Tema - 2 Fundamentos Del Proceso de Fijación Tisular

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Tema 2
Introducción
Principios de la fijación tisular
Tipos de fijación
Líquidos fijadores simples
Otros fijadores
Soluciones fijadoras simples que
contienen formaldehído
Mezclas fijadoras que contienen
formaldehído.
Eliminar el pigmento mercúrico.
Fijación en la microscopia electrónica
Introducción
Una vez que el ser humano ha muerto, las células no son capaces de recuperar las funciones vitales.
Los fenómenos degradativos empiezan una vez ha muerto el ser vivo y lleva a la destrucción de los
diferentes componentes de su cuerpo, hay dos fenómenos muy importantes, la autolisis y la
putrefacción, que, aunque conceptualmente son diferentes, están muy relacionados entre sí. La
autolisis es más precoz que la putrefacción.
Autolisis es el proceso por el cual, después de la muerte, se produce la autodigestión enzimática celular,
tras la salida del contenido lisosómico al citoplasma por rotura de la membrana de estos orgánulos. Se
denomina putrefacción al efecto ejercido por determinadas toxinas y enzimas bacterianas sobre los
tejidos. Los microorganismos son de origen saprófito y se complementan con la autolisis hasta
conseguir la total destrucción celular.
Tanto en la autolisis como en la putrefacción influyen diferentes factores:
 La localización y naturaleza del tejido. Tejidos ricos en enzimas digestivas como el páncreas o
que tienen gran cantidad de gérmenes como el intestino lo sufren con mayor intensidad.
 La temperatura existente en el medio que se encuentran. A mayor temperatura ambiente, mayor
velocidad de autolisis y putrefacción, la temperatura óptima para la actividad enzimática y
bacteriana oscila entre 37 y 42 ºC.
Principios de la fijación
tisular
La fijación tisular consiste en interrumpir los procesos de degradación que aparecen tras la muerte
celular, tratando de conservar la arquitectura y composición tisular lo más próxima posible a como se
encontraban en el organismo vivo.
Debemos tener en cuenta los conceptos importantes.
 Imagen histológica real y equivalente: imagen de cuando el tejido aún se encontraba
vivo, esta imagen es inalcanzable tras el proceso de fijación.
 Imagen equivalente: Obtenida después de la manipulación histológica.
COMPRENDE: Fijación, Inclusión, Corte y Coloración.
La fijación es la etapa más esencial y menos cuidada. En histotecnología cualquier defecto o error puede
ser subsanado, a excepción de los cometidos durante la FIJACIÓN.
El objetivo fundamental de la técnica histológica es conseguir la mayor similitud entre Imagen real y
equivalente.
Condiciones para poder ser considerada imagen equivalente:
1. La constancia: la imagen equivalente ha de observarse en todos los tejidos idénticos obtenidos de
distintos individuos de una misma especia.
2. Reproductibilidad en todas las preparaciones histológicas.
Las imágenes que no cumplen los requisitos de constancia y reproductibilidad deben considerarse
artefactos y cambian de una preparación a otra.
Los artefactos más notables de la fijación son:
- Desgarros y retracciones provocados por la diferencia de retracción que hay en los tejidos, estos
cambios se relacionan con la distinta proporción de agua que tienen los tejidos, potenciados por las
diferencias en las presiones osmóticas del fijador y los tejidos. Ejemplo artefactos de los espacios
Grunhagen- Mingazzini por retracción secundaria del proceso de fijación.
1. No EXISTE un método universal de fijación.
2. No todos los fijadores conservar indefinidamente el tejido, ya que la fijación no equivale a
conservación tisular.
3. Un defecto en la fijación JAMÁS podrá ser corregido.
4. Es INÚTIL realizar un estudio histológico sobre un material con graves defectos de fijación.
Tipos de fijación
Se distinguen dos tipos de fijación tisular dependiendo del estudio microscópico que se vaya a realizar.
1. Fijación histológica o citológica: pretende la conservación de la arquitectura y estructura de los
tejidos y células, sin considerar los cambios moleculares.
2. Fijación histoquímica: es más trascendente para preservar la composición molecular y bioquímica
de los tejidos. Estudios de funcionalismo tisular (histoautorradiografía, histoquímica enzimática) y
estudio de antígenos (inmunohistoquímica).
