INVESTIGACION DE Salmonella. PROTOCOLO DE AISLAMIENTO DE Listeria Sp. Y Campylobacter Sp.

Microbiología de Alimentos
UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

FACULTAD DE CIENCIAS
Escuela de Biología y Microbiología
INVESTIGACION DE Salmonella. PROTOCOLO DE AISLAMIENTO DE Listeria Y

Campylobacter
Asignatura: Microbiología de Alimentos
Docente: Dr. César Julio Cáceda Quiroz
Alumnos:
Alexandra Alférez Manrique
Alberto Agustín Alexis Maldonado Delmas
Códigos:
. 2015-118028
. 2015-118011
TACNA
Julio - 2020
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INVESTIGACIÓN DE Salmonella EN ALIMENTOS
1. Introducción
Salmonella es un género bacteriano, perteneciente a la familia Enterobacteriaceae
Son bacterias Gram negativas, aerobios-anaerobios facultativos, fermentan la glucosa
con producción de gas. No fermentan la lactosa. Reducen nitratos a nitritos. Son
citocromo-oxidasa negativos y forman colonias típicas sobre medios de cultivo sólidos y
poseen características bioquímicas y serológicas definidas. (Pascual y Calderón, 2000)
Salmonella pertenece a un grupo de bacterias que están presentes en el intestino de
personas y animales sanos, de forma que las heces son el principal foco de
contaminación a los alimentos y al agua. Cuando llega a los alimentos frescos, tiene la
habilidad de multiplicarse muy rápidamente, y cuando una persona ingiere dicho
alimento contaminando, el gran número de bacterias provoca “salmonelosis”, infección
gastrointestinal provocada por dicha bacteria.
Las bacterias Salmonella spp. viven en el tracto intestinal de aves de corral, ganado
vacuno y porcino, y animales domésticos (tortugas, perros, gatos, roedores) sin
provocar problemas a su salud. En el medio ambiente (heces), esta bacteria sobrevive
durante mucho tiempo debido a su gran resistencia a la baja actividad de agua. (Elika,
2013)
Cuando las bacterias Salmonella pasan de los animales hospedadores a los
alimentos derivados (carne, huevos, leche) es capaz de multiplicarse a una velocidad
muy elevada, ya que puede duplicar su número cada 15 o 20 minutos si la temperatura
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es elevada (superior a 20°C), y más significativamente, si la temperatura ambiente
supera los 30ºC, ya que su temperatura óptima de crecimiento es de 30-37ºC. Si los
alimentos no se refrigeran rápidamente (el límite de crecimiento está en 6º C) el
microorganismo se multiplica, con el consiguiente riesgo de contaminar los alimentos.
Por tanto, temperatura y tiempo son dos factores claves en el desarrollo de la
Salmonella. (Elika, 2013)
La Salmonella puede llegar a los alimentos por varias vías:
Por las explotaciones avícolas y ganaderas con una inadecuada manipulación de los
alimentos derivados de los animales. La presencia de Salmonella spp. en los alimentos
de origen animal es debida, mayoritariamente, a la contaminación fecal durante los
procesos de obtención, aparte de la contaminación endógena de los huevos.
En proceso por falta de higiene e inadecuada manipulación de los alimentos:
Contaminación cruzada en los mataderos, en las fases posteriores de transformación
de los alimentos, y en la preparación y cocinado de los alimentos en el hogar.
Los manipuladores de alimentos pueden ser portadoras de Salmonella, de forma
que, al manipular los alimentos, sin tener en cuenta unas buenas prácticas de higiene,
contaminan los alimentos.
El agua de riego puede estar contaminada con Salmonella, transmitiéndose a las
frutas y verduras frescas regadas.
Debido a que la Salmonella es un microorganismo sensible a los tratamientos
térmicos, se asocia con el consumo de alimentos crudos o poco cocinados. El huevo
contaminado, crudo o poco cocinado, y los ovoproductos y preparados a base de
huevo son la principal fuente de infección de Salmonella, especialmente aquellos que
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contienen huevo crudo como la mayonesa, salsas, helados, cremas, masas de
pastelería. También, la carne de ave, de cerdo y de vacuno insuficientemente cocinada
y carnes fermentadas, leche no pasteurizada y productos derivados pueden estar
contaminadas con Salmonella. Las frutas y verduras regadas con agua contaminada,
también pueden ser transmisoras de la bacteria. Asimismo, el pescado y los moluscos
pueden estar infectados si el agua en el que se encuentran está contaminada con
Salmonella. (Ministerio de la Protección Social, Unidad de Evaluación de Riesgos para
la Inocuidad de los Alimentos UERIA, y Instituto Nacional de Salud INS, 2011)
Los recién nacidos, los bebés, los ancianos y las personas inmunocomprometidas
son los más susceptibles a las infecciones por Salmonella que los adultos sanos. El
sistema inmunitario desarrollado de manera incompleta en recién nacidos y lactantes,
las respuestas inmunológicas frecuentemente débiles y / o retardadas en las personas
mayores y debilitadas, y la producción baja de ácido gástrico en lactantes y ancianos,
facilitan la colonización intestinal y la diseminación sistémica de Salmonella en estas
poblaciones. (Montville, Matthews y Kniel, 2012)
La ingestión de solo unas pocas células de Salmonella puede ser infecciosa (Tabla
01). Los factores determinantes en la salmonelosis no se limitan a la heterogeneidad
inmunológica dentro de las poblaciones humanas y la virulencia de las cepas
infectantes, sino que también pueden incluir la composición química de los alimentos
contaminados. (Montville, Matthews y Kniel, 2012)
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Tabla 01.
Dosis infecciones de Salmonella en humanos.
Comida o ingrediente Serotipo Dosis infecciosa
(UFC) b
Ponche de huevo Meleagridis 106–107
Anatum 105–107
Queso de cabra Zanzibar 105–1011
Tinte carmín Cubana 104
Imitación de helado Typhimurium 104
Chocolate Eastbourne 102
Hamburguesa Newport 101–102
Queso Cheddar Heidelberg 102
Chocolate Napoli 101–102
Queso Cheddar Typhimurium 100–101
Chocolate Typhimurium ≤101
Papas fritas con paprica Saint-Paul, Javiana, ≤4.5 x 101
