UNIDAD DIDÁCTICA 2: APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE TINCIÓN Y OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS

Objetivos:
• Conocer el concepto de microorganismo, los tipos y la taxonomía.
• Conocer la morfología y agrupaciones bacterianas, e identificar las diferentes estructuras bacterianas.
• Conocer y desarrollar las técnicas de tinción y observación de microorganismos:
o Examen en fresco, simple y en gota pendiente.
o Preparación de un frotis bacteriano (muestra líquida-sólida).
• Conocer y aplicar los tipos y técnicas de tinción:
o Negativa, simple, tinción de Gram. Ziehl-Neelsen. Cápsulas y esporas.

Introducción

Un m.o es cualquier organismo unicelular que solo puede ser observado mediante microscopio. Para su estudio y
caracterización, se clasifican en bacterias, virus, hongos y parásitos.
La célula es la unidad morfológica y fisiológica de los seres vivos. Estas comparten una serie de características
esenciales, aunque poseen distintos niveles de complejidad. En función del modelo de organización celular, se
diferencia entre células procariotas y eucariotas. Todas las células poseen una membrana plasmática que las separa
del medio externo, material genético (ADN) y orgánulos celulares, que les permiten llevar a cabo las diferentes
funciones celulares (Ej: ribosomas). El medio celular interno es acuoso, se llama citosol o hialoplasma y en él se
encuentran inmersos todos los orgánulos y estructuras.

Imágenes de la estructura y orgánulos que conforman la célula procariota (izq.) y eucariota (der.).

Las células procariotas se clasifican en el grupo Bacteria y Archaea. Se caracterizan por presentar una pared celular
que rodea a la membrana plasmática, que sirve para proteger la célula. Además, algunas bacterias pueden presentar
una capa proteica extra que envuelve la pared celular, denominada cápsula. Esta cápsula sirve de protección frente a
la desecación y la fagocitosis, favorece la adherencia de la célula al medio y facilita su supervivencia cuando colonizan
a un huésped. La membrana plasmática presenta invaginaciones hacia el citoplasma llamadas mesosomas, en los que
se encuentran enzimas responsables de procesos metabólicos (respiración celular, excreción de sustancias, etc.).
Las células procariotas no poseen núcleo, sino que su ADN se encuentra inmerso en el citoplasma en una región sin
envoltura denominada nucleoide. Además, existen organismos procariotas que poseen moléculas de ADN circular, no
esenciales para la supervivencia de la bacteria en condiciones normales y denominados plásmidos. Un ejemplo de
estos plásmidos son genes de resistencia a antibióticos o metales, y que les permiten sobrevivir cuando se encuentran
en estas situaciones.
Algunas procariotas pueden presentar flagelos, que son filamentos generalmente alargados y poco numerosos,
involucrados en la movilidad celular. En función del nº de flagelos y su disposición en la célula, las bacterias con flagelos
se clasifican en atricas, monotricas, anfitricas, cefatricas, lofotricas y peritricas.

(células monotricas, atricas, anfitricas, cefatricas, lofotricas y peritricas)

Las fimbrias y pili son apéndices pilosos más pequeños. Las fimbrias pueden estar repartidas por toda la superficie
celular, y tienen una función de adherencia tanto a superficies como a otras células. Los pili son más largos que las
fimbrias, y aparecen 1 o 2 por célula. Estos están involucrados en la conjugación bacteriana, mediante la cual se
forma un canal que une dos bacterias, y a través del cual se pueden intercambiar material genético.
El intercambio de material genético entre dos células tiene interés clínico por el desarrollo de resistencia de las
bacterias frente a antibióticos, utilizando mecanismos de intercambio genético entre ellas en presencia de estos
(plásmidos de resistencia). Además de la conjugación bacteriana, existen otros mecanismos de intercambio como la
transformación y la transducción.

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 Mecanismos de intercambio de material genético bacteriano

Célula procariota.