Además, debemos distinguir entre la fijación inicial o primaria, que se realiza de forma inmediata
sobre tejido fresco, y la fijación secundaria o refijación, sobre tejido ya fijado un segundo fijador
para demostrar algún componente tisular específico o intensificar la fijación inicial.
Hay dos grupos:
1. Fijadores por métodos físicos: se emplea el enfriamiento por congelación de un tejido como
método para detener la autólisis y putrefacción tisular.
Es el método de elección para realizar estudios morfológicos o funcionales en los que se requiera
conservar intacta la estructura antigénica del tejido o su contenido enzimático. La clave de está
fijación es que se realice de forma instantánea, ya que el enfriamiento lento provoca la formación
de microcristales intracelulares de hielo que pueden producir rotura y dilaceración tisular que dificulte
el diagnóstico.
El procedimiento idóneo para fijar tejidos de congelación consiste en utilizar isopentano a -50ºC
como agente de congelación y realizar una fragmentación suficiente de la muestra que se vaya a
congelar, bloques de no más de 3 cm2 de superficie y 3mm de espesor, no debe requerir más de
10 segundos. La congelación directa de los tejidos en nitrógeno líquido los puede volverlos
quebradizos.
El mantenimiento del isopentano debe realizarse en congeladores de -70ºC.
Además de la congelación instantánea existen otros dos métodos más complejos:
 La CRIODESECACIÓN O LIOFILIZACIÓN: Consiste en someter el tejido a dos
manipulaciones complementaria. Fijación instantánea por congelación en nitrógeno líquidoy
desecación por sublimación directa del agua congelada a vapor en una bomba de vacío,
elimina el agua tisular por completo y garantiza una detención de la autólisis y una
conservación indefinida. Este método se recomienda para la fijación y y conservación de
sustancias difusibles intratisulares.
 La CRIOSUSTITUCIÓN: se fundamenta en las sustitución lenta y progresiva del agua
congelada de un tejido por un líquido fijador que en ocasiones puede actuar
simultáneamente como medio de inclusión. Tras la congelación instantánea del tejido en
nitrógeno líquido o isopentano a -50ª, se coloca el tejido congelado en el medio de
sustitución. Generalmente este medio esta formado por alcohol etílico, acetona y
propilenglicol 40% como agente hidrosoluble de inclusión, enfriado a -40ºC.
2. Fijadores por métodos químicos: Actúan desnaturalizando e insolubilizando las proteínas
tisulares, lo cual bloquea la autólisis por inactivación enzimática, además, algunos de estos fijadores
líquidos inhiben el crecimiento bacteriano.
1. Capacidad para BLOQUEAR DE INMEDIATO LA AUTÓLISIS: cuanto mayor sea esta capacidad,
mejor será el agente fijador. El efecto del fijador depende principalmente de su poder para producir
la desnaturalización o flocuación proteica, de forma que la actividad enzimática del tejido quede
paralizada.
2. EFECTO MICROBICIDA, que impide la acción bacteriana desencadenante de la putrefacción.
3. NO PROVOCAR retracciones o distorsiones sobre el tejido que provoquen anomalías en su
arquitectura.
4. INDUCCIÓN DE CAMBIOS EN LA TEXTURA Y COMPOSICIÓN TISULAR que favorezcan la
inclusión, corte y coloración del material histológico.
La primera cualidad se relaciona con la velocidad de penetración y de fijación que posea el agente
fijador.
Se denomina VELOCIDAD DE PENETRACIÓN a la rapidez con la que un fijador se difunde en el
interior de un tejido. El tamaño de las piezas que se ha de fijar deberá ser directamente
proporcional a la velocidad de penetración del tejido. El fijador siempre llega después de haber
comenzado la autólisis.
La VELOCIDAD DE PENETRACIÓN de los distintos fijadores es muy variable:
 La mayor es de los alcoholes y acetona.
 Formalina 0,9mm/hora.
 Acido pícrico y sublimado 0,3 mm/hora.
 La VELOCIDAD DE FIJACIÓN de un agente químico no está siempre en concordancia con su
velocidad de penetración. La formalina penetra relativamente rápido, pero lo fija con lentitud.
