Protocolo para la dotorrnInación do huevos do Protocolo para la determinación do huevos do Protocolo para la determinación do

holmIntos en aguas (NMX-AA-113-SCF1.1999) holmintos en suelos y blosolidos huevos do holmintos en pastos (Kozan,
(NOM-004 ECO, 2002) etal.) (17)
Sodlmontación Elución do la muestra
Elución do la muestra
  Se pesó

Se recolectaron 10 el equivalente a lOg del peso seco
Se pesó 1 kg del
litros de agua y se de la muestra y se adiciono al vaso de
material vegetal y se
sedimentar24 'rasa la licuadora, con 800 ml de Tween 80
=4%1: al 0,1 % (Wv).
 Se
dividió en porciones
de 200 g. Se tuvo
encantidadc'Ie%que It yp e od e r= r
encendió la licuadora por 5 segundos
y luego se apago por otros 5 segundos.
menor, por lo cual la cantidad de solución
Se repitió este procedimiento tres
detergente variaba dependiendo de la
veces.
cantidad de muestra recolectada y debia
 Se agrego
ser proporcional a la cantidad de vegetal
la mezcla en un vaso de precipitado, se
pesado. Se anoto la cantidad de vegetal
enjuago el vaso de la licuadora con 200
pesado para tenerlo en cuenta en el
ml de Tween 80 al 0,1 % (Wv) y se
momento del cálculo.
adicionaron al mismo vaso de precipitado.

 Se dejo
Se preparó el baño
sedimentar durante 3 horas.
ultrasonido
ri€,IlltroaszliedsOleuerórneiteelgilleandt: por
cada porción d10
minutos.

Después de cada
sonicación se retiraba
m a t e r
i a l y
Filtración Filtración
 Se aspiró el 90 %  Se aspiro el 90% del
sobrenadante empleando n c d v
del sobrenadante empleando el método de
vasos comunicantes y se descartó.
 e l m
Se Z
otl s:d i ralle= comunicantes
 Se filtró el =I:su Y„ Imdiez sc: 160 pm con el fin de remover los sólidos
sedimento a través de un
tamiz de 160 pm, con el fin de remover los sólidos grandes grandes.

5 litros de agua de la llave
Se enjuago con p r ot ocSole o
a g n
or i g i n a l p l a2nlte de
c sae uqe s d e blel a v e
c o n a g u a destilada, pero se realizo
(el protocolo original plantea que se debe dicho cambio
enjuagar con gua destilada, pero se hizo para economizar el recurso), y se recuperó en el
a
dicho  n sr n n re c
je d e jo s eerriereitar durante
cambio para economizar el recurso),
y se recuperó en el mismo recipiente.
 Se dejó 3 horas.
sedimentar durante 3 horas.

Contrifugación y flotación
• S e a s p i r ó e l
Contrifugación y flotación
9 0 % d e l s o b r e n a d a n • Se aspiró el sema na s : nd n l Pasas permitir
e1nter2 de aire se completo
90% del sobrenadante empie..do el evap orado con agua destilada.
empleando el método de vasos método de vasos comunicantes y se descarto.
comunicantes y se descartó. • Se centrifugo el sedimento a 660 g por 5 minutos
 Se el
sobrenadante, y se adicionaron al
5e ugmcierinuttnoisyn el ed
s l m e ni n a
sed esc a rt ó e nt d ur . a e
l s ob r e n a d a n te , g
ad a r ; te, Y
sedimentod
10 volúmenes de solución de ZnSO,con
al cual se añadieron 10 volúmenes de densidad de 1,3.
solución de ZnSO, de densidad de 1,3. • Se areanrionnetnrogs= los tubost inubutonssy se centrifugó el

• leer:Ireclu7pnYser ó e l s ob re n a:n 1Paa:I l ónil ta .•

's e ce in 'f i g
s
n i
s e .

el sedimento.

Se agregaron 15
mi de ácido
acetoacético y 10
ml de éter dietílico
o etil acetato. Este
procedimiento se
hizo en cámara de
extraccion usando
máscara de
protección con
cartuchos
especiales para
solventes. Se agito
la muestra
durante 2
minutos teniendo
la precaucion de
aflojar la tapa
después de cada
agitacion para
liberar los gases.

Se centrifugo a
660 g durante 3
minutos. La

IgedusálrecedIsslárnisIrrcelicadanartEsntrdersricii: adiciono icirrsntitos de •

clinoasceiedriZtds=te 3 horas.
"' n' en
Extracción sobrenadante empleando el rrarp l iro el sobrenadante el método

 Se aspir o s'Inr n" ic ante s Y

se descarto,

de vasos cdrers=n Ytcs r-e

atig; iuraMe 5 minutos.

