UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEÓN

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA E INMUNOLOGÍA
DEPARTAM

Métodos Básicos en Microbiología

Manual de Laboratorio

DR. ARTURO ESPINOZA MATA

MC FRANCISCO J. SÁNCHEZ VELÁZQUEZ

2014
 ENCUADRE DE LABORATORIO DE MÉTODOS BÁSICOS EN
MICROBIOLOGÍA

ASISTENCIA: Se requiere un mínimo de 100 % de asistencias. Sólo se

justifican faltas por ENFERMEDAD y se tiene hasta tres días después de la
falta para presentarlo. NO HABRÁ REPOSICIÓN DE PRÁCTICAS.

PUNTUALIDAD: El alumno tiene un límite de 5 minutos, dentro de los

cuales se considera retardo. NO se permite la entrada después de 10
minutos. Dos retardos equivalen a Una falta (2 Retardos = 1Falta).

VESTIMENTA: Ropa limpia y BATA LIMPIA y en buenas condiciones. NO

se permiten PIERCING, GORROS, CACHUCHAS, LENTES OSCUROS
dentro del laboratorio. Hombres con cabello corto, afeitados, uñas cortas.
Mujeres con el cabello recogido y sin maquillaje. Ambos con zapato cerrado,
no chanclas, huaraches o cualquier tipo de zapato abierto.

TELÉFONOS o CUALQUIER OTRO TIPO DE DISPOSITIVO

ELECTRÓNICO: Deberán permanecer APAGADOS Y GUARDADOS; por
cuestiones de Bioseguridad, no está permitido tenerlas en el área de trabajo.
Si se le sorprende utilizando este tipo de equipo en clase será retirado de la
sesión y se le tomará como inasistencia.

COMPORTAMIENTO: Respetuoso con el facilitador y sus compañeros. NO

se permite la entrada de personas ajenas al grupo. NO introducir BEBIDAS ni
ALIMENTOS, NO está permitido FUMAR dentro de ninguna de las
instalaciones de la Universidad. Dentro del laboratorio se deberá guardar un
comportamiento y lenguaje adecuados por parte de alumnos y facilitador. Si
no se tiene un comportamiento adecuado, se le amonestará retirándosele del
laboratorio y contándole como una falta. Las faltas al Reglamento, se
reportará a la Jefatura de de Carrera y al Tutor correspondiente.

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA: Limpiar y desinfectar su mesa antes y

después del inicio de la práctica. Procure trabajar con orden y limpieza,
guardando disciplina, con un manejo adecuado de muestras y de Residuos
Peligrosos Biológico Infecciosos (RPBI)

SESIONES DE LABORATORIO: Una vez iniciada la sesión no se permite

salir y entrar la sesión es continua sin interrupciones por ello, se debe llegar
con todo el material necesario para trabajar, así como jabón y desinfectante
personal o por equipos.
 COMPETENCIAS
a. De la Formación General Universitaria a las que contribuye esta unidad de
aprendizaje

8. Utilizar los métodos y técnicas de investigación tradicionales y de vanguardia

para el desarrollo de su trabajo académico, el ejercicio de su profesión y la
generación de conocimientos.

10. Intervenir frente a los retos de la sociedad contemporánea en lo local y global

con actitud crítica y compromiso humano, académico y profesional para
contribuir a consolidar el bienestar general y el desarrollo sustentable.

14. Participar en la resolución de conflictos ambientales conforme a técnicas

específicas en el ámbito académico y de su profesión para la adecuada toma de
decisiones.
b. Específicas del perfil de egreso a las que contribuye la unidad de
aprendizaje

1. Gestionar la conservación de los alimentos con una visión integral de su

composición y de las modificaciones que estas presentan por efecto de las
condiciones de manejo y almacenamiento para garantizar su calidad e
inocuidad.

2. Optimizar procesos involucrados en la transformación de alimentos,

evaluando el efecto de las condiciones de proceso sobre las características
físicas, químicas y biológicas de las materias primas y productos para
contribuir a la mejora de la productividad con respecto al medio ambiente.

3. Diseñar alimentos y suplementos nutritivos e inocuos aplicando el método

científico y formulación en el marco del conocimiento integral de las materias
primas, alimentos, sistemas de calidad y proceso, para la satisfacción de las
necesidades nutricias y sanitarias de la población.

4. Utilizar técnicas fisicoquímicas, microbiológicas y biológicas de análisis de

alimentos tomando en cuenta la normativa respectiva y/o las características
de producto líder, en la evaluación de calidad de materias primas y líneas de
producción para obtener productos alimenticios competitivos y de calidad.

