Guía de Prácticas de Bioquímica General - Semestre 2023-I Guía de Prácticas de Bioquímica General - Semestre 2023-I

Práctica N° 9: fosfolípidos de las membranas son la cefalina o fosfatidiletanolamina, la fosfatidilserina

AISLAMIENTO DE LECITINA – EMULSIÓN DE GRASAS - y el fosfatidilinositol.
HIDRÓLISIS DE GRASAS POR ACCIÓN DE LA LIPASA PANCREÁTICA

I. MARCO TEÓRICO

Los lípidos son un grupo heterogéneo de moléculas orgánicas insolubles en agua

(hidrofóbicas). Están compuestas principalmente por carbono e hidrógeno y en menor
medida por oxígeno, aunque también pueden presentar fósforo, nitrógeno y azufre. No son
polímeros sino más bien moléculas que tienden a asociarse por interacciones no
covalentes (interacciones hidrofóbicas) para formar superestructuras como monocapas,
micelas, bicapas, liposomas o vesículas.
Los esteroides son otra clase de moléculas lipídicas, que se identifican por su estructura
Poseen las siguientes funciones:
de cuatro anillos fusionados. Aunque a nivel estructural no se asemejan a otros lípidos, los
✔ Energética (triacilglicerol)
esteroides se incluyen en esta categoría porque también son hidrofóbicos e insolubles en
✔ Estructural (fosfolípidos)
agua. Todos los esteroides tienen cuatro anillos de carbono enlazados y varios de ellos,
✔ Reguladora (hormonas, vitaminas, coenzimas)
como el colesterol, también tienen una cola corta. Muchos esteroides tienen un grupo
✔ Aislante: térmico (triacilglicerol) y eléctrico (glucolípidos) funcional –OH unido a un sitio específico, como se muestra en la figura; estos esteroides
también se clasifican como alcoholes y se denominan esteroles.

1.1 Solubilidad de lípidos

Una característica importante es que aquellos lípidos que tienen ácidos grasos en su
composición pueden formar jabones al ser titulados con una base fuerte (lípidos
saponificables), por lo que los jabones son considerados como agentes emulsionantes.
Los lípidos pueden ser simples (triacilgliceroles, TAG) o complejos (fosfolípidos). Por
ejemplo, la lecitina o fosfatidilcolina es el más común de los fosfolípidos que, a diferencia
de las grasas y aceites, se dispersa en el agua en forma coloidal. La fosfatidilcolina es el
principal constituyente de las bicapas lipídicas de las membranas celulares de mamíferos,
posee la característica de ser soluble en etanol pero insoluble en acetona. Otros
Los lípidos poseen una solubilidad variable al combinarse con disolventes orgánicos, e
insolubilidad parcial o total en agua. La baja solubilidad de los lípidos en el agua se debe
a que su estructura química es fundamentalmente hidrocarbonada (alifática, alicíclica o
aromática), con gran cantidad de enlaces C-H y C-C. La naturaleza de estos enlaces es
100% covalente y su momento dipolar es mínimo. De la naturaleza hidrofóbica de los
lípidos, se derivan sus principales propiedades biológicas.
El agua, al ser una molécula muy polar y con gran facilidad para formar puentes de
hidrógeno, no es capaz de interaccionar con las grasas. En presencia de moléculas
lipídicas, el agua adopta una estructura muy ordenada en torno a ellas, lo que maximiza
las interacciones entre las propias moléculas de agua, reduciendo la movilidad del

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lípido. Todo ello supone una configuración de baja entropía, que resulta
energéticamente desfavorable. Esta disminución de entropía es mínima si las moléculas
lipídicas se agregan entre sí, e interaccionan mediante fuerzas de corto alcance, como
las fuerzas de Van der Waals. A este fenómeno se le denomina “efecto hidrofóbico''.

