SECRETARÍA DE LA DEFENSA NACIONAL

DIRECCIÓN GENERAL DE EDUCACIÓN MILITAR Y

RECTORÍA DE LA UNIVERSIDAD DEL EJÉRCITO Y FUERZA AÉREA

ESCUELA MILITAR DE MEDICINA

TESIS:

Evaluación de la respuesta de anticuerpos IgG e IgA específicas contra péptidos diseñados

bioinformáticamente a partir de la hemaglutinina del virus de la influenza AH1N1

PRESENTADO POR:
SUBTTE. PAS. MED. JUAN ANTONIO AVENDAÑO PONCE.
SUBTTE DE SND PAS. MED. DAVID ALEXANDER RODRÍGUEZ
BECKER.

ENERO 2023
 ÍNDICE

TÍTULO DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN................................................................................1

INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………………………………
……………………5

PLANTEAMIENTO DEL
PROBLEMA……………………………………………………………………………..6

IMPORTANCIA DE LA INVESTIGACIÓN
……………………………………………………………………………..8

JUSTIFICACIÓN………………………………………………………………………………………………
……………………..9

VIABILIDAD……………………………………………………………………………………………………
……………………..10

OBJETIVO DE
ESTUDIO………………………………………………………………………………………………………..1
1

HIPÓTESIS………………………………………………………………………………………………………
……………………..12

VARIABLES……………………………………………………………………………………………………
………………………13

OBJETIVOS.
……………………………………………………………………………………………………………………
…….14

TIPOS DE
INVESTIGACIÓN………………………………………………………………………………………………
…..15

TECNICAS E
INSTRUMENTOS……………………………………………………………………………………………..1
6

POBLACIÓN……………………………………………………………………………………………………
…………………….19

MUESTRA………………………………………………………………………………………………………
……………………..20

CRONOGRAMA DE
ACTIVIDADES………………………………………………………………………………………21

FUENTES DE
CONSULTA…………………………………………………………………………………………………….2
2
 TÍTULO DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN

Evaluación de la respuesta de anticuerpos IgG e IgA específicas contra péptidos

diseñados bioinformáticamente a partir de la hemaglutinina del virus de la
influenza AH1N1

RESPONSABLES DE ASESORES

MMC. Karen Medina Quero

ASESOR DE CONTENIDO
MMC. Karen Medina Quero

ASESOR METODOLÓGICO
Dr. Arturo Contis Montes de oca
 INTRODUCCIÓN

Propósito
El funcionamiento racional del estudio consiste evaluar la respuesta inmune de péptidos
diseñados bioinformáticamente que sean capaces de generar anticuerpos y reconocer distintos
tipos de hemaglutininas del virus de la influenza AH1N1 que pueda servir de base para el diseño
de una vacuna universal.

Elementos Centrales
La Hemaglutinina (HA) es una proteína situada en la membrana del virus. Es la más
importante puesto que los subtipos dependen de la variación de los aminoácidos que lo forman.

La Neuraminidasa (NA) es otra proteína en la membrana viral, existen 11 tipos (N1-N11),

siendo N1 y N2 las más comunes

Cuando se presenta un reordenamiento en los genes, se produce un cambio en la cubierta

antigénica viral, por lo tanto, la respuesta de anticuerpos contra un tipo viral no es efectiva para
otro. Es este el motivo por el cual se desarrollan y aplican vacunas de influenza de manera anual
con los principales subtipos virales circulantes.

CAPÍTULO I. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Descripción del problema

La influenza es una enfermedad respiratoria que es provocada por el virus de la influenza
perteneciente a la familia Orthomyxoviridae del cuál se conocen 3 serotipos: Influenza A, B e
5
influenza C. siendo el primero el más importante como causa de enfermedad.

