UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE

AGRONOMIA

INFORME DE PRÁCTICAS VACACIONALES

“TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS DE MANEJO DE MATERIAL

DE LABORATORIO Y CRIANZA DEL HOSPEDERO PARA LA
PRODUCCIÓN MASIVA DE AGENTES DE CONTROL
BIOLÓGICO”.

ALUMNO: CUADRA QUISPE, PEDRO HELÍ.

ASESOR: M.Sc. CAROLINA CEDANO SAAVEDRA.

TRUJILLO-PERÚ
2013

pág. 1
 AGRADECIMIENTO

Quiero expresar mi más sincero agradecimiento a todas las personas que

hicieron posible la realización de mis prácticas vacacionales:

Al Ing. CAROLINA GIOVANA ZAVALETA HUERTAS, Gerente de

la empresa BIOMIL SOLUTIONS E. I R. L. y a todo su personal quienes

compartieron sus conocimientos y experiencias en forma desinteresada y me

brindaron su apoyo incondicional.

A todos los docentes de la Escuela Académico Profesional de Agronomía

y, en particular a mi asesor de Prácticas Vacacionales, a la M.Sc. CAROLINA

CEDANO SAAVEDRA, por sus extraordinarios consejos y excelentes aportes en mi

formación académica.

En especial a Dios y a mis padres por su gran apoyo incondicional, porque

me enseñaron muchas cosas que hoy me permiten desenvolverme en la vida. Además

por ser mí impulso, mi alegría, y brindarme la fuerza necesaria para lograr mis metas

trazadas.

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 PRESENTACIÓN

Señores miembros del jurado:

En cumplimiento con las disposiciones vigentes concernientes al reglamento de

prácticas vacacionales de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad

Nacional de Trujillo. Me permito someter a su consideración y evaluación el

presente informe titulado “TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS DE MANEJO

DE MATERIAL DE LABORATORIO Y CRIANZA DEL HOSPEDERO

PARA LA PRODUCCIÓN MASIVA DE AGENTES DE CONTROL

BIOLÓGICO”.

El presente informe muestra información, experiencia y conocimientos adquiridos

durante el proceso de prácticas vacacionales realizadas en el laboratorio de Sanidad

Vegetal de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Nacional de

Trujillo y en el laboratorio de la empresa Biomil Solutions E. I. R. L; en el cual

describo todas las actividades realizadas y experiencias adquiridas durante su

ejecución, realizadas desde el 07 de Enero del 2013 hasta el 26 de Abril del 2013.

Además de ello aprovecho la oportunidad para expresar mi más sincero

agradecimiento a los docentes de la Escuela Académico Profesional de Agronomía

por sus enseñanzas académicas teórico – prácticas que han contribuido

satisfactoriamente a mi formación profesional.

Trujillo, 02 Setiembre del 2013

CUADRA QUISPE, Pedro Helí.

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 INDICE

CONTENIDO Págs.

I. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………..05

II. DATOS GENERALES DEL ALUMNO…………………………………………06

DATOS GENERALES DE LA EMPRESA Y/O INSTITUCIÓN……………….06

III. ACTIVIDADES DESARROLLADAS …………………………………………..08

LIMPIEZA Y ESTERILIZACIÓN DE PLACAS PETRI……………….…………..08

Procedimiento de Limpieza y esterilización de placas Petri………….……………..10

IV. CRIANZA DEL HOSPEDERO ARTIFICIAL Galleria mellonela PARA LA

PRODUCCIÓN MASIVA DE NEMATODOS

ENTOMOPATOGENOS……………………………………….……………....11

CRIANZA DE NEMATODOS ENTOMOPATOGENOS (NEP)…...….....……15

V. APRECIACIONES GENERALES DEL PRACTICANTE…………………….…….21

VI.CONCLUSIONES………………………………………………………………........22

VII.RECOMENDACIONES……………………………………………..……………...23

VIII. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA………………………………………………........24

