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ORIGEN ANIMAL MEDIANTE LC-MS/MS Rev. 2

1. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN

El objetivo del presente procedimiento es definir la sistemática que utiliza AGQ Labs
USA para la determinación (calibración y ensayo) de vitaminas D 2 y D3 (Ergocalciferol y
Cholecalciferol respectivamente), utilizando para ello la técnica de cromatografía líquida
con detector de masas (LC-MS/MS) empleando la ionización APCI.

El rango de trabajo, parámetros y matrices a determinar son las siguientes:

Parámetro Rango de trabajo Matriz

Ergoscalciferol (Vitamina D2)

0.5-50 ug/100g Alimentos
Cholecalciferol (Vitamina D3)

2. GENERAL

2.1 Definiciones

 LC: cromatografía líquida.

 MS/MS: espectrómetro de masas triple cuadrupolo.
 mg/L: miligramos de analito por litro de solución.
 µL: microlitros.
 mL: mililitros.
 µm: micrómetros.
 psi: unidad de presión del sistema anglosajón de unidades. Libras por pulgada
cuadrada,
 Torr: unidad de presión. Un Torr equivale a la presión de un milímetro de mercurio.
 rpm: revoluciones por minuto.
 %V/V: volumen de soluto en 100 mL de solución.
 Q1: Cuadrupolo 1, se relaciona con ion precursor.
 Q3: Cuadrupolo 3, se relaciona con ion producto.
 1/X: regresión lineal realizada con peso estadístico, los puntos de menor
concentración de la curva predominan más en la regresión lineal que los puntos de
mayor concentración.
 LDT: Límite de determinación total (límite de cuantificación).
 APCI: Ionización química a presión atmosférica.

2.2. Principio del método

El método se basa principalmente en la saponificación de la grasa y la posterior

extracción de la fracción insaponificable en muestra de alimentos para la identificación y
cuantificaciones de las vitaminas D2 y D3.

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2.3 Interferencias

Pueden existir interferencias causadas por la etapa de evaporación del extracto, si en

lugar de separar la parte superior del extracto se recoge parte del gel que se genera en la
interfase (revisar punto 4.4)

2.4 Precisión y Exactitud

La verificación del método se ha realizado siguiendo las pautas marcadas en el PG-04 y

los datos asociados están recogidos en la carpeta del proyecto correspondiente.

2.5 Limitaciones del Método

Además de las limitaciones aparte de las definidas en el apartado 2.3 Interferencias, se

deben respetar los volúmenes y concentraciones de las alícuotas para realizar la recta de
calibrado y los fortificados.

2.6 Requerimientos de Acondicionamiento de Alícuota y Plazo Técnico

El ingreso y recepción de las muestras se realiza según PE-170, revisión vigente.

El acondicionamiento de las muestras se realiza según PE-169, revisión vigente.
Mantener la muestra congelada si el análisis no se realizará inmediatamente. La muestra
se triturará y homogenizará completamente. Se debe realizar el ensayo el análisis lo antes
posible una vez homogenizada la muestra dado que las vitaminas se degradan por efecto
de la luz y el oxígeno.

2.7 Almacenamiento de Muestras

Una vez terminada la extracción, una porción de la muestra se conservará congelada

durante un periodo de 30 días. Una vez transcurrido este periodo la muestra se eliminará.

2.8. Criterios de Evaluación del Desempeño

Muestras ciegas: se introducirá en la cadena de producción una muestra por el

responsable del laboratorio, fortificada con una concentración conocida del analito, con
total desconocimiento del personal de laboratorio.

El criterio de aceptación o rechazo de este resultado será el siguiente: Se acepta el

resultado si la diferencia entre el valor verdadero y el obtenido no supera el 30% de error
según la siguiente expresión:

Valor obtenido−Valor verdadero

%Error= x100
Valor verdadero

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Si la diferencia es mayor del 30% se volverá a analizar la secuencia de trabajo completa.