El virus de la influenza A tiene una forma esférica, su envoltura deriva de la parte de la membrana
plasmática celular, en la cual se ubican 3 proteínas de membrana, las cuales son, Hemaglutinina
(HA), Neuraminidasa (NA) y el Canal iónico (M2).
El genoma del virus se encuentra segmentado en ocho fragmentos de ARN Monocatenario en
sentido negativo, el cual, codifica para las proteínas PB1, PB2 y PA (polimerasas), Hemaglutinina
(HA), Nucleoproteína (NP), Neuraminidasa (NA), proteína de matriz (M1) y proteína de canal iónico
(M2), así como proteínas no estructurales (NS1 y NS2).

Existen diferentes subtipos de influenza A, los cuales están determinados según el subtipo de HA
y NA que presenta el virus en su estructura, actualmente se conocen alrededor de 18 subtipos de HA
(H1-H18) y 11 de NA (N1-N11), pero solo 3 subtipos de HA (H1, H2 y H3) y 2 de NA (N1, N2)
presentan uniones estables en la población humana.

La HA de los virus de influenza humana se une al ácido siálico α 2-6-Galactosa, que están
presentes en el epitelio respiratorio superior.

6
 Después de la infección viral se generan anticuerpos séricos del subtipo IgG de memoria y
defensa, los RNA virales (polimerasas) se hacen resistentes ante dichos anticuerpos, esto debido a
la capacidad de realizar la transcripción de hay NA que origina nuevas cepas del virus, este
proceso es conocido como drift antigénico y es la razón por la que se producen epidemias anuales
y por lo que se deben generar vacunas nuevas continuamente.

El cerdo y las aves son especies de animales que también infecta el virus y estos actúan como
hospederos intermediarios, mezclando y ampliando el potencial zoonótico del virus, dando pie a
cambios importantes en las proteínas virales hay NA, este proceso es conocido como shift
antigénico.

La presente investigación parte de realizar múltiples alineaciones en las secuencias de

aminoácidos de la Hemaglutinina (Ha) de los diferentes subtipos de Virus de la influenza A (IAV),
con la finalidad de desarrollar péptidos que se encuentre conservado entre los distintos tipos y a la
vez sea capaz de generar anticuerpos específicos con capacidad neutralizante frente a las diversas
hemaglutininas de los virus circulantes, todo esto bajo ensayos inmunoenzimáticos post
inmunización.

Del cual se deriva a la siguiente pregunta de investigación:

Pregunta de investigación

¿Los péptidos diseñados bioinformáticamente a partir de la hemaglutinina del virus de la influenza

generarán una respuesta de anticuerpos específica capaz de reconocer los diferentes tipos de
hemaglutininas víricas en modelos de conejo y ratón?

7
 CAPÍTULO II. IMPORTANCIA

El presente trabajo de investigación busca determinar si se presenta una respuesta inmunogénica

de los anticuerpos IgG e IgA contra los péptidos bioinformáticamente diseñados a partir de
modificaciones en los epítopos del virus de la influenza A, mediante el uso de Inmunoensayos.
La importancia de esta investigación es que se busca apoyar los estudios de investigación en
torno al desarrollo de una vacuna universal para el virus de la influenza A, dicho ha sido el
responsable de múltiples epidemias a lo largo de la historia antigua y moderna reciente, la causa
de esto se debe a la elevada tasa de replicación y recombinación, proceso conocido como shift
antigénico, que le confiere dichas características para generar nuevos subtipos de virus cada año.
Tiene una importante necesidad sanitaria a nivel mundial.

8
 CAPÍTULO III. JUSTIFICACIÓN
En la actualidad, las epidemias causadas por el virus de la influenza A representan un problema de
salud pública a nivel mundial debido a que han provocado diversas epidemias a lo largo de la
historia, resultado de su alta capacidad para generar nuevos subtipos de virus cada año.

“Cambios en la hemaglutinina (H) y en la neuroaminidasa (N) se observaron en las distintas

epidemias:

 1933: H1N1
 1957: H2N2 (gripe asiática)
 1968: H3N2 (gripe de HongKong)
 1977: reaparición de H1N1 (gripe rusa).”
(Rev Chil Infect 2004; 21 (2): 162-164).