5. Implementar sistemas de calidad requeridos en la industria alimentaria

aplicando el conocimiento del alimento, condiciones de proceso, técnicas
analíticas y normativas nacionales e internacionales para la toma de
decisiones tendiente a una mejora continua y/o sostenida.
 REPRESENTACIÓN GRÁFICA

Conocer las buenas prácticas de un

laboratorio de microbiología

Distinguir los medios de cultivo y

PRODUCTO INTEGRADOR
Informe técnico del aislamiento y diferenciación técnicas para estudio de la diversidad
morfológica de un microorganismo a partir de un cultivo microbiológica
mixto

Separar microorganismos en base a

su morfología
 PRÁCTICA No. 1

PREPARACIÓN Y USO DE DESINFECTANTES EN EL

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA.

Elementos de competencia:

Realizar soluciones desinfectantes para su uso adecuado en la limpieza y

desinfección de superficies de laboratorio.

Comprender el fundamento de la desinfección para entender el mecanismo

fisiológico que sucede en los microorganismos cuando se somete a dicho proceso.

Fundamento:

Cuando se limpia una superficie el objetivo es remover la suciedad visible.

Un proceso de limpieza adecuado permitirá seguir con la etapa complementaria
que es la desinfección, esta etapa permite eliminar los microorganismos presentes
en las superficies a través de la aplicación de sustancias químicas o calor.
La acción microbicida de los desinfectantes en los microorganismos puede ser
debida a diversos fenómenos, según las diferentes sustancias: modificación de la
permeabilidad de la membrana celular o bien ruptura de ésta; acción sobre ciertas
enzimas o determinadas proteínas; oxidación, reducción o hidrolisis de los
componentes celulares; competencia de sustratos esenciales del metabolismo. PUIG-
DURÁN FRESCO JORGE. 2002

Esto, se lleva a cabo en dos fases: el contacto directo de la solución desinfectante

con los microorganismos y el acceso a los componentes celulares de las
moléculas del principio activo .WILDBRETT, GERHARD. 2006.

Material y equipo

Mechero de Bunsen
Cajas de Petri
2 Pipetas de 2ml
1 Matraz Erlenmeyer de 125ml con torunda
Reactivos

Agua Destilada
Solución salina al 0.85%
Agar nutritivo
Desinfectantes

ACTIVIDAD

Etapas de la limpieza y desinfección

Limpieza

1.- Recoger y desechar los residuos del producto, polvo o cualquier otra

suciedad presentes en el lugar a limpiar.

Desinfección

1.- Asegurarse de que la superficie este limpia, si no es así limpiar como se

explico anteriormente.
2.- Antes de proceder a desinfectar se debe tener lista la solución desinfectante.

PREPARACION DE DESINFECTANTES

Para la preparación de los agentes desinfectantes a las concentraciones

deseadas se emplea la siguiente formula:

V1C1=V2C2

DONDE:

V1= V2*C2/ C1

V1= Volumen desconocido

C1= Concentración conocida

V2= Volumen deseado

C2= Concentración deseada

Ejemplo:
Hipoclorito comercial al 13% y se desea preparar al 6% un volumen de 50 mililitros
50ml de hipoclorito al 6%
V1C1=V2C2
V1 (13%) = ( 50ml) (6%)
V1= (50ml) (6%)
13%
V1= 24ml
Se requieren 24 ml. del hipoclorito de sodio al 13% el cual debe aforarse a 50ml
con agua destilada.

3.- Aplicar la solución desinfectantes sobre el lugar o superficie que se va a

desinfectar.
4.- La solución desinfectante se deja sobre el lugar que se está desinfectando
por un tiempo mínimo de un minuto, dependiendo de la sustancia utilizada.

CONTROL DE CALIDAD DEL PROCESO DE DESINFECCIÓN

Existen numerosos métodos para realizar evaluaciones de la actividad

microbicida, esta puede efectuarse determinando su poder bacteriostático o
bactericida.
Para el control de superficies las técnicas utilizadas son muy diversas, una de
estas, es la técnica por limpia con escobillón o torunda, el cual es un método muy
antiguo y el más utilizado en todo tipo de industria, para poder determinar si el
desinfectante cumple o no los requisitos básicos con una total garantía de eficacia.

Método de hisopado:

1.- Consiste en frotar una superficie determinada con un hisopo húmedo, el área
desinfectada.
2.- Después descargar este hisopo en 6ml de solución salina al 0.85%.
3.- Homogeneizar
4.- Con una pipeta estéril de 2ml, transferir 1ml y 0.1ml a una caja de Petri.
5.- Añadir de 12 a 15ml de Agar nutritivo.
6.- Homogeneizar en la forma siguiente mezclarlo mediante 6 movimientos de
derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido
contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr
una completa incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje
la cubierta de las cajas.
7.- Dejar solidificar.
8.- Incubar a 37° C/ 24 a 48h.
9.- Contar colonias que se desarrollen en el medio de cultivo.
10.- Comparar los resultados obtenidos en los diferentes equipos y desinfectantes.
11.- Concluir cual desinfectante fue más efectivo en base al número de colonias
obtenido. Aquel desinfectante que obtenga números bajos en las placas, se
tomará como el más efectivo.