Los lípidos son solubles en solventes orgánicos y la polaridad de éstos es variable. En

este sentido, para una extracción de lípidos se debe tener en cuenta los valores de la
constante dieléctrica de los solventes con el fin de conocer la polaridad de éstos, debido
a que mientras mayor es el valor de la constante mayor es su polaridad. Así tenemos:

Material complementario:
1.2. Emulsión Emulsiones:
https://youtu.be/JbGBUhXrxAs (duración: 2.47 min)
La emulsión se define como una solución imperfecta en la que dos líquidos que son ¿Cómo actúan los detergentes?
inmiscibles (por ejemplo, el agua y el aceite) se mezclan íntimamente. Esta mezcla debe https://www.youtube.com/watch?v=UJbINMKJv7Y (duración: 1.53 min)
ser estable, para lo cual se requiere de un tercer componente llamado agente
emulsionante o emulgente. Estos agentes tienen dos funciones: 1.3. Hidrólisis de triacilgliceroles

✔ reducir la tensión entre los líquidos a ser emulsionados

La hidrólisis de los triacilgliceroles se inicia por medio de una lipasa que es producida
✔ prevenir la coalescencia de las gotas dispersadas.
en la lengua y continuando en el estómago mediante una lipasa ácida estable; sin
embargo, esta digestión es muy lenta ya que en la boca y el estómago se mantiene una
En el tracto gastrointestinal, existen las condiciones necesarias para emulsificar las
interfase lípido-acuosa por no haber suficientes agentes emulsionantes para realizar
grasas. Los agentes emulsionantes que permiten la formación de una emulsión son
una emulsión completa, que permita el contacto entre la enzima y el sustrato. Recién en
principalmente las sales de los ácidos biliares, las proteínas, los fosfolípidos,
el intestino delgado proximal se consigue una emulsión completa al llegar por el
jabones y bicarbonatos de metales alcalinos. Las moléculas de los emulsionantes se
conducto colédoco las sales biliares, donde los triacilgliceroles van a ser hidrolizados
asocian a la capa exterior de las gotitas de grasa y disminuyen bruscamente la tensión
por la lipasa pancreática. La lipasa libera los ácidos grasos esterificados a los carbonos
superficial en el contacto de las fases, lo que se traduce en un aumento de la estabilidad
1 y 3 del glicerol, quedando un monoacilglicerol con el ácido graso esterificado en la
de la emulsión. Cuando esto ocurre, los grupos hidrófilos de los emulsionantes se sitúan
posición 2. Debido a esto, el intestino absorbe los monoacilgliceroles y los ácidos grasos.
en la fase acuosa y los hidrófobos se disuelven en la grasa, favoreciendo su atomización
en gotas menudas (micelas), de tal forma que se produce la emulsión.

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- 06 tubos de ensayo 16 x 150 mm

- Gradillas para los tubos

III. PARTE EXPERIMENTAL

EXPERIENCIA 1: Aislamiento de la fosfatidilcolina o lecitina a partir de la yema de

huevo utilizando etanol y acetona

a. Colocar ½ yema de huevo en un vaso de precipitado o beaker.

(Figura tomada de: hidrolisi de grasa por lipasas - Bing images)
b. Incorporar 20 mL de etanol caliente y mezclar con la ayuda de una varilla de vidrio por
aproximadamente 4 min, y dejar enfriar.
c. Filtrar en un tubo de ensayo de 16 x 150 mm. Si el filtrado es turbio repetir el proceso
de filtración.
d. Colocar en un tubo de 16 x 150 mm, 5 mL de acetona fría y luego añadir gradualmente
el filtrado.
e. Observar la formación de grumos blanquecinos que corresponden a la lecitina.

