UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS – ESPE
CÓDIGO: [Link].505
VERSIÓN: 1.0
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA AGRICULTURA FECHA ULTIMA
REVISIÓN: 26/10/16
CARRERA: Ingeniería en Biotecnología
GUÍA PARA LAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO, TALLER O CAMPO
PERIODO PREGRADO S-I
ASIGNATURA: Biología Sintética y Edición Genética NIVEL: Pregrado
LECTIVO: ABRIL-AGO 22
PRÁCTICA
DOCENTE: Francisco Flores NRC: 7194, 7195 2
N°:
LABORATORIO DONDE SE DESARROLLARÁ LA
A206, A204
PRÁCTICA:
TEMA DE LA Diseño de circuitos genéticos
PRÁCTICA:
INTRODUCCIÓN:
El diseño de circuitos genéticos es un campo interdisciplinario que involucra varios conceptos de ingeniería, bioquímica y biología.
El circuito genético es un conjunto de partes biológicas que codifican ARN o proteínas, que permiten que las células individuales
respondan e interactúen entre sí para realizar algunas funciones lógicas. Se sabe que muchos mecanismos reguladores celulares
están codificados a nivel de ADN como motifs reguladores, promotores, represores, osciladores, etc. La actividad genética, el
control transcripcional y los mecanismos postranscripcionales, pueden regularse estrechamente mediante señales intrínsecas y
externas. En los inicios de la ingeniería genética y la biología sintética, la construcción de circuitos genéticos era una tarea
sumamente ardua, propensa a muchos errores. Las herramientas computarizadas de diseño genético han logrado cambiar eso y
han optimizado el trabajo de diseño. Las herramientas de diseño asistido por ordenador (CAD) permiten la construcción de circuitos
genéticos, ligando la esquematización hecha por un investigador con el cálculo de los parámetros cinéticos para simular el posible
comportamiento del circuito. De esta manera, estas herramientas automatizan el proceso mediante el cual se diseñan circuitos
genéticos complejos para programar células, especialmente bacterias y levaduras, con el fin de llevar a cabo acciones específicas,
como activar una enzima en particular o producir una determinada proteína. En biología sintética se han utilizado organismos
unicelulares de esta manera para producir medicamentos, sensores biológicos que incluyen células o anticuerpos, enzimas para su
uso en la industria y más. Además de las herramientas CAD, existen softwares como Cello, que son capaces de construir el circuito
genético con base en las condiciones dadas por el investigador. Tinkercell es una de las herramientas más populares utilizadas en
biología sintética, por su interfaz amigable y la variedad de funcionalidades disponibles para construir un circuito genético. En esta
práctica se va a utilizar Tinkercell para aprender la forma en la que se construyen los circuitos genéticos que comúnmente se
utilizan en biología sintética.
OBJETIVOS:
• Diseñar los tipos de circuitos genéticos comúnmente utilizados en biología sintética, mediante el uso de herramientas de
diseño asistido por ordenador (CAD).
• Simular los resultados esperados para cada circuito generado.
MATERIALES:
REACTIVOS: N/A INSUMOS: N/A
EQUIPOS: Computador
MUESTRA:N/A
INSTRUCCIONES:
- Descargar e instalar el software Tinkercell [Link]
UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS – ESPE
CÓDIGO: [Link].505
VERSIÓN: 1.0
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA AGRICULTURA FECHA ULTIMA
REVISIÓN: 26/10/16
CARRERA: Ingeniería en Biotecnología
• - Utilice el navegador Chrome o Firefox.
ACTIVIDADES POR DESARROLLAR:
1. Introducción al diseño de circuitos genéticos
a) Ver el video [Link]
b) Iniciar Tinkercell y revisar el catálogo de componentes disponibles.
c) Construir un circuito genético simple conformado por un promotor, secuencia codificante (cds) y terminador.
d) Asociar la producción de una proteína fluorescente a la cds.
e) Simular la producción de la proteína fluorescente utilizando los modelos determinista, estocástico exacto, estocástico con
salto tau, e híbrido. Reportar los resultados obtenidos con cada modelo.
2. Construcción de un circuito genético para el procesamiento de moléculas
a) Disponer dos reacciones bioquímicas y fusionarlas a través de la molécula intermedia.
b) Colocar dos moléculas vacías a los extremos para definir la producción de la primera molécula y la degradación de la
última.
c) Añadir dos enzimas que catalicen las reacciones intermedias.
d) Construir dos circuitos genéticos conformados por promotor, cds y terminador.
e) Conecta un componente de protein production entre cds y la enzima para los dos circuitos.
f) Insertar los circuitos dentro de un vector.
g) Reportar la simulación de la reacción y los cambios que se producen al alterar los Km y Kcat.
3. Diseño de un circuito inversor
a) Activar los componentes: Operator, Represor Binding Site, Inducible Promoter, Repressible Promoter.
b) Colocar dos moléculas vacías a los extremos para definir la producción de la primera molécula y la degradación de la
última.
c) Construir dos circuitos compuestos por promotor, cds y terminador. El primer circuito se compone de un promotor inducible
y el otro de un promotor reprimible.
d) Asociar un factor de transcripción al promotor inducible.
e) Asociar la cds 1 a la producción de un factor de transcripción tf2.
f) Asociar el tf2 al promotor reprimible.
g) Asociar la cds 2 a la producción de una proteína fluorescente.
h) Correr la simulación y reportar los cambios producidos al alterar las concentraciones de los factores de transcripción tf1
y tf2, la fuerza de los promotores y las constantes Kd y Kh de las reacciones.