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I. INTRODUCCIÓN

El Laboratorio de Sanidad Vegetal de la Escuela de Agronomía de la Universidad

Nacional de Trujillo, es un ambiente donde se realizan distintas actividades como

trabajos de investigación de tesistas, práctica pre profesionales, se brinda apoyo a

investigadores que imparten cursos de áreas afines con prácticas de laboratorio, se

atiende a otras instituciones educativas sobre el funcionamiento del mismo,

señalando que su actividad principal es atender las necesidades de enseñanza del plan

de estudios de la Escuela Académico Profesional de Agronomía, para que los

alumnos puedan realizar experimentos prácticos necesarios para comprobar los

conocimientos teóricos que se les imparte y proporcionarles las herramientas para

realizar aplicaciones reales de los conocimientos adquiridos.

En el Laboratorio de Sanidad Vegetal se imparten prácticas relacionadas con la

observación e identificación de microorganismos patógenos como: hongos, bacterias,

nematodos, etc. También se observan, identifican, cultivan y multiplican

microorganismos agentes de control biológico de plagas.

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 II. DATOS GENERALES DEL ALUMNO

Apellidos y nombres:

CUADRA QUISPE, Pedro Helí

N° de matrícula:

012901109

Créditos aprobados:

187

Escuela Académico Profesional:

Agronomía.

Asesor:

M.Sc. CEDANO SAAVEDRA, Carolina Esther.

DATOS GENERALES DE LA INSTITUCIÓN Y/O EMPRESA:

Nombre de la institución:

Laboratorio de Sanidad Vegetal de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la

Universidad Nacional De Trujillo.

Localización geográfica:

Dirección: Av. Juan Pablo II S/N (Facultad de Ciencias Agropecuarias)

Longitud: 79°02’11.43’’

Latitud: 8° 06’ 52.21’’

Distrito: Trujillo.

Provincia: Trujillo.

Departamento: La Libertad.

Laboratorio de la empresa Biomil Solutions E. I. R. L.

Dirección: Av. Gonzales Prada 690 – Urb. Santa María – Trujillo

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 ORGANIGRAMAS.

En el gráfico 1 se presenta el organigrama de la Universidad Nacional de Trujillo

donde se aprecia la ubicación de las Facultades y Laboratorios.

En el gráfico 02 se presenta el organigrama de la empresa Biomil Solutions

E.I.R.L.

Recursos humanos.

Ing. Agrónomo.

Personal colaborador que labora.

Practicantes

Duración de prácticas: 4 meses.

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 III. ACTIVIDADES DESARROLLADAS:

Objetivos:

Objetivos generales:

 Ejecutar técnicas de limpieza y asepsia de material de vidrio del laboratorio.

 Preparar y esterilizar material de vidrio en laboratorio.

 Crianza de Galleria mellonella.

 Multiplicación de agentes de control biológico de plagas agrícolas.

LIMPIEZA Y ESTERILIZACIÓN DE PLACAS PETRI.

1. Introducción.

El lavado o la limpieza de la cristalería no debe descuidarse, porque puede ser la fuente

de problemas, por ejemplo, residuos mínimos de ciertos detergentes resultan

bactericidas; por lo tanto, para trabajos de precisión es necesario comenzar con

utensilios de vidrio bien lavados. Para trabajos difíciles deben hacerse uno o más

enjuagues con agua destilada o todo lavado. En algunos lugares esto debe hacerse

rutinariamente si el agua contiene exceso de carbonatos. Cuando el vidrio es difícil de

limpiar se usa una solución sulfocrómica que es especial para la limpieza cuando

existen residuos fuertemente adheridos. (French y Herbert, 1982).

Para trabajar con microorganismos causantes de enfermedades de cultivos agrícolas es

requisito indispensable mantenerlos en estado de cultivo sin contaminantes, para lo cual

el procedimiento aséptico es esencial. El primer paso para conseguir este propósito es la

esterilización de la cristalería.

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 La esterilización es la eliminación por muerte o separación de todo organismo

viviente de un material. Esto se consigue por medio de calor, filtración u otros

métodos físicos o químicos. Los métodos más comunes incluyen el uso de calor,

en sus formas de calor seco o de calor húmedo.

