Universidad del Valle de México

Universidad del Valle de México  

Escuela de Ciencias de la Salud, Campus Querétaro  

Licenciatura en medicina, tercer semestre.

Materia: Agresión y defensa en medicina humana
Docente: Jessica Enríquez Farias

Práctica 18: Tinción gram y otras técnicas de tinción.

Fecha de entrega: 26/marzo/2022

Integrantes:

 Álvarez Álvarez Luisa Gabriela

 Escobar Ríos Marc Antoine
 Figueroa Hurtado Andrés Salvador
 Pérez García Mary Claudia
 Vázquez González Fernando

INTRODUCCIÓN
Estructura bacteriana Las diferentes estructuras
bacterianas que observamos (ver figura 2) las
podemos dividir, según sean constantes en las células
o no, en estructuras permanentes o variables. Dentro
de las primeras se destaca: la pared celular, la
membrana celular, los ribosomas y el material
genético. Las estructuras variables son: los flagelos,
las fimbrias o pilis, la cápsula y los esporos. (Herley,
2019)
Estructuras variables, son aquellos que existen en
algunas bacterias, pero no en todas; un mismo grupo
bacteriano o una misma cepa bacteriana las puede
presentar o no, dependiendo de las condiciones en
donde se desarrolle. Las estructuras variables no
resultan esenciales para la vida de la bacteria.
Además, podemos clasificar las estructuras
bacterianas en internas o citoplásmicas y externas o
de la envoltura celular. Dentro de las internas
destacamos el material genético, los ribosomas y los
cuerpos de inclusión. La envoltura celular engloba la
membrana plasmática, la pared celular que la
recubre, la cápsula y los apéndices como fimbrias o
pilis y flagelos. Contiene los sitios de transporte para
nutrientes, interviene en la relación huésped parásito,
es blanco de las reacciones del sistema inmune y
puede contener estructuras tóxicas para el huésped
(Herley, 2019)
Figura 1. Diagrama de la pared bacteriana.
Grampositiva a la derecha y gramnegativa a la
izquierda
El tamaño de las bacterias oscila entre las 0.5 y 3
µm, pudiendo llegar en algunos tipos a 10 µm. Las
bacterias de interés médico tienen un tamaño entre
0.4 y 2 µm. Solo son visibles entonces, al
microscopio óptico o microscopio electrónico. Para
observarlas con el microscopio óptico se usa el
Universidad del Valle de México
objetivo de inmersión (100X), sumergiendo esta
lente en una gota de aceite (aceite de inmersión) en
el preparado a observar. A modo comparativo, una
célula eucariota mide más de 5 µm (un eritrocito
tiene un diámetro de 7µm), mientras que un reovirus
mide menos de 0.1µm. Su tamaño pequeño
determina una relación entre la superficie y el
volumen elevada, con alta tasa metabólica. (Herley ,
2019)
MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA
La forma de las bacterias al microscopio está
determinada por la rigidez de su pared celular.
Básicamente, se diferencian según su forma en cocos
(esféricas u ovaladas), bacilos (cilíndrica o de
bastones; rectos o curvos) y espirilos (espiral); dentro
de estas últimas se encuentran: Treponema, Borrelia
y Leptospira (ver figura 1). Las espirilos varían en el
número de vueltas, desde pocas (Borrelia) a muchas
(Treponema). Las bacterias pueden mantenerse
unidas unas con otras después de la división celular,
pero conservando siempre la independencia celular.
Si el plano de división es único, podemos encontrar
diplococos o cocos en cadena (microorganismos del
género Streptococcus). (Sherris, 2021)
Figura 2. Morfología: 1. cocos; 2. diplococo; 3.
cocos en cadenas; 4. cocos en racimos; 5. cocos en
tetradas; 6. cocobacilos; 7. bacilos; 8. bacilos
bordes redondeados; 9. bacilos bordes rectos; 10.
bacilos fusiformes; 11, 12. bacilos curvos; 13 al 15.
espiroquetas.
Las coloraciones que se usan para teñir los
preparados de bacterias se pueden dividir en:
simples, diferenciales y especiales. Las primeras, por
ejemplo, el azul de metileno, nos permiten observar