4. Diseño de un circuito AND
a) Hacer dos constructos compuestos por promotor inducible, cds y terminador.
b) Asociar factores de transcripción a los promotores inducibles.
c) La cds1 se asocia con la producción de una proteína precursora de la proteína fluorescente.
d) La cds2 se asocia con la producción de un factor de transcripción.
e) Hacer un tercer circuito formado por promotor inducible, cds y terminador.
f) La cds3 se asocia con la producción de una enzima que catalice la conversión del precursor en la proteína fluorescente.
g) Asociar el tercer promotor inducible con el factor de transcripción producido por cds2.
h) Conectar la enzima producida por cds3 con la reacción de conversión del precursor a proteína fluorescente.
i) Correr la simulación y reportar bajo qué condiciones aumenta o disminuye la producción de la proteína fluorescente.
UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS – ESPE
CÓDIGO: [Link].505
VERSIÓN: 1.0
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA AGRICULTURA FECHA ULTIMA
REVISIÓN: 26/10/16
CARRERA: Ingeniería en Biotecnología
5. Diseño de un circuito OR
a) Hacer dos constructos compuestos por promotor inducible, cds y terminador.
b) Asociar factores de transcripción a los promotores inducibles.
c) Asociar cds1 y cds2 a la producción de factores de transcripción.
d) Hacer un tercer circuito formado por dos promotores inducibles, cds y terminador.
e) Asociar los factores de transcripción codificados por cds1 y cds2 a los promotores inducibles del tercer circuito.
f) Asociar la cds3 a la producción de una proteína fluorescente.
c) Correr la simulación y reportar bajo qué condiciones aumenta o disminuye la producción de la proteína fluorescente.
6. Diseño de un circuito N-AND
a) Seguir los pasos para la construcción del circuito AND.
b) Asociar el cds3 a la producción de un factor de transcripción.
c) Hacer un cuarto circuito compuesto por un promotor reprimible, cds y terminador.
d) Asociar el factor de transcripción de cds3 con el promotor reprimible, como una interacción de represión de transcripción.
e) Correr la simulación y reportar bajo qué condiciones aumenta o disminuye la producción de la proteína fluorescente.
7. Diseño de un circuito N-OR
a) Seguir los pasos para la construcción del circuito OR.
b) Asociar el cds3 a la producción de un factor de transcripción.
c) Hacer un cuarto circuito compuesto por un promotor reprimible, cds y terminador.
d) Asociar el factor de transcripción de cds3 con el promotor reprimible, como una interacción de represión de transcripción.
e) Correr la simulación y reportar bajo qué condiciones aumenta o disminuye la producción de la proteína fluorescente.
8. Diseño del circuito del operador Lac.
a) Colocar una célula dentro del lienzo y nombrarla como ecoli.
b) Disponer una molécula fuera de la célula y nombrarla como lactosa.
c) Hacer tres réplicas de lactosa y pegarlas dentro de la célula.
d) Hacer un circuito conformado por promor, sitio de unión de represor, rbs, cds y terminador.
e) Colocar dentro de la célula una enzima que se nombra como lacZ y otra que se nombra como lacI.
f) Asociar LacI con rs1 mediante una interacción de represión.
g) Asociar la lactosa con LacI mediante una interacción de represión.
h) Conectar la lactosa exterior con la interna, a través de una reacción 1 a 1 de transporte.
i) Asociar un módulo de degradación a la lactosa interna
j) Correr la simulación y reportar bajo qué condiciones aumenta o disminuye la producción de lactosa.
9. Esquematización de circuitos con miniEugene
a) Revisar los parámetros para determinar la posición de los elementos de un circuito en miniEugene
[Link]
b) Hacer un esquema del circuito inversor utilizando miniEugene.
RESULTADOS OBTENIDOS:
El estudiante debe ser capaz de responder las siguientes preguntas:
• ¿Cuál es la diferencia entre un modelo estocástico y uno determinista? ¿Qué es el modelo tau?
UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS – ESPE
CÓDIGO: [Link].505
VERSIÓN: 1.0
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA AGRICULTURA FECHA ULTIMA
REVISIÓN: 26/10/16
CARRERA: Ingeniería en Biotecnología
• En la construcción del circuito genético para el procesamiento de dos moléculas ¿Qué sucede al aumentar la fuerza del
vector?
• En el circuito inversor ¿bajo qué condiciones se puede incrementar la producción de GFP?
• ¿Cómo se espera que sean los resultados de los circuitos AND, N-AND, OR, N-OR?
• ¿Qué es el circuito XOR?
CONCLUSIONES:
• Para el diseño de circuitos genéticos existen diversos softwares basados en diseño asistido por ordenador (CAD), que
permiten combinar la esquematización de circuitos genéticos con un conjunto de reglas para simular su comportamiento.
• El diseño de circuitos genéticos se basa en una serie de reglas que norman la interacción entre sus componentes. Los
organismos biológicos tienen incorporadas estas normas en sus sistemas de regulación para su supervivencia.
• Las simulaciones en ocasiones se pueden ver afectadas por cambios en las concentraciones de sus componentes. Muchas
partes biológicas tienen información sobre sus cinéticas de reacción, producción y degradación, y de su concentración en
estado natural.
RECOMENDACIONES:
• Hacer un esquema del posible comportamiento de un circuito previo a su construcción.
• En caso de que los resultados no tengan coherencia con el comportamiento esperado, revisar que las partes se
encuentren correctamente conectadas.
FIRMAS
F: …………………………………………. F: …………………………………………. F: ……………………………………………..
Nombre: Francisco Flores Ph.D. Nombre: Dra. Claudia Segovia Nombre:
COORDINADOR DE ÁREA DE COORDINADOR DE LABORATORIOS
DOCENTE CONOCIMIENTO