Si el problema persiste se revisarán los datos y se registrarán las medidas a tomar.

El resultado de %Error se debe registrar en: Anexo “Planificación y resultados de

Muestras Ciegas”.

Ensayos de Aptitud: El laboratorio participara al menos una vez para cada familia de
ensayos en el periodo entre dos reevaluaciones, alternando, de ser posible, las matrices
que puede albergar cada familia de ensayo.

Los criterios de aceptación y rechazo será de acuerdo con el método estadístico Z score y
se seguirán los criterios descritos en el PG-05 “Aseguramiento de la validez de los
resultados”.

Para la evaluación del criterio de desempeño se realizará una formación colectiva para
explicar los puntos principales en la preparación y estudio de la nueva matriz introducida
en el alcance de este procedimiento de ensayo.

3. MATERIALES

3.1 Equipamiento

 Cromatógrafo liquido con detector de masas triple cuadrupolo y columna

cromatográfica
 Intensity Solo 2 C18 100x2.1mm 2.1μm (Bruker) o equivalente.
 Probe de ionización APCI.
 Centrífuga.
 Estufa.
 Campana de extracción de gases.
 Agitador de tubos.
 Trituradora.
 Rotavapor o sistema de evaporación por corriente de nitrógeno.
 Balanzas analíticas de precisión, de al menos 0.001 g y 0.00001 g.
 Viales de 2.5 ml con tapón de septum para inyector automático.
 Guantes de látex.
 Pipetas Pasteur.
 Matraces aforados de vidrio clase A.
 Matraces de evaporación en forma de corazón.
 Micropipetas y sus puntas correspondientes.
 Frascos de vidrio color topacio.
 Tubos falcon 50 mL
 Tarrinas para la conservación de muestras.

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3.2 Reactivos

 Agua Osmotizada o de superior calidad (CAS: 7732-18-5).

 Hexano calidad HPLC o superior (CAS: 92112-69-1).
 Etanol calidad HPLC o superior (CAS: 64-17-5).
 Hidróxido potásico 90% calidad ACS, ISO (CAS: 1310-73-2).
 Pyrogallol 98% (CAS:87-66-1)
 Ácido Fórmico 98% (CAS:64-18-6)
 Metanol calidad HPLC o superior (CAS:67-56-1)

3.3 Materiales de Referencia

Estándar certificado de:

 Vitamina D2 (Ergocalciferol) Analytical Standard (CAS: 50-14-6).
 Vitamina d3-D2 (6,19,19-d3) Analytical Standard (CAS: 1217448-46-8).
 Vitamina D3 (Cholecalciferol) Analytical Standard (CAS: 67-97-0).
 Vitamina d3-D3 (6,19,19-d3) Analytical Standard (CAS: 80666-48-4).

3.4 Patrones de la Recta de Calibrado

La curva de calibrado se resume en la siguiente tabla (se realiza por proceso en agua,
según apartado 4.4.) su preparación es diaria siempre y cuando se preparen muestras.

uL Patrones uL STD uL STD uL STD

Concentración
Internos Vitaminas Vitaminas Vitaminas
Vitaminas (µg/100g)
(500 µg/L) (50 µg/L) (500 µg/L) (10 mg/L)
Blanco 20 - - -
0.2 20 40 - -
0.5 20 100 - -
1.0 20 - 20 -
5.0 20 - 100 -
10.0 20 - 200 -
25.0 20 - - 25

3.5 Controles de Calidad

En cada lote de muestras correspondientes a 1 día se realizarán los siguientes controles

de calidad:

 1 Blanco matriz
 1 Blanco reactivo
 1 Duplicado

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 1 fortificado (alternando en el tiempo el fortificado) de alguno de los siguientes

niveles:
Concentración uL Patrones uL STD uL STD uL STD Rango de
Vitaminas Internos Vitaminas Vitaminas Vitaminas aceptación
(µg/100g) (500 µg/L) (50 µg/L) (500 µg/L) (10 mg/L) (%)
0.5 20 100 - - 60-140
5.0 20 - 100 - 60-140
25.0 20 - - 25 60-140