Rubislaw
Alfalfa Newport ≤4.6 x 10 2
Helado Enteritidis ≤2.8 x 101
Fuente: Montville, Matthews y Kniel, 2012
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2. Objetivos
Identificar la secuencia para el aislamiento de Salmonella.
Reconocer las pruebas bioquímicas para diferenciar a Salmonella de otras bacterias
lactosa negativas.
3. Materiales
Muestra
 Cascara de huevo
Materiales de laboratorio
 Tubos de ensayo 16 x 160 mm
 Matraz Erlenmeyer de 200 mL
 Pipetas 10 ml, 1ml.
 Placas Petri 90 mm
 Probeta 100 ml
 Asa de cultivo
 Portaobjetos
 Gradillas
Instrumentos Y Equipo
 Una balanza
 Autoclave
 Incubadora
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 Cocina eléctrica
Reactivos
 Agua destilada
 Agua peptonada
Medios De Cultivos
Agua de peptona tamponada (Buffer Peptone Water: BPW)
Composición
Cloruro sódico 5g
Fosfato disódico 9g
Fosfato potásico 1,5 g
Agua destilada 1,000ml
Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 7 + 0,1. Distribuir en matraces
Erlenmeyer de 500 ml a razón de 225 ml. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 20
minutos.
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Caldo de enriquecimiento selectivo líquido, tetrationato-bilis-verde brillante
(Muller-Kauffmann)
1. Caldo base:
Polipeptona 5g
Carbonato cálcico 10 g
Sales biliares 1g
Tiosulfato sódico 5 H2O 30 g
Agua destilada 1.000 ml
Disolver por calentamiento hasta ebullición. Ajustar el pH a 8,4 ± 0,2. Mantener a
5-8°C.
2. Solución de yodo-yoduro potásico:
Yodo 20 g
Yoduro potásico 25 g
Agua destilada 1 00 ml
Disolver el yoduro potásico en un pequeño volumen de agua y añadir el yodo Agitar
hasta su disolución. Añadir el resto del agua. Conservar la solución en frasco topacio y
lugar oscuro.
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3. Solución verde brillante
Verde brillante 0,1 g
Agua destilada 100 ml
Disolver perfectamente. Dejar un día en oscuridad para su autoesterilización.
4. Medio completo
Caldo base 1.000 ml
Solución de yodo yoduro potásico 20 ml
Solución de verde brillante 10 ml
Mezclar bien con agitación para re-suspender el precipitado que se forma. Distribuir,
de forma aséptica, en matraces Erlenmeyer estériles, a razón de 100 ml. Este medio se
conserva, como máximo, durante 1 semana a 4 °C.
Caldo Rappaport-Vassiliadis-peptona de soja (RVS)
Composición
Triptona 5g
Cloruro sódico 8g
Cloruro magnésico 400 g
Oxalato verde malaquita 0,40 g
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Agua destilada 100 ml
Una vez mezcladas las tres soluciones, ajustar el pH a 5,2 ± 0,2. Distribuir el medio,
a razón de 10 ml en tubos con tapón de rosca. Esterilizar en autoclave a 115 °C
durante 15 minutos. Se conserva en refrigeración durante un mes.
Caldo selenito cistina
Composición
Triptona 5g
Lactosa 4g
Fosfato disódico 5,50 g
Selenito acido de sodio 4g
L-Cistina 0,01 g
Disolver por calentamiento y agitación. Ajustar el pH a 7 ± 0,2. No esterilizar en
autoclave. Distribuir, asépticamente, en matraces Erlenmeyer estériles, a razón de 100
ml. Si se precipita el selenito de sodio en forma de un sedimento rojo, el medio no es
utilizable. Se usa exclusivamente el día de su preparación.
Agar verde brillante
Composición
Extracto de levadura 3g
Proteosa peptona o polipeptona 10 g
10
Cloruro sodico 5g
Lactosa 10 g
Sacarosa 10 g
Rojo fenol 40 ml
Verde brillante 2,5 ml
Agar 20 g
Suspender los ingredientes en 960 ml de agua destilada y calentar hasta la
ebullición, agitando frecuentemente, hasta obtener la solución completa.
Enfriar a 50-60°C, ajustar la reacción de tal modo que el pH final sea 6,9 ± 0,1 y
distribuir en recipientes adecuados. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 12
minutos.
Se dispone del medio comercialmente en forma deshidratada prepararlo en la forma
indicar en el envase.
Agar Hektoen (Hektoen Enteric: HE)
Composición
Peptona 12 g
Cloruro sódico 5g
Sales biliares 9g
Sacarosa 12 g
Lactosa 12 g
Salicina 2g
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Citrato férrico amónico 1,50 g
Tiosulfato sódico 5g
Fuchina acida 0,10 g
Azul de bromotimol 0,064 g
Agar 14 g
Disolver por calentamiento y agitación hasta ebullición, dejando hervir durante 1
minuto, como máximo. Ajustar el pH a 7,6 ± 0,2. Preparar placas de Petri. El medio se
debe utilizar el mismo día de su preparación
Agar sulfito de bismuto
Composición
Extracto de carne 5g
Peptona 10 g
Glucosa 5g
Fosfato disódico 4g
Sulfato ferroso 0,3 g
Indicador sulfito de bismuto 8g
Verde brillante 5 ml
Agar 20 g
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Suspender los componentes en 1L de agua destilada mezclar bien y calentar hasta
la ebullición con agitación frecuente para disolver las sustancias solubles. Se forma un
precipitado que no llega a disolverse. Enfriar hasta unos 45-50°C y distribuir en placas
de Petri en cantidades de 15-20 ml. No esterilizar. La selectividad del medio disminuye
48 horas después de su preparación.
Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (W.I. Taylor, 1965)
Composición
Xilosa 3,75 g
Clorhidrato de L-lisina 5g
Lactosa 7,5 g
Sacarosa 7,5 g
Cloruro sódico 5g
Rojo fenol 40 ml
Agar 15 g
Añadir los componentes a 960 ml de agua destilada, calentar hasta la ebullición para
conseguir la solución completa, enfriar a 50-55°C, ajustar la reacción de tal forma que
el pH después de la esterilización sea de 6,9 y esterilizar en autoclave a 121°C durante
15 minutos.
Enfriar a 50-55°C y añadir de modo aséptico las siguientes soluciones en las
cantidades indicadas:
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20 ml de una solución de tiosulfato-citrato (preparada disolviendo 34 gramos de
tiosulfato sódico y 4 gramos de citrato ferrico amonico en 100 ml de agua y esterilizado
por filtración)
25 ml de una solución acuosa al 10% de desoxicolato sodico (esterilizado, por
filtración o en autoclave a 121°C 15 minutos)
Agar manitol Usina cristal violeta verde brillante (Manitol Lysine Crystal Violet
Brilliant Green: MLCB)
Composición
Peptona 10 g
Lab Lemco 2g
