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Revista de la ciencia de la alimentación y la agricultura J Sci Food Agric 88: 1415–1422 (2008)

Aplicación de la metodología de
respuesta superficial para optimizar la
hidrólisis del gluten de trigo y caracterización de
fracciones hidrolizadas seleccionadas
´ 1 y Mar´ÿa C An˜on´ 2,3
Silvina R Drago, 1.3 ÿ Rolando J González
1Instituto de Tecnolog´ya de Alimentos, FIQ-UNL, 1ÿ de Mayo 3250 (3000) Santa Fe, Argentina
2CIDCA calle 47 y 116, La Plata, Argentina
3CONICET

Resumen

ANTECEDENTES: El objetivo de este trabajo fue optimizar las condiciones experimentales de hidrólisis para obtener hidrolizados de gluten de trigo
y caracterizar fracciones de hidrolizados con diferentes grados de hidrólisis para desarrollar ingredientes funcionales proteicos. Se utilizó la
metodología de respuesta de superficie para analizar el efecto de los factores de reacción en el grado de hidrólisis para evaluar las condiciones para
la actividad máxima de la enzima proteasa fúngica.
Se prepararon hidrolizados que tenían tres índices de ácido tricloroacético (TCAI) diferentes. Las fracciones solubles a pH 4, 6,5 y 9 de estos
hidrolizados se caracterizaron mediante electroforesis, cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa, contenido de grupos amino libres y
longitud de la cadena peptídica.

RESULTADOS: Los rangos de temperatura y pH para la actividad enzimática más alta a las 2,5 h fueron 54–58 ÿC y 4,2–4,4, respectivamente.
La composición de la fracción hidrolizada difiere según el grado de hidrólisis y el pH de extracción, siendo la diferencia más pronunciada a bajo
TCAI. El hidrolizado con un 32% de TCAI está compuesto por péptidos cuyo tamaño es inferior a 18,5 kDa, con una longitud de cadena peptídica
promedio de 14 residuos de aminoácidos.

CONCLUSIÓN: La combinación del grado de hidrólisis y el pH de extracción permite obtener fracciones de diferente composición peptídica, que
podrían ser tenidas en cuenta a la hora de buscar una composición definida relacionada con determinadas características funcionales.

ÿ 2008 Sociedad de la Industria Química

Palabras clave: hidrólisis; gluten de trigo; enzimas; diseño experimental; metodología de respuesta de superficie

INTRODUCCIÓN El la tradicional química.4,5 Aunque se pueden utilizar diferentes

gluten es uno de los productos obtenidos del proceso de molienda
húmeda del trigo, que consta de varios pasos: hidratación de la
harina, formación del gluten, lavado y secado del gluten vital final
en condiciones suaves, lo que garantiza que se conserven las
propiedades viscoelásticas únicas.
Se utiliza especialmente para mejorar las harinas panificables
comerciales de trigo de calidad media y, también, para reforzar las
propiedades viscoelásticas en formulaciones especiales1,2 que
requieren propiedades funcionales relacionadas con la
viscoelasticidad o vitalidad del gluten.3 Debido al precio relativamente
bajo del gluten en comparación con otros ingredientes proteicos,
existe interés en ampliar el ámbito de aplicación del gluten mediante
transformaciones estructurales que podrían aportar otras propiedades
funcionales.
La hidrólisis es una de las alternativas que permiten la
modificación de proteínas, la cual puede llevarse a cabo ya sea por
métodos químicos (ácidos o alcalinos), físicos o enzimáticos,
presentando estos últimos notables ventajas sobre
proteasas de grado alimentario, la única información disponible
habitualmente es la que ofrece el fabricante, que se limita a las
condiciones de uso basadas en
ensayos realizados sobre un sustrato estándar, cuyas características
estructurales difieren de las correspondientes al sistema proteico
en estudio.
Controlando las condiciones de reacción durante la hidrólisis
enzimática, se pueden obtener hidrolizados de diversas
características. El grado de hidrólisis de la proteína depende del
uso esperado del hidrolizado, 6,7 y se requieren bajos grados de
hidrólisis para mantener las propiedades funcionales.8,9
El objetivo del presente trabajo fue optimizar las condiciones
experimentales de hidrólisis para obtener hidrolizados de gluten de
trigo utilizando la metodología de respuesta superficial y caracterizar
fracciones de hidrolizados con diferentes grados de hidrólisis para
desarrollar ingredientes proteicos funcionales.