Se dará por válida la extracción si:

 Se cumple el rango de aceptación del fortificado.
 El blanco matriz no supera el límite de cuantificación (0.5 ug/100g), de lo
contrario un técnico calificado debe determinar si puede o no informar positivos
de acuerdo con la curva de calibración.
 El blanco reactivo no supera el límite de cuantificación (0.5 ug/100g), de lo
contrario un técnico calificado debe determinar si puede o no informar positivos
de acuerdo con la curva de calibración.

En caso de no cumplir con el rango de aceptación se dará por válida la extracción si:

 La recuperación del interno es > 140% y no hay positivos; en el caso de haber

positivos se repetirá la inyección y en caso de seguir incumpliendo se repetirá
el proceso de extracción del fortificado o estándar interno.
 La recuperación del estándar interno es < 60% se repetirá la inyección y en
caso de seguir incumpliendo se repetirá el proceso de extracción o estándar
interno.

NOTA: los volúmenes y concentración de partida del estándar interno y/o fortificado
pueden variar a decisión del analista, siempre que lleguen a la misma concentración final.

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4. PROCEDIMIENTO

4.1 Prescripciones Previas

Preparación de estándares y soluciones

 Fase Móvil A: Agua con 0,1% Ácido fórmico.

 Fase Móvil B: Metanol con 0,1% ácido fórmico.

Tienen duración máxima de dos meses y deben conservarse a temperatura ambiente.

 Disolución 50 %p/v de hidróxido potásico (KOH): pesar 50 g de hidróxido potásico y

enrasar a 100 mL de agua (agitar bien para disolver). La caducidad de esta
disolución será de 15 días. Nota: reacción muy exotérmica, esperar a que se
enfríe para su enrase y su posterior manejo. Extremar las precauciones de
seguridad en el manejo de esta disolución.

 Disolución 3 %p/v de Pyrogallol en EtOH: pesar 30 g de pyrogallol y enrasar a 1 L

de etanol (agitar bien para disolver). La caducidad de esta disolución será de 15
días. Mantener protegida de la luz directa pues se oxida con facilidad.

 Disolución de hexano saturado en Pyrogallol: pesar la cantidad adecuada de

pyrogallol de forma que tengamos una disolución saturada en hexano.

 Disolución madre individual: para una concentración aproximada de 1000 mg/L

pesar la mínima cantidad con precisión de al menos 0.0001 g en balanza analítica
y enrasar con etanol a 10 mL. Anotar el peso exacto en la hoja de registro
correspondiente (Anexo 2). Esta disolución también puede venir preparada
comercialmente.

 Disolución de Vitaminas 100 mg/L: Se toma un volumen de 100 μL de la disolución

madre (Nota: este volumen puede cambiar en función de la concentración de esta)
y enrasar con Etanol a 1 mL (Anexo 3).

 Disolución de Vitaminas 10 mg/L: Se toma un volumen de 100 μL de la disolución

de 100 mg/L y enrasar con Etanol a 1 mL (Anexo 3). Con una caducidad de 3
meses.

 Disolución de Vitaminas 500 μg/L: Se toma un volumen de 50 μL de la disolución

de 10 mg/L y enrasar con Etanol a 1 mL (Anexo 3). Esta disolución se prepara a
diario.

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 Disolución de Vitaminas 50 μg/L: Se toma un volumen de 100 μL de la disolución

de 500 μg/L y enrasar con Etanol a 1 mL (Anexo 3). Esta disolución se prepara a
diario.

 Disolución de Patrones Internos 100 mg/L: Se toma un volumen de 100 μL de la

disolución madre (Nota: este volumen puede cambiar en función de la
concentración de esta) y enrasar con Etanol a 1 mL (Anexo 3). Esta disolución
también puede venir preparada comercialmente.

