Tema - 4 Métodos y Técnicas de Inclusión Deshidratación

®Ifapes®Ifapes®Ifapes®Ifapes®Ifapes®I
®
fapes®Ifapes®Ifapes®Ifapes®Ifapes®Ifa
pes®Ifapes®Ifapes®Ifapes®Ifapes®Ifape
s®Ifapes®Ifapes®Ifapes®Ifapes®Ifapes
Tema 4 Métodos y técnicas de inclusión:
deshidratación
Introducción
Deshidratación por agente químicos
Aclaramiento
Infiltración o impregnación
Introducción
La mayor parte de los estudios necesitan una inclusión en un medio sólido para el estudio
anatomopatológico, con la excepción de los cortes obtenidos por congelación.
Este medio confiere dureza e impide la fragmentación del tejido durante el corte, asegurando la
obtención de secciones finas, regulares y homogéneas.
Deshidratación por
agente químicos
La finalidad de la deshidratación es eliminar completamente el agua de las muestras, para poder
embeber el tejido con los medios de inclusión que no sean hidrosolubles.
La deshidratación se puede realizar mediante agentes químicos o por procesos físico-químicos
(criodesecación y criosustitución).
La deshidratación podrá llevarse a cabo por cual reactivo capaz de absorber el agua de los tejidos. Las
condiciones esenciales de un buen agente deshidratante son:
1. No debe alterar las estructuras tisulares.
2. Debe poder mezclarse con el reactivo intermediario o agente aclarante.
3. Rapidez en el proceso.
4. Reducción a un mínimo aceptable el endurecimiento que provoca en los tejidos.
5. Peligrosidad o toxicidad mínimas.
6. Bajo riesgo de incendio/explosión.
7. Baja toxicidad por inhalación, ingestión y contacto.
El proceso de deshidratación suele realizarse mediante la utilización del alcohol etílico, y en él interviene
los siguientes factores:
- Graduación de los alcoholes: La operación de deshidratación se realiza empleando series
de alcoholes de graduación ascendente, 50, 70, 80, 95 y 100º, ya que la utilización directa de
un alcohol de elevada graduación provocaría una marcada retracción del tejido.
- Volumen y número de baños de deshidratación: El volumen recomendado suele ser 1/10,
es decir, 10 veces superior al volumen de la pieza que se va a deshidratar.
Los baños múltiples implican:
1. Menor permanencia en cada baño ahorra tiempo y disminuye el riesgo de u
endurecimiento excesivo de la muestra.
2. Menor índice de saturación de agua en alcohol.
3. Mejor control del grado de deshidratación de la muestra.
4. Menor riesgo de alteración tisular por el brusco cambio en la fuerza de extracción del
agua.
- Duración de la deshidratación: Va a depender del volumen de los fragmentos tisulares y de
su contenido en agua. Tener en cuenta lo siguiente:
1. La deshidratación ha de ser completa.
2. La exposición prolongada al agente deshidratante provoca un endurecimiento en los
tejidos.
- Empleo de agentes accesorios durante el proceso de deshidratación: Es muy útil el uso
de estos reactivos porque eliminan el exceso de agua en el propio agente deshidratante,
consiguiendo una disminución de la presión de vapor del agua de solvatación, lo que provoca,
que el efecto del deshidratante sea más homogéneo. Además, suponen un ahorro porque
permite utilizar más veces el baño deshidratante.
Principales reactivos utilizados:
1. Sulfato de cobre anhidro: sirve al mismo tiempo como indicador del grado de
deshidratación. Los cristales de cobre adoptan una coloración azul brillante cuando el
líquido se satura de agua.
2. Oxido de calcio.
3. Resinas humectantes.