En mayo de 2009 México tuvo una alerta de epidemia del virus de la influenza tipo A(H1N1) (gripe
A) que mantuvo a la población de la Ciudad de México en cuarentena.
En el presente trabajo se seleccionaron péptidos diseñados bioinformáticamente a partir de los
epítopos del virus de la influenza A H1N1 aislado en México en el 2009 y se evaluará el nivel de
respuesta inmunogénico de los anticuerpos IgG e IgA contra estos péptidos, en muestras de suero
de conejos y ratones inmunizados con el péptido diseñado.

Beneficio institucional
El contribuir a la línea de investigación para el desarrollo de una vacuna que pueda ser capaz de
reconocer las distintas variantes de hemaglutininas del virus y así evitar formular vacunas anuales
con los virus circulantes, el beneficio a nivel institucional se consigue al disminuir la vacunación
constante y poder generar una vacuna capaz de evitar infecciones por el virus de la influenza A de
distintas variantes, viéndose reflejados los resultados a largo plazo en una mayor calidad de vida
para los integrantes de las fuerzas armadas y sus derechohabientes.

9
 CAPÍTULO IV. VIABILIDAD
El presente trabajo de investigación es concebido como viable, esta afirmación está respaldada
por los recursos con los que se disponen en términos de materiales, reactivos, instalaciones como
laboratorios, siendo estos, el laboratorio de inmunología de la Escuela Militar de Graduados de
Sanidad, el Bioterio de la Escuela Militar de Medicina y el laboratorio de inmunología de la
Escuela Superior de Medicina del Instituto Politécnico Nacional.

Recursos humanos tecnológicos y materiales

Para el presente protocolo se cuenta con los recursos necesarios para llevar a cabo la investigación
mismos que serán proporcionados por los C. MMC. Karen Medina Quero y el Dr. Arturo Contis Montes
de Oca.

10
 CAPÍTULO V. OBJETO DE ESTUDIO

El objeto de estudio en esta investigación es la respuesta inmunológica desarrollada de los

anticuerpos IgG e IgA ante los péptidos diseñados bioinformáticamente de la hemaglutinina
del virus de la influenza A, evaluado por inmunoensayo.

11
 CAPÍTULO VI. HIPÓTESIS O SUPUESTO DE INVESTIGACIÓN

Los péptidos R y S diseñados bioinformáticamente a partir de la hemaglutinina del virus generará

anticuerpos IgG e IgA capaces de reconocer las distintas hemaglutininas del virus de la influenza A.

12
 CAPÍTULO VII. VARIABLES O CATEGORIAS

Tipo de
Variable Definición conceptual Definición operacional Indicador
variable

Variables dependientes
Molécula que contiene dos o más Espectrofotometría
aminoácidos (las moléculas que se Producto Customatizado,
unen entre sí para formar Empresa: Peptide 2.0®
proteínas), Diseñada a partir del
virus de la hemaglutinina por
alineación entre otras Secuencia: Pep R: Cuantitativa
Péptido Microgramos/microlitro
hemaglutininas CKTSSWPNNHDSNNNKGVTA continua
ASPHAGAKSFYKNL

Pep S:
SLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTK
Proteína que se encuentra en la
capa externa de los
paramixovirus. Esta proteína Producto Comercial,
ayuda a las partículas del virus a Hemaglutininas H1, H2, H3, H5, Cuantitativa
Hemaglutinina Microgramos/microlitro
unirse a las células y, por lo tanto, H7. SinoBiological® continua
facilita la infección. Espectrofotometría

Variable independiente
Proteínas producidas por
las células plasmáticas del
cuerpo cuando son
activadas por linfocitos T a Suero sanguíneo,
Anticuerpos través de la presentación de Cuantitativa
anticuerpos de titulación en Densidad óptica (U.A.)
IgG e IgA antígenos específicos. continua
placa: Espectrofotometría

13
 CAPÍTULO VIII. OBJETIVOS DE ESTUDIO

Objetivo general

Evaluar los títulos de anticuerpos específicos IgG e IgA en conejos y ratones inmunizados con el
péptido diseñado.