 Es un fenómeno químico determinado por el tiempo en que cada fijador tarda en precipitar y
estabilizar los componentes químicos de los tejidos.
 Los fenómenos de retracción o distorsión dependen principalmente de los cambios inducidos
en la presión osmótica de los tejidos, en condiciones normales la presión osmótica de los tejidos
está en torno 300 miliosmoles, se relaciona directamente con su contenido en sales y proteínas.
Por este motivo, cuando se somete un tejido a la acción de un fijador y la presión osmótica no
es coincidente, se establece un flujo de agua entre el fijador y el tejido en función de un
fenómeno de osmosis hasta que las dos presiones se equilibran. Si la presión del tejido es
superior a la del fijador, el agua es arrastrada hacia el interior del tejido, produciéndose un
hinchamiento. Si por el contrario, el agua fluye hacia el fijador ocurre una retracción.
Los efectos potenciadores de la coloración o que favorezcan su inclusión y corte dependen de su
capacidad para provocar desnaturalización proteica que determine el endurecimiento óptimo. El
efecto mordiente de los fijadores produce un incremento de la tinción provocada por un colorante
determinado, debido a esto se seleccionan para cada técnica unos fijadores de preferencia.
Por lo que hemos visto no existe un fijador ideal, cada fijador ofrece ventajas e inconvenientes.
1. Para evitar la autolisis, la muestra debe ser introducida en el líquido fijador lo antes posible.
2. El tejido debe estar cortado en láminas de 0.5 mm de espesor máximo. Si se necesita fijar un órgano
en bloque, realizar incisiones sobre la superficie y apertura de las cavidades internas con el fin de
que el líquido fijador se introduzca rápidamente en el interior de la muestra.
3. Relación del volumen de fijador y la muestra 1/20.
4. Presión osmótica tanto del fijador como del tejido tienen que ser equivalentes.
5. El pH del fijador tiene que ser próximo al del suero fisológico, salvo que su fórmula tenga que
contener ácidos.
6. Tiempo de fijación tiene que ser el idóneo para cada fijador, pero recordar que hay un tiempo máximo
de fijación que no tiene que sobrepasarse.
Este paso tiene el objetivo de eliminar los residuos del agente fijador.
1. Limitar el tiempo de contacto de la muestra con el fijador.
2. Evitar el contacto con los medios de inclusión.
Líquidos fijadores simples
Pueden emplearse de manera individual o formando parte de mezclas fijadoras. Se clasifican en:
Son sustancias muy higroscópicas, eliminan toda el agua provocando la desnaturalización proteica.
Esto va a dar lugar a importantes alteraciones tanto en la organización como en la estructura tisular y
celular. Este tipo de fijadores provocan grandes cambios en la morfología orgánica, sobre todo si se
utilizan de manera individual. Por el contrario, algunos de estos fijadores alteran mínimamente la
estructura antigénica tisular (acetona).
Estos fijadores producen disolución parcial de las grasas, pero los hidratos de carbono tienen una
completa conservación.
La rápida salida del agua del tejido utilizando estos fijadores provoca endurecimiento tisular, además
de desplazamiento y arrastre de sustancias, sobre todo con el glucógeno.
Los fijadores más importantes que actúan por deshidratación tisular son los alcoholes (etílico y
metílico), la acetona y el cloroformo. Los único que pueden emplearse como fijadores simples son
la acetona y el alcohol etílico. El alcohol metílico se utiliza solamente para las extensiones
hematológicas, el cloroformo formando parte de mezclas fijadoras.
4.1.1 alcohol etílico
Es un agente muy volátil, inflamable, transparente, de olor agradable.
Suele utilizarse para la fijación a 70-90º de concentración.
Preserva el glucógeno y la actividad de diversas enzimas, fija los pigmentos y se utiliza en las
extensiones citológicas. Es un buen fijador para técnicas inmunohistoquímicas porque modifica
levemente la estructura antigénica.
Ventajas:
1. Fija y deshidrata el tejido al mismo tiempo.
2. Posee una gran velocidad de penetración.
3. Precipita muy rápidamente las proteínas y el glucógeno.
4. Es un buen agente bactericida.
Inconvenientes:
1. Fuerte reductor (No es compatible con fijadores oxidantes: tetraóxido de osmio, dicromato
potásico).
