U.D 2.

- LAS BACTERIAS 2022-2023

1. MICROORGANISMOS

Puede considerarse a Anton van Leeuwenhoek como el padre de la microbiología, puesto

que fue el primero en observar, en 1674 y gracias al uso de unas lentes, unos seres
microscópicos a los que denominó «animáculos». Años después y gracias al avance
tecnológico en microscopía se han podido ir caracterizando e identificando los distintos
tipos de microorganismos que se han ido observando hasta la actualidad.

Puesto que la microbiología clínica se centra en el estudio de un grupo de organismos tan

diverso, es de obligada necesidad conocer los tipos que aquí se incluyen, así como las
características diferenciales que permiten su clasificación.

Los microorganismos son un grupo heterogéneo de seres vivos que se caracterizan por ser
microscópicos, es decir, que son perceptibles a simple vista (salvo alguna excepción). Por
este motivo, es necesario aplicar técnicas de tinción y observación microscópica para
visualizarlos.

La microbiología clínica se centra en el estudio de un gran número de microorganismos

que interaccionan con animales (principalmente el ser humano). Las relaciones que
existen entre ellos van desde procesos beneficiosos que protegen de otros patógenos, a
otros capaces de provocar enfermedades.

1.1 TIPOS

Para poder comprender mejor este complejo mundo, los microorganismos se dividen en
cuatro grupos: bacterias, hongos, parásitos y virus.

 Bacterias.-son organismos formados por una sola célula procariota con una
estructura relativamente simple. En el ser humano habitan miles de especies
bacterianas que tienen diferentes efectos sobre él.

 Hongos.- A diferencia de las bacterias , están formadas por células eucariotas con
una estructura compleja que comprende un núcleo bien definido, mitocondrias,
aparto de Golgi,etc. Se pueden diferenciar, a su vez, dos tipos de hongos:

-Levaduras.-forma unicelular.
-Mohos.- forma filamentosa.

 Parásitos.- Corresponde al grupo de microorganismos más complejo, formado por

una o varias células eucariotas.

 Virus.- Son partículas infecciosas que necesitan parasitar obligatoriamente a una

célula para multiplicarse, ya que necesitan de su maquinaria para poder
reproducirse.

En las superficies corporales humanas existen microorganismos que se conocen como

flora normal o microflora. En la mayoría de los casos suele ser beneficiosa, por ejemplo,
protegiendo frente a infecciones provocadas por gérmenes patógenos y participando en la
metabolización de los alimentos, entre otros.

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En determinadas situaciones, como por ejemplo cuando el sistema inmunitario del

paciente es más débil (inmunodepresión), esta flora normal puede invadir el organismo
humano y provocar enfermedades; en este caso son conocidos como patógenos
oportunistas.
Por otra parte, existen también los llamados patógenos estrictos, que van siempre
asociados a una enfermedad.

1.2 TAXONOMIA

La taxonomía es una forma de clasificar a los microorganismos bajo el siguiente orden

jerárquico (taxones): especie, género, familia, orden, clase, división, reino y dominio.
La especie corresponde al nivel más básico y en él se engloban organismos con
características fisiológicas y genéticas comunes.
El género es el taxón que comprende especies con algunas características compartidas.
Para clasificar a las especies de microorganismos es imprescindible identificarlas y
nombrarlas.
En el sistema de nomenclatura (sistema binomial) se utilizan dos nombres derivados del
latín o del griego. El primero de estos nombres suele corresponder al género y el segundo
tiene relación con alguna característica de la especie. El nombre de la especie siempre
debe aparecer en cursiva o subrayado.

2. BACTERIAS

En el laboratorio de Microbiología es fundamental conocer la morfología, los patrones de

agrupación y las estructuras presentes en las diferentes especies bacterianas, puesto que
sirven de ayudan para su identificación.

2.1 MORFOLOGIA Y AGRUPACIÓN

Existen, fundamentalmente, los siguientes tipos de morfologías bacterianas :

 Cocos: redondos.
 Bacilos: formas alargadas.
 Cocobacilos: formas intermedias entre cocos y bacilos (ovoides).
 Bacilos fusiformes: formas alargadas con extremos en punta.
 Vibrio: forma alargada curvada.
 Espirilo: forma alargada en espiral.
 Espiroqueta: forma alargada con ondulaciones.
 Filamentosa: en forma de hilo. Son células largas y delgadas o cadenas de células.