la existencia de bacterias, su morfología, su
agrupación, la presencia de esporos y la existencia de
otros tipos celulares. Las diferenciales (por ejemplo
la coloración de Gram y la de Ziehl Nielseen) además
de lo anterior, permiten la diferenciación de las
bacterias porque usan diferentes colorantes que se
comportan distinto según el microorganismo en
cuestión. Las tinciones especiales se usan para
objetivar distintas estructuras como la cápsula, el
núcleo, los flagelos, los esporos, etc. Antes de la
coloración hay que realizar la preparación y la
fijación del frotis. (Flores, 2008)
La preparación del frotis consiste en extender
homogéneamente la muestra (por ejemplo, un cultivo
bacteriano) o una suspensión de la misma sobre una
lámina. Una vez preparado el frotis debe secarse y
fijarse (por ejemplo, con calor). Con la fijación del
frotis se pretende obtener la muerte de los
microorganismos, la adhesión a la lámina y la
conservación de su morfología. (Flores, 2008)
Después de preparar y fijar el frotis, se puede realizar
cualquier tipo de coloración (simple o diferencial).
La coloración de Gram es la más usada en
bacteriología; debe su nombre a quién la describió en
1884. Es una coloración diferencial, dado que las
bacterias pueden clasificarse según su respuesta en
grampositivas o gramnegativas. Las primeras se
tiñen de color azul violeta y las segundas adquieren
un color rosado o rojo. (Flores, 2008)
La diferente reacción de las bacterias a la coloración
de Gram se relaciona con diferencias fundamentales
de la envoltura celular de estas dos clases de células.
En el cuadro 1 se muestran los colorantes usados, su
tiempo de aplicación y la diferente coloración que
adoptan las bacterias grampositivas y gramnegativas
en cada paso de la coloración de Gram. (Flores,
2008)
Cuadro 1. Diferencias en tinción de bacterias gran
positivas y negativas.
Universidad del Valle de México
OBJETIVOS
 Conocer, comprender e identificar el
procedimiento que se lleva a cabo después de
tener las muestras de cultivo listas, previamente
realizadas.
 Aprender a cultivar por medio del uso del haza,
así como llevar el procedimiento correcto y
continuo de las tinciones, respetando el tiempo
por cada tinción, para que de esta manera pueda
ser visible en el microscopio.
 Identificar a base del uso del microscopio óptico
las colonias que crecieron a lo largo de la semana,
así como poder distinguirlas morfológicamente.
MATERIALES Y MÉTODOS
1.- Se deberá de limpiar la mesa de trabajo, con el fin
de no contaminar los cultivos y las muestras. La
limpieza se hará con extrán, benzal y alcohol etílico
al 70%, es importante aplicarlos por separado y en el
orden en cómo fueron escritos.
2.- Se corrobora que los portaobjetos estén limpios,
en caso de no estarlos, se pueden limpiar con agua.
3.- Se enciende el mechero de Bunsen
4.- Con los portaobjetos limpios, se agregará una
gota de agua destilada.
5.- Al mismo tiempo o puede ser con el apoyo de un
compañero, se toma un asa bacteriológica y se pasa
sobre la flama del mechero y se deja por unos
segundos o al “rojo vivo”; posterior a esto, se hace
un pequeño raspado en la caja petri, sin tocar el agar,
solo la colonia de la bacteria.
6.- Con la muestra en el asa, se agrega al portaobjetos
en el que previamente se le agregó una gota de agua;
se recomienda revolver un poco, para que se
impregne de una mejor forma la muestra.
7.- Para tomar la muestra en el caldo nutritivo, se
tiene que homogeneizar todo el cultivo, esto se puede
hacer a mano, posterior a esto, con el asa previamente
calentada, se sumerge en el cultivo por al menos 3
segundos y se mezcla en el portaobjetos, que se debe
de preparar igual que en el punto anterior.
8.- Cuando se realicen todas las muestras, estas se
van a secar en el mechero, se puede hacer con pinzas
o a mano; solo se sobrepasa el portaobjetos con la

muestra en la flama del mechero hasta que esta se
seque, cuando todas estén listas, es momento de
pasar a la tinción.
9.- La tinción se realizará en una tarja, de preferencia,
se toman todas las muestras y se colocan sobre el
puente de tinción.
10.- Se agregará 1 gota de cristal violeta a todas las
muestras, es importante tomar tiempo, puesto que
una vez que se agregue el colorante, se deberá de
contar 1 minuto, para que una vez pasado este
minuto, se enjuaguen las muestras.
Universidad del Valle de México
11.- Se agrega una gota de alcohol cetona a cada una
de las muestras, se contarán 5 segundos y se van a
enjuagar.
12.- Se agregará una gota de safranina a las muestras
y se contará 1 minuto, para posteriormente enjuagar
y secar un poco, ya que el que el portaobjetos se
encuentre un poco húmedo, facilita la adhesión del
cubreobjetos.
13.- Se observan las muestras en el microscopio
óptico, con los aumentos de 10x, 40x y 100x.
14.-Para observar a 100x, se debe de agregar aceite
de inmersión. Tomar evidencias.