EXPERIENCIA 2: Emulsión de las grasas

2.1. Experimento sobre la tensión superficial del agua

a. Colocar en un vaso plástico transparente, agua hasta ⅔ del volumen total.

b. Adicionar de 3 a 5 gotas de aceite.
(Figura tomada de:: acción Emulsionante de la lipasa pancreática - Bing images) c. Observar la disposición del aceite en el agua.
d. Adicionar 2 a 3 gotas de jabón líquido.
Material audiovisual complementario e. Observar nuevamente, la disposición del aceite en el agua.
https://www.youtube.com/watch?v=DRcvBCad47U (duración: 1.23 minutos) Video complementario:
https://www.youtube.com/watch?v=gJkyHNG9Mdc (duración: 4.28 min)

Objetivos 2.2. Emulsión de grasas con emulgentes

- Aislar lecitina utilizando las propiedad de solubilidad de los lípidos en solventes
orgánicos a. Preparar la siguiente batería:
- Comprobar el efecto de agentes emulsionantes. Solución Tubos
- Evaluar la actividad de triacilglicerol lipasas en la hidrólisis de los TAG. 1 2 3 4 5 6
Agua destilada (mL) 1 --- --- --- --- ---
II. MATERIALES Solución de sales biliares 1% (mL) --- 1 --- --- --- ---
Solución de proteína 20% (mL) --- --- 1 --- --- ---
Material que deben traer los alumnos por mesa.
Solución de jabón 1% (mL) --- --- --- 1 --- ---
- 1 botella pequeña de aceite vegetal Bicarbonato de sodio 1% (mL) --- --- --- --- 1 ---
- 1 huevo Solución de lecitina 1%(mL) --- --- --- --- --- 1
- 1 sobre de gasa Aceite vegetal (gotas) 4 4 4 4 4 4
- 06 tubos de ensayo 13 x 100 mm

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b. Agitar vigorosamente y con la misma intensidad los 6 tubos. Vídeo sobre titulación (complementario):
c. Dejar en reposo por 2 minutos. https://es.khanacademy.org/science/chemistry/acid-base-equilibrium/titrations/v/titrati
d. Observar y describir los resultados. on-introduction (duración: 9.24 minutos)
e. Ordenar los tubos por orden del grado de emulsión.

EXPERIENCIA 3: Hidrólisis de los triacilgliceroles (grasas neutras) por la lipasa III. INFORME
pancreática
El informe deberá contener una carátula y el desarrollo de los siguientes puntos:
La lipasa pancreática es una enzima hidrolasa que se secreta en el páncreas para ayudar en
la digestión y absorción de las grasas. Ésta cataliza la hidrólisis de triglicéridos a glicerol y
Experiencia 1: Aislamiento de la fosfatidilcolina o lecitina a partir de la yema de huevo
ácidos grasos libres, para que se puedan absorber. Las lipasas sólo son activas en una
utilizando etanol y acetona
interfaz de aceite y agua. Para demostrar la actividad “in vitro” de la lipasa, se puede 1. ¿Qué es la lecitina? ¿Dónde se localiza? ¿Qué función cumple?
evaluar de 2 maneras: (1) En incubación, determinar el incremento de la acidez del medio 2. ¿Por qué se emplea en la elaboración de alimentos?
producida por los ácidos grasos liberados mediante titulación con NaOH; (2) mediante la 3. ¿Qué implicaría el uso de diferentes solventes orgánicos en el aislamiento de la
medición de la variación del pH. Recordar que, a mayor actividad de la lipasa, ocurre el lecitina?. Explique las propiedades de los solventes empleados en la extracción de
incremento de los ácidos grasos libres que se generan en el curso de la descomposición de lecitina
los triacilgliceroles lo que ocasiona la acidez del medio. 4. ¿Cuál es la función de la filtración en la experiencia?
5. ¿Por qué se utiliza incubación en baño María? ¿Qué ocurriría si se incrementa la
a. Preparar el sustrato (aceite neutralizado) a emplear: a partir de 8 mL de aceite temperatura de incubación? Explique por qué.
vegetal, agregar fenolftaleína (2 gotas) y NaOH 0.1N, en agitación constante (cantidad 6. ¿Cómo se comprueba que lo aislado corresponde a la lecitina? Investigue otros
suficiente para obtener un color rosado) métodos de comprobación. Fundamente su respuesta.
b. Disponer en tubos de 16 x 150, lo siguiente:
Experiencia 2: Emulsión
Tubo 1. ¿Por qué se requiere de un emulgente para lograr la emulsión de las grasas?
Solución Blanco 1 2 2. ¿Qué agente actúa como detergente natural en nuestro organismo?
Aceite vegetal neutralizado (mL) 0 1 1 3. ¿Por qué la agitación logra mezclar el agua y el aceite temporalmente?
Buffer fosfato de sodio y potasio 0.1M pH 8 (mL) 2 2 0 4. ¿Es importante el pH para la acción de las sales biliares?
5. ¿Es posible mezclar agua con aceite? Ejemplos
Sales biliares en buffer fosfato de sodio y ….(mL) 2 0 2
Agua destilada (mL) 1 2 2
Experiencia 3: Hidrólisis de los triglicéridos (grasas neutras) por la lipasa pancreática
1. ¿Por qué se utiliza buffer fosfato a pH 8 en la experiencia?
c. Agitar los tubos suavemente, si el color rosa disminuye entonces agregar una pequeña
2. ¿Cuál es la función de la titulación con NaOH?
gota de NaOH 0.1N, y agregar:
3. En base a los cálculos hallados, interprete los resultados obtenidos en los tubos 1 y 2.
4. ¿Por qué se observa gasto en el tubo blanco?
Lipasa pancreática (1% pancreatina en buffer 1 1 1
fosfato)(mL)
IV. CUESTIONARIO