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Las bacterias pueden aparecer aisladas con las formas celulares descritas anteriormente, o
pueden quedar unidas tras la división y dar lugar a agrupaciones características, según su
plano de división.
Tanto la morfología como la agrupación son de gran ayuda a la hora de identificarlas y
clasificarlas debido a que las células de una misma especie mantienen los mismos
patrones de forma y disposición a la hora de agruparse.
Los cocos pueden aparecer como:

 Diplococos (en parejas).

 Estreptococos (en cadenas).
 Estafilococos (en racimos).
 Tétradas.
 Sarcinas
Los bacilos tienen menos tendencia a la agregación, pero pueden aparecer a veces:
 En "empalizada" (en paralelo).
 En forma de "letras chinas" (recuerdan a la letra L o V).
 En cadenas.

Para generar las diferentes

agrupaciones, cada grupo
adoptará un plano de división
diferente..

Las corinebacterias se caracterizan por presentar formas en "empalizada" y "letras

chinas". Y las bacterias del género Lactobacillus se disponen en largas cadenas.

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Los conocidos como organismos pleomorficos son los que adoptan varias formas a lo largo
de su vida.

2.2 ESTRUCTURA BACTERIANA

Las bacterias están formadas por una célula procariota y tienen una estructura
relativamente sencilla comparada con la célula eucariota, tal y como se especifica en el
siguiente cuadro:

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Las estructuras más importantes de las bacterias se muestran en esta figura:

a) Citoplasma.- En él se desarrolla el metabolismo celular. Contiene el nucleoide, ARN

mensajero, plásmidos (pequeñas moléculas de ADN circular), ribosomas de tipo 70 S
e inclusiones citoplasmáticas que actúan como reserva de energía o como depósito de
componentes necesarios para la célula.

b) Nucleoide.-Es la zona del citoplasma donde se sitúa el cromosoma bacteriano. Se

denomina así para diferenciarlo del núcleo rodeado de membrana de la célula eucariota. El
material genético que contiene es una única molécula de ADN circular de doble cadena.

c) Membrana plasmática. Es una doble capa de fosfolípidos (bicapa lipídica) que aísla al
citoplasma del exterior. Contiene proteínas que permiten el transporte de sustancias al
interior y exterior de la célula. Además, tiene una serie de enzimas que llevan a cabo la
producción de energía la cual, en organismos eucariotas, se desarrolla en orgánulos como
las mitocondrias.

Existen también unas estructuras conocidas como mesosomas, que corresponden a

invaginaciones de la propia membrana hacia el interior del citoplasma. Su función es

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unirse al cromosoma bacteriano y asegurar su correcto reparto a cada célula hija durante
la división celular.
Las bacterias se caracterizan por la ausencia de esteroles (por ejemplo, colesterol) en su
membrana plasmática, a diferencia de las células eucariotas. Una excepción a esta regla
son los micoplasmas, que carecen de pared celular y contienen esteroles que confieren
estabilidad a la membrana.

d) Pared celular.- La pared celular es una estructura que tienen todas las bacterias a
excepción de los micoplasmas. Es una estructura dura y elástica, pero que le permite el
intercambio de sustancias.
Esta pared se encuentra rodeando por completo a la membrana plasmática y, por lo tanto,
a la célula. Su función principal es conferirle la forma y rigidez necesaria para soportar los
cambios externos que, de ser muy acusados, provocarían la lisis o rotura celular.

Debido a la gran importancia de la pared para la supervivencia de la célula, es la zona

diana de muchos agentes antibacterianos, como los antibióticos.
Esta estructura no solo es importante por estar presente en casi todas las bacterias y
conferirle protección, sino porque divide en dos grupos generales a casi todas las bacterias
de interés clínico: bacterias grampositivas y bacterias gramnegativas.

La diferencia estructural de la pared hace que las bacterias queden teñidas de color
diferente tras colorearlas con la tinción de Gram, que es una de las pruebas más
importantes que se utilizan en el laboratorio clínico para la identificación bacteriana. Tras
la tinción, las bacterias grampositivas quedan teñidas de violeta oscuro, mientras que las
gramnegativas aparecen de color rosado.