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Las células eucariotas tienen el material genético en el interior del núcleo, separado del citoplasma por la envoltura
nuclear, la cual permite el transporte de moléculas entre el núcleo y el citoplasma. En el citoplasma se encuentran una
gran variedad de orgánulos celulares. La diferencia entre una célula eucariota animal y una vegetal reside en el tipo
de orgánulos celulares presentes.

Además de las estructuras celulares anteriormente vistas, existen otros orgánulos comunes a las células animales y
vegetales:
▫ Retículo endoplasmático (liso/rugoso): sintetiza lípidos y proteínas.
▫ Aparato de Golgi: organiza el transporte intra/extracelular de moléculas.
▫ Mitocondrias: realizan la respiración celular (obtención de energía de la célula).
▫ Lisosomas: digestión celular de diversas sustancias.
▫ Citoesqueleto: estructura filamentosa que se encuentra repartida en el citoplasma. Funciones de movimiento
celular y de movimiento de sustancias en el interior.
▫ Vacuolas: almacenamiento de sustancias y estabilidad celular (control de pH, tamaño celular, etc.)
Por último, las células eucariotas animales poseen orgánulos exclusivos como el centrosoma (organización del
citoesqueleto), y las vegetales poseen cloroplastos (fotosíntesis) y pared celular (celulosa).

Bacterias: morfología, agrupación y estructura bacteriana.

Las bacterias son m.o procariotas de tamaño muy pequeño (0,2µm - 10µm). Los siguientes aspectos de la estructura
de las bacterias son de gran interés para las técnicas de observación y de tinción que se desarrollan durante esta
unidad.

• Pared celular: todas las bacterias a excepción de los micoplasmas presentan esta estructura, que les brinda
protección y permite el intercambio de sustancias. En función de la composición de la pared celular, que
determina el comportamiento de la misma frente a los tintes empleados en la tinción de Gram, las bacterias
se clasifican en grampositivas (Gram +) y gramnegativas (Gram -).
o Bacterias Gram +: la pared celular es gruesa, y está formada por peptidoglicano y enlaces cruzados de
ácidos teicoicos. Las bacterias Gram + quedan teñidas de violeta/azul en la tinción de Gram.
o Bacterias Gram -: la pared celular es delgada. Está formada por peptidoglicano y poseen una envoltura
exterior fosfolipídica con lipoproteínas en la cara interior (unión con peptidoglicano) y
lipopolisacáridos en la cara exterior (propiedades antigénicas). Las bacterias Gram – quedan teñidas
de una coloración rosácea.

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 Similitudes y diferencias estructurales de la pared celular de Gram + (izq.) y Gram - (der.).

La pared celular de los micoplasmas es muy rica en lípidos, lo que le confiere resistencia frente a ácidos y bases. Este
grupo de bacterias requiere de tinciones especiales para su identificación (tinción Ziehl-Neelsen).

• Morfología bacteriana y agrupaciones: en función de su morfología y las agrupaciones que pueden presentar,
las bacterias se clasifican en: cocos (redondeadas. Forman agrupaciones de dos en dos, de cuatro en cuatro,
en cadena, en forma de cubo y de racimo), bacilos (forma de bastón alargado. Se agrupan en filas de dos, en
cadena, etc.), vibrios (forma de coma), espirilos (forma de espiral) y espiroquetas (forma serpenteante).

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 • Formación de endosporas: algunas bacterias Gram + pueden formar endosporas. Son estructuras que
contienen una copia del cromosoma bacteriano y ribosomas. Se generan por esporogénesis en el interior de
la bacteria y se emplean como mecanismos de supervivencia frente a condiciones ambientales físicas y
químicas adversas (luz UV, antibióticos, cambios de pH, etc.). Estas son liberadas del interior de la bacteria en
dichas situaciones y, cuando las condiciones vuelven a ser adecuadas, germinan y se convierten en células
vegetativas viables. Además de permitir la identificación bacteriana en función de su ubicación en el interior
de la bacteria, y de su forma y tamaño, también tienen interés clínico, ya que estas causan intoxicaciones
(toxinas) y enfermedades al ser humano.