 Disolución de Patrones Internos 10 mg/L: Se toma un volumen de 100 μL de la

disolución de 100 mg/L y enrasar con Etanol a 1 mL (Anexo 3). Con una caducidad
de 3 meses.

 Disolución de Patrones Internos 500 μg/L: Se toma un volumen de 50 μL de la

disolución de 10 mg/L y enrasar con Etanol a 1 mL (Anexo 3). Esta disolución se
prepara a diario.

Las disoluciones se conservarán congeladas y en oscuridad como máximo 1 año para las
de concentración superior o igual a 100 mg/L. Si se observa degradación en alguno de los
compuestos este plazo de conservación puede verse reducido.

Los volúmenes se pueden cambiar en función de las necesidades del laboratorio para
adecuarlos a su producción.

4.2 Condiciones Instrumentales

 Instalar la probe de APCI y girar la aguja corona apuntando hacia el interior del
equipo.
 El cromatógrafo estará sin ningún mensaje de error.
 Verificar que hay suficiente fase móvil en sus depósitos.
 La columna se irá acondicionando de forma gradual hasta las condiciones finales
de trabajo que indique el método instrumental. Se dejará acondicionar antes de
comenzar con el análisis.
 Se verifica el estado del Autosampler y de las bombas.
 Las condiciones analíticas del HPLC se detallan a continuación:
 Columna: Intensity Solo 2 C18 100x2,1 mm 2,1um (Bruker) o equivalente.
 Temperatura Columna: 40°C
 Volumen de inyección: 20 µL
 Temperatura autosampler: 10°C
 Gradiente Bombas:

Tiempo Flujo Fase A (%) Fase B (%)

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(min:sec) (µL/min)
0.00 400 90 10
0.50 400 90 10
1.00 400 0 100
7.80 400 0 100
7.90 400 90 10
11.00 400 90 10

 Verificar las siguientes condiciones en el detector:

 Source Type: APCI
 Spray Voltaje (+): 20 uA
 Spray Voltage (-): 20 uA
 Cone Temperature: 300 °C
 Cone Gas Flow: 10
 Heated Probe Temperature: 200 °C
 Probe Gas Flow: 20
 Nebulizer Gas Flow: 30
 Exhaust Gas: ON
 Los MRM se presentan a continuación:

ANALITO CAS Number Q1 (mass) Q3 (mass) CE (V)

Vit D3-d3 80666-48-4 (+) 388.5 370.0 5
Vit D2-d3 1217448-46-8 (+) 400.5 125.0 10
67-97-0 259.1 10
Vitamin D3
(+) 385.3 159.1 20
(Cholecalciferol)
107.1 20
50-14-6 69.1 30
271.3 47
Vitamin D2 (Ergocalciferol) (+) 397.3
125.0 44
107.1 21

4.3 Calibración

La preparación de los puntos de calibración se describe en el apartado 3.4. Una vez

terminada la inyección se procesa la calibración con el método de trabajo
correspondiente.

Mediante un ajuste por mínimos cuadrados, se obtiene la ecuación de la recta que

constituye la calibración. Usando peso estadístico 1/X

y=m⋅x +b
Donde:
y Área del pico cromatográfico.
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b ordenada en eje y.
m pendiente de la recta.
X concentración de patrón en µg/L.

Una vez finalizada la secuencia de análisis, se procesará dicha secuencia. La

identificación y cuantificación de los compuestos se realiza de forma automática mediante
el software del instrumento.

La identificación de los compuestos se realiza a través del método de procesamiento

según tiempos de retención estimados cada día con un criterio de tolerancia de ± 0,25 min
respecto de la calibración del estándar (siempre y cuando la curva a la cual se procesa
corresponda a la misma matriz de la muestra, ya que distintas matrices pueden presentar
tiempos de retención levemente mayor a 0.25 min de diferencia o si existe evidencia de
que cromatográficamente los tiempos se desplazaron producto de un cambio en la
presión de la columna y/o bomba HPLC).