Tanto las bacterias grampositivas como las gramnegativas tienen en común la presencia
de mureína o peptidoglicano, que está formado por largas cadenas de polisacáridos
alternando moléculas de N-acetilgucosamina (NAG) y N-acetilmurámico (NAM). Las
cadenas se disponen en paralelo formando una especie de malla, unidas por los NAM
mediante enlaces peptídicos. El enlace peptídico se realiza entre pequeñas cadenas de
aminoácidos unidas a los NAM.

 Bacterias grampositivas.- La pared celular de las bacterias grampositivas está

formada por una capa gruesa de peptidoglicano o mureína. Además, contiene
ácidos teicoicos que se unen covalentemente a la pared y ácidos lipoteicoicos que
se unen a la membrana plasmática. Las micobacterias son un tipo especial de
grampositivas ya que tienen ácidos micólicos, que son componentes céreos que les
confieren una peculiaridad a la hora de teñirlas: son ácido-alcohol resistentes.

 Bacterias gramnegativas.- La pared de las bacterias gramnegativas es más

compleja que la grampositiva. Consta de una fina capa de peptidoglicano y una
membrana externa que lo rodea. La membrana externa es exclusiva de las
gramnegativas y delimita un espacio situado entre esta y la membrana plasmática
conocido como espacio periplásmico. Esta membrana se caracteriza por la
presencia de lipopolisacáridos (LPS) y porinas. El LPS se conoce también como
endotoxina porque tiene un efecto tóxico sobre el organismo. Las porinas son
proteínas que permiten el paso de ciertas sustancias al interior de la célula.

Muchos de los lipopolisacaridos de la membrana externa confieren propiedades

antigénicas a las bacterias. La parte más externa del lipopolisacarido se denomina

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antígeno O y permite la identificación de cepas de la misma especie mediantes

métodos serológicos, clasificándolos en serogrupos.

e) Flagelo.- Es una estructura proteica en forma de filamento helicoidal que se une por un
extremo a la envoltura celular (membrana plasmática y pared celular) y tiene como
función la movilidad de la bacteria mediante movimientos rotatorios a modo de hélice.
Dependiendo del sentido de giro del flagelo, la bacteria se dirige en una dirección u otra;
de esta forma puede dirigirse hacia zonas donde existen sustancias atrayentes (por
ejemplo, nutrientes) o alejarse de sustancias no deseadas. Pueden poseer más de un
flagelo dispuestos en diferentes posiciones así encontramos:

j) Fimbrias o Pili.- Son estructuras proteicas en forma de pelo, más cortas que los flagelos.
Existen los pili comunes, que tienen una función de adhesión a superficies, y los pili
sexuales, que permiten el paso de ADN (plásmidos) de una bacteria a otra, en un proceso
conocido como conjugación bacteriana.

g) Cápsula.- Algunas bacterias tienen una capa de polisacáridos o proteínas envolviendo

toda la superficie celular, la cápsula. Esta estructura la ayuda a adherirse a superficies,
facilitando la colonización de ciertos tejidos, y actúa también como barrera frente a
determinadas moléculas, como los anticuerpos del organismo hospedador.

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h) Endospora bacteriana.- Es una estructura que desarrollan algunas especies

bacterianas en el interior celular ante situaciones adversas (esporogénesis) , permitiendo
así su supervivencia. Es una forma de resistencia frente a condiciones extremas de
desecación, temperatura, radiación y agentes químicos que una célula no podría soportar.
Esta estructura consta de varias capas que mantienen en el interior el material genético y
los componentes necesarios para desarrollar una célula cuando las condiciones se vuelvan
favorables. Cuando la célula madre se lisa, las esporas se liberan al exterior, donde
permanecen periodos de tiempo muy variables en estado latente, hasta que determinados
estímulos provocan su germinación. Al germinar se convierten en células vegetativas
viables, capaces de realizar nuevamente todas sus funciones vitales.
Tanto la forma como el tamaño o su ubicación (central, subterminal o terminal) son
característicos de cada especie, por lo que son útiles en la identificación de las especies
que puedan presentar espora.