• Ribosomas bacterianos: los ribosomas bacterianos tienen una velocidad de sedimentación de 70S, y están
formados por ARNr y proteínas. Se dividen en una subunidad mayor (ARNr 23S y proteínas) y una menor (ARNr
16S y proteínas), y el análisis del ADN codificante de ambos ARNr (23S y 16S) permiten la identificación
bacteriana mediante métodos/técnicas moleculares.

• Requerimientos para el crecimiento bacteriano:

El crecimiento de las bacterias depende de su metabolismo. El conocimiento de los requerimientos metabólicos y las
condiciones de crecimiento de las bacterias nos permite la obtención y conservación de las muestras clínicas, así como
la selección de los medios de cultivo y pruebas más apropiados para su crecimiento e identificación.
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 ▫ Nutrición bacteriana: las bacterias obtienen los sustratos que necesitan del medio externo. Todas las bacterias
requieren agua y ciertos elementos básicos como carbono, fósforo, azufre o nitrógeno. En función de los
requerimientos adicionales, las bacterias pueden ser no exigentes (necesitan algunas moléculas simples como
aminoácidos (aa) o azúcares) o nutricionalmente exigentes (necesitan compuestos más complejos como
vitaminas, cofactores, etc.). Ciertas bacterias se denominan bacterias energéticamente exigentes (Ej:
Rickettsia) porque son incapaces de producir y almacenar energía, y deben tomarla de la célula que infectan.
En cuanto a los requerimientos de oxígeno y dióxido de carbono, las bacterias se clasifican en bacterias
aerobias (necesitan oxígeno), anaerobias facultativas (soportan condiciones anaeróbicas, pero crecen mejor
con oxígeno), microaerófilas (crecen en presencia de bajas concentraciones de oxígeno), aerotolerantes
(crecen en presencia de oxígeno, pero no lo necesitan para vivir), y capnófilas (requieren de oxígeno y un 5-
10% de dióxido de carbono para crecer).
▫ Requerimientos de temperatura (Tª): cada bacteria requiere un rango determinado de Tª para crecer y
sobrevivir. Dicho rango se debe tener en cuenta para el procesamiento y conservación de las muestras clínicas.
Atendiendo a su Tª óptima de crecimiento, las bacterias pueden clasificarse en bacterias psicrófilas (soportan
bajas Tª, 0-20ºC), mesófilas (crecen a Tª intermedias, 20-40ºC), termófilas (soportan altas Tª, +55ºC),
estenotérmicas (solo sobreviven y crecen en rangos de 35-36ºC), euritérmicas (crecen en amplios rangos de
Tª, 0-44 ºC), y extremófilas (crecen en rangos de Tª inferiores a 0 ºC o superiores a 80ºC).

▫ Requerimientos de pH: el grado de acidez o basicidad del medio condiciona y determina el crecimiento
bacteriano. En función del rango de pH en el que pueden crecer, se clasifican en bacterias neutrófilas (pH 5,5
– 8,0), acidófilas (pH 0,0 – 5,5) y alcalófilas (pH 8,0 – 11,5).

▫ Obtención de energía: conocer el mecanismo de obtención de energía bacteriana es fundamental para su

cultivo, aislamiento e identificación en el laboratorio. Existen tres tipos de mecanismos: la respiración aeróbica
u oxidación, que se lleva a cabo en presencia de oxígeno (condiciones aeróbicas o aerobiosis). La realizan tanto
bacterias aerobias como anaerobias facultativas en presencia de oxígeno. La respiración anaeróbica se realiza
en ausencia de oxígeno (condiciones anaeróbicas o anaerobiosis). La realizan tanto bacterias anaerobias
estrictas como anaerobias facultativas en ausencia de oxígeno. La fermentación es un mecanismo anaeróbico,
propio de bacterias anaerobias estrictas o facultativas en ausencia de oxígeno, que se diferencia de la
respiración anaeróbica en que los subproductos finales o metabolitos del proceso de obtención energética
son moléculas orgánicas (etanol, ácido acético, láctico, etc.).