2.
3.
No fija bien la cromatina, ya que disuelve los ácidos nucleicos.
Endurece y contrae excesivamente los tejidos.
4.
5.
Pierde actividad porque se va diluyendo con el agua.
Carece de efecto mordiente.
6. Da lugar a desplazamiento de sustancias.
4.1.2 ACETONA
Es un agente muy volátil, inflamable, transparente, de olor dulzón.
Se emplea como fijador en las técnicas de inmunohistoquímica e histoquímicos.
Normalmente se utiliza sin diluir a 4 ºC.
Ventajas:
1. Conserva la estructura antigénica y la actividad enzimática.
Inconvenientes:
1. Provoca gran contracción tisular, dando lugar a graves artefactos.
2. Endurece, no superar las 2 horas de fijación.
3. Disuelve las grasas cuando se utiliza a temperaturas mayores de -40ºC, exceptuando los
fosfolípidos y galactolípidos.
Proteínas son anfóteras, su punto isoeléctrico se situa entorno a pH 5.8. En este punto su estabilidad
es mínima (se desprenden del agua ligada a las proteínas) y su disociación máxima. Por esta razón
las soluciones coloidales precipitan porque se agregan ácidos y disminuye el pH.
Todos los fijadores empleados aquí tienen carácter ácido, se utilizan en mezclas fijadores y tienen la
propiedad de tener gran velocidad de penetración y algún poder de decalcificación.
4.2.1 ácido acético
Líquido transparente con olor a vinagre. En su forma puro es conocido como ácido acético glacial. A
10ºC tiende a solidificarse en forma de agujas.
Se emplea en soluciones diluidas entre el 1-5%.
Ventajas:
1. Es el fijador ideal para nucleoproteínas y ácidos nucleicos.
2. Produce edema intersticial que actúa compensando la retracción excesiva provocada por otros
fijadores.
Inconvenientes:
1. Mal fijador de membranas y citoplasmas.
2. Destruye las mitocondrias.
4.2.2 ácido tricloroacético
Se presenta en forma de cristales incoloros muy cáusticos.
Se utiliza en soluciones al 2.5-5%.
Ventajas:
1. Excelente medio de decalcificación.
2. Adecuado para estructuras nerviosas.
Inconvenientes:
1. Disuelve las nucleoproteínas y ácidos nucleicos.
2. Provoca hinchamiento excesivo de los tejidos.
3. Si se lava con agua corriente produce hinchamiento de fibras colágenas, eliminar con 3 baños de
alcohol de 30-60 minutos de duración.
4.2.3 Ácido crómico

Se presenta en forma de cristales de anhídrido crómico. Se utiliza a concentraciones del 2%.
Ventajas:
1. Excelente fijador estructural.
2. Fijador oxidante por esta razón actúa como mordiente.
Inconvenientes:
1. No es compatible con fijadores reductores como el formol y los alcoholes.
2. Presenta una escasa velocidad de penetración.
3. Impregna con una coloración verdosa (lavar abundantemente).
El fijador es un catión metálico, como el cromo, el mercurio o el ácido pícrico.
4.3.1 Cloruro mercúrico o sublimado
Polvo blanquecino muy tóxico. Se emplea en solución acuosa saturada.
Ventajas:
1. Excelente fijador de los caracteres morfológicos celulares es elegido para patologías
hematopoyéticas y renales.
2. Excelente mordiente.
Inconvenientes:
1. No es un buen agente bactericida.
2. Escasa velocidad de penetración es necesario fraccionar el bloque de manera muy cuidadosa
(espesor máximo 5mm).
3. Contrae y endurece los tejidos. No sobrepasar las 4 horas de fijación.
4. Da lugar a precipitados metálicos de color pardo. Para eliminar este precipitado es necesario
realizar un tratamiento del tejido con soluciones alcohólicas yodadas parecidas al Lugol, este
tratamiento recibe el nombre de deszenkerizar.