Diagrama de flujo

INICIO

Limpiar la mesa con: extrán, benzal y alcohol al 70%

Encender el mechero de Bunsen

Tomar los portaobjetos con los que se va a trabajar

 Universidad del Valle de México

¿Están
NO
limpios los Limpiarlos con
portaobjetos agua y secarlos
?

SI

Agregar una gota de agua destilada en cada portaobjetos

Se va a tomar una muestra con el asa bacteriológica, previo a la

toma, se calienta el asa en el mechero.

Con la muestra tomada, se mezcla en la gota de agua del

portaobjetos

Secar las muestras en el mechero

 Universidad del Valle de México

Agregar una gota de azul violeta a las muestras y dejarlas así por un
minuto

Enjuagar las muestras y agregar una gota de lugol, esperar un

minuto para poder enjuagar.

Agregar alcohol cetona, solo se dejrá por 5 segundos y se va a enjuagar

Agregar una gota de safranina a las muestras y dejar pasar 1 minuto para
poder enjuagar; con mucho cuidado, se coloca el cubreobjetos a cada
muestra.

Observar cada muestra en el microscopio, con los aumentos de 10x, 40x y 100x.
Al usar el 100x, se debe de usar aceite de inmersión.

FIN

RESULTADOS

Tabla 1. Especificaciones en cuanto a muestras, aumentos y descripción de los resultados visualizados tras la
realización de la práctica.
 Universidad del Valle de México
MUESTRA AUMENTO DESCRIPCIÓN
40X El tamaño de las colonias bacterianas no es
uniforme. Se pueden observar bacilos en toda la
muestra y tambien cocos.
- Las bacterias son gram positivas.

FRENTE
100X El tamaño de las colonias bacterianas es uniforme.
Se observan cocos y diplococos. En la parte superior
se pueden observar bacterias gram positivas y en la
parte inferior bacterias gram negativas.

OMBLIGO
100X El tamaño de las colonias no es uniforme. Tenemos
gran diversidad de bacterias ya que encontramos
cocos, bacilos y estreptococos esparcidos en toda la
muestra, estos son gram positivo. En la colonia de
la parte inferior izquierda también se observan
bacterias gram negativas.

OÍDO
100X El tamaño de las colonias es uniforme. Podemos
observar cocos y diplococos. En el lado izquierdo
las bacterias son gram positivas y en el lado derecho
son gram negativas.

PALADAR
 Universidad del Valle de México
40X El tamaño de las colonias no es uniforme,
encontramos una gran diversidad de bacterias.
Encontramos estreptococos los cuales se unen unos
con otros y son gram positivos. En la parte superior
izquierda encontramos diplococos gram negativos.

TAZA DE BAÑO

DISCUSIÓN gran positivas o negativas, gracias a la tinción gram

Después de analizar los resultados obtenidos en la
práctica, visualizamos la aplicación de los
conocimientos previamente obtenidos. Logramos
identificar la forma de las diferentes bacterias que
fueron cultivadas en la sesión previa y reconocimos
el fundamento de varias características, como por
ejemplo las morfológicas que nos dan información
acerca de las formas de las bacterias visualizadas,
como se mencionaba en la bibliografía (Sherris,
2021), está determinada por la rigidez de su pared
celular, por lo que se pueden observar cómo cocos
(esféricas u ovaladas), bacilos (cilíndrica o de
bastones; rectos o curvos) y espirilos (espiral);
siendo el caso de las 5 muestras plasmadas en la tabla
de resultados.
Por otro lado, logramos clasificar a estas mismas
bacterias según las características de su pared como
que realizamos en laboratorio, misma que es
reconocida como la más usada en bacteriología
(Flores, 2018).
CONCLUSIÓN
Tras la realización de la práctica se cumplieron los
objetivos planteados, ya que se identificaron los
procedimientos a los cuales se deben someter las
distintas muestras para la observación al
microscopio; se realizó el proceso de traslado de
cultivo para fijación de la muestra a observar, su
posterior tinción y finalmente, se logró visualizar con
ayuda del microscopio óptico las diferentes
estructuras presentes en las muestras tomadas en la
sesión previa a la práctica, al igual que la
identificación de las diferentes morfologías que estas
presentaban.