Técnicas de observación microscópica de m.o

Las técnicas microscópicas junto con las tinciones o colorantes empleados en el laboratorio de microbiología clínica
pueden ayudar a detectar los agentes etiológicos de forma rápida y eficaz. En la siguiente tabla se observa la utilidad
relativa de los tipos de microscopio más importantes para cada uno de los cuatro grupos principales de m.o.
Tipo de m.o Microscopio óptico Microscopio óptico Microscopio de Microscopio
(campo claro) (campo oscuro) fluorescencia electrónico
Bacterias + +/- + -
Hongos + - + -
parásitos + - + +/-
Virus - - + +/-

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El microscopio óptico utiliza luz visible para observar las muestras. La luz pasa a través de la muestra, después atraviesa
varias lentes de aumento, y genera una imagen mucho mayor a la de la muestra. El aumento total depende de las
lentes empleadas. El lente objetivo (más próximo a la muestra) de la mayoría de los microscopios ópticos aumenta el
tamaño 100 veces (100X), y la lente ocular la aumenta 1o veces (10X). La combinación de ambas proporciona un
aumento de 1000X que permite visualizar hongos, parásitos y la mayoría de las bacterias, a excepción de los virus que
requieren un aumento de 100000X.

Partes de un microscopio óptico.

Esquema de las lentes presentes en un microscopio óptico y efecto.

El poder de resolución de un microscopio es la mínima distancia entre dos objetos aumentados que se puede
distinguir. El poder de resolución de la mayoría de los microscopios ópticos permite distinguir unas células de otras,
pero no diferenciar estructuras subcelulares. Para conseguir una mejor resolución, se utiliza aceite de inmersión que
se vierte entre el lente objetivo y la muestra fijada.
Otro aspecto clave es el contraste. Los m.o son transparentes en esencia, y es necesario emplear tinciones que los
resalten a ellos y a sus estructuras del resto de la muestra. Sin embargo, las técnicas de tinción no son válidas para la
observación de células vivas. Para la observación de estas, suelen emplearse el microscopio de campo oscuro o de
contraste de fase.
El microscopio de campo oscuro permite observar m.o vivos y no visibles al microscopio de campo claro porque no se
pueden teñir por métodos estándares, o porque quedan distorsionados por las tinciones dificultándose la apreciación
(Ej: observación de Treponema pallidum).
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El microscopio con contraste de fase permite observar detalladamente estructuras internas de m.o vivos. La imagen
formada contiene zonas muy iluminadas y otras de diferentes tonalidades grises e incluso negras (observación de
hongos).

El microscopio invertido permite realizar observaciones mediante la técnica de gota pendiente. (observación
movimiento bacteriano).

El microscopio de fluorescencia utiliza colorantes fluorescentes (fluorocromos) que se excitan energéticamente con
luz UV, y al regresar a su estado normal liberan el exceso de energía en forma de luz visible (fluorescencia). La
fluorescencia depende del colorante (elección en función del m.o) y filtros de luz empleados. Su principal ventaja es
el gran contraste que consigue respecto al microscopio óptico.

Microscopio de fluorescencia (izq.) e imagen de células teñidas con fluorocromos (der.).

El microscopio electrónico no utiliza luz visible para visualizar las muestras, sino un haz de electrones. Tampoco usa
lentes de vidrio, sino lentes electromagnéticas para enfocar los electrones sobre la muestra. Las imágenes obtenidas
son en blanco y negro, pero su resolución es de 100000X, por lo que son útiles para para la investigación de
características morfológicas de cualquier tipo de m.o. No obstante, debido a su elevado coste, y a que no son
necesarios para el diagnóstico microbiológico (salvo casos de virus o algunos parásitos), son pocos los laboratorios que
cuentan con ellos.