5. Dificultad para identificar zonas de necrosis tisular, por la intensa eosinofilia que provoca.
4.3.2 Dicromato potásico
Polvo rojo amarillento, potente oxidante.
Se emplea en solución acuosa entre 1-2%. pH óptimo de este agente fijador de encuentra por debajo
de 4.4.
Ventajas:
1. Efecto mordiente.
2. Excelente fijador para los lípidos complejos, también para mielina, mitocondrias y aparato de
Golgi.
3. Imprescindible para demostrar la reacción cromafín y hacer las técnicas de Golgi de
impregnación argéntica de las células de sistema nervioso central.
Inconvenientes:
1. No es compatible con agentes reductores como alcoholes o formaldehído, ya que es un
potente oxidante.
2. Endurece poco los tejidos y presenta baja velocidad de penetración.
3. Produce artefactos tisulares, formación de vacuolas, retracciones y cambios en la morfología,
4. Disuelve la cromatina, cuando la solución no está acidificada.
5. Produce pigmento verde. Lavar abundantemente en solución salina o tamponada.
4.3.3 Ácido pícrico
Es el 2, 4,6-trinitrofenol. Se presenta como agujas cristalizadas de tonalidad amarilla. Son explosivas y
muy tóxicas.
Se emplea en solución saturada al 2%.
Ventajas:
1. Excelente fijador estructural. Preserva muy bien la composición proteica.
2. Óptima contracción de los tejidos.
3. Buena velocidad de fijación, velocidad de penetración baja.
4. No disuelve el glucógeno ni los lípidos. Muy buen fijador de estos.
5. Tiene acción decalcificante.
6. Presenta gran estabilidad.
Inconvenientes:
1. Es explosivo.
2. No fijar tejidos frágiles.
3. Tiempo óptimo de fijación 4-18 horas. Si se sobrepasa provoca retracción tisular y destruye los
precipitados cálcicos y la hemosiderina.
4. Eliminar por completo antes la inclusión en parafina, sino provoca deterioro estructural de la
muestra que la deja inservible semanas después. Eliminar con lavados de alcohol 70-80% o
solución saturada de carbonato de litio en alcohol 70%.
5. Incompatible con la inclusión en celoidina.
4.3.4 Acetato de uranilo
Solo se utiliza para técnicas de microscopia electrónica. Se encuentra en forma de cristales de tonalidad
amarilla muy solubles en agua y que se descomponen con la luz.
Se emplea en solución acuosa al 2-3%.
Se define reticulación cuando la desnaturalización de las proteínas no se produce por precipitación,
sino porque el agente que da lugar a este paso induce la rotura masiva de los puentes de hidrógeno y
posterior formación de la malla reticular.
Los fijadores más importantes son aldehídos o fuertes oxidantes como el tetróxido de osmio.
4.4.1 Formaldehido o formol
Es una sustancia que en estado puro es un gas tóxico (irrita las mucosas) que se disuelve con mucha
facilidad en agua. En concentraciones del 35-40% estabilizado con metanol recibe el nombre de
formalina pura o formol.
Si es expuesto a temperaturas bajas tiende a precipitar polimerizando hacia paraformaldehído, esto es
reversible agregando unas gotas de hidróxido sódico y calentando la muestra.
Se utiliza como fijador al 4%, si forma parte de una preparación de formalina, se diluye en 9 partes de
agua, solución salina o tampón.
Ventajas:
1. Fijador más barato.
2. Buen fijador único.
3. Es un buen agente desinfectante y no endurece demasiado, fijador óptimo para guardar
biopsias y piezas quirúrgicas.
4. Escasa retracción tisular.
5. Velocidad de penetración intermedia (1mm/h).
6. Excelente agente fijador del tejido adiposo y lípidos en general, impregnación argéntica,
tejido nervioso.
7. La fijación de los tejidos puede ser acelerada o retrasada modificando la temperatura:
 Temperatura ambiente 36 horas.
 A 35ºC 12-24 horas.
 A 55ºC 3 horas
 Fijador de elección cuando se utilizan hornos microondas.
8. Compatible con la mayor parte de las tinciones.
Inconvenientes:
1. Es un agente irritante (mucosa nasal y conjuntiva).
2. Debido al efecto de la luz y el oxígeno se transforma en ácido fórmico, para evitarlo almacenarlo
en frascos opacos o utilizarse en forma de solución neutra o tamponada.