* Correspondencia a: Silvina R Drago, Instituto de Tecnolog´ÿa de Alimentos, FIQ-UNL, 1ÿ de Mayo 3250 (3000) Santa Fe, Argentina E-mail:
sdrago@fiq.unl.edu.ar (Recibido el 11 de octubre de 2007 ; versión revisada recibida el 6 de febrero de 2008; aceptada el 7 de febrero de 2008)

Publicado en línea el 18 de abril de 2008; DOI: 10.1002 / jsfa.3233

ÿ 2008 Sociedad de la Industria Química. J Sci Food Agric 0022–5142 / 2008 / $ 30,00
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´
SR Drago, RJ Gonzalez, MC A n˜on´
EXPERIMENTAL La
enzima utilizada en los experimentos, proporcionada por
´
Genencor SA (Arroyito, Córdoba, Argentina), es una proteasa
fúngica derivada de Aspergillus oryzae (31.000 UH g ÿ 1). La
actividad se expresa en unidades de hemoglobina, donde 1 HU
es aquella actividad que liberará 0,0447 mg de nitrógeno no
proteico en 30 min en las condiciones del ensayo (hemoglobina
desnaturalizada, pH 4,7; T: 40 ÿC). La enzima es una mezcla de
endo/exopeptidasas cuyas características son las siguientes: pH
efectivo 3,5–9, pH óptimo 4,3–5; rango de temperatura 30–50
ÿC.
Como sustrato se utilizó gluten vital comercial, proporcionado
´
por Molinos Semino SA (Carcaran˜a, Santa Fe, Argentina). La
composición del gluten fue la siguiente: humedad 5,95 %
(método AACC 44-15A); 10 proteína (N × 5,7) 77,20 % en base
seca (db) (método Kjeldahl – AACC 46-11); 10 almidón 13,15 %
db (método Ewers polar método); extracto etéreo 0,71% db
(método AACC 30-25); 10 y ceniza 0,834% db (ICC No.
104 – IRAM No. 15 851, norma técnica).
Tratamiento térmico del gluten vital Para
dispersar el gluten vital en agua y asegurar una suspensión
uniforme, se realizó un tratamiento térmico moderado. El gluten
vital se colocó en tubos cilíndricos (16 mm de diámetro) con
tapón de rosca, los cuales se colocaron en un baño de agua
hirviendo durante 15, 25 y 35 min. A continuación, la muestra se
enfrió colocando los tubos en un baño de agua a 21 °C. Para
estimar la intensidad del tratamiento térmico, se analizó el
impacto en las propiedades viscoelásticas de cada muestra
mediante un alveograma, realizado con un alveógrafo de Chopin
(París, Francia), que utilizó como modelo una mezcla de gluten-
almidón. El tiempo de tratamiento térmico se seleccionó en
función de la capacidad del gluten tratado para formar una
dispersión uniforme, considerando el alveograma como indicador
de la intensidad del tratamiento térmico.
Efecto de las variables operativas en el grado de
hidrólisis según lo estudiado por diseños experimentales
Se utilizó la metodología de respuesta superficial para analizar
el efecto de los factores de reacción (pH, temperatura y tiempo)
en el grado de hidrólisis con dos diseños experimentales.11
Diseño experimental 1, 'compuesto central estrella de cubo
bloqueada', consistió en un total de 20 experimentos que
incluyeron 15 tratamientos con cinco puntos centrales adicionales.
Los niveles de los factores de reacción se seleccionaron teniendo
en cuenta los datos de pH y temperatura suministrados por el
fabricante, y el tiempo, que osciló entre 2 y 5 h, considerando
una variación de tiempo entre cada nivel experimental suficiente
para mostrar la diferencia entre cada tratamiento. Para ser más
precisos en la evaluación de la actividad enzimática máxima
para este sustrato en particular, se utilizó un segundo diseño
experimental, 'diseño compuesto central 22 + estrella', usando
pH (entre 3 y 5) y temperatura (entre 35 y 55 ÿ C) como variables
independientes, con un total de 11 experimentos (nueve
tratamientos con un
1416
dos puntos centrales adicionales). El tiempo se mantuvo
constante (2,5 h). Los datos obtenidos fueron modelados por
una función polinomial de segundo grado. En cada caso, la
hidrólisis se llevó a cabo en un sistema discontinuo de laboratorio
con control de temperatura y agitación. La concentración de
proteína fue del 5% y la relación enzima/sustrato (E/S) del 3%,