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Examen en fresco y técnica de preparación en gota pendiente.
El examen en fresco es una técnica sin tinciones que se emplea para la observación microscópica de un cultivo de m.o.
Esta técnica se emplea para la visualización de la morfología de uno o varios tipos de m.o y su movimiento dentro de
un medio acuoso. El protocolo para su preparación y observación es el siguiente:
1. Coger un portaobjetos, identificarlo y colocar una gota de agua destilada en la superficie
2. Esterilizar el asa de siembra, comprobar que se ha enfriado y recoger una porción de muestra (colonias) sólida
o líquida, que se extiende en la gota de agua del portaobjetos. Volver a esterilizar el asa de siembra.
3. Colocar un cubreobjetos encima. Colocar una gota de aceite de inmersión en la superficie del cubreobjetos.
4. Llevar al microscopio y colocar la lente en contacto con la gota de aceite de inmersión del cubreobjetos.
5. Una vez finalizada la visualización, limpiar el lente con alcohol y desechar el portaobjetos.

Esta técnica la veremos más profundamente en la práctica 2.2. Examen en fresco y técnica en gota pendiente.
Video de apoyo. Técnica de preparación de un examen en fresco (Youtube):
https://www.youtube.com/watch?v=W5T66qe6vxY&t=17s

Como se ha comentado anteriormente, el examen en fresco puede resultar útil para determinar la presencia de
movimiento celular, la cual puede deberse a la presencia de flagelos. La técnica de preparación en gota pendiente
permite observar dicho movimiento. Para ello, se sigue este procedimiento:
1. Se deposita una gota de medio de cultivo del m.o a analizar en el centro del cubreobjetos.
2. Se coloca múltiples gotas de aceite de inmersión/glicerina por los laterales y equinas del cubre
3. Colocar el portaobjetos excavado que posee una oquedad cóncava encima del cubreobjetos, sin que la gota
con el medio de cultivo llegue a tocar el fondo de la oquedad.
4. Observar en el microscopio. Se puede emplear un condensador más bajo para aumentar el contraste.

Video de apoyo. Técnica de preparación en gota pendiente (con glicerina) (Youtube):

https://www.youtube.com/watch?v=CAKfm77cUoU

Preparación de un frotis o extendido de bacterias a partir de una muestra sólida/líquida.

En la práctica rutinaria, la mayoría de las muestras se analizan a partir de una preparación de la muestra extendida
sobre un portaobjetos, a la que se denomina frotis o extendido.
Para la preparación de un buen frotis, se debe recoger una cantidad de muestra apropiada, suficiente para la
observación de m.o y la justa para que la turbidez no sea excesiva, lo que dificulta la observación. La muestra debe
quedar bien fijada para evitar que se pierda durante el proceso de tinción.
Si la muestra a teñir es la propia muestra del paciente y no se requiere un pretratamiento de la misma, se coloca una
gota sobre el portaobjetos (muestra líquida) o se frota sobre la superficie del portaobjetos (muestra sólida. Ej: hisopo
con mucosa). Si el extendido procede de una muestra de un cultivo sólido, se puede emplear una aguja estéril o el
mismo asa de siembra esterilizada, y homogeneizarlo sobre el portaobjetos con una gota de agua esterilizada. Si la
muestra procede de un cultivo líquido, puede verterse directamente una gota de muestra sobre el portaobjetos, o
recoger una gota del cultivo con el asa de siembra (previamente esterilizada) y extender sobre el portaobjetos.

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La muestra se fija en el portaobjetos empleando metanol o con calor. Para la fijación por calor, puede colocarse el
portaobjetos sobre una placa calefactora (60 ºC/10min) hasta que se seque, o pasar varias veces el portaobjetos por
la llama del mechero Bunsen hasta que seque. En ambos procedimientos el extendido debe quedar en la cara superior
del portaobjetos, sin exponerse directamente a la llama o placa. Para la fijación con metanol, se debe cubrir el
extendido con metanol al 95% durante 1min y, una vez fijado, dejar secar al aire.

Técnicas de tinción para microscopía óptica. Tinción simple, negativa. Tinción de Gram, de Ziehl-Neelsen. Tinción
de cápsulas y esporas.
La técnica de tinción se elige en función del m.o o estructura que se quiere observar, así como el microscopio a
emplear. Como se ha visto, las tinciones empleadas en microscopia óptica emplean colorantes o cromóforos, los cuales
pueden ser ácidos o básicos. Las tinciones se pueden clasificar en: tinciones simples, tinciones diferenciales y tinciones
específicas (microscopía fluorescente).