ANEXOS
Otras técnicas de tinción:

Recomendaci Generalidades de
Tinción Técnica de tinción Imagen
ón de uso la técnica
Se emplean tres Identificación
productos: de La tinción se basa
• Carbol Fucsina microorganis en colocar carbol-
Fenicada (Fucsina mos fucsina y calentar la
Básica) patógenos preparación
• Solución de Azul de Mycobacteriu ligeramente para
Ácido-alcohol Metileno al 1% m solubilizar las
resistencia • Solución de Alcohol tuberculosis, ceras, lípidos y
(ZiehiNeelsen) Ácido así como otros ácidos grasos
algunos de la pared celular
protozoarios para que permita el
del género paso libre del
Apicomplexa colorante, el cual
tiene una enorme
afinidad por los
 Universidad del Valle de México
ácidos micólicos
presentes en la
pared.
Se emplean: Se emplea en Las endoesporas se
• Verde malaquita: aquellas producen cuando
capaz de teñir las bacterias que las condiciones
esporas en caliente. producen ambientales son
• Safranina: colorante endoesporas, desfavorables
de contraste que tiñe como formándose una
las formas Clostridium y espora por cada
vegetativas. Bacillus forma vegetativa.

Procedimiento:
1. Preparar los frotis
bacterianos
indicados.
2. Teñir con verde
malaquita. Con unas
pinzas de madera
colocar la muestra
encima de la llama
De esporas de
del mechero de
Wirtz-
forma que el
Cortitlin
colorante humee
durante 5 min.
3. Lavar con abundante
agua el exceso de
colorante.
4. Teñir con safranina 1
min.
5. Lavar con abundante
agua el exceso de
colorante.
6. Secar la preparación.
7. Observar la
preparación al
microscopio. Anotar
la disposición y la
morfología de las
tres especies del
género Bacillus
• Se fija químicamente Utilizado para Permite observar y
la suspensión la observación clasificar a las
bacteriana, mediante de Vibrio bacterias de
formol, y se hace la cholerae acuerdo con la
De flagelos de
extensión en un disposición de sus
Leifson
portaobjetos. Esta tinción se flagelos
• Se deja secar al aire, usa para ver
sin calentamiento flagelos
alguno. bacterianos
 Universidad del Valle de México
• Se cubre la
preparación con una
mezcla de ácido
tánico y el colorante
rosanilina, de
preparación
extemporánea. El
ácido tánico engruesa
los flagelos y la
rosanilina los tiñe.
• Se retira el exceso de
colorante con agua.
• Se deja secar al aire,
antes de su
observación al
microscopio
1. Extensión. Tinción muy Luego los frotis
2. Desecación. usada para pueden reteñirse
3. Fijación. Dejar micobacterias, con la coloración de
enfriar. cuando el Ziehl-Neelsen o
4. Coloración: Cubrir la volumen de Kinyoun
preparación con el muestras a directamente sobre
colorante auramina- examinar es la tinción con el
rodamina elevado. Se fluorocromo, si se
previamente filtrado. fundamenta en elimina antes el
Mantenerlo así la afinidad que aceite de inmersión
durante 15 min. No poseen los
hay que calentar. ácidos
5. Lavar con agua micólicos de
destilada. la pared
6. Decoloración con celular de las
alcohol -HCl. Cubrir micobacterias
Rodamina- la preparación con el por los
Auramina decolorante y dejar colorantes
actuar de 3 a 4 fluorescentes
minutos. o
7. Lavar con agua fluorocromos
destilada. Auramina y
8. Añadir Rodamina
permanganato
potásico al 0,5% en
agua destilada y
dejar actuar de 2 a 4
minutos. El
permanganato se
utiliza para eliminar
la fluorescencia
residual de los
desechos de fondo.
Pero debe evitarse el
 Universidad del Valle de México
tratamiento excesivo
con el contra
colorante porque
puede rebajar la
intensidad
fluorescente de los
bacilos coloreados.
9. Lavar con agua
destilada.
10. Secar al aire y
observar con el
microscopio de
fluorescencia.