ajustándose el pH con HCl o NaOH, según fuera necesario. Se
llevó a cabo un blanco de reacción paralelo.
Progreso de la reacción de hidrólisis
Se siguió el progreso de la hidrólisis por medio del índice de
ácido tricloroacético (TCAI), utilizando TCA al 20% y diluyendo
la muestra en proporción 1:1. El N se midió por el método
Semimicro – Kjeldahl. El TCAI, que se utilizó como medida
indirecta del grado de hidrólisis (DH), se calculó de la siguiente
manera:
TCAI = [N soluble en TCA (hidrolizado)
- N soluble en TCA (blanco)
× 100] / N amínico total
Relación enzima/sustrato
Las condiciones seleccionadas del diseño experimental fueron
pH 4,25 y temperatura 55 ÿC y concentración de sustrato [S] del
5%. Las relaciones E/S en estudio fueron 1,87%, 3%, 3,75%,
5% y 10% (p/p). El TCAI se determinó utilizando Lowry et al.
técnica12 para medir la concentración de proteínas.
Preparación de hidrolizados Los
hidrolizados se prepararon en un reactor discontinuo de 5 L con
agitación, utilizando un baño termostatizado mantenido a una
temperatura constante de 55 ÿC. Se añadió HCl (3 mol L ÿ 1)
para mantener un pH constante de 4,25. Se utilizó una
concentración de proteína del 8% (p/p) y relación E/S del 5%.
Los hidrolizados se obtuvieron a diferentes tiempos de reacción:
31 min, 2 hy 6 h La inactivación enzimática se realizó a 70 ÿC
durante 15 min. Los hidrolizados se congelaron a -20 ÿC y se
liofilizaron.
Preparación de fracciones a diferentes pH Para
obtener fracciones de hidrolizados a diferentes pH (4, 6,5 y 9)
se preparó una solución al 2% (p/p, db) de los diferentes
hidrolizados.13 El pH se logró adicionando 0,8 mol L ÿ 1 HCl o
0,8 mol L ÿ 1 NaOH. Las muestras se agitaron durante 1 h a
temperatura ambiente y luego se centrifugaron durante 15 min a
8000 × g a temperatura ambiente. El sobrenadante (el extracto
en cada pH) se congeló y se determinó el contenido de proteína
utilizando el método semimicro-Kjeldahl.
Caracterización de fracciones solubles a diferentes pH de
gluten tratado térmicamente (TTG) e hidrolizados
Dodecilsulfato de sodio – electroforesis en gel de poliacrilamida
(PÁGINA SDS) (EF)
La electroforesis se realizó de acuerdo con
Laemmli, 14 en un sistema de tampón de gradiente de 4-15% utilizando un
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Hidrolizados de gluten de trigo y caracterización de fracciones seleccionadas
Celda de electroforesis Mini-Protean II (Bio-Rad, Hercules, CA,
EE. UU.) con una fuente Modelo 200/2.0 Bio-Rad. Las placas de
gel se fijaron y tiñeron con una solución que contenía Coomassie
Blue R 250 al 0,125 %, metanol al 50 % y ácido acético al 10 %
en agua.
Los extractos de pH se mezclaron con tampón de muestra que
contenía tampón de apilamiento, glicerol y azul de bromofenol,
utilizando una dilución de 1,33, con o sin 5% de ÿ-mercaptoetanol.
Las mezclas se calentaron en un baño de ebullición durante 90 sy
se cargaron.
Cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RP-
HPLC) de extractos Los extractos se diluyeron a una
concentración de proteína (N × 5.7) o 2.5 mg mL - 1. Se utilizó
una columna Sephasil péptido C8 de 12 STm ST 4.6/250
(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ., USA), junto con un
autoinyector Waters 717 Plus Auto sampler (Millipore, Billerica,
MA, USA), un Waters 600 E bomba (sistema de suministro
multisolvente, Millipore) y un detector de matriz de diodos (Waters
996, Millipore). Los péptidos fueron separados y eluidos a 1.1 mL
min-1, a 60 ÿC, utilizando los siguientes buffers: buffer A:
acetonitrilo – agua 2:98, con 650 µL L-1 de ácido trifluoroacético
(TFA); tampón B: acetonitrilo – agua 65:35 con 650 µL L ÿ 1 TFA,
y detectado a 210 nm. Dado que los perfiles de elución de RP-
HPLC se pueden agrupar en categorías de acuerdo con el
aumento de la hidrofobicidad de los péptidos eluidos, se llevó a
cabo un análisis de 15 cromatogramas integrando las áreas de los
picos en tres secciones de cada cromatograma:
(a) componentes de bajo peso molecular y baja hidrofobicidad: 0–
20 min de rango de elución; (b) componentes de peso
molecular medio e hidrofobicidad media: 20-40 min de rango de
elución;
(c) componentes de alto peso molecular y alta hidrofobicidad: 40–
60 min de rango de elución.
Los resultados se expresaron como porcentaje de cada sección
con respecto al área total.
Determinación del contenido de grupos amina
libres Para este fin se utilizó la técnica del o-ftaldialdehído
(OPA)16 . Se usó el contenido de grupos de amina libre para
calcular el número de enlaces peptídicos escindidos durante la
hidrólisis.
Estimación de la longitud de la cadena peptídica (PCL)
PCL se puede estimar mediante la siguiente expresión: 17
PCL (fracción soluble) = 100 × S / (h / htot)%
donde htot es el número total de enlaces peptídicos en el sustrato
proteico (8,3 mEq g ÿ 1 proteína), h es el número de enlaces
peptídicos escindidos durante la hidrólisis y S es la fracción de
proteínas solubles.
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Análisis estadístico Se
utilizó el software Statgraphics Plus 3.0 para el análisis estadístico.
El efecto de las variables sobre el TCAI se analizó mediante la
metodología de superficie de respuesta y se utilizó la prueba de
diferencia mínima significativa (LSD) para determinar las
diferencias estadísticas entre muestras (p <0,05).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tratamiento térmico del gluten vital La
tabla 1 muestra los resultados de las pruebas alveográficas. Se
observa un aumento significativo de la fuerza del gluten (P) ,
incluso con un ligero tratamiento térmico (15 y 25 min).
Estos resultados concuerdan con los reportados por Autran y
18 Berrier.19 por Jeanjean et al.
El tratamiento térmico también produjo una disminución de la
energía total absorbida (W) y del índice de hinchamiento (G). Los
valores correspondientes a las muestras de 15 y 25 min fueron
similares; sin embargo, un tratamiento de 35 min resultó excesivo,
lo que explica la caída de P y también indica una disminución en
la capacidad de formación de masa.
El aumento de la relación P/G al inicio del proceso de
desnaturalización térmica está relacionado con la disminución de
la cohesividad. Estos resultados indican que la disminución de la
capacidad de formación de gluten provocada por el tratamiento
térmico está mejor descrita por G y W. El gluten tratado durante
25 min produjo un diagrama alveográfico similar al observado
frecuentemente en muestras de trigo tomadas de silos con
sobrecalentamiento. La calidad panificable del gluten podría estar
asociada a la formación de agregados entre las distintas fracciones
proteicas 21 , lo que podría ser resultado de la polimerización por
intercambio sulfhidrilo – disulfuro.22 El tratamiento térmico
seleccionado fue de 25 min, ya que se obtuvo una mejor dispersión
del gluten en comparación con el correspondiente a 15 min, que
parece insuficiente para una fácil dispersión, y además con el
tratamiento de 25 min no se sobretrata el gluten como en el caso
del tratamiento de 35 min.
Efecto de las variables operativas sobre el grado de
hidrólisis según lo estudiado por diseños experimentales
La Tabla 2 muestra los resultados de TCAI correspondientes al
diseño experimental de estrella de cubo bloqueado compuesto
central. Se observa que el valor más alto de TCAI se obtuvo para
un extremo del diseño (pH 3.8 y 40 ÿC) y los más bajos rondaron
el pH 6.5
Tabla 1. Prueba alveográfica
Muestra WP G P/G
Gluten vital 172c 82b 15.5c 5.29a
15 min gluten 135b 111c 11b 10.1c
25 min gluten 135b 119d 10b 11.9d
35 min gluten 35a 71a 8.5a 8.35b
W, energía total absorbida; P, fuerza; G, índice de hinchazón; P/ G, índice
de equilibrio alveográfico.
Para cada columna, letras diferentes representan diferencias significativas
entre las muestras (p <0,05).
1417
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SR Drago, RJ Gonzalez, MC A n˜on´