Cloruro sódico 4g
Manitol 3g
L-Clorhidrato lisina 5g
Tiosulfato sódico 4g
Citrato férrico amónico 1g
Cristal violeta 0,01 g
Verde brillante 0,0125g
Agar 15 g
Agua destilada 1.000ml
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Disolver por calentamiento y agitación hasta la ebullición. Ajustar el pH a 6.8 ± 0,2.
No esterilizar en autoclave. Atemperar a 50 °C y preparar placas de Petri con porciones
de 20 ml.
4. Procedimiento
Preenriquecimiento en medio liquido no selectivo
Pesar, asépticamente y en envase estéril, 25 g del producto por analizar.
Añadir 225 ml de agua de peptona tamponada para obtener una solución al 1:10.
Mezclar bien e incubar a 37 °C durante 16-20 horas.
Enriquecimiento en medios líquidos selectivos
Agitar el cultivo de preenriquecimiento y sembrar, con una pipeta estéril, en los
siguientes medios líquidos selectivos:
10 ml de cultivo sobre 100 ml de caldo tetrationato-bilis-verde brillante (Muller
Kauffmann) e incubar a 42-43 °C durante 18-24 horas.
0,1 ml de cultivo sobre 10 ml de caldo Rappaport-Vassiliadis peptona de soja (RVS),
e incubar a 42° ± 1 °C durante 18-24 horas.
10 ml de cultivo sobre 100 ml de caldo selenito-cistina, e incubar a 37 °C durante 18-
24 horas.
Aislamiento diferencial sobre medios solidos selectivos
A partir de los cultivos obtenidos en los distintos medios líquidos selectivos,
sembrar, por duplicado y sin recargar el asa en la segunda placa, sobre:
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 Agar-verde brillante-rojo fenol (BGA)
 Agar-xilosa-lisina-desoxicolato (XLD)
 Agar Hektoen (HE)
 Agar sulfito bismuto (SB)
 Agar-manitol-lisina-cristal violeta-verde brillante (MLCB)
Incubar en estufa a 37 °C todas las placas sembradas, durante 24-48 horas
Aislar, como mínimo, dos colonias con aspecto típico de Salmonella de cada uno
de los medios de aislamiento selectivo utilizados.
Sembrar cada colonia en agar hierro triple azúcar (TSI), con asa de cultivo, primero
en la superficie inclinada por diseminación y, luego, en el fondo por picadura. Sin
flamear ni recargar el asa, sembrar, por picadura en el fondo y por diseminación en la
superficie inclinada del medio agar lisina hierro (LIA).
Incubar los tubos de TSI a 37 °C durante 24 horas y los de agar LIA a 37 °C
durante 48 horas.
Seleccionar todos los cultivos que muestren crecimiento característico de
Salmonella sobre agar TSI, se correspondan o no con la reacción de dichos cultivos en
agar LIA.
No desechar los cultivos atípicos sobre agar TSI cuando la reacción sobre agar LIA
es típica (fondo alcalino: rojo). Desechar los cultivos que no se correspondan con el
crecimiento típico de las Salmonella sobre agar TSI ni con el de agar LIA.
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Confirmación bioquímica de las colonias sospechosas
Sembrar las colonias sospechosas sobre agar nutritivo, contenido en placas de
Petri. Incubar a 37 °C durante 18-24 horas.
Comprobar la pureza del cultivo, que servir· para efectuar las pruebas
confirmativas bioquímicas y serológicas.
Prueba de la ureasa: Sembrar abundantemente con un asa en tubos que
contengan caldo urea. Incubar los tubos sembrados en baño María a 37 °C durante 2
horas. Los gérmenes que poseen ureasa crecen en el medio y hacen virar el indicador
a rojo.
Fundamento
Salmonella no crecen en este medio, por carecer de ureasa y no utilizar la urea
como única fuente de carbono. Si la cepa en estudio da prueba de ureasa positiva, se
desecha por no ser Salmonella, cuando la prueba es negativa, se prosigue el estudio
de la cepa problema para confirmarla como Salmonella con otras pruebas.
Caldo lisina-decarboxilasa: Si la reacción en agar LIA ha sido claramente positiva,
es suficiente para considerar que la cepa en estudio es positiva a la lisina
decarboxilasa. Cuando la reacción en agar LIA es dudosa, sembrar, a partir de un
cultivo reciente sobre agar nutritivo, en caldo lisina-decarboxilasa. Incubar a 37 °C
durante 48 horas, haciendo una lectura a las 24 horas.
Fundamento
Salmonella da reacción alcalina en este medio, que se manifiesta por la aparición de
un color rojo púrpura; la reacción es negativa cuando el medio muestra color amarillo.
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Caldo rojo fenol dulcitol: Sembrar en el medio caldo rojo fenol dulcitol. Incubar a 37
°C durante 48 horas y hacer una lectura a las 24 horas.
Fundamento
La mayoría de las Salmonella fermentan el dulcitol con formación de ácido (viraje a
amarillo) y gas.
Caldo rojo fenol lactosa: Sembrar en el medio caldo rojo fenol lactosa. Incubar a 37
°C durante 48 horas y hacer una lectura a las 24 horas.
Fundamento
Salmonella no fermenta la lactosa, por lo que no se modifica el medio
Caldo rojo fenol sacarosa: Sembrar en el medio caldo rojo fenol sacarosa. Incubar
a 37 °C durante 48 horas y hacer una lectura a las 24 horas.
Fundamento
Salmonella no fermenta la sacarosa, por lo que no se modifica el medio.
Prueba de Indol: Sembrar tubos que contengan agua de triptona. Incubar a 37 °C
durante 24 horas. En uno de los tubos, añadir 0,5 ml del reactivo de Kovacs, para
investigar si se ha producido o no indol.
Fundamento:
La reacción es positiva si aparece un anillo rojo en la superficie. La mayoría de
Salmonella no producen indol
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Confirmación serológica de las colonias sospechosas
Con la confirmación serológica se puede identificar a nivel de especie. Sobre un
portaobjetos de vidrio bien limpio, señalar tres áreas.
Depositar en una de ellas una gota de la suspensión del cultivo en estudio y
mezclarla con suero polivalente.
En otra de las áreas señaladas, hacer lo mismo, pero utilizando suero polivalente H.
Finalmente, en una tercera, depositar ˙nicamente una gota de la suspensión del cultivo,
que servir· de testigo. Mover cuidadosamente el portaobjetos y observar si se produce
o no aglutinación en el transcurso de un minuto.
Tabla 02.
Reacciones de Salmonella
Fermentación glucosa (TSI) + Fermentación glucosa (TSI)

