­I1 . I, Porcentaje e intensidad de fluorescencia
mediana, de RIG­I dentro de células CD452. Los datos se presentan como media 6 SEM. La significación estadística entre los
grupos se determinó con la prueba de Kruskal­Wallis. *p < 0,05.

formación22. Además, el acetato está claramente relacionado con la
modulación de diferentes funciones de la respuesta inmune23­25 y el control
de enfermedades respiratorias26.
También estudiamos el efecto de la administración de acetato en la
infección del epitelio por RV porque es el sitio principal de la replicación
inicial del virus. Encontramos un efecto de refuerzo antiviral similar del
acetato en líneas celulares pulmonares humanas, con efectos más potentes
observados en células A549 que en células BEAS­2B (que se sabe que
expresan niveles basales más altos de IFN e ISG).27,28 Esto podría explicar
parcialmente por qué el tratamiento con acetato tuvo efectos menores en las
células BEAS­2B. Por el contrario, observamos que en BEC primarios
humanos diferenciados (ALI­BEC), no hubo un efecto claro del acetato en
las respuestas de IFN tipo I a RV. Además, también evaluamos la capacidad
del acetato y otros SCFA para modular las respuestas de IFN tipo I en
macrófagos alveolares cultivados ex vivo y, de manera similar, no
encontramos ningún efecto. Esta discordancia entre in vivo e in vitro
hallazgos pueden sugerir que múltiples tipos de células y células
Las comunicaciones pueden ser responsables del fenotipo claro observado
in vivo, observándose un efecto menos potente cuando las células aisladas
se tratan con AGCC.
Aunque el enfoque principal de nuestro estudio fue evaluar los efectos de
SCFA en la inmunidad antiviral innata, es concebible que puedan ocurrir
efectos posteriores en las respuestas inmunitarias adaptativas, y los estudios
futuros pueden centrarse en los efectos potenciales en las poblaciones y la
producción de linfocitos T y B. de anticuerpos neutralizantes.
También cabe señalar que el modelo de ratón que utilizamos es uno
donde ocurre una replicación del virus relativamente limitada (;24­36 horas),
aunque todos los puntos finales medidos son claramente dependientes de
la replicación . efectos sostenidos. Además, nuestros experimentos se
realizaron exclusivamente en ratones hembra, y estudios posteriores
deberían confirmar si se producen efectos similares en los machos.
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456 ANTUNAS ET AL
Aunque el acetato tuvo efectos limitados en ALI­BEC, observamos que la
administración de butirato podría aumentar la inducción de respuestas de IFN
tipo I por parte del RV. Estos datos contrastan con el estudio de Chemudupati
et al30 , que demostró un efecto supresor del butirato sobre las respuestas de
IFN tipo I. Sin embargo, este estudio utilizó concentraciones mucho más altas
de butirato y también se centró en diferentes virus respiratorios.
La producción de mucosidad en los pulmones es una característica de la
infección por RV, que conduce a una mayor gravedad clínica y exacerbación
del asma y la EPOC,31,32 específicamente a través del aumento de MUC5AC
en la inflamación de las vías respiratorias.33 Mostramos que el tratamiento con
acetato redujo la expresión de Muc5AC en los pulmones en los días 4 y 6 post
infección. En consecuencia, se ha demostrado que los SCFA atenúan la
producción de moco en los pulmones durante la infección por influenza34 y la
inflamación alérgica de las vías respiratorias.34,35 Sin embargo, en las células
ALI­BEC, el acetato no moduló la expresión del gen Muc5AC, aunque se debe
tener en cuenta que los puntos de tiempo posteriores fueron no examinado
Nuestra observación de expresión reducida de mucina en ratones tratados
con acetato e infectados con virus está en consonancia con nuestros hallazgos
previos de que el IFN tipo I regula negativamente la expresión principal de
Muc5ac de mucina en las vías respiratorias durante la infección por virus.14
Los mecanismos moleculares a través de los cuales esto ocurre son poco
claro, aunque la evidencia previa muestra que la inflamación de tipo 2 mediada
por IL­13 puede ser importante en la inducción de MUC5AC.36,37 Los estudios
adicionales deben tratar de comprender de manera más integral cómo el
acetato puede afectar la producción de moco en las vías respiratorias.
Para estudiar los mecanismos moleculares a través de los cuales los SCFA
inducen IFN, también medimos la expresión de genes de detección de vías
antivirales. Observamos que el butirato, y en menor medida el acetato, pueden
inducir la expresión de RIG­I en células epiteliales de pulmón de ratones
ingenuos. Nuestros datos sugieren que estos SCFA están aumentando la
respuesta de detección de virus, preparando los pulmones para una respuesta
innata aumentada a una infección por virus.
En las células epiteliales de las vías respiratorias tanto en el asma como en
la EPOC se ha demostrado una producción alterada de IFN tipo I ex vivo para
la infección por RV.38,39 Se postula que este defecto aumenta la susceptibilidad
a las exacerbaciones inducidas por virus en estos individuos. el mecha
Se desconocen los mecanismos que impulsan estos defectos. Se necesita
más trabajo utilizando modelos de animales o sistemas de cultivo de células
enfermas para determinar si la disbiosis microbiana observada en el asma y la
EPOC conduce a una deficiencia relativa de acetato u otros SCFA, que podría
corregirse mediante la administración para restaurar la inmunidad antiviral
deteriorada.
En resumen, el uso de SCFA como tratamiento contra la infección por RV
está asociado con el aumento de la producción de IFN tipo I y tipo III,
componentes centrales de la respuesta inmune antiviral pulmonar. Este estudio
destaca que la administración vía aérea de metabolitos microbianos como
SCFA puede tener efectos beneficiosos sobre la inmunidad antiviral y podría
mejorar potencialmente la gravedad de las enfermedades virales respiratorias.
Damos las gracias a Sasha Ashbourne­Lewis de asistencia técnica.
Mensaje clave
d El tratamiento con SCFA aumenta la respuesta antiviral contra la infección por RV; el
tratamiento con acetato reduce la producción de IL­6 y MUC5AC mediada por virus
en el pulmón.
J ALLERGY CLIN IMMUNOL
FEBRERO 2023
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J ALLERGY CLIN IMMUNOL ANTUNES Y AL 457.e2
VOLUMEN 151, NÚMERO 2