2.3 REQUERIMIENTOS PARA EL CRECIMIENTO BACTERIANO.

El crecimiento bacteriano se inicia con la captación de nutrientes del medio externo, que
dependerán del tipo de metabolismo que la bacteria sea capaz de llevar a cabo.

El conocimiento de los requerimientos metabólicos y de las condiciones de crecimiento de

las bacterias es imprescindible para llevar a cabo de forma correcta la obtención, remisión
y conservación de muestras clínicas, así como para la elección de los medios de cultivo y
pruebas más apropiados para el crecimiento e identificación de cada bacteria.

Las bacterias obtienen del medioambiente los sustratos necesarios para su crecimiento.
Aunque los constituyentes generales de las bacterias son muy similares, la capacidad de
captación de nutrientes y de transformación de los mismos es muy variable entre distintas
especies bacterianas.

Todas las bacterias necesitan agua y ciertos elementos básicos como carbono, fósforo,
azufre o nitrógeno. La mayoría de bacterias solo requieren, además de los elementos
anteriores, algunas moléculas simples para crecer, como pueden ser aminoácidos y
azúcares. Por ello se denominan bacterias nutricionalmente no exigentes (como por
ejemplo Pseudomonas, Escherichia o Staphylococcus).

Sin embargo, existen también bacterias nutricionalmente exigentes, que requieren

también compuestos más complejos como vitaminas y cofactores para poder desarrollarse
(como Haemophilus o Neisseria).

Por otro lado, ciertas bacterias denominadas bacterias energéticamente exigentes, son
incapaces de producir y almacenar su propia energía, por lo que obligatoriamente deben
tomarla de la célula que infectan (como el caso de Chlamydia y Rickettsia).

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En cuanto a los requerimientos de O2 y CO2 de las bacterias, pueden clasificarse en los

siguientes tipos:

-Bacterias aerobias: necesitan oxígeno.

-Bacterias anaerobias estrictas: no pueden vivir en presencia de oxígeno.

-Bacterias anaerobias facultativas: son capa-ces de soportar condiciones de anaerobiosis,

pero crecen mejor en presencia de oxígeno.

-Bacterias microaerófilas: crecen en presencia de pequeñas cantidades de oxígeno.

-Bacterias aerotolerantes: crecen en presencia de oxígeno, pero no lo necesitan para vivir.

-Bacterias capnófilas: son bacterias aerobias que, además de O2, necesitan también la
presencia de un 5-10 % de CO2 para crecer.

Además cada bacteria requiere un rango determinado de temperatura para crecer y

sobrevivir. Esta característica influye en su capacidad patogénica, así como en la forma de
transmisión del medioambiente al hombre. Dicho rango de temperatura debe ser tenido
en cuenta para el procesamiento y la conservación de las muestras clínicas en el
laboratorio.

Atendiendo a su temperatura óptima de crecimiento, las bacterias pueden clasificarse en:

-Bacterias psicrófilas: soportan bajas tempera-turas, entre 0 ºC y 20 ºC.

-Bacterias mesófilas: crecen a temperaturas intermedias, entre 20 ºC y 40 ºC

-Bacterias termófilas: soportan altas tempera-turas, de 55 ºC o más.

-Bacterias estenotérmicas: solo crecen y so-breviven en rangos estrechos de temperatura,

entre 35 ºC y 36 ºC.

-Bacterias euritérmicas: crecen en amplios ran-gos de temperatura, entre 0 ºC y 44 ºC.

-Bacterias extremófilas: crecen en rangos de temperatura o muy bajos (temperaturas infe-

riores a 0 ºC) o muy altos (temperaturas supe-riores a 80 ºC

El grado de acidez o basicidad del medio es un importante condicionante para el

crecimiento bacteriano. En función del rango de pH en el que pueden crecer, las bacterias
se clasifican en:

-Bacterias neutrófilas: pH entre 5,5 y 8,0.

-Bacterias acidófilas: pH entre 0,0 y 5,5.

-Bacterias alcalófilas: pH entre 8,0 y 11,5

Para poder desempeñar sus procesos metabólicos, las bacterias deben producir y
almacenar energía para luego poder reutilizarla. El conocimiento del tipo de metabolismo
que puede realizar cada bacteria es de gran importancia para el cultivo, aislamiento e
identificación bacteriana en el laboratorio.