La razón de iones no debe superar un 20 % con respecto al patrón de referencia.

La cuantificación de la muestra se puede realizar de la siguiente manera:

 Interpolando el área de la muestra en la ecuación de la curva como se indica

anteriormente.
 Calibración de 2 estándares (la diferencia entre los estándares no debe ser
superior a 10 veces) y el área de la muestra debe encontrarse entre los 2
estándares, esta curva de 2 puntos se debe inyectar antes y después de las
muestras y el RSD entre cada estándar de la primera inyección y la segunda no
debe ser superior a 30%.

Los criterios de aceptación para la curva de calibrado serán los siguientes:

• Se comprobará que los compuestos dan señal cromatográfica al punto de
sensibilidad.

En el caso de existir algún positivo se estudiará y aceptará la calibración para los

compuestos:

• Criterio visual: recta próxima a los puntos y que tiende al origen, siendo éste un
criterio previo y complementario a los dos siguientes.
• Coeficiente de regresión R2: ≥0.99.
• Desviación estándar de la calibración ≤ 30% (RSD).

Si no cumple alguno de los criterios establecidos, se distingue entre:

• Si se ve el punto de menor concentración indicará que el equipo pasa los criterios

de sensibilidad, por lo tanto, se pueden emitir resultados en caso de no detectar positivos
en la muestra.

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• Si no cumple el criterio de sensibilidad, se vuelve a inyectar el punto de menor

concentración y no se emiten resultados hasta que se demuestre la sensibilidad del
equipo.

En el caso de no cumplir con alguno de los criterios establecidos, se podrá eliminar algún
punto de la recta (por una mala inyección y/o mala preparación de este) siempre y cuando
no se elimine el punto más bajo de la recta (el límite de cuantificación) y la recta esté
compuesta por al menos 4 niveles de calibración.
La calibración se podrá reinyectar por incumplimiento de los anteriores criterios de
aceptación, después de investigaciones previas.

4.4 Ejecución del Ensayo

 En un tubo falcon para centrífuga de fondo cónico se pesa 1 g de muestra.

 Añadir 20μL de la disolución de patrones internos de 500 μg/L.
 Añadir 25mL de etanol al 3% en pyrrogalol + 5 mL de una disolución de hidróxido
potásico al 50%.
 Agitar 5 minutos en agitador rotatorio e incubar la muestra a 50 ºC durante 1 hora.
 Enfriar la muestra durante 30 minutos en baño de agua/hielo o congelador.
 Añadir 15 mL de hexano saturado en pyrogallol.
 Agitar 5 minutos en volteador y centrifugar a 3900 rpm durante 10 minutos.
 Transferir el máximo volumen de la fase orgánica (la superior) a otro tubo falcon.
 Realizar una segunda extracción con 10 mL de hexano saturado en pyrogallol.
 Agitar 5 minutos en volteador y centrifugar a 3900 rpm durante 10 minutos.
 Transferir el máximo volumen de la fase orgánica (la superior) al tubo falcon junto
con el extracto anterior.
 Añadir 15 mL de agua.
 Agitar 5 minutos en volteador.
 Enfriar la muestra durante 30 minutos en baño de agua/hielo o congelador y
centrifugar a 3900 rpm durante 10 minutos.
 Transferir con cuidado 10 mL de la fase orgánica (la superior) a un matraz o tubo
de fondo cónico (*).
 Evaporar en rotavapor a 40 ºC.
 Retomar el extracto con 1 mL de etanol y traspasarlo al vial cromatográfico para su
análisis por LC.
 Si hay que diluir se tomará el volumen de muestra necesario (según la dilución
requerida) y se anotará en la orden de trabajo para realizar la corrección
correspondiente sobre el resultado. Las diluciones se harán con el extracto
resultante de una muestra “blanco”, para mantener la concentración de los
patrones internos en la muestra.