• Tinciones simples: se emplean soluciones acuosas con un único colorante básico. En ocasiones se puede añadir
un aditivo denominado mordiente, que favorece la unión del colorante al m.o e intensifica la coloración. El
objetivo de una tinción simple es visualizar el tamaño, morfología y tipo de agrupación celular de los m.o. La
técnica consiste en aplicar el colorante durante un tiempo determinado, luego lavar y secar para su posterior
observación al microscopio.

La tinción con azul de metileno es una de las tinciones simples más empleadas. El procedimiento consiste en
cubrir con azul de metileno (1%) el frotis ya fijado, dejar 2min a Tª ambiente y finalmente, lavar con agua
destilada y dejar secar a Tª ambiente.

Tinción con azul de metileno observado al microscopio óptico.

La tinción negativa con nigrosina no emplea cromóforos, sino que emplea sustancias oscuras insolubles que
tiñen el fondo (nigrosina o tinta china). Los m.o contrastan con el fondo teñido, el cual permite su
visualización. Esta técnica se emplea para observar bacterias con cápsula, esporas, flagelos, etc.
En este tipo de tinción, el colorante se añade en la preparación del frotis. Se debe poner una gota del
colorante en el portaobjetos y resuspender en ella una pequeña cantidad de muestra tomada con el asa de
siembra. A continuación, sobre el portaobjetos con la gota se desliza el extremo de otro portaobjetos
formando un ángulo de 45º, de modo que la gota quede extendida formando una fina capa sobre el
portaobjetos. En función del m.o a estudiar, se deja secar el frotis o se observa directamente en húmedo.

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 Tinción negativa con nigrosina observada en el microscopio óptico.
• Tinciones diferenciales: utilizan dos cromóforos de distinto color permitiendo la diferenciación de m.o que,
por sus características estructurales, se tiñen de forma diferente.

La tinción de Gram permite observar y diferenciar la gran mayoría de bacterias, a excepción de las clamidias
(difíciles de hallar fuera de sus células huésped), micoplasmas (bacterias carentes de pared celular) o
bacterias con un tamaño excesivamente pequeño. Esta tinción clasifica a la mayoría de las bacterias en el
grupo de las bacterias Gram + y bacterias Gram -. El procedimiento a seguir es el siguiente:
1. Una vez la muestra está extendida y fijada, sobre ella se aplica el colorante cristal violeta (básico/tinción
violeta azulada). Para ello, cubrir el frotis con la solución de cristal violeta, dejar a Tª ambiente 1min, lavar
el exceso con agua destilada y escurrir el portaobjetos.
2. Se adiciona una solución de yodo denominada lugol como mordiente, que forma un complejo con el cristal
violeta y favorece la unión de esta a la pared bacteriana de las Gram +. Dejar 1min a Tª ambiente, lavar
con agua destilada y escurrir el portaobjetos.
3. Añadir una solución decolorante de alcohol/acetona en proporción 1:1 que elimina el cristal violeta solo
de las Gram -. Dejar actuar 30seg, lavar con agua destilada y escurrir el portaobjetos. Si se deja más tiempo,
se puede provocar la decoloración de las Gram + también.
4. Añadir safranina como colorante de contraste (ácido/tinción rosácea) que tiñe a las Gram – y dejar 2min
a Tª ambiente. Lavar con agua destilada y escurrir el portaobjetos. Dejar secar al aire.
5. Una vez realizada la tinción, la muestra se observa al microscopio óptico con el objetivo de inmersión
(100X) empleando una gota de aceite de inmersión.

Esquema del protocolo a seguir para realizar la tinción de Gram.

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 Observación microscópica de bacterias Gram + (azul) y Gram - (rosa) teñidas mediante la tinción de Gram.