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Para obtener energía, las bacterias pueden emplear uno de estos tres mecanismos:

-Respiración aeróbica (oxidación): se lleva a cabo en presencia de oxígeno, es decir, en

aerobiosis. La realizan tanto bacterias aerobias, como anaerobias facultativas cuando hay
presencia de oxígeno en el medio. Las bacterias quimiorganótrofas que realizan
respiración aeróbica oxidan un compuesto orgánico en presencia de un aceptor externo de
electrones. En este caso, el aceptor final es el oxígeno molecular.

-Respiración anaeróbica: se lleva a cabo en ausencia de oxígeno, es decir, en anaerobiosis.

La realizan tanto bacterias anaerobias estrictas, como anaerobias facultativas cuando no
hay presencia de oxígeno en el medio. En este caso el aceptor final externo de electrones
nunca es el oxígeno molecular (puede ser NO3, SO4 o CO3).

-Fermentación: ocurre en ausencia de oxígeno. Al igual que la respiración anaeróbica, la

realizan tanto bacterias anaerobias estrictas, como anaerobias facultativas cuando no hay
presencia de oxígeno en el medio. El sustrato inicial de la ruta también es la glucosa u
otros azúcares, mientras que los sustratos que actúan como aceptores finales de
electrones son moléculas orgánicas. En esta ruta intervienen la glucólisis, seguida de un
proceso de degradación del piruvato obtenido de la glucólisis, que dará lugar a la síntesis
final de moléculas orgánicas como etanol, ácido acético, ácido láctico, ácido butírico, etc.

3. TECNICAS DE OBSERVACIÓN MICROSCOPICA DE MICROORGANISMOS

Dado el pequeño tamaño de los microorganismos, su observación en el laboratorio se hace

a través de microscopía. Para el diagnóstico microbiológico se suelen utilizar varios tipos
de microscopios: microscopio óptico (de campo claro), microscopio de campo oscuro,
microscopio de contraste de fases, microscopio de fluorescencia y microscopio electrónico.

El microscopio óptico es el más utilizado en los laboratorios de microbiología, permitiendo

visualizar bacterias, hongos y parásitos. Los virus no pueden ser detectados por este
método debido a su pequeño tamaño, por Io que es necesario el uso de un microscopio
electrónico que permite el aumento de 100.000X (a diferencia del microscopio óptico, que
tiene como máximo aumento 1.000X). El microscopio electrónico tiene un elevado coste,
por lo que es poco utilizado.

Para visualizar e identificar bacterias de una forma adecuada, se utiliza por lo general el
aumento de 100X (objetivo de inmersión) con aceite de inmersión. Aumentos menores
pueden usarse para observar algunos hongos y parásitos, aunque también pueden usarse
para hacer un barrido general de la muestra y detectar zonas óptimas para la
identificación de microorganismos.

Es común a todas las técnicas de observación microscópica tener en cuenta las condiciones
de esterilidad. Normalmente se trabaja cerca de la llama del mechem Bunsen y las
muestras son transferidas mediante asa de siembra previamente esterilizada en la llama
(se acerca el extremo del filamento a la llama y se flamea hasta que alcance un rojo
incandescente, y se deja enfriar cerca de la llama). También es posible utilizar material
estéril de un solo uso.

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3.1 EXAMENES EN FRESCO

Es la forma más sencilla de visualizar microorganismos. En caso de muestras sólidas,

consiste en poner una gota de agua o suero fisiológico sobre un portaobjetos y suspender
la muestra (inóculo) en el líquido con un asa de siembra estéril. Si la muestra es líquida, se
deposita directamente una gota sobre el portaobjetos. A continuación se coloca un
cubreobjetos sobre la muestra y se observa al microscopio. Es importante que no
aparezcan burbujas de aire al colocar el cubreobjetos, ya que de lo contrario aparecen
estructuras que impiden una correcta visualización de los microorganismos. Para evitarlo
simplemente hay que apoyar un lateral del cubreobjetos sobre el portaobjetos y luego,
lentamente, dejar caer el resto.
Existe otra técnica conocida como preparación en “gota pendiente", que se utiliza sobre
todo para la detección del movimiento. El procedimiento de esta técnica puede resumirse
en cuatro pasos:

1. Impregnar los bordes de un cubreobjetos con una sustancia que permita su posterior
adherencia con el portaobjetos. Puede ser parafina, vaselina o aceite de inmersión.
2. Colocar la muestra (de la misma forma que para su estudio en fresco) en el centro del
cubreobjetos y rodeada por la sustancia adherente.
3. Usar un portaobjetos excavado (con una zona cóncava en el centro) y colocarlo sobre el
cubreobjetos, de tal forma que se haga coincidir la concavidad con la muestra.
4. Al darle la vuelta al conjunto, obtenemos la preparación lista para observar al
microscopio.
Este tipo de exámenes permiten estudiar la morfología, tamaño y color real de los
organismos, así como su movilidad. El principal inconveniente es que la mayoría de los
microorganismos no tienen color y no existe suficiente contraste como para visualizarlos
de forma óptima. Para solventarlo, se suele utilizar microscopía de campo oscuro o de
contraste de fases.

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3.2 PREPARACION DE FROTIS BACTERIANO

El frotis bacteriano, o extendido, es el procedimiento que se utiliza para extender y

separar de forma adecuada una muestra de microorganismos y poder observarlos en
microscopía.

Consta de tres pasos básicos: extensión de la muestra sobre el portaobjetos, fijación y

tinción.

La extensión puede hacerse de diferente manera en función del tipo de muestra. Si la

muestra procede directamente del paciente en un hisopo o torunda, simplemente hay que
pasarlos por la superficie de un portaobjetos realizando movimientos rotatorios para
descargar el material de una forma homogénea y representativa.

Si las muestras son líquidas, se deposita una gota mediante pipeta o asa de siembra estéril,
extendiendo posteriormente con el asa el líquido por la superficie del portaobjetos. En el
caso de muestras sólidas, es necesario depositar una gota de agua o suero fisiológico
previamente y emulsionar después la muestra. La transferencia de la muestra sólida se
hace con un asa de siembra estéril, homogeneizando a la vez que se realiza la extensión.
Una vez extendida la muestra, se deja secar al aire.

La fijación consiste en aplicar calor o metanol sobre la superficie de la muestra para que
quede adherida al portaobjetos y, de esta forma, no perder material durante la tinción. La
fijación por calor se puede hacer en una platina caliente (600C, al menos 10 min) o
mediante rápidos pases del portaobjetos sobre la llama del mechero Bunsen (con cuidado
de no aplicar el calor en exceso, ya que podría dañar la estructura celular). También se
puede fijar añadiendo unas gotas de metanol al 95 % sobre el material extendido durante
1 minuto. Para retirarlo, se dan ligeros golpes con el canto del portaobjetos sobre un papel
de filtro y finalmente se espera a que esté totalmente evaporado. Por último, se procede a
la tinción.

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3.3 TECNICAS DE TINCION Y TIPOS

Existen multitud de tinciones que pueden emplearse en el campo de la microbiología. Las

tinciones empleadas en microscopía óptica son cromogénicas, las cuales emplean
colorantes (sustancias con una porción coloreada denominada cromóforo) que se unen a
algunos componentes de las bacterias coloreando determinadas estructuras. Los
colorantes pueden ser básicos, colorantes con el cromóforo cargado positivamente como
el cristal violeta, el azul de metileno, la safranina, el verde malaquita o la fuscina básica; o
colorantes ácidos, con el cromóforo cargado negativamente como el rojo Congo, el rosa de
Bengala, la eosina o la fucsina ácida.

La mayoría de los colorantes utilizados en microbiología son derivados de las anilinas,

sales orgánicas intensamente pigmentadas. Las tinciones se pueden clasificar en:
•Tinciones simples: solo se emplea un colorante y toda la muestra se tiñe del mismo color.
•Tinciones diferenciales: se visualiza más de un color debido a que se utiliza más de un
colorante (Gram o Ziehl-Neelsen).
•Tinciones especiales:
•Tinciones específicas: se utilizan anticuerpos marcados con una molécula fluorescente
para identificar una estructura celular en particular. En microscopía óptica se emplean las
dos primeras, mientras que la última se emplea en microscopía de fluorescencia.