(*) Nota: Evitar el tomar el gel que se produce en la interfase ya que afecta de
forma notable a la señal de los analitos.

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5. CÁLCULOS

A la hora de procesar una secuencia de trabajo, lo primero será procesar la curva de

calibrado la cual deberá cumplir según lo indicado en el apartado 4.3.

Identificación de un positivo

Se revisará que el tiempo de retención de los picos obtenidos en el cromatograma

coincide con el del patrón. Se aceptará una tolerancia de ± 0.2 min con respecto al patrón.
Mayores desviaciones en el tiempo de retención se aceptarán para ciertas matrices,
previa confirmación por adición estándar del compuesto.

Integración y cuantificación

• La integración y cuantificación del compuesto se realiza de forma automática por el

software del equipo.
• Para la integración automática se establecen los parámetros de integración que por
defecto nos ofrece el software. En el caso de que sea necesario realizar una integración
de forma manual se hará de línea de base a línea de base.
• La expresión para el cálculo de las cuantificaciones viene dada directamente por el
software del equipo, aplicando la recta de calibrado del método, proporcionando así el
dato final de concentración para cada uno de los analitos analizados.
• En caso de duda debido a un efecto matriz, para evitar la emisión de un falso
positivo se realizará una adición estándar de la materia activa concreta a un nivel similar
al cuantificado por el método, para descartar a reportar el resultado positivo.
• La respuesta del detector para los analitos detectados en el extracto de la muestra
debe estar dentro del rango de la calibración inyectada. En caso de que la concentración
exceda el nivel más alto de la calibración, se evaluara por área considerando el área del
punto más alto de la curva de calibración, cuya diferencia no supere el 20%, de lo
contrario es necesario diluir la muestra con un extracto de blanco matriz similar al de la
muestra.

Expresión de resultado:

μg Vitamina / 100 g muestra = μg/100g Vitamina (recta) / (g muestra)

Interpretación del Resultado:

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 Cuando el resultado se encuentre bajo el límite de detección, se informará No

Detectado.
 Si el resultado es sobre el LC de la técnica, se informa en µg/100g.

Los cálculos de incertidumbres son realizados según el PG-04 y todos estos datos están
incluidos en los informes de validación correspondientes.

No se aplica factor de recuperación (dato de la validación del método), se incluye dentro

de la incertidumbre del resultado, calculada según PG-04.

6. EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DE LOS ENSAYOS

6.1 Ausencia de Contaminación

Por cada tanda analítica se ensayará una muestra blanca para asegurar que las
condiciones de extracción de las muestras son correctas y no tenemos contaminaciones
cruzadas o interferencias. Para ello se tomará una muestra no tratada y se procederá de
la misma forma que una muestra de rutina, siguiendo el procedimiento detallado en el
apartado 4.4 de este procedimiento.

El control será correcto siempre que el valor obtenido para el blanco sea menor o igual al
33% del límite de cuantificación de cada analito. En caso contrario se estudiarán las
causas y se procederá en consecuencia.

6.2 Precisión

La precisión se evaluará semanalmente utilizando los valores obtenidos para el fortificado

al límite de cuantificación el que corresponde al duplicado del punto más bajo de la curva
de calibrado.

En condiciones de repetibilidad, no deberá ser superior al 30%, calculado como CV (%)

de repetibilidad según se indica en el PG-05. Si no se cumple se estudiarán las posibles
desviaciones en el proceso de extracción.

6.3 Veracidad

La veracidad se evaluará semanalmente mediante una muestra fortificada con los analitos
a detectar al nivel del límite de cuantificación. Siempre que sea posible, realizar esta
fortificada sobre una muestra que no contenga la materia activa a analizar.

La fortificada se prepara según apartado 3.5. y se evaluará según se define en el PG-05,

aplicando la siguiente expresión:
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Valor Referencia−Valor Resultado

Veracidad= ·100
Valor Referencia
Siendo:
Valor Referencia: concentración del analito teórica.
Valor Resultado: concentración del analito obtenida.

