Guia de Biotecnología Molecular (o algo así)

Biotecnología: Obtención de un producto a través de microorganismos

Biotecnología Molecular: Obtención de un producto a través de microorganismos
recombinantes
Ejemplo.
 E. coli productora de insulina
 Cultivos resistencias
 Arroz dorado
 Vacunas recombinantes
Bioinformática, Usos:
 Predecir el resultado de un experimento con programas computacionales
antes de hacerlo en el laboratorio
 Secuenciación
 Alineamiento de secuencias
 Diseño de fármacos
Algunos temas de biología molecular:
ADN: molécula de la herencia, transmite los rasgos hereditarios
La doble cadena se estabiliza por los puentes de hidrógeno entre sus bases
nitrogenadas, que quedan hacia adentro de la doble cadena
Purinas: Adenina y Guanina
Pirimidinas: Timina y Citosina
Adenina se une a Timina (o Uracilo) y forman dos puentes de H
Guanina se une a Citosina y forman tres puentes de H
Por fuera de la cadena queda el esqueleto de azúcar fosfato. Algunos enlaces
importantes para este esqueleto son:
Enlace glicosídico: une el C1 de la desoxirribosa con el N de la base nitrogenada
Enlace fosfodiéster: une el C3 de una desoxirribosa con el C5 de otra, el principal
para la formación del esqueleto azúcar fosfato.
Durante el proceso de TRANSCRIPCION una RNA polimerasa dependiente de
DNA se reconoce una secuencia de reconocimiento a través de un promotor
(como se le conoce en condiciones naturales) o primer (artificial) y se abre la
cadena para una región y producir un RNA
Una cadena de RNA y DNA se puede dividir por CODONES, que consisten en
grupos de 3 nucleótidos consecutivos.
Las cadenas de RNA siempre tienen dos tipos de codones bien conservados:
 Un codón de inicio, que permite que se inicie la transcripción, y también la
traducción, también conocido como Sitio de Unión a Ribosoma (RBS,
Ribosome Binding Site), que siempre es AUG, que codifica a una
metionina.
 Un codón de paro, término, que permite identificar al ribosoma hasta donde
debe llegar la proteína traducida, existen 3 tipos de codones de paro
o UAG
o UGA
o UAA

Considera que U=T

Mecanismos de Regulación
 Algunos organismos, como las bacterias, tienen mecanismos de regulación,
como la proteína Rho, ρ, la cual se coloca sobre el transcrito (RNA) y se
desplaza hasta toparse con la polimerasa, cuando se encuentran, corta el
RNA para terminar la transcripción
 En eucariotas, existe la maduración de ARNm, ya que se necesitan eliminar
los intrones que solo sirven para dar estabilidad al ADN, para esto se
transporta el RNA hasta el ribosoma desde el núcleo, por lo cual existen
dos estructuras que estabilizan el transcrito:
o Cap-5’: También llamado caperuza, es una guanina metilada al inicio
de la secuencia, evita que las exonucleasas degraden el ARNm
o Cola de poli A: Consisten en 100-200 nucleótidos de adenina que se
colocan en el extremo 3’, los cuales le dan estabilidad al transcrito
En el proceso de la TRADUCCIÓN, la cadena de RNAm (RNAm maduro en el
caso de eucariotas) entra en el ribosoma y por medio de anticodones se va
formando la cadena de aminoácidos, unidos por enlaces peptídicos
Donde empezó la traducción (desde el codón AUG), se le conoce como extremo
N-terminal; donde termina es el extremo C-terminal
Los aminoácidos los podemos clasificar según su polaridad, la cual depende de la
cadena que se una al carbono alfa del aminoácido (el carbono que tiene tanto el
grupo amino como el grupo carboxilo).
Tipo de aa Aminoácido Codones 3 letras 1 letra
Sin carga, Glicina GGU Gly G
apolar GGC
GGA
GGG
Alanina GCU Ala A
GCC
GCA
GCG
Valina GUU Val V
GUC
GUA
GUG
Leucina UUA Leu L
UUG
CUU
CUC
CUA
CUG
Metionina AUG Met M
Isoleucina AUU Ile I
AUC
AUA
Sin carga, Serina UCU Ser S
polares UCC
UCA
UCG
AGA
AGG
Prolina CCU Pro P
CCC
CCA
CCG
Treonina ACU Thr T
ACC
ACA
ACG
Cisteína UGU Cys C
UGC
Asparginina AAU Asn N
AAC
Glutamina CAA Gln Q
CAG
Aromáticos Fenilalanina UUU Phe F
UUC
Tirosina UAU Tyr Y
 UAC
Triptófano UGG Trp W
Cargados Lisina AAA Lys K
positivamente AAG
(base) Arginina CGU Arg R
CGC
CGA
CGG
AGA
AGG
Histidina CAU Hys H
CAC
Cargados Aspartato GAU Asp D
negativamente GAC
(ácido) Glutamato GAA Glu E
GAG