Objetivos específicos

 Evaluar la respuesta de anticuerpos IgG e IgA específica en suero del conejo inmunizado
intradérmicamente contra los péptidos diseñados.

 Evaluar la respuesta de anticuerpos IgG e IgA específica en suero de ratones inmunizados

intranasalmente contra los péptidos diseñados.

 Determinar la respuesta cruzada de reconocimiento de anticuerpos IgG de los conejos y ratones

contra diferentes tipos de hemaglutininas del virus de influenza A.

CAPÍTULO IX. TIPOS DE INVESTIGACIÓN

Diseño del Estudio

El estudio será realizado mediante la evaluación in vitro del título de anticuerpos IgG e IgA por medio
de inmunoensayo, brevemente; un conejo o grupos de ratones serán inmunizados con dos péptidos
14
diseñados de la hemaglutinina del virus de la influenza AH1N1, posteriormente se obtendrá el suero y
se determinarán los anticuerpos contra el péptido de trabajo, así como contra diferentes hemaglutininas
del virus.

Péptido R Secuencia: CKTSSWPNNHDSNNNKGVTAASPHAGAKSFYKNL

Péptido S Secuencia: SLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTK

Fuente de datos: Primaria

Tipo de Estudio

Por el control de asignación a los factores de Estudio: Experimental exploratorio

Por medición única en tiempo: Transversal prospectivo

Por su finalidad: Analítico

Practica
Orientación

Cuantitativa
Enfoque

Correlacional
Alcance

Experimental
Diseño
Transversal
Temporalidad

15
 CAPÍTULO X. TÉCNICAS E INSTRUMENTOS DE RECOLECCIÓN DE DATOS.

METODOLOGÍA

La inmunización del modelo múrido o conejos con los péptidos R y S, se realizará vía subcutánea e
intraperitoneal. Los grupos fueron establecidos de la siguiente manera: (Tabla 2).

GRUPO EXPERIMENTAL TRATAMIENTO. (N=6)

1 CONTROL VEHÍCULO (PBS)

2 Péptido R
3 Péptido S
CONEJO 1 Péptido R
CONEJO 2 Péptido S

Tabla 1. Grupos experimentales

Las intervenciones experimentales se llevarán a cabo una vez por semana. Se administrarán tres dosis en
total, una dosis cada siete días. Siete días después de la última inmunización, se aplicará eutanasia a los
ratones de acuerdo con la AVMA (por sus siglas en inglés, American Veterinary Medical Association )
y su guía Guidelines for the Euthanasia of Animals, edición 2020
(https://www.avma.org/sites/default/files/2020-02/Guidelines-on-Euthanasia-2020.pdf).
Se prepara el péptido colocando en una báscula 1 microtubo de 2 ml y verificamos que la báscula
marque (0), se introduce 1 mg del péptido a utilizar y se le agrega 1 ml de solución inyectable (estéril),
obteniendo así una concentración de 1μg/1μL del péptido.
En el caso de los ratones se utilizó una cepa de ratones macho BALB/c de 25-30g (de entre 6 a 8
semanas de edad), los cuales fueron colocados en cajas de acrílico de 34.5x49x17 cm. Se les
proporcionó alimento a libre demanda.
Se trabajó con 2 grupos de 6 ratones cada uno, en cada grupo se probó un péptido diferente (R y S). A
los ratones se les permitió adaptarse a las condiciones ambientales por una semana. Para realizar la
inmunización en los ratones, estos fueron anestesiados con 50μL de isoflurano en una cámara cerrada.
Se colocó al ratón en el interior del frasco, por aproximadamente 20 segundos, hasta lograr una
anestesia satisfactoria, posteriormente se procedió inmunizar por ruta intraperitoneal inoculando 20μl
del péptido más 30μl del adyuvante en un volumen final de 50μl para cada ratón en un periodo de 7 días
entre cada inmunización (como se muestra en el esquema), en la primera inmunización se utilizó el
péptido más el adyuvante de Freund completo, en la segunda se utilizó el péptido más el adyuvante
incompleto y en la tercera se utilizó el péptido más solución salina. 7 días posteriores a la última
16
inmunización se realizó la eutanasia y la obtención de las muestras de sangre. Para esto, se anestesiaron
a los ratones con 50μl de isoflurano en una cámara, seguido de una dislocación cervical y finalmente se
realizó sangrado por punción cardiaca con jeringa de tuberculina para obtener sangre total,
posteriormente se centrifugó la sangre hasta obtener el suero, el cual se guardó a -70°C, hasta su uso.
(Fig. 1).