A) TINCIONES SIMPLES

En las tinciones simples se emplean soluciones acuosas o alcohólicas con un único

colorante bá-sico. En ocasiones se añade un aditivo, denominado mordiente, para
intensificar la coloración. El mordiente puede favorecer la unión del colorante al
microorganismo o recubrir alguna estructura como los flagelos para que, debido al
aumento de grosor, queden más teñidos.

La finalidad de la tinción simple no es diferenciar microorganismos, sino simplemente

visualizar su tamaño, morfología y tipo de agrupación celular.

La técnica consiste en aplicar el colorante durante un tiempo determinado, luego lavar y

finalmente secar para su observación al microscopio. Alguna de las tinciones simples más
empleadas en microbiología son la tinción con azul de metileno y la tinción negativa con
nigrosina.

B) TINCIONES DIFERENCIALES

Las tinciones diferenciales emplean dos colorantes de diferente color que permiten la
diferenciación de microorganismos que, por sus características estructurales, tienen
comportamientos tintóreos diferentes. Las dos tinciones diferenciales más empleadas en
microbiología son la tinción de Gram y la tinción de Ziehl-Neelsen.

1.Tinción de Gram. Es la más utilizada en microbiología y constituye la base de la

clasificación bacteriana dividiendo a las bacterias en dos grandes grupos: gramnegativas y
grampositivas. La técnica consiste en los siguientes pasos:
— Añadir cristal violeta (1 minuto). Cubrir por completo la superficie de la muestra para
que este colorante primario pueda llegar a todas las células. En este primer paso se van a

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teñir de violeta oscuro todas las bacterias, tanto las grampositivas como las
gramnegativas.
— Lavar con agua el exceso de cristal violeta.
— Cubrir con lugol (l min). Esta solución actúa como mordiente, es decir, forma un
complejo insoluble con el colorante primario en bacterias grampositivas. Lavar con agua el
exceso de lugol.
— Lavar con una solución decolorante (agua-acetona 1:1) hasta que deje de arrastrar
colorante de la muestra. La decoloración afectará solo a las bacterias gramnegativas, que
por su tipo de pared no forman complejos insolubles con el lugol y dejan salir al colorante
primario. En este momento, las bacterias gramnegativas aparecen incoloras.
— Lavar con agua.
— Cubrir con safranina (I min). Este es el colorante
— Lavar con agua el exceso de safranina.
Dejar secar. Para evitar que los restos de colorante queden en la superficie de la
preparación, es conveniente dejar secar en vertical y dejando que el exceso de agua caiga
sobre un papel de filtro. Finalmente, si existen restos de la tinción, se pasa un algodón con
alcohol por la base del portaobjetos.
— Observar al microscopio óptico con objetivo de inmersión.

2.Tinción de ZiehI-NeeIsen. Se utiliza para teñir micobacterias como, por ejemplo,

Mycobacterium tuberculosis (agente causal de la tuberculosis). El fundamento de esta
tinciÓn se basa en una característica diferencial de la pared de estas bacterias. Tienen
ácidos micólicos que permite a la bacteria resistir a la decoloración, incluso tras añadir
una mezcla de ácido y alcohol, por lo que también se les conoce como microorganismos
ácido-alcohol resistentes.
La coloración consiste en los siguientes pasos:
— Cubrir el frotis con el colorante primario: carbolfucsina (mezcla de fucsina y fenol).
Calentar durante 5 minutos sin permitir que hierva el colorante. Para ello se puede usar un
mechero
Bunsen, sujetando el portaobjetos con una pinza o apoyado en una plataforma metálica
sobre la llama. Como alternativa, se puede calentar sobre una plataforma que se caliente
por electricidad. Es importante que la muestra no se seque en ningún momento, por Io que
se puede añadir más colorante en caso necesario. El fenol del colorante primario y el calor
hacen que la fucsina (de color rojo) penetre en todas las células del extendido.
Lavar con agua.
Lavar con solución decolorante (HCI al 3 % en etanol al 95 hasta que deje de arrastrar
colorante rojo. Tras este paso, las bacterias ácido-alcohol resistentes permanecerán
teñidas de color rojo, mientras que las restantes aparecen decoloradas.
— Lavar con agua.
— Añadir el colorante de contraste (azul de metileno) (I min). Mediante este segundo
colorante se tiñen las bacterias, que no son ácido-alcohol resistentes, de color azul.
— Lavar con agua.
— Dejar secar y examinar a microscopía. Las bacterias ácido-alcohol resistentes (mico-
bacterias) aparecen de color rojo y el resto, tanto células como bacterias, de color azul.
Actualmente existen laboratorios que han sustituido la tinción ZiehI-NeeIsen por otras
tinciones acidorresistentes en frío. Existen dos: el método Kinyoun y el método auramina-
rodamina (que usa colorantes fluorescentes).