Lisina-decarboxilasa + Fondo tubo rojo
SH2 + Ennegrecimiento
Ureasa - Color sin cambio
Caldo Usina decarboxilasa + Color rojo
Caldo rojo fenol dulcitol + Color amarillo y gas
Caldo rojo fenol lactosa - Color sin cambio
Caldo rojo fenol sacarosa - Color sin cambio
Caldo KCN - No crece
Rojo metilo (RM) + Color rojo
Voges Proskauer (VP) - Color sin cambio
Citrato V Azul: crecimiento (+)
Sin cambio de color ni crecimiento (-)
Fuente: Pascual y Calderón, 2000
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5. Protocolo
7. Aislar, colonias de cada uno de los medios de aislamiento selectivo

utilizados
8. Sembrar cada colonia en agar TSI, y LIA e incubar a 37°C/ 24 h
9. Seleccionar todos los cultivos que muestren crecimiento característico de

Salmonella
10. Sembrar las colonias sospechosas sobre agar nutritivo, en placas de Petri.
11. Incubar a 37 °C/ 18-24 horas.
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- Caldo lisina-
- Prueba de la ureasa: decarboxilasa:
Sembrar abundante con Sembrar sobre
Protocolo para el aislamiento de Listeria
(ISO 11290-1:2017)
1. Introducción
El género Listeria pertenece al “Grupo de bacilos no esporulados Gram positivos”
junto con otros géneros: Listeria, Lactobacillus, Brochothrix, Renibacterium, Kwthia y
Cariophanon, según el Manual de Bergey. (Pascual y Calderón, 2000)
Dentro del género Listeria se incluyen seis especies: L. monocytogenes, L. innocua,
L. welshimeri, L. seeligeri, L. ivanovii, L. grayi,
L. monocytogenes y L. ivanovii son patógenos. L. monocytogenes es un patógeno
humano. L. ivanovii es principalmente un patógeno animal. (Montville, Matthews y
Kniel, 2012)
L. monocytogenes es un germen de forma bacilar, no esporulado, flagelado y por
tanto móvil, bacteria Gram positiva, anaerobio facultativo, catalasa positiva y que crece
bien a temperatura amplias (4°C- 65°C). Es un bacilo corto y con extremos
redondeados. Mide entre 0,5-2 u de largo por 0,2-0,5 u de grueso; a veces adopta
forma de cocobacilo. Se presenta aislado, en parejas, cadenas cortas o agrupado en V.
Se puede desarrollar entre valores de pH comprendidos entre 5,0 - 9,0. (Pascual y
Calderon, 2000)
Los alimentos donde se ha aislado L. monocytogenes son numerosos, entre ellos:
Leche y productos lácteos. En la leche cruda de vaca se encuentran en mayor o
menor cantidad todas las bacterias patógenas procedentes de las heces del animal,
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incluidas especies del género Listeria, por lo que este producto y sus derivados pueden
ser causa de listeriosis humana.
Carne y productos cárnicos. En estos productos, el 30% de las muestras analizadas
son positivas a L. monocytogenes.
Canales de aves. La contaminación de las canales de aves por L. monocytogenes es
elevada, siendo el 50% de las muestras positivo.
Alimentos vegetales. En los vegetales la contaminación es menor, limitándose a 5-8
gérmenes por gramo.
Pescados. Los pescados capturados en alta mar están exentos de este
microorganismo. La contaminación por L. monocytogenes suele ser de un 10 por 100
de las muestras analizadas de pescados, puestos a la venta.
Mariscos. La contaminación en los mariscos es algo superior a la de los pescados,
entre 12-15% de las muestras analizadas.
2. Objetivos
Aplicar correctamente el protocolo para lograr el aislamiento correcto de Listeria spp
3. Materiales
Muestra
 Leche fresca de vaca
Materiales De Laboratorio
 Placas de Petri, en vidrio o plástico, con diámetros de 90 mm a 100 mm.
 Pipetas graduadas de1 ml y 10 ml, graduada en divisiones de 0,1 ml.
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 Pera de succión o cualquier otro sistema de seguridad capaz de adaptarse a
las pipetas graduadas.
 Mechero Bunsen
 Asa de siembra estéril 3 mm de diámetro
 Pinzas, fino, redondo, de acero inoxidable.
 Tubos de ensayo 18 mm × 180 mm y 9 mm × 180 mm
Materiales Y Equipos
 Balanza
 Stomacher
 Mezclador Vortex
 Nevera 5 ± 3oc
 Incubadora: 37 ± 1 ° C
 Contador de colonias (opcional)
 Bucles de 10 µl o hisopos con punta de algodón
 Microscopio óptico: objetivo x 40
Reactivos
 Solución de peróxido de hidrógeno.
 Suplemento para el medio Fraser semi.
 Suplemento para el medio Fraser completo.
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Medios De Cultivos
Diluyente salino de peptona (diluyente de recuperación máxima)
Composición
Peptona 1,0 g
Cloruro de sodio 8,5 g
Agua 1L
pH 7.0 ± 0.2 a 25 ° C
Medio caldo Fraser y Fraser
Composición
Medio Fraser Fraser
Peptona proteosa 5.0 g 5.0 g
Triptona 5.0 g 5.0 g
Extracto de carne 5.0 g 5.0 g
Extracto de levadura 5.0 g 5.0 g
Cloruro de sodio 20,0 g 20,0 g
di-Fosfato de hidrógeno y sodio 12,0 g 12,0 g
Dihidrógeno fosfato de potasio 1,35 g 1,35 g
Esculina 1.0g 1.0g
Cloruro de litio 3,0 g 3,0 g
Citrato de amonio férrico 0,5 g 0,5 g
Ácido nalidíxico 10 mg 20 mg
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Clorhidrato de acriflavina 12,5 mg 25 mg
Agua 1L 1L
pH 7.2 ± 0.2 a 25 ° C
Agar Listeria según Ottaviani y Agosti (ALOA)
Composición
Digestión enzimática de tejidos animales 18,0 g
Digestión enzimática de caseína 6.0 g
Extracto de levadura 10,0 g
Piruvato de sodio 2,0 g
Glucosa 2,0 g
Glicerofosfato de magnesio 1,0 g
Sulfato de magnesio (anhidro) 0,5 g
Cloruro de sodio 5.0 g
Cloruro de litio 10,0 g
di-Fosfato de hidrógeno y sodio (anhidro) 2,5 g
L-fosfatidilinositol 2,0 g
5-bromo-4-cloro-3-indolil--D-glucopiranosido 0,05 g
Anfotericina B 0,01 g
Sal de sodio del ácido nalidíxico 0,02 g
Ceftazidima 0,02 g
Sulfato de polimixina B 76,700 UI
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Agar 12 - 18.0 g
Agua 1L
pH 7.2 ± 0.2 a 25 ° C
Agar selectivo para Listeria (agar Oxford)
Composición
Base de agar sangre de Columbia 39,0 g
Esculina 1,0 g
Citrato de amonio férrico 0,5 g
Cloruro de litio 15,0 g
Cicloheximida 0.4 g
o anfotericina B 0,01 g
Sulfato de colistina 20.0 mg
Acriflavina 5.0 mg
Cefotetano 2,0 mg
Fosfomicina 10.0 mg
Agua 1l
pH 7.0 ± 0.2 a 25 ° C
Se realizará el ensayo según el siguiente método: Método horizontal para la
investigación de Listeria Monocytogenes basado en la norma ISO 11290-1
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4. Procedimientos
Preenriquecimiento
Pesar asépticamente 25g o 25ml de muestra en una bolsa de polietileno estéril
donde se agrega 225ml de medio Caldo Freiser precalentado a temperatura ambiente y
se homogenizó en un Stomacher.
Colocar el caldo de enriquecimiento primario (medio Freiser) en una incubadora a 30
± 1ºC por 25 h ± 1 h.
Enriquecimiento
Después de incubar transmitir 0,1ml de caldo de enriquecimiento primario incubado
en un tubo con 10 ml de caldo Freiser concentrado (enriquecimiento secundario).
Incubar a 37 ºC ± 1ºC por 24 h ± 2 h
Aislamiento
Sembrar con un asa estéril en doble placa y por estría en agar ALOA y agar Oxford
para lograr colonias individuales.
Incubar a 37 ± 1ºC por 24 h ± 2h.
Nota: En agar Oxford, al cabo de 24 h de incubación, las colonias de Listeria sp son
pequeñas, de color grisáceo, rodeadas de un halo negro. Después de incubar 24 h
más, doblan su tamaño, se vuelven más oscuras, a veces con reflejos verdosos,
apareciendo un halo negro y una depresión central.
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Después de incubar los cultivos de enriquecimiento secundario (caldo Fraser)
sembrar en agar Listeria y placas de agar Oxford para lograr colonias individuales.
Invierta las placas inoculadas de modo que el fondo quede hacia arriba y colocar en
una incubadora a 37 ± 1 ° C durante 48 ± 2 h (si colonias de presunto L.
monocytogenes o Listeria spp son evidentes a las 24 h ± 2h, la incubación puede
detenerse en esta etapa)
Selección de colonias sospechosas
Seleccionar colonias aisladas comparadas con colonias típicas de Listeria sp. y
sembrar por estriado en agar Tripticasa Soya con con 0.6% de extracto de levadura
(TSYEA) para aislamiento de Listeria.
Incubar a 37 ºC ± 1 ° C durante 18 h ± 24h
Confirmación de Listeria sp
Realizar prueba de la catalasa de la colonia aislada en TSYEA
Realizar coloración Gram
Para el examen de movilidad: Sembrar por picadura una colonia en Agar movilidad,
incubar a 25°C ± 1 ° C durante 48 h (+ 3 días si es necesario). Examinar el desarrollo
alrededor de la picadura. Listeria sp son móviles y dan un cultivo típico en forma de
sombrilla
28
Confirmación de Listeria monocytogenes
Investigación de la hemólisis: Sembrar por picadura en Agar Sangre una colonia
aislada en TSYEA. y sembrar cultivos de control positivo (Listeria monocytogenes) y
negativo (Listeria innocua) e incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.
Examinar con luz blanca. Listeria monocytogenes presenta una estrecha zona de
clara y ligera β-hemólisis.
Para la utilización de glúcidos: Sembrar en xilosa y ramnosa una colonia aislada en
TSYEA e incubar a 37°C ± 1°C durante 5 días. La reacción es positiva si aparece una
coloración amarilla.
Para el Test de CAMP: Sembrar en paralelo en Agar Sangre las cepas de
Rhodococcus equi y de Staphylococcus aureus. Después, sembrar en perpendicular
las cepas problema, junto con dos cepas control (Listeria monocytogenes y Listeria
innocua).
Todas las Listeria sp. se presentan como pequeños bacilos Gram positivas, móviles,
catalasa positiva.
Listeria monocytogenes se diferencia de las demás especies por las características
siguientes:
29
Tabla 01
Pruebas bioquímicas de Listeria sp
Producción acido Test de CAMP