Se emplearon conejos macho (Cepa) con un peso de 4kg con una edad de (semanas), dichos animales
fueron adquiridos a través de (proveedor) y puestos bajo el resguardo del bioterio de la escuela militar
de medicina, en jaulas separadas, durante su estancia fueron alimentados con (alimento) , la primer
semana fue de ambientación, misma que les permitió regular adecuadamente sus ciclos sueño vigilia.
Se trabajaron con 2 conejos, cada uno se inmunizó con el péptido S y el péptido R respectivamente.

Al término de la primera semana de ambientación, se realizó la primera inmunización comenzando ser

depilados por la espalda y anestesiados con lidocaína al 0.5% vía subcutánea , se inyectaron 400 μg de
péptido con 300 μg de adyuvante de Freund completo para la primera inmunización y se inyectaron
300 μg de péptido con 300 μg de adyuvante de Freund incompleto para la segunda inmunización,
siendo la tercer inmunización, la última donde se inyectaron 300 μg de péptido sin adyuvante mediante
la vía intramuscular, El proceso de obtención de la sangre del conejo fue realizado mediante punción
cardiaca, este procedimiento involucró anestesiar al conejo administrando 100 μl de isoflurano en una
máscara. posterior a eso se administró vía intraperitoneal pentobarbital 8 ml, una vez sedado el conejo
se procede a realizar la punción cardiaca, este procedimiento consta en realizar un corte sagital con un
bisturí, disecando planos hasta cortar parte de los huesos de la caja torácica, dejando expuesto el
corazón. Posterior a esto, se localizó el ventrículo del lado derecho y se obtuvo el tejido sanguíneo, con
ayuda de una jeringa de 20 ml, la sangre obtenida por punción cardiaca, el suero será separado y
guardado a -70ºC hasta su uso Se concentraron todas las muestras sanguíneas en los respectivos grupos
experimentales y se realizaron los procedimientos de inmunoensayos.

17
Determinación de IgA e IgG

Se sensibilizará una placa de microtitulación de poliestireno de 96 pozos fondo plano y de alta afinidad
(Corning Costar 3590), con una concentración de 5 µg/1000 µl del péptido R y S (Peptide 2.0); 5
µg/1000 µl de hemaglutinina purificada (SinoBiological®) o 5 µg/1000 µl de vacuna comercial

Figura 1. Inmunización y muestreo. Línea de tiempo donde se identifican cada una de las etapas experimentales y
recolección de muestras, indicando el día en el que serán realizadas.
(Agripal S1 ®, Vaxigrip ®) en un amortiguador de carbonatos (100 mM) a un pH de 9.6, y un volumen
final de 100 µL por pozo, se incubará durante 1 hr a 37 ᵒC, se lavará la placa con Tween 20 al 0.05% en
amortiguador de fosfatos (PBS-T) 3 veces, con ayuda de un lavador de placas (Automatic Washer
EMW-600 Labomed Inc. E.U.), tras lavar adecuadamente, se bloquearán los sitios de unión no
específica, adicionando proteínas Blotto al 5.0% y BSA al 3.0% (en el caso de la hemaglutininas
purificadas) en amortiguador de carbonatos con un pH de 9.6 y se incubó a 37°C por 2 hrs.
Posteriormente se realizarán lavados con PBS-Tween, por 3 ocasiones. Se agregará la muestra en
dilución 1:100 (suero) y utilizando como vehículo con Tween 20 al 0.05% en amortiguador de fosfatos
(PBS-T), y se incubará 1 hora a 37 ᵒC. Las placas se lavarán 3 veces con PBS-Tween para agregar el
anticuerpo secundario anti-IgA acoplado a peroxidasa (HRP-Goat Anti-Mouse IgA, IgG marca
Invitrogen, novex by life technologies catálogo 627420. Lot 1490901]), a una dilución de 1:1500. Tras
incubar a 37 ᵒC 1 h, las placas se lavarán y se adicionará la solución de sustrato para la peroxidasa
(amortiguador citrato-fosfato pH=5/OPD/H 2O2) durante 20 min a temperatura ambiente a la oscuridad,
y se detendrá con 100l de H2SO4 2.5 M. Por último, la absorbancia se medirá a λ=492 nm en un lector
de microplacas (EON [BioTek, E. U.]).(Fig. 2)