La asepsia consiste en la aplicación de un conjunto de procedimientos para

eliminar o reducir la contaminación por microorganismos sin el empleo de

antisépticos. Conjuntamente con la aplicación de métodos asépticos se utiliza

esterilización, desinfectantes, medios selectivos y técnicas especiales según el tipo

de microorganismo, con el fin de establecer y mantener cultivos puros de

Fitopatógenos.

La asepsia consiste en la exclusión de los propágulos de microorganismos

contaminantes que provienen del aire, del material vegetal del cual se aíslan los

Fitopatógenos, de los utensilios, manos o ropa de que realizan para las tareas y de

aquellos microorganismos transportados y diseminados por ácaros, insectos, etc.

1. Materiales y herramientas.

 Esponja

 Agua

 Estufa

 Papel A4

 Papel toalla

 Cocina a gas

 Olla de aluminio

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2. PROCEDIMIENTO DE LIMPIEZA Y ESTERILIZACIÓN DE

PLACAS PETRI.

 Después de usar las placas Petri, estas eran colocadas en un recipiente para

posteriormente ser hervidas y lavadas.

 Las placas se colocaron en una olla con agua y con ayuda de una cocina a

gas se les hizo hervir por 60 minutos.

 Luego de hervir, las placas se lavaron con detergente en agua corriente y

se pusieron a secar en papel toalla.

 Una vez secas, las placas fueron envueltas en papel usado de tamaño

A4 para ser esterilizadas. Las placas pequeñas fueron envueltas en grupos

de 3 y las grandes en grupos de 2.

 Las placas Petri fueron esterilizadas en estufa a 180°C por espacio de

90 a 120 minutos.

 Después de esterilizar las placas Petri, fueron almacenadas en

un contenedor herméticamente cerrado (Fig.1) indicando que era material

estéril para evitar la contaminación.

Figura 1: Placas Petri esterilizadas, almacenadas en un contenedor

herméticamente cerrado.

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IV. CRIANZA DEL HOSPEDERO ARTIFICIAL Galleria mellonela PARA LA

PRODUCCIÓN MASIVA DE NEMATODOS ENTOMOPATOGENOS.

4.1 INTRODUCCIÓN

La polilla de la cera, es una especie de insecto lepidóptero del suborden Glossata.

Es de distribución mundial.

La polilla de la cera tiene una gran importancia como plaga ya que causa grandes

pérdidas económicas a los apicultores de todo el mundo por la gran cantidad de

panales que destruye. Es un problema particularmente serio en América Central

porque su clima tropical (la temperatura es más alta y es más o menos constante,

y hay más humedad) favorece el desarrollo de la especie (Brivio, 2002; Realpe,

et al, 2007).

4.2 MATERIALES

 Papel

 Ligas

 Tijeras

 Botiplas.

 Tela de poliseda fina

 Alimento o dieta.

 Etc.

4.3 PROCEDIMIENTO DE CRIANZA DEL HOSPEDERO

4.3.1 POSTURAS

La recuperación de posturas se realiza colocando en un taper 150 cocones y

cuando emergen los adultos (Fig. 2) se le coloca tela de poliseda fina y

sobre este papel para la recuperación de posturas todos los días durante 10 días.

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 Figura 2: Adultos emergidos de los cocones
colocados en el botiplas.

4.3.2 SEMBRADO

Se realiza el sembrado después de 7 a 8 días en 400 gramos de dieta preparada

más polen sin moler (Fig. 3) que va alrededor del taper sobre este colocamos las

posturas aproximadamente 1000 huevos para tapar con una tapa de papel.

Figura 3: Colocación de posturas sobre el alimento.