FIGURA E1. Caracterización de cultivos ALI­BEC. El transwell de ALI no infectado se fijó con formalina y se incrustó en
parafina como se describió anteriormente. E1 Azul alcián estándar, pH 2,5 y tinción con ácido peryódico de Schiff (AB/
PAS) se realizó en secciones de ALI de 5 mm de espesor para visualizar el epitelio pseudoestratificado.
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457.e3 ANTUNES Y OTROS J ALLERGY CLIN IMMUNOL
FEBRERO 2023

figura E2. El tratamiento con acetato induce IFN­b en líneas de células epiteliales pulmonares humanas infectadas con RV­A1.
A, Diseño experimental de celdas A549 y BEAS2B. AE, Análisis realizado en células A549. B, expresión de ARNm de IFNB1,
IFNL2 y Vi perin a las 4 y 8 horas posteriores a la infección mediante qPCR en tiempo real. C, expresión génica de IFN­b, IFN­1
y viperina a las 4 horas posteriores a la infección con RV1B inactivado por UV al que se accedió mediante qPCR en tiempo real.
D, niveles de ARN del RV a las 24 y 48 horas posteriores a la infección analizados mediante qPCR en tiempo real. E, Efecto
citopático viral de 24 y 48 horas después de la infección accedido por el ensayo TCID50. FH, análisis realizado en células A549.
Expresión génica de F, IFNB1, IFNL2 y Viperina a las 4 y 8 horas posteriores a la infección mediante qPCR en tiempo real. G,
niveles de ARN del RV a las 24 y 48 horas posteriores a la infección analizados mediante qPCR en tiempo real. H, Efecto
citopático viral de 24 y 48 horas después de la infección accedido por ensayo TCID50. qPCR, PCR cuantitativa. Los datos se
presentan como media 6 SEM. Los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron al menos dos veces cada uno. La
significación estadística entre grupos se determinó con la prueba de Kruskal­Wallis, excepto en D y E, en los que se utilizó la
prueba de Mann Whitney. *p < 0,05.
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J ALLERGY CLIN IMMUNOL ANTUNES Y AL 457.e4
VOLUMEN 151, NÚMERO 2

Figura E3. Expresión de MUC5AC en cultivo ALI­BEC. Antes de la infección, los cultivos ALI se trataron basalmente con
100, 400 o 1600 mM de acetato, propionato o butirato durante 24 horas en 600 ml de medio ALI. Posteriormente, los
cultivos ALI BEC se infectaron apicalmente con RV­A1 y las muestras de medios basales se recolectaron a las 8 y 48
horas posteriores a la infección. AC, expresión del gen MUC5AC a las 8 y 48 horas posteriores a la infección mediante
qPCR en tiempo real. qPCR, PCR cuantitativa. Los datos se presentan como media 6 SEM. La significancia estadística
entre grupos se determinó con la prueba de Kruskal­Wallis.
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457.e5 ANTUNES ET AL J ALLERGY CLIN IMMUNOL
FEBRERO 2023

Figura E4. El tratamiento ex vivo con SCFA no modula la expresión de IFN tipo I e ISG en macrófagos
alveolares. Se tomaron ratones sin tratar y sus macrófagos BAL (5 x 104 células/pocillo) se recolectaron y
cultivaron ex vivo. El cultivo se trató con acetato (A), butirato (B) y propionato (C) durante 24 horas (100 y 400
mM) y luego se infectó con RV1B. Los lisados celulares se tomaron a las 8 y 24 horas y se analizaron mediante
qPCR. Expresión de A, B y C, Ifnb1, Viperin y 2'­5'Oas detectada por PCR en tiempo real. qPCR, PCR
cuantitativa. Los datos se presentan como media 6 SEM. La significancia estadística entre grupos se determinó
con la prueba de Kruskal­Wallis.