Tabla 2. Resultados de TCAI correspondientes al compuesto central Gráfico de Pareto estandarizado para TCAI
Diseño experimental de estrella de cubo bloqueado. [S] = 5%, E/S = 3%
R: pH
Automóvil club británico

Experimento No. pH Temperatura. ()C) Tiempo (h) TCAI B: temperatura

AB
C: tiempo
1 6.5 40 3.5 3.29 C.A.
2 8.0 32 2.0 0.44 cama y desayuno

ANTES DE CRISTO

3 8.0 32 5.0 1.05 CC

4 5.0 48 2.0 11.20 0 4 8 12 dieciséis 20 24
5 5.0 48 5.0 17.00 Efecto estandarizado
6 6.5 40 3.5 2.60
7 5.0 32 5.0 9.65 Figura 1. Diagrama de Pareto correspondiente al bloque compuesto central
8 8.0 48 2.0 0.70 diseño experimental cubo estrella. [S] = 5%, E/S = 3%; TCAI,
9 8.0 48 5.0 1.35 índice de ácido tricloroacético.

10 5.0 32 2.0 4.62

11 6.5 40 3.5 2.42
12 6.5 40 3.5 2.22
13 6.5 25.5 3.5 1.07 30
25
14 9.2 40 3.5 0.90
20
15 6.5 54.5 3.5 5.30 15
dieciséis 6.5 40 3.5 2.85 10
5
17 3.8 40 3.5 17.08 0
18 6,5 40 6,21 3.56 temperatura °C
25303540455055
3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5
19 6,5 40 0,79 0.73 pH
20 6,5 40 3,5 2.96
Figura 2. Respuesta de superficie para TCAI en función del pH y
temperatura, durante 3,5 h, correspondiente al compuesto central bloqueado
diseño experimental cubo estrella. [S] = 5%, E/S = 3%; TCAI,
índice de ácido tricloroacético.

o mas alto. El diagrama de Pareto (Fig. 1) muestra que el pH

es la variable de mayor impacto, tanto en su forma lineal
Tabla 3. Resultados de TCAI correspondientes al compuesto central
y término cuadrático. Los efectos de las tres variables diseño experimental 22+ estrella. [S] = 5%, E/S = 3%
fueron significativas, particularmente en el caso de la lineal
términos, el término cuadrático de pH y las interacciones Experimento No. pH Temperatura. ()C) TCAI

pH × temperatura y pH × tiempo. El tiempo cuadrático 1 4.25 45 17,600

término e interacción tiempo × temperatura, en el 2 3.0 35 12,484
por el contrario, no fueron significativas (P <0.05). Figura 2 3 3.0 55 12,630
muestra la superficie de respuesta para TCAI como una función 4 5.5 35 3,886
de pH y temperatura, durante 3,5 h Un mínimo de TCAI 5 5.5 55 13,568
se observó alrededor de 6.5–7.5 y baja temperatura. 6 4.25 45 17,466

Bombara, de 23 años que trabaja con harina de trigo, informó 7 4,25 30,9 8,500
8 4,25 59,1 20,036
Valores de TCAI a 54 ÿC, pH 6,5 y tiempo inferior a 6 h.
9 2,48 45 9,060
Sin embargo, Adler-Nissen, de 17 años que trabaja con proteína de soya
10 6,02 45 3.860 o más común

y una enzima derivada de A. oryzae, encontró que

11 4.25 45 17,000
la DH obtenida a pH 7 fue similar a la de
pH 5. En el presente trabajo, el TCAI obtenido
para pH 7 es sorprendentemente más bajo que el de pH 5,
El polinomio correspondiente a este experimento
esta diferencia probablemente se deba al hecho de que
el diseño fue
Se realizaron experimentos con diferentes sustratos.
y también un método diferente de medir DH.
El punto isoeléctrico del gluten está en torno a pH 7, lo que favorece TCAI% = ÿ46,5172 + 19,1734 × pH + 0,842979
asociación molecular por interacciones hidrofóbicas, × Temperatura - 3,44202 × pH2 + 0,19072 × pH
y los hace menos susceptibles al ataque enzimático
por formación de agregados. De acuerdo a los resultados × Temperatura - 00 147 418 × Temperatura2

obtenido, se obtendrán los valores más altos de TCAI

en el rango de pH entre 3.7 y 5.
La Tabla 3 muestra los resultados de TCAI correspondientes
al central diseño compuesto 22 + estrella. Análisis de
la varianza mostró que las dos variables eran significativas
en cada término y que el coeficiente de correlación fue
r = 0,9907. La figura 3 muestra la respuesta superficial para
TCAI en función del pH y la temperatura, y muestra
un máximo en torno a pH 4,2-4,4 y a 54 y 58 ÿC.
Según la información facilitada por el fabricante, las condiciones
de funcionamiento (pH y temperatura)
de esta enzima incluyen condiciones en las que muy
En el presente trabajo se observó baja actividad. Este
subraya la importancia de comprobar el funcionamiento
condiciones para cada sistema enzima-sustrato particular; La
metodología de respuesta de superficie podría usarse para
encontrar las mejores condiciones.

1418 J Sci Food Agric 88: 1415–1422 (2008)

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Hidrolizados de gluten de trigo y caracterización de fracciones seleccionadas