4.3.3 CAMBIO DE TAPA

Se realiza a la semana del sembrado de posturas, para lo cual se aprovecha para

separar los papeles de las posturas y poder realizar el cambio de tapa de papel por la

tela presionado por una liga.

pág. 12
4.3.4 PRIMER CAMBIO DE DIETA

Se realiza a la semana del cambio de tapa para separar las1000 larvas en 2 partes

quedando en cada taper con dieta nueva 500 larvas (Fig. 4). Luego tapamos. El

propósito del cambio de dieta es para brindarles mayor oxigenación y de esta

forma reducir el estrés.

Figura 4: Se cambia la dieta y se divide la cantidad de larvas inicial en dos

partes iguales.

4.3.5 SEGUNDO CAMBIO DE DIETA

Se efectúa el segundo cambio de dieta a la semana del primer cambio separando las

500 larvas en dos partes colocando en cada taper nuevo con dieta 250 larvas

pasando una semana más ya podemos realizar la cosecha

4.3.6 COSECHA

Realizamos la cosecha a los 30 días en promedio seleccionando (Fig. 5). Las

larvas grandes de las más pequeñas como también de algunos cocones.

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 Figura 5: cosecha de las larvas a los 30 días después de la siembra.

4.4 DIETA EMPLEADA

4.4.1 Ingredientes

 Comida de perro: 1500 gr

 Miel: 1kg

Preparación: consiste en mezclar los ingredientes uniformemente hasta formar una

masa pegajosa. (Fig. 6).

Figura 6: Preparación de la dieta.

pág. 14
 4.4.2 PREPARACIÓN DE LA MIEL

4.4.2. 1 INGREDIENTES

 Azúcar: 1kg

 Agua: 500ml

 Limón: ¼

Hervir el agua en una olla junto con el azúcar moviendo constantemente hasta que

espese o coja punto, agregando por último el zumo de limón y dejamos enfriar por

un día para poder recién utilizarlo o llenar en recipientes para almacenar.

5. CRIANZA DE NEMATODOS ENTOMOPATOGENOS (NEP)

5.1 INTRODUCCIÓN.

El creciente interés por una agricultura más limpia y sustentable, además de la

apertura de mercados externos de carne y leche, ha aumentado la presión por

disminuir o eliminar el uso de productos químicos en las praderas y campos

agrícolas. Esto ha llevado a la búsqueda de alternativas ecológicamente

sustentables, dentro de las cuales está el uso de organismos entomopatógenos.

Los organismos entomopatógenos son capaces de matar insectos, liberando

posteriormente millones de juveniles que son dispersos por el agua, viento u

otros insectos. Algunos de estos microorganismos son fácilmente multiplicados

en laboratorio, lo que permite su masificación, comercialización y fácil

distribución en el campo. Dentro de este grupo se encuentran las bacterias, virus,

protozoos, hongos y nemátodos entomopatógenos (Alves, 1998).

Los nemátodos entomopatógenos (NEP) son organismos cilíndricos no

segmentados, que presentan especificidad en la asociación simbionte con

bacterias que pertenecen a la familia Enterobacteriaceae, las cuales son Gramm

negativas y anaeróbicas facultativas. Se han reconocido dos géneros de

bacterias: Xenorhabdus y Photorhabdus asociado a las familias de nemátodos

pág. 15
entomopatógenos Steinernematidae y Heterorhabditidae, respectivamente.

(García, 1994)

Los nemátodos entomopatógenos presentan diferentes medios de adaptación a

las condiciones de suelo y clima, entre las que se destacan su habilidad de

moverse en el perfil del suelo en busca de un hospedero o condiciones óptimas

de sobrevivencia, de acuerdo a temperatura y humedad (Rodríguez, 2007).

Además, los NEP presentan estrategias de forrajeo, el cual se puede explicar en

base a dos tipos de respuesta; la primera se basa a los estímulos de los

hospederos, aquellos NEP presentan un forrajeo de perseguidor y el segundo en

base a los estímulos del ambiente, estos NEP presentan un forrajeo de

emboscadores. Además, pueden presentar una estrategia de forrajeo intermedia,

esto le permite parasitar a diferentes tipos de hospederos tanto móviles como

menos móviles en el perfil del suelo (Lewis 2002).