Para saber el peso molecular de una proteína MANUALMENTE, multiplica el

número de aminoácidos por 110 Da
Base de Datos: Almacena información de manera organizada para acceder a ella
de manera rápida
Ejemplos:
 NCBI: de EUA
 DDBJ: de Japón
 EMBL: de Europa
 PubChem: Compuestos químicos
Archivo GenBank: Contiene la secuencia nucleotídica que codifica para una
proteína, también aparece la información de esta secuencia. (Considerar que
pueden existir errores en las bases de datos)
Pasos para acceder, porque ¿por qué no?
1. Entra al NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
2. En el buscador, cambia All Databases, por Nucleotide
3. Escoger un gen que quieras investigar, dejen uso el ejemplo del profe y darle
clic, debe aparecer algo así

Cuidado, sé que dice mRNA, pero eso no es mRNA, eso es DNA complementario,
DNAc, para convertirlo en RNA, basta por cambiar las T’s por U
4. CDS: secuencia codificante, Sig_Peptide: péptido señal

Para calcular el número de aminoácidos, cuenta cuántos nucleótidos tiene la

secuencia, dividelo entre 3 y restale 1 (codon de termino)
La aplicación te menciona la traducción en proteína, si es muy pequeño para
verse, puedes picarle en Related information  protein para que se desplieguen
los aa
También puedes copiar la secuencia/proteína en formato FASTA

Este formato sirve para muchos programas, no tiene saltos

Análisis de Restricción: Es el corte de DNA con una enzima de restricción

Aplicaciones:
 Caracterización con plásmidos
 Amplicones
 Clonación
 Recombinación (enzimas de restricción y ligasas)
Recomendaciones: Que la enzima corte 1 ó 2 veces, que no genere bandas
iguales o pequeñas, para que se vean en el gel de corrimiento
No es lo mismo cortar una secuencia lineal que un plásmido circular
 Si corto una secuencia lineal una vez, se forman dos fragmentos, si lo corto
dos veces, se forman tres fragmentos (fragmentos=cortes+1)
 Si corto una secuencia circular una vez, solo se abre el plásmido, si lo corto
dos veces, se forman dos fragmentos (fragmentos=cortes)
WebCutter
1. Entra a http://heimanlab.com/cut2.html
2. Coloca la secuencia en formato FASTA (seguiré con el mismo ejemplo)
Los demás valores recomiendo dejarlos iguales, EXCEPTO el primero, hay que
especificar si se trata de una secuencia lineal o circular
Así se ven los resultados, es más cómodo ir hacia abajo y revisar la lista de
enzimas y escoger de acuerdo a lo que dijimos arriba

NEBcutter tiene la misma función que WEBcutter, pero te permite visualizar el gel
de agarosa que obtendrías
1. http://nc2.neb.com/NEBcutter2/
2. Ingresas la secuencia o el código del GenBank
Igual hay que considerar si es lineal o circular, recomiendo cambiar la opción NEB
enzymes a All commercially available
3. Le das en Submit (a lado del cuadro)

4. Selecciona custom diggest (primer cuadro gris)

Ten cuidado con las que tengan un *, esas pueden actividad Star (que en pocas
palabras significa que puede equivocarse la enzima)
Selecciona una y dale digest (cuadro verde)