3. Se consume durante la fijación.
4. Provoca incorporación de agua en los espacios tisulares debido a su baja presión osmótica
180 mOs. El volumen y el peso del tejido después de la fijación, aumenta de forma notable.
5. No fija bien las proteínas, pigmentos con contenido en hierro y derivados de la bilirrubina.
6. Produce un precipitado cristalino no birrefrigente de color pardonegruzco, conocido como
pigmento formólico. Este pigmento se elimina con:
 Solución alcohólica saturada de ácido pícrico.
 Soluciones alcohólicas alcalinas de Verocay(hidróxido potásico) o Kardasewisch(hidróxido
amónico).
Otros fijadores
Se presenta como un líquido oleoso al 25%. Tiene el mismo mecanismo de actuación que el
formaldehído.
Se prepara en concentraciones entre el 1-3%.
Ventajas:
1. Fijador de elección para microscopia electrónica. Excelente fijador para preservar la morfología
celular.
2. Se utiliza para la fijación de animales por perfusión en patología experimental.
Inconvenientes:
1. Velocidad de penetración muy baja.
2. No fijar el tejido más de 3 horas porque provoca retracción y endurecimiento tisular.
3. Utilizar en soluciones amortiguadoras (tampón cacodilato), osmolaridad muy baja.
Se presenta en forma de cristales de tonalidad amarillenta, muy volátiles y tóxicos.
Se prepara al 1% en tampón fosfato.
Ventajas:
1. Es el mejor fijador estructural. Se emplea en microscopia electrónica como segundo fijador
y como agente de contraste.
Inconvenientes:
1. Elevado precio, se descompone con la luz, se guarda en oscuridad.
2. Es muy poco soluble, problemas para disolverlo.
3. Altamente tóxico, es obligatorio trabajar en campana de extracción.
4. Muy baja capacidad de penetración.
5. Incompatible con fijadores reductores y con la tinción del PAS.
6. Inactiva las enzimas y altera la composición antigénica.
Soluciones fijadoras
simples contienen
formaldehído
Se emplea para prevenir el efecto osmótico.
Se prepara disolviendo 9 gramos de cloruro sódico en 1000 mL de formalina 10%.
Se prepara agregando a la formalina 10% carbonato cálcico, esta sal neutraliza el exceso de ácido
fórmico. Su uso ha sido desplazado por la formalina tamponada.
Es con diferencia la solución más utilizada actualmente, previene el cambio osmótico y el depósito de
pigmento formólico que ocurre a pH inferior a 6. Su componente principal es el fosfato sódico más la
formalina.
Generalmente se emplea para fijar tejido nervioso en alguna impregnación argéntica.
Se prepara agregando 1 mL de ácido acético glacial a 99 mL de formalina. pH en torno a 2.
La primera tarea del técnico en el hospital deberá ser la fabricación de los bloques de parafina incluidos
Este fijador estabiliza las moléculas enzimáticas, de elección para alguna técnica de histoenzimología.
Mezclas fijadoras
Estas mezclas pretenden sumar las ventajas de los fijadores y disminuir los inconvenientes.
Estas mezclas se dividen en dos grupos, dependiendo si contienen o no formaldehído.
7.1.1 LÍQUIDO DE BOUIN
Es una de las mezclas más empleadas, es una alternativa a la formalina, o cuando no se pueden utilizar
mezclas con sublimado.
Se utiliza para la fijación de la piel, órganos endocrinos, testículos y tejidos embrionarios.
No indicado en biopsias renales.
Formulación:
- Solución acuosa saturada de ácido pícrico 750 mL.
-
-
Formalina concentrada 250 mL.
Ácido acético glacial 50 mL.
- pH final 2.2
El tiempo de fijación oscila entre 4-24 horas (depende del tamaño de la muestra).
Después de la fijación lavar abundantemente con alcohol de 70% para eliminar el ácido pícrico.
Una vez fijado el tejido se puede guardar en etano 80%.
7.1.2 FIJADOR DE BOUIN-HOLLANDER
Se emplea para fijar cilindros de médula ósea.