d. Incubar a 37 °C durante 40 min, y agregar:
Solución etanólica de fenolftaleína al 1 % (gotas)
e. Titular con NaOH 0.01 N
1. Dibuje la estructura de 2 moléculas de TAG y 2 moléculas de lecitina usando ácidos
grasos saturados e insaturados ( ej. ácido oleico, ácido esteárico, DHA, EPA, etc)
3 1 1 indicando sus moléculas constituyentes.
2. ¿Qué son las grasas trans? y ¿Cómo afectan la salud?
3. ¿Cómo se obtienen las margarinas? y ¿Cómo un helado mantiene su aspecto?
4. Explique las propiedades de los solventes empleados en el aislamiento de la lecitina.

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5. ¿Por qué, de acuerdo a lo observado, se puede considerar a las sales biliares y a las
lecitinas, como los mejores emulsificantes?
6. A través de un esquema, detalle la función del ácido taurocólico.
7. ¿Qué condiciones son necesarias para evidenciar “in vitro” la actividad de la lipasa
pancreática?
8. Analizar el siguiente video: https://youtu.be/NX6NMoHCfs0
a. ¿Qué diferencias observa respecto al método utilizado en la práctica?
b. ¿Qué implicaría el uso de diferentes solventes orgánicos en el aislamiento de la
lecitina? Explique las propiedades de los solventes empleados en la extracción
de lecitina.
8. De acuerdo al siguiente video relacionado a la evaluación de la digestión de las grasas
por la lipasa: https://www.youtube.com/watch?v=3GEy1H7vfXM (duración: 12.12
minutos)
a. ¿Cómo se mide la actividad de la lipasa en la simulación?
b. ¿Cómo se puede determinar si se produjo hidrólisis de las grasas en el tubo 5?
c. ¿Estaría activa la lipasa pancreática en la boca?

V. REFERENCIAS

- Martínez Guerra, J. J. (2002) Libro electrónico de Bioquímica, segunda edición,

Universidad Autónoma de Aguascalientes, México.
- http://cdigital.dgb.uanl.mx/la/1020111502/1020111502_017.pdf
- https://mobiroderic.uv.es/bitstream/handle/10550/55673/23437.pdf?sequence=1&i
sAllowed=y
- https://www.lipidmaps.org/
- https://youtu.be/fY_6uJN7hrg .