Hemolisis
Especie
Ramnosa Xilosa S.aureus R. equi
L.
+ + - + -
monocytogenes
L. innocua - V - - -
L. ivanovii + - + - +
L. seeligeri (+) - + (+) -
L. welshimeri - V + - -
L. grayi - - - - -
Fuente: Allaert y Escola, 2002
Siendo:
*V: Reacción variable
* (+): Reacción débil
* +: Reacción positiva en más de 90%
* - : Ausencia de reacción
30
Método horizontal para la investigación de Listeria Monocytogenes basado en la norma ISO 11290-1
5. Protocolo
PREENRIQUECIMIENTO ENRIQUECIMIENTO
1. Pesar 25g o 25ml de muestra + 2. Incubar a 30 ± 1ºC por 25 h

225ml de medio Caldo Freiser ±1h 3. Agregar 0,1ml de caldo Medio Fraser 4. Incubar a 37 ºC ± 1ºC por
precalentado incubado en un tubo con 10 ml de 24 h ± 2 h
caldo Freiser concentrado
AISLAMIENTO CONFIRMACION
5. Sembrar con un asa estéril en 6. Incubar a 37 ± 1ºC por 7. Seleccionar colonias 9. Realizar: prueba de la catalasa,
doble placa y por estría en agar 8. Incubar a 37 ºC ± 1 ° coloración Gram, examen de
24 h ± 2h C durante 18 h ± 24h
ALOA y agar Oxford. aisladas y sembrar movilidad: Listeria sp.
Realizar prueba de la hemólisis,
por estriado en agar examinar con luz blanca
Producción de ácidos y el Test de CAMP:
Listeria monocytogenes
31
PROTOCOLO DE AISLAMIENTO DE Campylobacter
(ISO 10272-1:2017)
1. Introducción
El aislamiento de especies de Campylobacter método horizontal para la detección de
Campylobacter spp. Es aplicable a productos destinados al consumo humano o para la
alimentación de animales, y a muestras ambientales en el área de producción y
manipulación de alimentos, estos microorganismos son bacilos Gram-negativos
pequeños, ondulados, móviles y cuentan con un flagelo polar. Son microaerófilos y
ligeramente termófilos. (Adams & Moss, 2008)
Es una de las causantes de enfermedades diarreicas, bacterianas, más común en
los Estados Unidos. Campylobacter jejuni, es la cepa asociada con la mayor parte de
las infecciones reportadas en los seres humanos, puede estar presente en el cuerpo
sin causar una enfermedad notable. Los organismos Campylobacter se pueden
encontrar en cualquier lugar y comúnmente se pueden encontrar en el tracto intestinal
de gatos, perros, aves, ganado vacuno, ganado porcino, roedores, monos, aves
silvestres y en algunos humanos. La bacteria pasa a través del cuerpo en las heces y
circula a través ambiente. (USDA, 2011)
2. Objetivos
Aplicar correctamente el protocolo para lograr el aislamiento correcto de
Campylobacter.
32
3. Fundamento De La Prueba
Se le da a Campylobacter un enriquecimiento en medio líquido que le servirán para
las actividades metabólicas y posterior desarrollo de donde obtendrá nutrientes
principalmente de piruvato , hierro y sangre , posteriormente entrará en una
competencia con otros microorganismos ante sales biliares y antibióticos específicos
para favorecer la prevalencia de Campylobacter, el crecimiento es lento y se da a
temperaturas de 35 – 42ºC generalmente y en atmosfera microaerófila ya que
concentraciones altas de oxígeno inhiben su crecimiento. (Biesta-Peters et al., 2019)
4. Materiales
Muestra
 Muestra representativa y cuidada de raspado de ciego de pollo sin congelar y
almacenado a 3ºC ± 2ºC y sometido a análisis lo más rápido posible.
Materiales de laboratorio
 Placas de Petri, en vidrio o plástico, con diámetros de 90 mm a 100 mm.
 Pipetas graduadas de entrega total, con una amplia apertura, y una capacidad
nominal de 1 ml y 10 ml, graduada en divisiones de 0,1 ml, y Pipetas Pasteur.
 Pera de succión o cualquier otro sistema de seguridad capaz de adaptarse a
las pipetas graduadas.
 Mechero Bunsen
 Asa de siembra estéril 3mm de diámetro
 Pinzas, fino, redondo, de acero inoxidable.
 tubos de cultivo de dimensiones 18 mm × 180 mm y 9 mm × 180 mm
33
Instrumentos y equipo
 Horno
 Autoclave
 incubadora, capaz de operar entre 37°C y 55°C.
 Incubadora, capaz de operar a 41,5°C ± 1°C.
 Baños de agua capaces de operar a 25°C y 37°C ± 1ºC
 Microscopio, preferiblemente con contraste de fase (para observar la motilidad
característica de Campylobacter).
 Aparato adecuado para lograr una atmósfera microaerobia con un contenido
de oxígeno del 5% con un contenido de oxígeno del 5% ± 2%, dióxido de
carbono 10% ± 3%, hidrógeno 10%, y el resto nitrógeno. Se utilizan
recipientes herméticos apropiados para contener platos de Petri y/o matraces
o botellas de aproximadamente 350 ml de capacidad utilizados para el caldo
de enriquecimiento. (Frascos anaerobios bacteriológicos).
 pH-metro, precisa hasta 0,1 unidades de pH a 25°C.
Reactivos
 Solución de hipurato de sodio.
 Solución de ninhidrina, 3,5%
 Diclorhidrato de tetrametil-1,4-fenilendiamina
 Discos de acetato de indoxilo
34
Medios de cultivos
Caldo Bolton
1. Medio básico
Composición por litro de agua destilada
Digestión enzimática de tejidos 10,0g
animales
Hidrolizado de lactoalbúmina 5,0 g
Metabisulfito sódico 0,5 g
Carbonato de sodio 0,6 g
α- Ácido cetoglutárico 1,0 g
Haemin (disuelto en hidróxido de 0,01g
sodio al 0,1%)
Preparación
Disuelva los componentes básicos o el medio básico completo deshidratado en el
agua, calentando si es necesario.
Ajuste el pH, si es necesario, de modo que después de la esterilización el pH del
medio completo sea 7,4 ± 0,2 a 25°C. Dispensar el medio básico en matraces de
capacidad adecuada. Esterilizar en la autoclave ajustado a 121ºC durante 15 min.
35
2. Sangre de caballo desfibrinada lisada estéril
Use sangre de caballo lisada con saponina para proporcionar nutrientes y hemo
para catalasa bacteriana.
3. Solución antibiótica
Composición por 5 ml de etanol / agua destilada 50/50
Cefoperazona 0,02 g
Vancomicina 0,02 g
Lactato de trimetoprima 0,02 g
Etanol / agua destilada estéril 50/50 5 ml
Preparación
Disuelva los componentes en la mezcla 50/50 de etanol y agua destilada estéril.
4. Medio completo
Composición
Medio básico 1 000 ml
Sangre de caballo desfibrinada lisada estéril 50 ml