Se aceptará el resultado si la recuperación está entre el 60%-140%. La cuantificación de

este punto se hará mediante recta de calibrado.
Si en algún caso la recuperación es <60% y tiene señal cromatográfica, se podrán emitir
resultados no detectado tras comprobar que las muestras tienen ausencia de señal
cromatográfica. Si alguna muestra tuviese señal cromatográfica se volvería a inyectar con
una fortificada válida.
Si no se cumple el apartado anterior se estudiará las posibles desviaciones en el proceso
de extracción.

6.4 Sensibilidad

El instrumento debe demostrar la sensibilidad del método con un estándar a nivel del
límite de cuantificación. Se deberá tener una señal cromatográfica bien definida
caracterizado por su ratio señal ruido, tanto para el ión de identificación/cuantificación,
como para el cualificador/es.

Si el instrumento no es capaz de llegar a la sensibilidad necesaria se debe realizar

mantenimiento y/o lo determinado por el técnico de laboratorio lo cual debe quedar
registrado en el registro correspondiente.

7. ACTIVIDAD PREVENTIVA

7.1. Fichas de Seguridad

Todas las fichas de seguridad de los productos químicos que se utilizan en este
procedimiento se encuentran en formato digital en la carpeta Orgánico Alimentaria.

7.2 Riesgos asociados al Trabajo a realizar y Medidas Preventivas a adoptar

La evaluación de riesgos asociada al puesto de trabajo está recogida en la intranet en el

apartado de Prevención de Riesgos Laborales y se resumen a continuación:

RIESGO EPP
Guantes, vestuario de trabajo, protección ocular (gafas
Exposición a agentes o pantallas faciales) y otros equipos de protección
químicos por contacto indicados en los procedimientos de trabajo y
adecuados a los productos químicos utilizados.
Exposición a agentes Campanas de extracción, como medida
químicos por inhalación complementaria de protección a la extracción
localizada, y si no se garantiza una adecuada
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RIESGO EPP
renovación ambiental, se deberán utilizar equipos de
protección respiratoria con filtros adecuados.
Es preciso utilizar calzado que quede bien sujeto al pie
Caída de personas a y que disponga de suela antideslizante, sin perjuicio de
distinto nivel aquellos puestos que requieran uso de calzado de
seguridad.
Es preciso utilizar calzado que quede bien sujeto al pie
Caída de personas al y que disponga de suela antideslizante, sin perjuicio de
mismo nivel aquellos puestos que requieran uso de calzado de
seguridad
Caída de objetos en
Guantes, bandejas, carretillas, mesas portátiles
manipulación
Golpes o cortes con Normas de seguridad para la correcta utilización de
objetos o herramientas material de vidrio de laboratorio
Golpes o cortes con Medidas de seguridad para la utilización y manejo
objetos o herramientas seguro de cuchillos y cuchillas de elementos de corte
Atrapamiento por o entre Antes de utilizar los equipos de trabajo debe
objetos comprobarse que sus protecciones y condiciones de
uso son las adecuadas y que su conexión o puesta en
marcha no representa un peligro para terceros
Contactos con Guantes, vestuario de trabajo, protección ocular (gafas
sustancias agresivas - o pantallas faciales) y otros equipos de protección
Contactos con P.Q. del indicados en los procedimientos de trabajo y
laboratorio, mezclas y adecuados a los
formulados productos químicos utilizados.
Campanas de extracción, como medida
complementaria de protección a la extracción
Inhalación o ingestión de
localizada, y si no se garantiza una adecuada
sustancias tóxicas
renovación ambiental, se deberán utilizar equipos de
protección respiratoria con filtros adecuados
Utilizarán los elementos auxiliares (pinzas,
Contactos térmicos
agarradores, etc)
Manipulación manual de
Guantes, bandejas, carretillas, mesas portátiles
cargas

8. GESTIÓN DE RESIDUOS

El retiro de residuos está a cargo de una empresa privada, y se realiza de acuerdo con
el procedimiento PG-13.