Las familias más utilizadas en el control biológico de insectos son

Steinernematidae y Heterorhabditidae, de las cuales se conocen actualmente 62

especies de la familia Steinernematidae y 14 de la familia Heterorhabditidae,

respectivamente (Nguyen, 2009).

El ciclo de vida de los NEP consta de huevo, cuatro estados juveniles (J1 a J4),

separados por mudas, y adulto (Griffin et al., 2005). Los nemátodos infectivos

corresponden al estado juvenil J3, pero que mantienen la cutícula del estado J2,

y que son denominados dauers, son los encargados de localizar a su hospedero

de forma activa debido a diversos estímulos físicos y químicos que emite el

hospedero (Fan et al., 2000).

Los dauers entran al hospedero a través de sus aberturas naturales (boca, ano y

espiráculos), una vez situados en el hemocele los NEP liberan las bacterias

simbiontes, las que son transportadas en una porción ventricular del intestino,
pág. 16
 luego éstas se multiplican y ocasionan la muerte del insecto por septicemia en un

período entre 24 y 48 horas. Esta bacteria destruye los tejidos internos del

insecto, para crear un medio favorable para la alimentación y reproducción de

los nemátodos entomopatógenos (Griffin et al., 2005).

Se ha demostrado la efectividad del género Steinernema y Heterorhabditis, al ser

patógenos obligados de una amplia variedad de insectos que habitan en el suelo

(Kaya, 1993; Fan et al., 2000).

Los nemátodos entomopatógenos presentan la mayoría de los atributos que debe

tener un agente de control biológico efectivo: matan a su huésped rápidamente,

son específicos contra numerosos insectos plaga, inocuos para vertebrados y

plantas, fáciles de propagar y almacenar, capaces de buscar a su huésped por sí

mismos, no contaminan el medio ambiente y se adaptan bien a un control

integrado de plagas (Griffin et al., 2005).

5.2 MATERIALES

 Larvas de Galleria mellonela.

 Nematodos en estado juvenil del genero Heterorhabditis.
 Taper N° 05.
 Agua hervida y fría.
 Formol.
 Alcohol.
 Algodón.
 Esponjas.
 Probetas.
 Pipetas.
 Legía.
 Placas Petri.
 Parrillas de vidrio.
 Microscopio.
 Balanza electrónica.
 Selladora.
 Pizeta.
 Material de limpieza de laboratorio.

pág. 17
5.3 PRODUCCIÓN DE LOS NEMÁTODOS ENTOMOPATOGENOS EN

CONDICIONES DE LABORATORIO MEDIANTE EL SIGUIENTE

PROCEDIMIENTO.

1. Se utiliza los últimos estadio larvales de Galleria mellonela criadas en

laboratorio.

2. Infestación:

 Contar 250 larvas y pesarlas.

 Desinfectar las bandejas N° 05 con alcohol.

 Colocar papel toalla o papel absorbente en la base del taper.

 Contar los juveniles infectivos de nemátodos entomopatógenos. Esto se

realiza sacando alícuotas con la micro pipeta y visualizarlo al microscopio.

Por regla de tres simple se calculan los 5 000 juveniles infectivos de

nematodos entomopatógenos necesarios para infestar 250 larvas (20

juveniles infectivos por larva).

 Se prepara un suspensión de 5000 juveniles en estado infectivo en 5 ml de

agua hervida fría.

 Asperjar los juveniles infectivos sobre el papel y las larvas.

 Tapar los taperes con sus respectivas tapas de plástico, realizar la

codificación correspondiente y dejar por 2 días tiempo que las larvas

mueren por septicemia las cuales se tornan de un color rojizo por efecto

que tienen los nematodos entomopatógenos que viven en simbiosis con

una bacteria que da la coloración.

3. Pasados los 2 días se procede a orear cambiando la tapa de plástico por una

tapa de papel y dejar por 3 días.

pág. 18
4. Al cabo de los 5 días después de la infestación de proceder a la cosecha de las

larvas infestadas, las cuales se desinfectan con lejía al 1% y se enjuaga con

solución de agua hervida fría con formol al 0.2% por cada litro de agua.