Solución antibiótica 5 ml
Preparación
Al medio básico, a una temperatura de 47°C a 50°C, agregue la sangre
asépticamente la solución antibiótica y mezcle. Dispensar el medio asépticamente en
36
tubos o matraces de capacidad adecuada para obtener las porciones necesarias para
la prueba. Si el medio de enriquecimiento se ha preparado de antemano, no debe
mantenerse durante más de 4 a temperatura ambiente o en la oscuridad a 3 ° C ± 2 ° C
por más de 7 días.
Agar De Desoxicolato De Cefoperazona De Carbón Modificado (agar mCCD)
1. Medio básico
Composición
Extracto de carne 10,0 g
Carbón 4,0 g
Digestión enzimática de caseína 3,0 g
Desoxicolato de sodio 1,0 g
Sulfato de hierro (II) 0,25 g
Agar 18,0 g
Agua 1 000 ml
Preparación
Disolver los componentes básicos o el medio básico completo deshidratado en el
agua, hirviendo. Ajuste el pH, si es necesario, de modo que después de la
esterilización sea 7,4 ± 0,2 a 25°C. Dispensar el medio básico en matraces de
capacidad adecuada. Esterilizar en autoclave ajustado a 121°C durante 15 min.
37
2. Solución antibiótica
Composición por 5 ml de agua destilada
Cefoperazona 0,032 g
Preparación
Disuelva los componentes en el agua. Esterilizar por filtración
3. Medio completo
Composición
Solución antibiótica 5 ml
Preparación
Agregue la solución antibiótica al medio básico, enfríe a 47°C a 50°C, luego mezcle
cuidadosamente. Vierta unos 15 ml del medio completo en placas de Petri estériles.
Permitir solidificar. Inmediatamente antes de su uso, seque cuidadosamente las placas
de agar, preferiblemente sin las tapas y la superficie del agar hacia abajo, en un
gabinete de secado durante 30 minutos o hasta que la superficie del agar esté libre de
humedad visible. Si se han preparado de antemano, las placas de agar sin secar no se
mantendrán durante más de 4 ha temperatura ambiente o en la oscuridad a 3°C ± 2°C
por no más de 7 días.
38
Agar Sangre Columbia
1. Medio básico
Composición en un litro de agua destilada
Almidón 1,0 g
Agar 18,0 g
Preparación
Disuelva los componentes básicos o el medio completo deshidratado en el agua,
calentando. Ajuste el pH, si es necesario, de modo que después de la esterilización sea
7,3 ± 0,2 a 25°C. Dispensar el medio básico en matraces de capacidad adecuada.
Esterilizar en la autoclave ajustado a 121°C durante 15 min.
2. Sangre de oveja desfibrinada estéril
3. Medio completo
Composición
Sangre de oveja desfibrinada estéril 50 ml
Preparación
Agregue la sangre asépticamente al medio básico, enfríe a 47°C a 50°C, luego
mezcle. Vierta unos 15 ml del medio completo en placas de Petri estériles. Permitir
solidificar. Inmediatamente antes de su uso, seque cuidadosamente las placas de agar,
preferiblemente sin las tapas y la superficie del agar hacia abajo, en un gabinete de
39
secado durante 30 minutos o hasta que la superficie del agar esté libre de humedad
visible. Si se han preparado de antemano, las placas de agar sin secar no se
mantendrán durante más de 4 ha temperatura ambiente, o más de 7 días a 3°C ± 2°C.
Caldo Brucella
Composición en un litro de agua destilada
Glucosa 1,0 g
Sodio hidrogenosulfito 0,1 g
Preparación
Disuelva los componentes básicos o el medio completo deshidratado en el agua,
calentando si es necesario. Ajuste el pH, si es necesario, para que después de la
esterilización sea 7,0 ± 0,2 a 25 ° C. Dispensar el medio en cantidades de 10 ml en
tubos de capacidad adecuada. Esterilizar en la autoclave ajustado a 121 ° C durante 15
min.
Agar Sangre Mueller Hinton
1. Medio básico
Composición por litro de agua destilada
40
Almidón soluble 1,5 g
Agar 18 g
Preparación
Disuelva los componentes básicos o el medio básico completo deshidratado en el
agua, hirviendo. Ajuste el pH, si es necesario, de modo que después de la
esterilización sea 7,3 ± 0,2 a 25° C. Dispensar el medio básico en matraces de
capacidad adecuada. Esterilizar en la autoclave ajustado a 121 ° C durante 15 min.
2. Sangre de oveja desfibrinada estéril
3. Medio completo
Sangre de oveja desfibrinada estéril 50 ml
Preparación
Agregue la sangre asépticamente al medio básico, enfríe a 47 ° C a 50 ° C, luego
mezcle. Vierta unos 15 ml del medio completo en placas de Petri estériles. Permitir
solidificar. Inmediatamente antes de su uso, seque cuidadosamente las placas de agar,
preferiblemente sin las tapas y la superficie del agar hacia abajo, en un gabinete de
secado durante 30 minutos o hasta que la superficie del agar esté libre de humedad
visible. Si se han preparado de antemano, las placas de agar sin secar no se
mantendrán durante más de 4 ha temperatura ambiente, o más de 7 días a 3 ° C ± 2 °
C.
41
5.Procedimiento
Enriquecimiento en medio líquido
Preparar la suspensión inicial, introducir una cantidad x de la porción de prueba
(masa o volumen) en nueve veces su volumen del medio de enriquecimiento caldo
Bolton y homogenizar.
Incubar a 37 ° C durante 4 h a 6 h y luego a 41,5°C durante 44 h. ± 4 h en una
atmosfera microaerófila.
Aislamiento y selección
De los cultivos obtenidos luego del enriquecimiento se inoculan dos medios sólidos
selectivos:
Agar de desoxicolato de cefoperazona de carbón modificado (agar mCCD);
Cualquier otro medio selectivo sólido basado en un principio diferente al del agar
mCCD (preferiblemente tomar un segundo medio de aislamiento basado en un principio
diferente del agar mCCD como el agar Skirrow, agar Karmali o agar Preston).
Incubar a 41,5ºC en una atmósfera microaerobia y se inspeccionan después de 44 h.
± 4 h para detectar la presencia de colonias típicas y/o sospechosas de Campylobacter
(colonias grisáceas con brillo metálico, planas y húmedas con tendencia a extenderse).
Confirmación
42
Para confirmar, tome de cada placa de cada medio selectivo al menos una colonia
considerado típico o sospechoso de ser Campylobacter y otras cuatro colonias si la
primera es negativa.
Colocar cada una de las colonias seleccionadas en una placa de agar Sangre