Alcohol etílico (CH3 CH2 OH): es el más utilizado. Es un excelente deshidratante, pero presenta el
inconveniente de que es muy inflamable y más caro que el alcohol metílico. Una forma más barata el
utilizar alcohol etílico desnaturalizado con metanol, denominado etanol para uso industrial.
 Alcohol metílico (CH3 OH): A veces se emplea como sustituto del etílico. Es muy inflamable y tóxico.
 Acetona (CH3-CO-CH3): Muy volátil y de acción rápida. Si se deja en los tejidos por tiempo prolongado,

aumenta exageradamente su fragilidad.
Alcohol butílico (CH3- CH2- CH2- CH2-OH): Deshidratante lento, miscible con la parafina lo que

permite prescindir de los agentes aclarantes.
Dioxano (Dióxido de etileno): Miscible con la parafina. Toxicidad muy elevada en espacios pequeños.


Alcohol isopropílico (CH3 CH [OH] CH3): No puede utilizarse con la inclusión en Celoidina.
Tetrahidrofurano: Agente de acción rápida que no causa retracción excesiva.
Aclaramiento
Su principal función es la sustitución del agente deshidratante por una sustancia miscible con el
medio de inclusión
Hay bastantes, su elección va a depender de unos factores.
- Rapidez para eliminar el deshidratante.
- Escasez de acciones nocivas sobre los tejidos y células (endurecimiento, retracción).
- Adecuación del aclarante al agente de deshidratación y al medio de infiltración.
- Facilidad de eliminación.
- Baja toxicidad, peligrosidad y coste.
Los agentes aclarantes son también conocidos como líquidos intermediarios.
El protocolo de los agentes aclarantes incluye la realización de baños sucesivos de duración variable
en función de la pieza. A veces está indicado, antes de los baños con líquidos intermediarios, utilizar
diversas mezclas de agente deshidratante con aclarante en diferente proporción. (2/1, 1/1, 1/2).
Ventajas:
1. Es líquido intermediario más rápido.
2. No disuelve la celoidina.
3. Endurece poco los tejidos.
4. Se elimina fácilmente del medio de inclusión.
5. El punto óptimo de clarificación es fácil de apreciar.
Inconvenientes:
1. Es tóxico.
2. Solo aclara desde el alcohol absoluto.
3. Tiende a volver blanquecino el tejido.
4. Endurece si actúa mucho tiempo.
5. Tiende a la acidificación.
Interés práctico:
1. Aclara muestras de grosor menor 5 mm en 30-60 minutos.
2. Empleo rutinario.
Ventajas:
1. Es rápido, pero menos que el xileno.
2. Endurece menos que el xileno.
3. No blanquea los tejidos.
4. Conserva la muestra más de 12 horas sin alteración evidente.
5. Punto óptimo de clarificación fácil de apreciar.
Inconvenientes:
1. Es tóxico
2. Solo aclara desde el alcohol absoluto.
3. Tiende a la acidificación.
Interés práctico:
1. Aclara muestras de grosor menor 5 mm en 1-2 horas.
2. Se utiliza habitualmente, pero menos que el xileno.
Ventajas:
1. Relativamente rápido.
2. Endurece muy poco y no blanquea.
3. Mínima retracción.
4. Se elimina fácilmente.
Inconvenientes:
1. Muy tóxico.
2. Muy inflamable.
Interés práctico:
2. Se utiliza como agente de sustitución.
Ventajas:
1. Muy tolerante.
2. No afecta a la muestra.
3. Es lento.
4. Útil para tejidos fibrosos, especímenes descalcificados, piel, etc.
Inconvenientes:
1. El aclaramiento es difícil de apreciar.
2. El tejido tiende a flotar en el cloroformo.
3. Muy complicado de eliminar en la parafina, sino se elimina correctamente provoca el deterioro
de la muestra.
4. Olor desagradable.
Interés práctico:
2. Utilización en tejidos fibrosos.
3. Se utiliza como agente de sustitución en algunas ocasiones.
Ventajas:
1. No es inflamable.
2. Acción parecida al cloroformo, con menor costo.
Inconvenientes:
1. Muy tóxico.
2. Inconvenientes parecidos al cloroformo.
Interés práctico:
1. El tiempo de aclarado se sitúa alrededor de las 15 horas.
2. Se utiliza para muestras duras.
Ventajas:
1. Miscible con la parafina, puede utilizarse simultáneamente como agente deshidratante y
aclarante.
Inconvenientes:
1. Realizar lavado previo para eliminar completamente, ya que es incompatible con los fijadores
que llevan dicromato.
2. Índice de deshidratación más bajo que el del alcohol etílico.
3. Eliminar el agua tras cada inclusión con cloruro cálcico.
4. Es inodoro y muy tóxico. Para su utilización es obligatorio el uso de campana de extracción de
gases.
Interés práctico:
1. Restringido a inclusiones donde no se pueda utilizar los alcoholes como deshidratante.
Infiltración o
impregnación
El objetivo es infiltrar o rellenar completamente la muestra histopatológica con el medio que se va a
utilizar para la imbibición del tejido. Consiste en sustituir el agua intratisular con medio de infiltración,
rellenando los espacios intra y extratisulares.
La finalidad es proporcionar a la pieza homogeneidad y dureza óptimas para realizar cortes finos de
calidad. Hay diferentes métodos, pero el método de elección es la parafina.
Las parafinas son sustancias de tipo céreo compuestas por mezclas de hidrocarburos saturados de
cadena larga. Dependiendo de la longitud de esta cadena variará el punto de fusión (40-70ºC).
Las parafinas des uso habitual poseen una temperatura de fusión de 54-58ºC.
La dureza de la parafina está en función de la plasticidad, más que en el punto de fusión. El punto de
plasticidad se sitúa unos grados por debajo del punto de fusión y se conoce como la temperatura más
baja a la que puede ocurrir una deformación sin fractura.
Actualmente se utilizan polímeros plásticos de peso molecular conocido y otros aditivos (no superan el
1%) que hacen mejorar sus propiedades. Las parafinas clásicas se oxidan rápidamente y se
amarillenta.
Mejoras de los polímeros plásticos:
- Obtención de secciones más uniformes, se comprime menos el tejido.
- Aumento de la dureza y homogeneidad del bloque, facilita el corte en los tejidos de mayor
dureza.
- Menor fragilidad de los bloques al alterar la estructura cristalina de la parafina solidificada,
lo que disminuye el tamaño de los cristales.
El índice de infiltración depende del tamaño de las moléculas y de la viscosidad. El baño se
infiltración se mantiene 2-4 ºC sobre su punto de fusión.
Se realiza mediante baños sucesivos en parafina fundida. Estos baños deben ser renovados
frecuentemente, pues se van contaminando con solvente (líquido de aclaramiento), cuya presencia
provoca una disminución en el punto de fusión de la parafina, haciéndola más blanda y menos
apropiada para el corte. También, debido a la evaporación del líquido intermedio se produce una
desecación y retracción de la pieza, lo que va a conferir un aspecto típico de cuero curtido de las
inclusiones defectuosas.
Este proceso puede realizarse de forma manual o automática mediante los procesadores de inclusión.
1. Procedimiento manual de inclusión.
Esta forma de inclusión se utiliza para piezas de extrema delicadeza o por grandes variaciones
de volumen (piezas quirúrgicas completas).
Cuando es necesario realizar una inclusión rápida en parafina, el proceso puede ser acelerado
realizando los pasos de fijación y deshidratación con calor.
De igual forma puede utilizarse la tecnología de microondas para facilitar la fijación, inclusión y
coloración tisular, realizando un tratamiento durante 3 minutos al 25% de intensidad en un
microondas doméstico de 1300 W de potencia. Tenemos tener la precaución de impedir la
ebullición de los líquidos.
2. Procesamiento automático de inclusión tisular.
Este sistema posee tres ventajas fundamentales:
1. Permite el procesamiento de múltiples especímenes a la vez.
2. Economizan la cantidad de reactivos empleados.
3. El procesamiento se realiza rápidamente a lo largo de la tarde/noche del día de la recepción