Formulación:
-
-
Acetato neutro de cobre 2.5 gr.
Ácido pícrico 4 gr.
-
-
Ácido acético glacial 1.5 mL.
-
Notas:
Agua destilada 100 mL.
- Los pasos de preparación son:
 Primero disolver el cobre en agua destilada.
 Agregar el ácido pícrico.
 Filtrar y agregar el formol y el ácido acético.
-
-
Esta solución se conserva indefinidamente a temperatura ambiente.
Tiempo de fijación entre 48-72 horas
7.1.3 BOUIN ALCOHÓLICO (FIJADOR DE DUBOSCQ-BRASIL)
Velocidad de penetración más elevada que el Bouin.
Se utiliza cuando las piezas son voluminosas y para el glucógeno.
Formulación:
- Alcohol etílico 80%.
-
-
Ácido pícrico 0.5 gr.
-
Notas:
-
-
Preparar antes de su uso.
Tiempo de fijación 2-3 horas.
7.1.4 LÍQUIDO DE GENDRE
Variante del Bouin alcohólico diseñado para fijar el glucógeno y pigmentos derivados de la
hemoglobina.
Formulación:
- Solución saturada de ácido pícrico en alcohol 70%. 80 mL.
-
-
Ácido pícrico 0.5 gr.
-
Notas:
-
-
Tiempo de fijación 1-4 horas.
Después de la fijación realizar dos lavados cortos en etanol de 80%, 95% y 100%.
7.1.5 FIJADOR DE MÜLLER
Disolución acuosa de dicromato potásico agregando sulfato sódico.
La importancia real reside en que se utiliza para fabricar los fijadores de Orth y Zenker.
Formulación:
- Dicromato potásico 2.5 gr.
-
-
Sulfato sódico 1 gr.
Agua destilada 100 mL.
Notas:
- Tiempo de fijación 24-48 horas.
- Después de la fijación lavar en abundancia con agua corriente varias horas.
7.1.6 FIJADOR DE ORTH
Se utiliza para demostrar la reacción cromafín y alguna técnica de impregnación argéntica de

tejido nervioso, generalmente Golgi rápido.
Formulación:
-
-
Solución stock Orth.
Solución trabajo:
 Solución stock 90 mL.
 Formalina concentrada 10 mL.
Notas:
- Tiempo de fijación para tejido nervioso 48 horas.
- Después de la fijación lavar abundantemente con agua y guardados en alcohol de 70%.
7.1.7 SOLUCIÓN DE B-5 Y ZENKER-FORMOL (LÍQUIDO DE HELLY)
Las dos soluciones son muy parecidas. La solución Zenker-formol tiene a mayores en su composición
dicromato potásico y sulfato sódico.
La mayor utilidad de estos fijadores reside en que mejoran la coloración nuclear.
Actualmente es imprescindible que la mezcla fijadora contenga sublimado para el diagnóstico de
patologías del sistema linfoide y hematopoyético, ya que para clasificar un tumor malignos de alto o
bajo grado, que tenga origen en lo ganglio linfáticos o la médula ósea, es imprescindible una fina
visualización de los detalles celulares.
A la vez estas soluciones fijadores son de elección para el riñón, hígado, fibras del tejido conjuntivo
y fibrina.
FORMULACIÓN B-5
- Solución stock:
 Cloruro mercúrico 12 gr.
 Acetato sódico 2.5 gr.
 Agua destilada 200 mL.
Esta solución debe almacenarse en frasco opaco y oscuridad, en estas condiciones es estable por largo
tiempo.
- Solución de trabajo:
 Formalina concentrada 2 mL.
Notas:
-
-
Es una solución inestable.
Tiempo de fijación no superar las 4 horas.
-
-
El espesor máximo de los cortes no debe superar los 4mm.
Los cortes pueden ser almacenados indefinidamente en alcohol 70-80%.
- Debido a los depósitos mercúricos es necesario someter los cortes a la eliminación de estos
depósitos (deszenkerizar).
FORMULACIÓN DE ZENKER-FORMOL
- Solución stock:
 Cloruro mercúrico 5 gr.
 Dicromato potásico 2.5 gr.

Sulfato sódico 1 gr.