Dale en view gel

Así se verá, como verás, mi enzima no fue la mejor, quedó muy juntos los
fragmentos, vuelve a intentarlo

esta estuvo mucho mejor

Consideraciones:
 Poliacrilamida es mejor para detectar diferencias de tamaño
 Cuando aumenta la concentración de agarosa, disminuye la capacidad de
distinguir diferencias en tamaños
Alineamientos
Comparación de 2 o más secuencias de DNA o proteínas
Aplicaciones
 Comparación de genomas
 Conocer la función de una secuencia
 Buscar secuencias conservadas
 Sitios activos
 Árboles filogenéticos
 Fishing genes: buscar zonas concenso
Dos tipos de alineamientos según las secuencias: En pares, múltiples
Dos tipos de alineamientos según el tamaño:
 Global: comparación de una secuencia completa junto a otra
 Local: comparación de una región de una secuencia junto a otra región de
otra
Programas para hacer alineamientos:
Clustal Ω, Bioedit, Mega, Cobalt
CUAL RECOMIENDO: Clustal, https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/
Identidad: cuando en una misma posición de un alineamiento de secuencias se
encuentran 2 bases o aa iguales
Ejemplo 1:
Secuencia 1: atcg
Secuencia 2: acga
25% de identidad

Ejemplo 2:
Secuencia 1: ctcgag
Secuencia 2: ctcag
En este caso podemos agregar un “espacio”
S1: ctcgag
S2: ctc-ag
5/6 ó 83.3% de identidad
Ejemplo:
Secuencia 1: ctcgag
Secuencia 2: tcgagt
Agregamos un “espacio” y desplazamos
S1: ctcgag
S2: -tcgagt
Ahora dividimos entre 7, no 6
5/7 ó 71%
Similitud: cuando 2 aa comparten características químicas semejantes, revisa la
tabla de arriba
Protein Data Bank: Estructuras tridimensionales
Archivo PDB: contiene las coordenadas en el espacio de los atomos de la proteína
Algunos métodos experimentales para determinar estas coordenadas:
 Rayos, Resonancia magnética nuclear
Algunos métodos predictivos
 Modelamiento molecular: usa una estructura 3D como plantilla
 Threading: usa partes de diferentes proteínas
 Ab initio prediction: genera estructuras a partir de secuencias
Visualizadores:
 Swiss PDB viewer (el que usó el profe y no vi porque me sacó)
 Chimie
 Rosmol
PCR: Rx en cadena de la polimerasa. Amplificación de una secuencia específica
de DNA empleando primers (iniciadores, cebadores, oligos)
Aplicaciones: Diagnóstico clínico, alimentos, pruebas de paternidad, Organismos
genéticamente modificados OGM, etc.
Tipos de PCR:
 Punto final
 RT-PCR: de RNA a cDNA
 Real time PCR: # de copias en tiempo real
 qPCR: PCR cuantificable
 PCR multiplex: varios amplicones
 PCR largo >= 5000pb
 PCR in situ
Elementos necesarios para una PCR
 Taq DNA pol, proveniente de una bact. Extremófila, termoestable
 Primers (I y II, forward y reverse)
 DNA sample
 dNTP’s
 Buffer
  MgCl2
 Agua ultrapure
Programa del termociclador
Alrededor de 30 ciclos de la etapa 2
°C T
Etapa 1 Desnaturalizacion 94 5 min
inicial
Etapa 2 Desnaturalización 94 30 seg
Alineamiento o (50-65) (30 seg)
hibridación
Elongación o 72 1 min/kb
extensión
Etapa 3 Extensión final 72 10 min
Etapa 4 Refrigeración 4

Características de los Oligos

 20-30 bases
 Cadena sencilla
 Evitar estructuras secundarias (ej. Hairpins)
 Evitar dímeros de primers
 (G+C) = 50%
 Tm similares (la °C a la cual el 50% de las cadenas de DNA están
separadas)
 Primability (capacidad de iniciar la polimerización, que inicie con una G ó C)
Polimerasas
Existen dos polimerasas comerciales: Taq y Pfu
Act exonucleasa Act correctora TA cloning
5’  3’ 3’  5’
Taq Si No (mutaciones) Si
Pfu no si No

Cómo calcular la T óptima de apareamiento/etapa 2, paso 2 para PCR

Top = 0.3Tmp + 0.7Tmf – 14.9
Donde Tmp = primer de Tm menor
Tmf = Tm de todo el gen
Programa para calcular las temperaturas: OligoCalc
http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html
solo mete las secuencias de los primers y la del gen completo

Escoger la temperatura que dice Nearest Neighbor

Finalmente Calculos de concentración de reactivos de PCR
Es sencillo, haz una regla de 3 simple
Ejemplo: si quiero 25 microlitros de la master mix, tengo buffer al 10X y ocupo el
buffer a 1X:
(25uL*1X)/10X = 2.5 uL
La suma de todos los reactivos debe darte menos de 25uL y lo que sobre lo pones
como agua