La tinción de Ziehl-Neelsen permite la identificación de bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR). Dentro de

este grupo destacan micobacterias como Mycobacterium tuberculosis (tuberculosis) y Mycobacterium leprae
(lepra). Como ya se ha indicado anteriormente, las BAAR de entre las que destacan las micobacterias poseen
una pared celular muy lipídica (ceras) que las hace resistentes a la coloración. Esta técnica aprovecha la
composición de la pared celular para la diferenciación.
Para preparar esta tinción se requiere un frotis que no sea muy grueso, ya que podría dificultar el proceso de
decoloración, y fijarlo por calor. El procedimiento a seguir es el siguiente:
1. Cubrir el frotis con la solución de carbolfucsina (colorante básico/tinción rojiza). Calentar el portaobjetos
sobre una placa eléctrica o sobre la llama casi hasta llegar a la ebullición, cuando se observe liberación de
vapores. Tras el calentamiento, dejar enfriar a Tª ambiente 4-5min y repetir el calentamiento 2-3 veces.
Después se lava con agua destilada y se escurre el portaobjetos. El calentamiento fluidifica las ceras de la
pared celular de las BAAR, permitiendo al colorante penetrar dentro de la pared celular. Todos los m.o
quedan teñidos de rojo, y su diferenciación es determinada por el diferente comportamiento ante la
decoloración del paso 2.
2. Añadir en frío una solución decolorante de ácido clorhídrico/alcohol al 3-5 %, dejar a Tª ambiente durante
2min. Después se escurre, se lava con agua destilada y se vuelve a escurrir el portaobjetos. Al realizar la
decoloración en frío, las ceras de la pared de las BAAR se solidifican y no dejan salir al colorante en este
paso. Con el resto de las bacterias ocurre lo contrario, por lo que solo quedan teñidas de rojo las BAAR.
3. Se cubre el portaobjetos con azul de metileno como colorante de contraste. Se deja 1min a Tª ambiente,
se lava con agua destilada y se escurre el portaobjetos. Dejar secar al aire.
4. Una vez realizada la tinción, se observa la muestra con un aumento de 400X (objetivo 40X) y confirmar los
m.o sospechosos de estar teñidos de rojo con un aumento de 1000X utilizando el objetivo de inmersión
(100X).

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 Esquema del protocolo para realizar la tinción de Ziehl-Neelsen.

BAAR teñidos de rojo mediante tinción de Ziehl-Neelsen, observados al microscopio óptico.

• Las tinciones especiales se emplean para la coloración de estructuras específicas de los m.o, como la
cápsula, las endosporas o los flagelos.
La composición de la cápsula hace que sea difícil teñirla, por lo que suelen emplearse técnicas de tinción
negativa para detectarlas. Las más empleadas son la tinción con nigrosina, con tinta china o la tinción de
Hiss.
Las endosporas son estructuras especiales que solo pueden ser formadas por algunos géneros bacterianos.
Dichas estructuras, que presentan varias capas impermeables, no pueden ser teñidas por tinciones simples o
diferenciales, ya que los colorantes no penetran al interior celular. Por ello, para teñirlas se requieren
técnicas de tinción con calor, que permitan la penetración de los colorantes en la bacteria.
La técnica más utilizada para la observación microscópica de endosporas es la tinción de Wirtz-Conklin, que
se realiza sobre frotis fijados por calor. Una vez preparado el extendido, se cubre con una solución colorante
de verde malaquita al 5%, que tiñe las esporas de color verde. Para la penetración del colorante, se calienta
el portaobjetos con el mechero durante 5min sin que llegue a ebullición ni se seque. A continuación, se lava
el exceso de colorante y se cubre con una solución acuosa de safranina al 0,5%, el cual actúa como colorante
de contraste tiñendo células vegetativas. Finalmente se lava con agua y se deja secar. Al observar al
microscopio, las esporas se detectan en color verde, mientras que las células vegetativas se observan de
color rojizo.

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 Observación microscópica (óptico) de bacterias con endosporas (verde) entre un cultivo de células
vegetativas (rojo).

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