Columbia e incubar en una atmosfera a 41,5°C ± por 24 h a 48 h.
Utilizar los cultivos puros para examinar la morfología, la motilidad, el crecimiento
microbiano a 25°C, el crecimiento aeróbico a 41,5°C y presencia de oxidasa.
Examen de la morfología y la motilidad.
Suspenda una colonia de la placa de agar sangre de Columbia en 1 ml de caldo
Brucella y examinar la morfología y la motilidad utilizando un microscopio.
Conservar para un examen más detallado de todos los cultivos en los que los bacilos
curvos con una espiral. Se observa la motilidad de "sacacorchos"
Estudio de crecimiento a 25 ° C (microaerobio)
Utilizando las colonias aisladas del agar sangre de Columbia, inocular con ayuda de
un asa la superficie de una placa de agar con sangre Columbia
Incubar la placa a 25 ° C en una atmósfera microaerobia (6,14) durante 44 h. ± 4 h.
Observar si hay crecimiento visible de Campylobacter en colonias
Estudio de crecimiento a 41,5 ° C (aeróbico)
Utilizando las colonias aisladas, inocular con ayuda de un asa la superficie de una
placa de agar con sangre Columbia. Incubar la placa a 41,5° C en una atmósfera
aeróbica durante 44 h. ± 4 h.
Observar la placa para ver si hay crecimiento visible de Campylobacter colonias.
43
Detección de oxidasa
Usando un bucle de platino o una varilla de vidrio, tome una porción de una colonia
bien aislada de cada placa individual y colóquela en un papel de filtro humedecido con
el reactivo de oxidasa.
La aparición de un color malva, violeta o azul profundo en 10 segundos indica una
reacción positiva.
Identificación De Especie
Detección de catalasa
Para cada colonia seleccionada, depositar un ciclo de cultivo en una gota de
solución de peróxido de hidrógeno en un portaobjetos de microscopio limpio. La prueba
es positiva si aparecen burbujas en 30 segundos.
Detección de sensibilidad al ácido nalidíxico y a la cefalotina
Para cada colonia seleccionada del agar Columbia usar un bucle para preparar una
suspensión en caldo Brucella de densidad 0,5 en la escala de McFarland. Diluir esta
suspensión 1/10 con el mismo caldo.
Sumergir la superficie de una placa de agar sangre Mueller Hinton al 5% con la
suspensión.
Dejar en contacto durante 5 minutos, luego drenar el exceso de suspensión.
Secar las placas en un armario de secado a 37 ° C durante 10 min.
44
En la superficie del agar, colocar un disco de ácido nalidíxico y un disco de
cefalotina. Incubar las placas, con las tapas hacia arriba, a 37 ° C durante 22 h. ± 2h en
una atmósfera microaerobia.
Interpretar el crecimiento bacteriano de la siguiente manera:
El crecimiento que está en contacto con el disco se clasifica como resistente
La presencia de una zona de cualquier tamaño debido a la inhibición del crecimiento
se clasifica como susceptible.
Detección de hidrólisis de hipurato
Para cada colonia seleccionada del agar Columbia usar un asa con un inóculo
pesado para preparar una suspensión en un tubo de hemólisis que contiene 0,4 ml de
una solución de hipurato de sodio, teniendo cuidado de no incorporar cualquier agar.
Agitar para mezclar bien e incubar durante 2 horas en un baño de agua a 37 ° C o 4
horas en una incubadora a 37°C.
Con cuidado agregue 0,2 ml de una solución de ninhidrina en la parte superior de la
solución de hipurato de sodio. No sacudir.
Interpretar después de una incubación adicional de 10 minutos en el baño de agua a
37 ° C o en una incubadora a 37 °C. Un color violeta oscuro indica una reacción
positiva. Un color violeta pálido o ningún cambio de color indica una reacción negativa.
Detección de hidrólisis de acetato de indoxilo
Colocar una colonia seleccionada del agar Columbia en un disco de acetato de
indoxilo y agregar una gota de agua destilada estéril. Se requiere un bucle de material
de colonia para una reacción clara. Si el acetato de indoxilo se hidroliza, se produce un
45
cambio de color a azul oscuro en 5 min a 10 min. Ningún cambio de color indica que la
hidrólisis no ha tenido lugar.
Cálculos Y Expresión De Resultados
Tabla 1
Características de Campylobacter spp.
Morfología Bacilos curvos pequeños
Motilidad +
Crecimiento microaeróbico a 25ºC -
Crecimiento aeróbico a 41,5ºC -
Oxidasa +
Fuente: (Biesta-Peters et al., 2019)
Tabla 2
Características de especies de Campylobacter
Características C. jejuni C. coli C. lari C.
upsalensis
Catalasa + + + -O leve
Ácido Sensible Sensible Resistente Sensible
nalidixico
Cefalotina Resistente Resistente Resistente Sensible
Hidrolisis de + - - -
hipurato
Acetato de + + - +
46
indoxilo
Fuente: (Biesta-Peters et al., 2019)
47
6.Protocolo
48
Referencias bibliográficas
Adams, M. R., & Moss, M. O. (2008). Food Microbiology. Zaltbommel, Países
Bajos: Van Haren Publishing.
Biesta-Peters, E. G., Jongenburger, I., de Boer, E., & Jacobs-Reitsma, W. F.
(2019). Validation by interlaboratory trials of EN ISO 10272 - Microbiology of the food
chain - Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. -
Part 1: Detection method. International Journal of Food Microbiology, 288, 39-46.
https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2018.05.007
Casado González, C., & Torrico Cabezas, G. (2012). Medios de cultivo en un
laboratorio de Microbiología. Microlab.
Habib, I., Uyttendaele, M., & De Zutter, L. (2011). Evaluation of ISO 10272:2006
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1123. https://doi.org/10.1016/j.fm.2011.03.001
Pascual, M. & Calderon, V. (2000). Microbiologia Alimentaria. Metodologia
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USDA. (2011, julio). Información sobre Inocuidad de Alimentos. Servicio de
Inocuidad e Inspección de los Alimentos Departamento de Agricultura de los
Estados Unidos. https://www.fsis.usda.gov/wps/wcm/connect/b5043546-9cf4-4be0-
8a24-09e1885326a2/Campylobacter_QAs_SP.pdf?MOD=AJPERES
Vandevenne, C.A, Escola, M. (2002) Métodos de Análisis Microbiológicos de