 Agua destilada 100 mL.
- Solución de trabajo:
 Solución stock 95mL.
 Formalina concentrada 5mL.
Notas:
- Tener las mismas precauciones que con la solución B-5.
7.2.1 LÍQUIDO DE ZENKER
Esta solución pretende combinar las cualidades favorables del sublimado y el dicromato potásico. Se
utiliza generalmente para el proceso de refijación-decalcificación de las biopsias de médula ósea.
Formulación:
Solución stock Zenker (vista anteriomente). 95 mL.
-
- Ácido acético glacial 5 mL.
Notas:
-
-
Debe mezclarse justo antes de su utilización.
Tiempo de fijación, no sobrepasar las 48 horas.
- Tratar con sulfato sódico 5% durante 1-2 horas.
7.2.2 LÍQUIDO DE CARNOY
Es seguramente el mejor fijador de glucógeno, y en general, de hidratos de carbono simples y para
proteínas fibrilares (sobre todo miofibrillas).
Hay que tener en cuenta la excesiva retracción hística, así como hemólisis masica de los eritrocitos y
escasa conservación estructural de las proteínas globulares y del ADN.
Formulación:
-
-
Etanol absoluto 60 mL.
Cloroformo 30 mL.
-
Notas:
Ácido acético glacial 10 mL.
-
-
El tiempo de fijación puede ser acortado hasta las 3 horas.
Cambiar las muestras directamente a alcohol absoluto.
- El mayor endurecimiento se produce en la deshidratación con etanol, se puede sustituir por
metanol que provoca menor retracción.
Eliminar el pigmento
mercúrico
Es necesario tratar los cortes histológicos, antes de su tinción, con soluciones yodadas (solución de
Gram o lugol), que transforman el mercurio metálico en yoduro mercúrico soluble en tiosulfato sódico.
Formulación:
- Solución de Lugol:
 Yoduro potásico 2 gr.
 Yodo 1 gr.
 Alcohol 70-80% 100 mL.
- Solución de tiosulfato sódico:
 Tiosulfato sódico 5 gr.
 Agua destilada 100mL.
Notas:
1.
2.
Después de desparafinar, incubar las secciones en solución yodada 10 minutos.
Decolorar 2 minutos en la solución de tiosulfato.
3. Lavar en agua corriente 10 minutos antes de realizar la tinción.
Fijación en la
microscopia electrónica
Este tipo de microscopia consigue imágenes de miles de aumentos, por lo cual es imprescindible una
óptima conservación de las células (fijación los más rápida posible), además de que los cortes tienen
que tener una extraordinaria delgadez para permitir el paso de los electrones.
Se emplea un primer fijador, de elección es el glutaraldehído 2.5-4%en tampón fosfato o cacodilato (análisis de
rutina tampón fosfato, para citoquímica el cacodilato). Como segundo fijador el tetróxido de osmio.
Debido a la baja capacidad de penetración de estos fijadores el tejido no superará el volumen de 1 mm3.
Los tiempos de fijación son:
- Glutaraldehído de 4-16 horas. Se lava 3 veces en solución tampón.
- Tetróxido de osmio 1 hora. Lavar 2 veces con agua destilada.
- Soluciones stock:
 Solución 1: ortofosfato dihidrogenado de sodio al 2.26%.
 Solución 2: hidróxido sódico al 2.52%.

Solución 3: cloruro cálcico anhidro 0.5M.
 Solución 4: solución acuosa de glutaraldehído al 25%.
Notas:
- Tiempo de fijación 4-16 horas.
- pH 7.3-7.4.
- Mezclarse antes de su uso, es posible almacenarla varios días a 4ºC.
- Las soluciones de trabajo se conservan fácilmente a 4ºC.
- Solución stock:
 Cacodilato sódico 21.4gr.
 Ácido clorhídrico 40 mL.
 Cloruro cálcico 0.1M 10 mL.
 Sucrosa 30 gr.
-
 Agua destilada 1900mL.
Solución de trabajo:
 Solución acuosa de glutaraldehído 25%. 50 mL.
Notas:
- Tiempo de fijación entre 4-16 horas.
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Tema - 2 Fundamentos Del Proceso de Fijación Tisular

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