C) TINCIONES ESPECIALES.

Son aquellas que ponen de manifiesto estructuras específicas de la célula como gránulos
de reserva, flagelos, endosporas, etc.

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l. Tinción de endosporas. Las capas que rodean a la endospora le confieren un carácter

hidrofóbico y resistente, que hace necesaria la aplicación de calor para que el colorante
sea capaz de penetrar en ella. Pasos que seguir:
— Cubrir el frotis con verde de malaquita (colorante específico para las endosporas) y
calentar (5 min) de la misma forma que se explicó para el colorante primario en la tinción
de ZiehI-Neelsen.
— Lavar con agua.
Teñir con safranina (l min), que actúa como colorante de contraste tiñendo las células o
formas vegetativas.
Dejar secar y observar al microscopio las endosporas teñidas de color verde y las células
de color rosa.

D) TINCIONES ESPECIFICAS

Este tipo de colorantes emiten fluorescencia al ser expuestos a luz ultravioleta (en
microscopio de fluorescencia) y se denominan fluorocromos.
En función del tipo de colorantes fluorescentes empleados encontramos tinciones directas
con fluorocromos y tinciones directas con fluorocromos.

-Tinciones directas:
1.Naranja de acridina. Es un fluorocromo naranja que se une al ácido nucleico. Para teñir,
simplemente se deja actuar sobre el frotis durante 2 minutos y, tras lavar con agua y dejar
secar, se examina al microscopio. Tanto las células del huésped como los microorganismos
aparecen de color naranja brillante. Se utiliza cuando existe sospecha de presencia de
bacterias en hemocultivos y la tinción de Gram es dudosa.

2. Blanco de calcoflúor. Se utiliza para detectar infecciones por hongos, ya que este
colorante se une a la quitina (presente en la pared celular de los hongos).
Existen también tinciones con anticuerpos fluorescentes (inmunofluorescencia) que son
muy específicos y se utilizan para examinar muestras que contienen bacterias de dificil o
lento crecimiento (por ejemplo, Bordetella pertusis, agente causal de la tos ferina; o
bacterias del género Legionella).

-Tinciones indirectas

En estas técnicas de tinción con inmunofluorescencia los colorantes fluorescentes se ligan

con anticuerpos específicos formando los denominados conjugados colorante-anticuerpo.
Dichos conjugados se unirán a antígenos microbianos específicos permitiendo su
detección mediante el microscopio de fluorescencia. Esta técnica es muy valiosa puesto
que combina el alto contraste que proporciona la fluorescencia con la alta especificidad de
las uniones antígeno-anticuerpo.

El fluorocromo empleado con mayor frecuencia para la conjugación con anticuerpos es el

isotiocianato de fluoresceína (FITC), que emite fluorescencia intensa de color verde.
Existen kits comerciales para este tipo de tinciones.

Las técnicas de tinción con inmunofluorescencia se suelen utilizar para la detección de

bacterias de crecimiento difícil o lento como Bordetella petussis, Chlamydia trachomatis o
algunas especies de Legionella; para la identificación de bacterias previamente cultivadas;
en virología y en ciertos casos en parasitología

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 U.D 2.- LAS BACTERIAS 2022-2023

BIBLIOGRAFIA

1. G. PRATS. MICROBIOLOGIA CLINICA .Ed. Panamericana 2007

2. Laura Barrero Cuevas. Microbiologia Clinica. Sintesis 2016
3. Prescott, Harley, Klein. Microbiologia. McGrawHill 1999

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