Alimentos Editorial Diaz de Santos S.A. Madrid, España
49
Montville, T., Matthews, K., Kniel, L.( 2012) Food Microbiology An Introduction
Tercera edicion. Editorial American Society for Microbiology Press. Estados Unidos
de America
..
50

INVESTIGACION DE Salmonella. PROTOCOLO DE AISLAMIENTO DE Listeria Sp. Y Campylobacter Sp.

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Microbiología de Alimentos

UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

INVESTIGACION DE Salmonella. PROTOCOLO DE AISLAMIENTO DE Listeria Y

Asignatura: Microbiología de Alimentos

Docente: Dr. César Julio Cáceda Quiroz

Alexandra Alférez Manrique

Alberto Agustín Alexis Maldonado Delmas

INVESTIGACIÓN DE Salmonella EN ALIMENTOS

Salmonella es un género bacteriano, perteneciente a la familia Enterobacteriaceae

Son bacterias Gram negativas, aerobios-anaerobios facultativos, fermentan la glucosa

con producción de gas. No fermentan la lactosa. Reducen nitratos a nitritos. Son

citocromo-oxidasa negativos y forman colonias típicas sobre medios de cultivo sólidos y

poseen características bioquímicas y serológicas definidas. (Pascual y Calderón, 2000)

Salmonella pertenece a un grupo de bacterias que están presentes en el intestino de

habilidad de multiplicarse muy rápidamente, y cuando una persona ingiere dicho

alimento contaminando, el gran número de bacterias provoca “salmonelosis”, infección

gastrointestinal provocada por dicha bacteria.

vacuno y porcino, y animales domésticos (tortugas, perros, gatos, roedores) sin

provocar problemas a su salud. En el medio ambiente (heces), esta bacteria sobrevive

Cuando las bacterias Salmonella pasan de los animales hospedadores a los

alimentos derivados (carne, huevos, leche) es capaz de multiplicarse a una velocidad

muy elevada, ya que puede duplicar su número cada 15 o 20 minutos si la temperatura

es elevada (superior a 20°C), y más significativamente, si la temperatura ambiente

supera los 30ºC, ya que su temperatura óptima de crecimiento es de 30-37ºC. Si los

alimentos no se refrigeran rápidamente (el límite de crecimiento está en 6º C) el

microorganismo se multiplica, con el consiguiente riesgo de contaminar los alimentos.

Por tanto, temperatura y tiempo son dos factores claves en el desarrollo de la

Salmonella. (Elika, 2013)

La Salmonella puede llegar a los alimentos por varias vías:

alimentos derivados de los animales. La presencia de Salmonella spp. en los alimentos

de origen animal es debida, mayoritariamente, a la contaminación fecal durante los

procesos de obtención, aparte de la contaminación endógena de los huevos.

En proceso por falta de higiene e inadecuada manipulación de los alimentos:

Contaminación cruzada en los mataderos, en las fases posteriores de transformación

de los alimentos, y en la preparación y cocinado de los alimentos en el hogar.

Los manipuladores de alimentos pueden ser portadoras de Salmonella, de forma

contaminan los alimentos.

El agua de riego puede estar contaminada con Salmonella, transmitiéndose a las

frutas y verduras frescas regadas.

Debido a que la Salmonella es un microorganismo sensible a los tratamientos

térmicos, se asocia con el consumo de alimentos crudos o poco cocinados. El huevo

contaminado, crudo o poco cocinado, y los ovoproductos y preparados a base de

huevo son la principal fuente de infección de Salmonella, especialmente aquellos que

contienen huevo crudo como la mayonesa, salsas, helados, cremas, masas de

pastelería. También, la carne de ave, de cerdo y de vacuno insuficientemente cocinada

y carnes fermentadas, leche no pasteurizada y productos derivados pueden estar

también pueden ser transmisoras de la bacteria. Asimismo, el pescado y los moluscos

pueden estar infectados si el agua en el que se encuentran está contaminada con

Salmonella. (Ministerio de la Protección Social, Unidad de Evaluación de Riesgos para

la Inocuidad de los Alimentos UERIA, y Instituto Nacional de Salud INS, 2011)

sistema inmunitario desarrollado de manera incompleta en recién nacidos y lactantes,

las respuestas inmunológicas frecuentemente débiles y / o retardadas en las personas

mayores y debilitadas, y la producción baja de ácido gástrico en lactantes y ancianos,

facilitan la colonización intestinal y la diseminación sistémica de Salmonella en estas

poblaciones. (Montville, Matthews y Kniel, 2012)

01). Los factores determinantes en la salmonelosis no se limitan a la heterogeneidad

inmunológica dentro de las poblaciones humanas y la virulencia de las cepas

contaminados. (Montville, Matthews y Kniel, 2012)

Dosis infecciones de Salmonella en humanos.

Comida o ingrediente Serotipo Dosis infecciosa

Ponche de huevo Meleagridis 106–107

Queso de cabra Zanzibar 105–1011