Tabla 4. Solubilidad de hidrolizados de gluten y gluten tratado térmicamente

20 (TTG)
dieciséis

Muestras pH x ± SD
12
8 TTG 4.0 58,04 ± 0,41 d

4 6.5 5,88 ± 0,13h

9.0 25,58 ± 0,88 g
0 Temperatura. °C
3 3.5 354045505560 TCAI 14% 4.0 80,47 ± 0,28a, b
4 4,5 pH 5 5.5
6.5 35.87 ± 0.06f
9.0 57,77 ± 0,37 d
TCAI 22% 4.0 81,01 ± 0,50a
Figura 3. Respuesta de superficie para compuesto central experimental 6.5 53,74 ± 0,32e
diseño 22 + estrella. [S] = 5%, E/S = 3%; TCAI, ácido tricloroacético 9.0 73,88 ± 0,63c
índice.
TCAI 32,6% 4.0 77,58 ± 0,16a, b
6.5 67,54 ± 0,69b,c
Selección de relación E/S 9.0 79,94 ± 0,06a
La figura 4 muestra las curvas de hidrólisis correspondientes a
Letras diferentes representan diferencias significativas entre las muestras.
diferentes relaciones E/S a pH 4,25 y 55 ÿC, expresadas como
(P <0,05); x ± SD, media de triplicado ± desviación estándar.
porcentaje (% p/p). Se observa que el TCAI aumenta
con un aumento en E/S. Sin embargo, al seleccionar el
a otros valores de pH. La enzima podría hidrolizar
concentración de enzima para alcanzar un grado particular
la proteína, produciendo polipéptidos de gran tamaño, cuyas
de hidrólisis, la relación eficacia – economía
solubilidad es más dependiente del pH, junto con pequeñas
hay que tener en cuenta. Una enzima superior
péptidos La dependencia del pH podría estar asociada
La concentración podría utilizarse para aumentar
no sólo con el tamaño de los péptidos producidos por
tasa de hidrólisis, pero en este caso un análisis de costos de 15
hidrólisis sino también su carga neta. Linares et al.
materia prima frente a la velocidad de reacción debe llevarse
trabajando con hidrolizado de gluten de trigo (DH 1,4%,
afuera. En nuestro caso, se eligió una relación E / S del 5% porque
medido como el aumento de los grupos amino libres),
se consideró que era una proporción razonable, aunque
observó que un incremento de pH de 4 a 6.5 producía
con productos de alto valor añadido (por ejemplo,
una disminución en la solubilidad de los más hidrofóbicos
péptidos con funciones específicas) una mayor relación E / S
péptidos La disminución del tamaño molecular permite hidrolizados
podría ser seleccionado.
a obtener que sean más solubles que los
proteínas nativas y dentro de un rango de pH más amplio. Él
Análisis de hidrolizados y solubilidad perfil de solubilidad de la proteína parcialmente hidrolizada
Se prepararon tres muestras de hidrolizado bajo el mejora a lo largo de toda la escala de pH, siendo generalmente
condiciones previamente seleccionadas (pH, temperatura y mayor con mayor TCAI, ya que la proteína no
E/S) para tiempos de 0.5, 2 y 6 h y sus TCAI fueron no formar grandes agregados incluso en el isoeléctrico
14%, 22% y 32,6%, respectivamente. pH. El aumento de solubilidad obtenido a partir de una cantidad limitada
La Tabla 4 muestra las solubilidades de proteínas correspondientes La proteólisis se atribuye a la formación de
al gluten tratado térmicamente y a los tres hidrolizados. unidades polipeptídicas más pequeñas e hidrófilas
A pH 6,5 (región del punto isoeléctrico), hidrolizar o péptidos hidrófobos solubles, 24 así como la
la solubilidad siempre fue menor que la correspondiente disrupción de los agregados proteicos.25

Caracterización de fracciones solubles a diferentes

30
pH del gluten tratado térmicamente (TTG) y
25 hidrolizados
PAGINA SDS
20
Al observar el patrón de electroforesis correspondiente al gluten no
hidrolizado (TTG) (Fig. 5 (a),
15
carriles 4, 5 y 6), sin mercaptoetanol (ME), un
10 se puede observar tinción difusa para los extractos obtenidos
a los tres valores de pH. Estos podrían atribuirse
5 a la presencia de agregados proteicos distribuidos a lo largo
el rango de los pesos moleculares (MW) en estudio.
0
Al usar ME (Fig. 5 (b), carriles 4, 5 y 6) estos
0 20 40 60
los agregados se rompen y forman bandas bien definidas,
Tiempo (min)
que muestran que los puentes disulfuro pueden estar involucrados en
1,87% 3% 3,75% 5% 10% su formación. Además, el pH tiene una marcada influencia
sobre las fracciones de proteínas solubilizadas. los extractos
Figura 4. Efecto de la relación E/S (% p/p) sobre TCAI; [S] = 5%, pH = 4,25, a pH 4 y 9 tratados con ME (Fig. 5 (b), carriles 4 y
T = 55 ÿC; TCAI, índice de ácido tricloroacético. 5) están formadas por componentes de MW superiores a 94