5. Se acondicionan las larvas desinfectadas en la cámara White modificada

(parrillas de vidrió forrado con papel aluminio) estas se acondicionan en un

taper N°05 en el cual se agrega una lámina de agua hervida fría con formol al

0.2% y se tapa herméticamente por 5 a 6 días más.

6. Después de los 10 a 11 días de la infestación se procede a la cosecha (Fig. 7) de

los nematodos entomopatógenos en estado juvenil, para lo cual se procede de la

siguiente manera:

 Con una pizeta se agrega agua hervida fría con formol al 0.2%, sobre todas

las larvas, luego la suspensión de nematodos entomopatógenos del fondo

del taper se pasa por el tamiz de 38 micras (Fig. 8) y se recolecta en un

vaso de plástico (Fig. 9).

 Contar los juveniles infectivos se realiza sacando alícuotas con el micro

pipeta y visualizarlo al microscopio (Fig. 10).

Figura 7: Larvas infestadas para cosecha. Figura 8: Los nematodos entomopatógenos son
pág. 19 pasados por el tamiz de 38 micras.
 7. Luego de contados mediante alícuotas en el microscopio se conserva en

esponjas (Fig. 11) para su posterior aplicación en campo.

Figura 9: Recolección en vasos de plástico. Figura 10: Observación y contado de los nematodos
entomopatógenos en el microscopio

Figura 11: conservación en esponjas de los nematodos entomopatógenos

pág. 20
V. APRECIACIONES PERSONALES

 Las prácticas vacacionales realizadas en la Laboratorio de Sanidad Vegetal de

la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Nacional De Trujillo

y el laboratorio de la empresa Biomil Solutions E. I. R. L. fueron muy

beneficiosas para mí, puesto que me dio la oportunidad de aprender el trabajo

de laboratorio, y además el criterio que se debe tener en cuenta para la toma

de decisiones y las consecuencias que estas implican en el manejo y

producción de agentes de control biológico.

 En el transcurso de mis prácticas pude aprender y comprender que el trabajo

se debe realizar con orden, disciplina y sobre todo con mucha comunicación

dentro de la organización, puesto estos son elementos necesarios para lograr

el éxito dentro de la empresa y poder abrirnos el camino como profesionales.

 En cuanto al aspecto organizacional, he aprendido a trabajar en equipo, a

desenvolverme con responsabilidad y tenacidad encada labor asignadas en los

diferentes laboratorios.

pág. 21
VI. CONCLUSIONES

 Un buen manejo de la limpieza y temperatura garantiza una buena

producción de los agentes de control biológico.

 La manipulación de los agentes de control biológico es la etapa más

importante y crucial, pues de ello depende toda la producción masiva.

 Se logró aprender las diferentes técnicas y procedimientos de limpieza del

material de vidrio del laboratorio, a su vez todos los procesos de producción

masiva de agentes de control biológico como son los nematodos

entomopatógenos producidos en condiciones de laboratorio.

 He adquirido nuevos conocimientos y reforzado los adquiridos en ciclos

anteriores en los diferentes cursos, contrastando la teoría con la práctica. Esto

me ayudó bastante en mi formación como futuro profesional.

pág. 22
VII. RECOMENDACIONES

 La organización, la disciplina y el orden son factores importantes y decisivos

para un buen trabajo dentro de una empresa.

 La comunicación es una herramienta fundamental, es por ello que debe ser

constante y eficiente dentro de un grupo de trabajo.

 Durante la permanencia en la empresa el practicante debe intervenir en todas las

etapas de producción de los agentes de control biológico, pues de esta manera se

adquiere mayor experiencia tanto profesional como personal.

pág. 23
VIII. BIBLIOGRAFÍA

 Alves, S. 1998. Patologia e controle microbiano: vantagens e desventagens. pp:

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broca del café. Cenicafé.

pág. 24
 Reyes, M. 2003. Patogenicidad de nemátodos entomopatógenos (Nematoda:

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pág. 25