Cuando se une al ADN, Es muy Actúa tiñendo el

la naranja de acridina es aplicada en el ácido
espectralmente similar a laboratorio de desoxirribonucleic
un compuesto orgánico microbiología o y el ácido
conocido como para detectar ribonucleico
fluoresceína. El naranja bacterias en Compuesto
de acridina y la frotis de orgánico que sirve
fluoresceína tienen una líquidos y como colorante
excitación máxima a 502 exudados fluorescente
nm y 525 nm (verde) selectivo de ácidos
Es empleada, nucleicos con
Cuando el naranja de generalmente, propiedades
acridina se asocia con el en medios o catiónicas útiles
Naranja de
ARN, el tinte muestras para la
acridina
fluorescente experimenta donde la determinación del
un cambio de excitación visualización ciclo celular.
máximo de 525 nm de bacterias es
(verde) a 460 nm (azul). difícil,
El cambio en la permitiendo
excitación máxima detectar
también produce una bacterias, sin
emisión máxima de 650 embargo, no
nm (rojo). indica si son
Gram
positivas o
Gram
negativas.
• Depositar sobre un Está Emite fluorescencia
portaobjetos el considerado al ser activada por
material a analizar como un radiación
(escamas o alícuota método rápido ultravioleta
Blanco de
de colonia) y fácil para la afinidad que
calcoflúor
• Agregar una gota de identificación presenta por la
solución del de hongos celulosa y la quitina
fluorocromo (blanco presentes en la
de calcofluor M2r pared celular de los

(Sigma) 0,1g, azul de Identificación organismos
Evans (Sigma) 0,05 de levaduras fúngicos
g, agua destilada del
100ml) Malassezia
• 1 gota de KOH 10%
REFERENCIAS
Principios de diagnóstico por laboratorio de las
enfermedades infecciosas. Ryan K.J.(Ed.),
ionid=255428336
Schaechter M, Medoff G, Eisenstein BI, Guerra H.
Microbiología. Mecanismos de las
enfermedades infecciosas. Ed Panamericana.
2ª ed. Buenos Aires 1993 • Joklik WK,
Willett HP, Amos DB, Wilgert CM. editores,
Zinsser Microbiología. 20ª ed. BsAs.
Panamericana; 1994.
Ramos, L., Mellado, S., Ramadán, S., Bulacio, L., &
López, C. (2006). Empleo de blanco de
calcoflúor para el estudio de las especies de
Malassezia por microscopía directa. Revista
argentina de microbiología, 38(1), 4-8.
Albarado Y, Luzmila, & Flores F, Evelin. (2008).
Evaluación de la coloración diferencial de
fluorescencia modificada en Pseudomonas
spp. aisladas de suelo. Kasmera, 36(1), 17-27.
Recuperado en 26 de marzo de 2022, de
http://ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_artt
ext&pid=S0075-
52222008000100003&lng=es&tlng=es.
Universidad del Valle de México
género
(2021). Sherris. Microbiología médica, 7e.
McGraw Hill.
https://accessmedicina.mhmedical.com/cont
ent.aspx?bookid=3057&sect
Cultivo de microorganismos. Riedel S, & Hobden
J.A., & Miller S, & Morse S.A., & Mietzner
T.A., & Detrick B, & Mitchell T.G., &
Sakanari J.A., & Hotez P, & Mejia R(Eds.),
(2020). Jawetz, Melnick & Adelberg
Microbiología Médica, 28e. McGraw Hill.
https://accessmedicina.mhmedical.com/cont
ent.aspx?bookid=2955&sectionid=24886218
8
Graterol R, Oswaldo A, Barreto E, Michel E, Ramos,
Nidian A, Fernández F, Sandra, Da Mata J,
Omaira J, & Angulo, José A. (2016). Diseño
del Kit de Tinción Ziehl Neelsen del Instituto
Nacional de Higiene Rafael Rangel. Revista
del Instituto Nacional de Higiene Rafael
Rangel, 47(1-2), 18-26. Recuperado en 26 de
marzo de 2022, de
http://ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_artt
ext&pid=S0798-
04772016000100003&lng=es&tlng=es.