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e inferior a 14,4 kDa, y el extracto a pH 6,5 (Fig. 5 (b), carril 6)
está formado principalmente por componentes cuyo PM está en
torno a 43 y 14,4 kDa.
Las diferencias entre las fracciones extraídas a pH 4 y 9 son
particularmente evidentes en el rango de PM
26
entre 67 y 30 kDa. Según Cornec et al, las gliadinas están
presentes entre fracciones de 30-40 kDa, excepto la ÿ-gliadina,
que está presente en las fracciones ricas en gluteninas. Las
gluteninas de alto peso molecular están presentes en fracciones
de más de 50 kDa y las de bajo peso molecular están presentes
dentro del rango de 40 a 43 kDa. Las fracciones inferiores a 20
kDa no son proteínas de almacenamiento, sino proteínas de
unión a membrana y lípidos.
Los extractos a pH 9 y 4 de hidrolizado con TCAI = 14,1%
(Fig. 5 (a), carriles 1 y 3, respectivamente) tienen componentes
de PM superiores a 43 kDa que, al ser tratados con ME (Fig. 5
(b) , carriles 1 y 3), muestran que correspondían a subunidades
de PM por debajo de 43 kDa, unidas por puentes disulfuro. Es
decir, con una hidrólisis baja, los extractos a estos pH presentaron
componentes de alto PM, que correspondieron a fracciones de
gluteninas asociadas a S – S, aunque ya hidrolizadas. Los
extractos a pH 4 y 9 tienen diferentes componentes entre 40 y
30 kDa. En el caso de la fracción de pH 6.5 (Fig. 5 (b), carril 2) el
extracto
(un) S123456
kDa
94
67
43
30
20,1
14,4
Los polipéptidos están formados principalmente por monómeros
de PM inferior a 20,1 kDa, aunque muestran una dispersión de
PM, como los componentes de los extractos a pH 9.
Los extractos de hidrolizados con mayor TCAI (22% y 32,6%)
tuvieron componentes cuyo PM es superior a 43 kDa (no se
muestra la electroforesis sin EM), que corresponden a
asociaciones puente S – S de péptidos cuyo PM es inferior a 43
kDa para TCAI 22% e inferior a 20,1 kDa para TCAI 32,4%. Esto
se muestra en la Fig. 6 para muestras tratadas con ME. En todos
los casos parece haber componentes de 14,4 kDa, que no se
hidrolizan, ya que siempre hay una banda correspondiente a ese
MW.
Los extractos a pH 4 y 9 son similares pero se diferencian del
de pH 6,5, este último carece de los componentes correspondientes
a la zona de 20-40 kDa (ITCA 32,6%) o tiene cantidades bajas
de ellos (TCAI 22%), siendo esto probablemente relacionado con
la presencia de un tamaño peptídico limitante para la acción
enzimática en el rango de grados de hidrólisis evaluados en este
trabajo.
Longitud media de la cadena
peptídica La Figura 7 muestra la longitud media de la cadena
peptídica de la fracción soluble. Los extractos a pH 6,5 para el
mismo TCAI tienen los péptidos con los tamaños más pequeños.
Para el hidrolizado con 32,6% de TCAI, la extractabilidad de la
proteína no se vio muy afectada por el pH y sus extractos tienen
péptidos de alrededor de 14 residuos de aminoácidos.
La forma de actuar de la enzima se puede observar con el
PCL medido al pH correspondiente al punto isoeléctrico (pH 6,5)
o pH 9, donde la solubilidad del gluten tratado térmicamente es
baja. PCL muestra una rápida disminución con la progresión de
la reacción enzimática durante los primeros 30 min. Este aumento
es entonces más lento, lo que demuestra que los péptidos
solubles se degradan durante la hidrólisis hasta alcanzar una
determinada longitud. Después de eso, la enzima no actuaría
sobre ellos sino sobre los sustratos de mayor PM, lo que aumenta
la solubilidad.

Áreas integradas de RP-HPLC La

(b) S 1 2 3456 Figura 8 muestra las áreas integradas de los cromatogramas de
RP-HPLC. Los extractos a pH 6.5 tienen mayor
kDa
S 1 234 56
94

67 kDa

43 94

67
30
20.1 43
14.4
30

20.1
Figura 5. (a) EF-SDS-PAGE sin mercaptoetanol ni extractos de pH de 14.4
gluten tratado térmicamente (TTG) e hidrolizado (TCAI: 14%). S,
estándar; 1, 14% –pH 9; 2, 14% –pH 6,5; 3, 14% –pH 4; 4, TTG – pH
9; 5, TTG – pH 6,5; 6, TTG – pH 4. (b) EF-PAGE-SDS con Figura 6. EF-PAGE-SDS con mercaptoetanol o extractos de pH de
mercaptoetanol de pH extractos de TTG e hidrolizado (TCAI: 14%). S, hidrolizado (TCAI: 22% y 32,6%). S, estándar; 1, 32,6% –pH 9; 2,
estándar; 1, 14% –pH 9; 2, 14% –pH 6,5; 3, 14% –pH4; 4, TTG – pH 9; 32,6% –pH 6,5; 3, 32,6% –pH 4; 4, 22% –pH 9; 5, 22% –pH 6,5; 6,
5, TTG – pH 4; 6, TTG – pH 6,5. 22% –pH 4.