18
 ANALISIS ESTADÍSTICO

Los ensayos se realizarán por duplicado con los grupos descritos anteriormente. La comparación de
datos de seis grupos no pareados (independientes) será procesada con base en análisis no paramétrico
(prueba de Kruskal Wallis) o el análisis paramétrico, mediante análisis de varianza (ANOVA de una
vía). La comparación de datos de cada péptido en forma individual se realizará con el ANOVA de una
vía, donde se comparará los anticuerpos generados por el péptido. Se aplicará la prueba pos-hoc de
Kruskal Wallis y las significancias estadísticas se establecerán a valores de p≤ 0.05 para significancia.

Figura 2. Esquema general para el ensayo de ELISA. Se representa de forma esquemática los pasos para el ensayo de
ELISA. El primer paso representa en todos los casos, al antígeno, tanto a los péptidos, como las HA purificadas y las
vacunas comerciales Agripal S1 ® y Vaxigrip ®

CAPÍTULO XI. POBLACIÓN

Para esta investigación se trabajará con la totalidad de los 30 ratones divididos en 4 grupos de 6 cada
uno y un grupo control, así como 2 conejos que componen el universo de estudio.

19
 CAPÍTULO XII. MUESTRA

Para el presente estudio, se van a trabajar con 4 grupos de 6 ratones, con la disposición que a
continuación se indica:
 Grupo A de 6 ratones para el péptido (R),
 Grupo B de 6 ratones para el péptido (S).

Además, se incluirán 2 conejos en la investigación de los cuales 1 se inmunizará con el péptido (R), y la
otra muestra con el péptido (S).

El Grupo C con la misma cantidad de ratones, serán parte del grupo control, se les administrará el
vehículo para observar la respuesta base.

20
 CAPÍTULO XIII. CRONOGRÁMA DE ACTIVIDADES

TIEMPO 2022 2023

ACTIVIDAD JUN JUL AGO SEP OCT NOV DIC ENE FEB MAR ABR MAY JUN

1. Elección del tema. X

2.entrega del título de tesis X

3. elaboración del protocolo de X X

investigación

4. Revisión de avances del X

protocolo de investigación.

5. Presentación del protocolo de X

investigación al comité de
investigación del plantel

6. Inmunización de los ratones y X

conejos.

7. Sacrificio X

8. Recolección de muestras X

9. Elaboración del trabajo de tesis. X X X

10. Realización de correcciones. X

11. Presentación de trabajo final. X X

21
 CAPÍTULO XIV. FUENTES DE CONSULTA

1. Riedel, S., Morse, S., Mietzner, T. & Miller, S. (2019, 26 agosto). Jawetz Melnick & Adelbergs

Medical Microbiology 28 E (28th ed.). McGraw Hill / Medical.

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3. History of Flu (Influenza): Outbreaks and Vaccine Timeline. (s. f.). Mayo Clinic. Recuperado 4

de octubre de 2022, de https://www.mayoclinic.org/es-es/coronavirus-covid-19/history-disease-

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4. Gaitonde DY, Moore FC, Morgan MK. Influenza: Diagnosis and Treatment. Am Fam

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