de las muestras. Las muestras estarán listas al día siguiente para ser encastradas.
Es fundamental la renovación de los líquidos contenidos en los baños, su enturbiamiento o la
percepción de olor al aclarante en el último baño de parafina indica que es necesario
cambiarlos.
TÉCNICA DE MANUAL AUTOMÁTICO
PROCESAMIENTO
- Formol 10%
- Lavado Eliminar formol Eliminar formol.
- -
- Etanol 70% - 2 horas - 2 horas
- Etanol 96% - 2 a 4 horas - 2 horas
- Etanol Absoluto
- Etanol Absoluto
-
-
2 a 4 horas
1 a 2 horas
-
-
2 horas
1 hora
- Etanol Absoluto
- Xileno o Tolueno
-
-
1 hora
1 hora
-
-
1 hora
1 hora
- Xileno o Tolueno
- Xileno o Tolueno
-
-
1 hora
1 hora
-
-
1 hora
1 hora
- Parafina Líquida
- Parafina Líquida
-
-
1 hora
1 hora
-
-
1 hora
1 hora
- Parafina Líquida
TOTAL
- 2 horas
16 a 22 horas
- 2 hora
16 horas
Fig.1 Procesador de tejido automático empleado en el laboratorio. (Última generación Excelsior
AS, ThermoScientific).
3. Inclusión tisular mediante sistema de presión negativa.
Aplicar durante los baños de parafina un sistema de extracción de gases por una bomba de
vacío a una presión de 400-500 mm de Hg, con el objetivo de:
1. Eliminar las vacuolas aéreas del tejido, principalmente en el pulmón.
2. Extraer rápidamente los restos de agente aclarante, facilitando su vaporización.
Es una técnica que no se utiliza mucho debido al engorroso de su mecanismo.
Un método de inclusión alternativo para piezas delicadas y de pequeño tamaño es el de fijación
por liofilización en el vacío seguida de la inclusión directa en parafina dentro de la bomba de
liofilización.
Consiste en obtener un bloque sólido de tejido más medio de inclusión, mediante enfriamiento lento a
10-15ºC, temperaturas más bajas provocarían un brusco enfriamiento con contracción de los bloques,
pudiendo llegar a fracturarse. El objetivo es tener un bloque fácil de manejar, de dureza homogénea y
plasticidad y elasticidad óptimas, que permitan realizar secciones de calidad sin distorsión ni
fragmentación de los tejidos.
Para realizar los bloques se utilizan las estaciones de inclusión, que constan de dispensador de parafina
líquida, placa caliente para realizar la orientación de las piezas y placa fría para la solidificación del
bloque 5-10ºC.
Fig.2 Estación de inclusión utilizada en nuestro laboratorio. (HistoStarEmbedding Center,
ThemoScientific).
1. Orientación de la pieza.
La muestra infiltrada se coloca en la posición correcta al tipo de corte que se desea realizar,
teniendo en cuenta que la cara inferior del bloque será la superficie del corte. Esta posición
debe determinarse antes del procesamiento de la muestra, para lo cual la cara opuesta del
bloque será marcada con tinta china durante la prosección.
Además, la pieza deberá orientarse de tal modo que parte más blanda del tejido se corte en
primer lugar y la más dura o firma al final del proceso.
2. Moldes
Suelen ser metálicos, para facilitar un enfriamiento homogéneo en dirección ascendente.
El fondo de los moldes suele ser de distintos tamaños, que se ajustan a las piezas que se van
a incluir, en ellos encajan los casetes que contienen la muestra histológica y su identificación,
facilitando la confección de un bloque que no precisa de ningún montaje especial sobre el
portabloques del micrótomo. Los bloques pueden hacerse sin tamaño preestablecido usando
las clásicas pinzas de Leuckhart en forma de L.
Fig. 3 Moldes metálicos utilizados en la realización del bloque de parafina.
1
2
®
3

Tema - 4 Métodos y Técnicas de Inclusión Deshidratación

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Tema - 4 Métodos y Técnicas de Inclusión Deshidratación

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

®Ifapes®Ifapes®Ifapes®Ifapes®Ifapes®I

También podría gustarte