1420 J Sci Food Agric 88: 1415–1422 (2008)

DOI: 10.1002 / jsfa
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Hidrolizados de gluten de trigo y caracterización de fracciones seleccionadas

40
un
Estos resultados sugieren que la acción enzimática sobre
35 las proteínas del gluten redujo el tamaño de las moléculas de
30 b
gliadina y glutenina. El hidrolizado resultante variaba en
C
PCL
25 composición con el grado de hidrólisis alcanzado, aunque en
20 mi
F general la distribución del tamaño de los péptidos no sería
d
15 gramo
unimodal. Con un TCAI del 32 %, la mayor parte del
10
gramo
horas
hidrolizado está compuesto por péptidos cuyo tamaño es
5 inferior a 18,5 kDa, con un PCL promedio de 14 residuos de
0 aminoácidos. PCL es útil para evaluar el proceso de hidrólisis
0 10 20 30 40 a valores de pH en los que las proteínas tienen una baja
TCAI (%) solubilidad. Sin embargo, es importante señalar que PCL no
representa el promedio de una población unimodal,
pH 4 pH 6,5 pH 9
particularmente a bajos grados de hidrólisis.
Figura 7. Longitud media de la cadena peptídica frente a TCAI. Letras
diferentes representan diferencias significativas entre las muestras (P <0.05).
CONCLUSIONES
Se utilizó la metodología de respuesta superficial para
70 encontrar las condiciones experimentales requeridas para la
60 mayor actividad enzimática para la hidrólisis del gluten de
50
trigo por la proteasa fúngica.
Las fracciones a diferentes valores de pH tenían diferentes
40
área
total
%
composiciones, principalmente a bajo TCAI (14% y 22%), lo
30 que podría tenerse en cuenta al tratar de encontrar una
20 composición definida relacionada con determinadas
características funcionales.
10

0
14_4 22_4 32_4
GTT_4 GTT_9 14_6.5 14_9 22_6.5 22_9 32_6.5 32_9 AGRADECIMIENTOS Este
trabajo fue parcialmente financiado por Proyecto CAI+D
0-20 minutos 20-40 minutos 40-60 minutos 2005-005-25, Universidad Nacional del Litoral, Santa Fe,
Argentina.
Figura 8. Porcentaje de área de cada tramo de eluato (0–20, 20–40 y 40–
60 min) respecto al área total, correspondiente a diferentes extractos a pH
4, 6,5 y 9 de hidrolizados (TCAI: 14%, 22 % y 32,6%) y gluten tratado
térmicamente (TTG). REFERENCIAS

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emulsionantes de fracciones de péptidos de gluten obtenidas por hidrólisis
A medida que aumenta el TCAI, aumenta la cantidad de
enzimática limitada y ultrafiltración. J. Cereal Sci 35: 327–335 (2002).
componentes con hidrofobicidad y PM promedio (zona de
´ ˜ ´
20-40 min), excepto a pH 6,5, donde disminuye. También se 4 Guadix A, Guadix E, Paez-Duenas MP, Gonz alez-Tello P y
´ ´
observa que a medida que aumenta el TCAI se produce una Camacho F, Procesos tecnológicos y métodos de control para la hidrólisis
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clara disminución de los componentes hidrofóbicos (zona ¨
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extractos de pH 6,5. Esto podría atribuirse al patrón de 6 Spellman D, McEvoy E, Cuinn GO y FitzGerald RJ, Proteinasa y exopeptidasa
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tienen componentes de alto y bajo PM, a pH 6,5 las proteínas y pH-stat para la cuantificación del grado de hidrólisis. Int Dairy J 13:
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solubilizadas serían más pobres en componentes hidrofóbicos
de alto PM, y más ricas en componentes de baja 7 Mullally MM, O'Callaghan DM, Fitzgerald RJ, Donnelly WJ y Dalton JP,
hidrofobicidad, lo que se revierte a TCAI 32,6%, cuando Activación de zimógeno en preparaciones endoproteolíticas pancreáticas
aumenta la solubilidad. Se comprueba entonces que durante e influencia en algunas características del hidrolizado de proteína de
las primeras etapas de reacción (TCAI 14% y 22%) esta suero. J Food Sci 60: 227–233 (1995).
´
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enzima hidroliza la proteína, generando componentes de alto ´
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componentes solubles de bajo PM. Con un TCAI del 32,3 %, 9 Lee JY, Duck H y Lee CH, Caracterización de hidrolizados producidos por
la enzima genera péptidos que son solubles (solubilidad tratamiento con ácido suave e hidrólisis enzimática de harina de soja
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