9. RECUALIFICACIÓN

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Se debe realizar una recualificación al personal ya formado cuando se modifique lo

siguiente en el PNT:

 Niveles curva de calibrado

 Controles de calidad
 Rangos de aceptación en los controles de calidad
 Algún cambio en la ejecución del ensayo

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10. BIBLIOGRAFÍA Y REFERENCIAS

 Manual de instrucciones del cromatógrafo de gases al uso.

 Manual Software del equipo correspondiente.
 Procedimiento General para la Gestión de la Documentación. PG-01.
 Procedimiento General para el Control, Calibración, Verificación y Mantenimiento
de Equipos PG-03.
 Procedimiento General para la Validación de Métodos. PG-04.
 Procedimiento General para la Evaluación de la Calidad de los Ensayos. PG-05.
 Procedimiento de Recepción y Acondicionamiento de Muestras, PE-130.
 UHPLC Method Development Options for a Vitamin D2 and D3 Separation
 LC/MS/MS Determination of Vitamin D in Food
 Maximizing Triple Quadrupole Mass Spectrometry Productivity with the Agilent
StreamSelect LC/MS System.
 Fast Analysis of Fat-Soluble Vitamins in Infant Milk Powder by Heart Cutting 2D-LC
 Separation of fat-soluble vitamins.
 Simultaneous Determination of Vitamins D2 and D3 by LC-MS/MS in Infant Formula
and Adult Nutritionals: First Action 2011.13.
 Measurement of 25-OH-Vitamin D3 and 3-Epi-25-OHVitamin D3 by LC/MS/MS.
 Review. Extraction of fat-soluble vitamins.
 Online Analysis of 25-OH-Vitamin D2/D3 in Plasma and Serum with the EVOQ LC-
Triple Quad.
 Simultaneous Analysis of Vitamin A and D3 in Vitamin Premixes and Concentrates
by Convergence Chromatography/PDA Detection.
 Vitamina A y D. Equivalencia IU-mg.
 Analysis of Vitamin D3 and D2 in cheese by Bruker EVOQ™ Elite LC/MS/MS TQ.
 Application of Ultra-High-Performance Liquid Chromatography/Tandem Mass
Spectrometry for the Measurement of Vitamin D in Infant Formula and
Adult/Pediatric Nutritional Formula: First Action 2011.11.
 Combined Measurement of 6 Fat-Soluble Vitamins and 26 Water-Soluble
Functional Vitamin Markers and Amino Acids in 50 μL.
 Fat soluble vitamin detection in Food by LC/MS/MS.

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11. ANEXOS Y FORMATOS

11.1 Diagrama de Flujo

Tomar 1 g muestra en un
ANEXO-1 (FALCON N° 1)

Añadir: 20 uL Patrones Internos

Añadir: 25 mL EtOH (3% Pyrrogalol) + 5 mL KOH (50%)

Agitar 5 min.

Incubar 1 hr 50°C

Enfriar en congelador 30 min.

Añadir: 15 mL Hexano sat. Pyrrogalol + agitar 5 min.

Centrifugar y tomar la parte orgánica (superior) FALCON-N°2

2da extracción: 10 mL Hexano sat. Pyrrogalol + agitar 5 min.

Centrifugar y tomar la parte orgánica (superior) unir en el FALCON-N°2

Añadir: 15 mL Agua + agitar 5 min.

Enfriar en congelador 30 min.

Centrifugar y tomar la parte orgánica (superior)

Tomar 10 mL de fase orgánica (superior) y evaporar.

Reconstituir con 1000 uL EtOH, inyectar en el LC-MS

Procesado de resultados

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11.2 Registros

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12. MODIFICACIONES

Las modificaciones realizadas en el documento han sido:

REVISIÓN PUNTO DESCRIPCIÓN

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