i2
 Se centrifug v:selsedimento a 660 g durante
Se cdeenstcrifa . -e, sobrenadante y se recupero
5minutos.
Se descartó el sobrenadante y se recuperó el sedimento.
 Se agregaron 15 ml de acido acetoacenco y 10 ml de
éter dietílico o etil acetato. Este procedimiento se
hizo en cámara de extracción y se uso máscara de protección con cartuchos especiales para solventes. Se
agito la muestra durante dos minutos, teniendo la precaución de aflojar la tapa después de cada agitación
para liberar los gases.
 Se centrifugaron los tubos a 660 g durante 3 minutos.
La muestra quedó separada en tres fases distintas. Todos los residuos pesados,
incluidos los huevos, larvas y protozoario, quedaron ubicados en el
sedimento; sobre este se encontró la capa nitida de
solución tampón, y las grasas y los otros materiales
quedaron dentro del éter dietílico o etil acetato formando una capa densa en la parte superior del
tubo donde se centrifugó la muestra. Se eliminaron las dos capas superiores usando una pipeta Pasteur
y se recupero el sedimento.
 Sz d azerin 5 ml de H,S0,, 0,1N para un primer
'
 Se centrifugoman:lag durante 5 minutos.
 Se aspiro el sobrenadante y se dejaron 5 ml para un
segundo lavado con H,S0 .,, 0,IN.
 Se centrifugo a 660 g durante g minutos y se aspiró
el sobrenadante dejando 5 ml del mismo.
 Se incubó la muestra a 26 °C durante cuatro
Contrifugaelon 
 Se centrifugo a 1.500 g durante 15 minutos. Se Se repitió el
descartó el sobrenadante y se recuperaron los sedimentos de todos los tubos en un procedimiento
único tubo. para cada
 Se enjuagaron todos los tubos dos veces con la solución solución de
detergente; se agregaron al tubo con sedimento y se distribuyó el sedimento en tubos de lavado
centrifugación de 50 ml con, aproximadamente, 5 ml cada uno. correspondiente a
cada porción de
200 g (cada
Extracción porción de 200 g
 Se agregaron 15 ml de ácido acetoacético y 10 ml de contaba con un
éter dietilico o etil acetato a cada tubo. Este procedimiento se hizo en cámara de tubo
extracción usando máscara de protección con cartuchos especiales para solventes. Se independiente
agito la muestra durante 2 minutos; se tuvo la precaución de aflojar la tapa para la lectura en
después de cada agitación para liberar los gases. el microscopio).
 Se centrifugo a 660 g durante 3 minutos. La muestra quedó separada en tres 
fases distintas. Los residuos pesados, incluidos los huevos, larvas y protozoarios, Se incubaron
quedaron ubicados en el sedimento; sobre éste se observo la capa nitida los todos los tubos
de i a s nl n ra
lIY resultantes de
otros materialestampón;
cada muestra a
q dentro I
é t e r d i e t i i i c o 26 °C durante
o etil acetato, formando una capa densa en la parte superior del tubo. Se eliminaron las dos cua tro semana s dejandola s rrfl ojas
capas superiores usando una pipeta Pasteur y se recupero el sedimento en un único tubo por porción. p a r a r i i n t e r c a m b i o
sp leto el ni vel eva porado con
agua destilada.
 Se agregaron 5 ml de H,S0,, 0,1N.

:In:elo
Lectura en • Una vez finalizado laliizieardnoe do de 1."11nn :::z1121ranelso :I P:ríodo de incubación y antes
r c e P
Lectura en el microscopio


l nrel: fIro r i 4 cl o ri t a s o dr(igual

incubacion, se centrifugó el sedimento a 660 g ce I
e l ' s c
i r a t n
Se coloco el
durante 5 m i n u t o s . sedimento gota a
 volumen y se dereardsear durante 10 minutos. Se gota sobre una
Se aspiro el lámina
sobrenadante  lex:j portaobjetos
cuidadosamente rctlifi.rZiaa 660 g durante 5 convencional, y
para no remover el luego se cubrio
sedimento y se minutos y se decantó con laminilla.
descartó.  Se observo
  restlIc bajo un
Se puso el sedimento ots5e711:lo microscopio de
s n
gota a gota sobre e nrueangaudeaelitpen.agua destilada luz con 10X. Los
una lámina y se centrifugo bajo las mismas huevos que
portaobjetos condiciones. contenían una larva
convencional, y luego  Se completamente
se cubrió con aspiro el sobrenadante desarrollada y
laminilla. cuidadosamente para no móvil se
Sec observo
n)d kbajon un
er r
remover el sedimento y se consideraron
descarto dejando hasta 5 ml del viables; estas
fX. os qucOrIran ua11: volumen final. características
completamente desarrollada y móvil se  Se se
coloco el sedimento gota a gota
cs:1 1,1 1 ,=0,"I'aobbWasrl: InacutnerJ1Zso de sobre una lámina portaobjetos
convencional, y luego se cubno
c onf i r ma r on
bs eva
n ck : 1un
demás l'7Zsursaeens'sdeedrianInnto jece4Oosd
con laminilla. e a :vos no se
  uS ez cob n
. se r v o consideraron
n i
c :ll de la II sr : v os viables. Se hizo la
q u l l t= u n r l a tc om p l e ta me n
te lectura del
desarrollada y móvil se consideran viables; estas
concentracion total sedimento
n
completo.
de huevos c
oljlv eotec41Xs;elocsnidraasrru:vb:s r7loansceinc=ileram 
viables. Se hizo la lectura del sedimento completo. La suma de los
ysiglanZe hr:uvireablesi se hizo aplicando la  El huevos viables
cálculo de la concentracion más los no viables
N= total de huevos y de
(1) encontrados
huevos viables por 4 g de peso seco, se hizo aplicando
donde: debía ser igual a
la siguiente fórmula:
N: número total de huevos o de huevos N = á (,), la cantidad total
viables/I A: numero total de huevos y de de huevos en la
huevos viables muestra. Se
donde:
1 dns
:n l iedn :n
V c o n t a d o s :e n e„ litros
N: número total de huevos o de huevos viables por 4 g de
peso seco
calculo el número
total de huevos y
el de huevos
A: número total de huevos y de huevos viables viables por kg de
contados en el sedimento en 10 g de pesos seco peso fresco de la
muestra,
aplicando la
siguiente
formula: HH/Kg
PF=
+/V3,,,,,V4„...+/V5,,,„., (3),
donde:
kW/kg PF: número total de huevos o de
huevos viables/kg de peso fresco
N1,2,3,4,5 número total de huevos
o de huevos viables contados en cada
'cl:pdu%':::',:loddeo'adl=bnacc111°°