Resultados

Conclusiones

Cuestionario:
Literatura consultada:
 PRÁCTICA No. 2

EVALUACIÓN DEL PROCESO DE LAVADO DE MATERIAL DE

VIDRIO.
Elementos de competencia:

Realizar el proceso de lavado adecuado de material de vidrio.

Comprender el fundamento del lavado para entender el mecanismo fisiológico que

sucede en los microorganismos cuando se somete a dicho proceso.

Fundamento

Los métodos de limpieza del material deberán adaptarse al tipo de sustancia que
sea necesario remover. Para llevar a cabo el proceso de lavado, se recomienda el
empleo de detergentes biodegradables, neutros, que no dejen residuos, que
aplicada en determinadas condiciones es capaz de eliminar la suciedad de la
superficie que se desea limpiar.

Los detergentes modifican las propiedades físicas y químicas del agua, de forma
que ésta puede penetrar, desalojar y arrastrar residuos que se habían endurecido
sobre los utensilios. Reducen la tensión superficial y son buenos agentes
espumantes, humedificantes y emulsionantes.

La aplicación de detergentes persigue eliminar las capas de suciedad y los

microorganismos y mantenerlos en suspensión para que a través del enjuague se
elimine la suciedad desprendida y los residuos de detergente.

Material y equipo

1 Fibra de esponja
2 Pipetas de 1- 5ml
2 Cajas de Petri
4 Tubos de 18 x 150mm
1 Matraz Erlenmeyer de 250ml
1 Escobillón para tubos de 18 x 150mm
Reactivos

Agua destilada
Detergente neutro
Azul de bromotimol al 0.04%
Rojo de metilo

Actividades

1.- Lavar el material con detergente líquido preparado según ficha técnica de
proveedor.

2.- Utilizar cepillos con cerdas blandas y fibras de esponja.

3.- Enjuagar muy bien y con suficiente cantidad de agua corriente de calidad
potable.

4.- Enjuagar una vez con agua destilada.

5.- Colocar en horno de secado o dejar escurrir a temperatura ambiente.

CONTROL DE CALIDAD DEL PROCESO DE LAVADO

Evaluar la limpieza del material de vidrio a utilizar en la fase pre-

analítica y analítica del laboratorio es de vital importancia para minimizar los
errores aleatorios que puedan incidir en el resultado de los exámenes.

Es fundamental conocer si los procesos de limpieza efectuados desembocan a

una adecuada limpieza del material procesado.

PRUEBA DEL AZUL DE BROMOTIMOL

1.- Realizar prueba de verificación del proceso al 10% del material lavado

2.- Tomar piezas de vidrio

3.- Adicionar de 2 a 5 gotas de indicador de pH (azul bromotimol) a la superficie.

4.- Observar el cambio de color.

En el caso que la prueba sea positiva enjuagar la cristalería en agua destilada.

Repetir la prueba hasta que el resultado sea negativo.

Cuadro Nº 1. Viraje del azul de Bromotimol, según el pH

Azul Bromotimol al 0,04% pH

Verde Neutro - negativo

Azul Alcalino - positivo

Amarillo Ácido - positivo

PRUEBA DEL ROJO DE METILO

1.- Preparar el indicador rojo de metilo disolviendo 0,1 g de rojo de metilo en 300
ml de alcohol etílico y complete a 500 ml con agua destilada.

2.- Seleccione al azar una muestra y coloque 2 a 5 gotas del indicador, rojo de
metilo, en el material seleccionado.

El indicador no debe cambiar de color original (Rojo).

Haga un testigo positivo con una gota de detergente, añada el

indicador y deberá cambiar de color rojo a amarillo

Resultados y discusiones
Conclusiones

Cuestionario

Literatura consultada
 PRÁCTICA No. 3

ENVOLTURA Y PREPARACIÓN DE MATERIAL DE VIDRIO PARA

USO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA.

Elementos de competencia:

Realizar el proceso de envoltura correcta de material de vidrio de laboratorio.

Comprender el fundamento de envolver el material, para evitar su contaminación

microbiana después de ser sometido al proceso de esterilización y entrar en
contacto con el aire. De tal manera que el material de vidrio y otros se puedan
mantener estériles hasta el momento de su uso.

Fundamento:

El material de vidrio y otros que son utilizados en el laboratorio de microbiología,

tienen gran influencia en la calidad de los resultados, por lo que se debe prestar
un especial cuidado a su preparación antes de ser esterilizados. Una vez que el
material de vidrio está limpio y seco debe ser esterilizado, para lo cual debe ser
empacado usando un material adecuado según el proceso de esterilización que se
maneje, por ejemplo si se va a esterilizar por calor húmedo, la envoltura debe ser
resistente a la humedad, a la presión y que permita la penetración y circulación del
vapor de agua. El material de envoltura además debe ser resistente a pinchazos,
libre de colorantes, libre de sustancias tóxicas y ser económico. Para la
esterilización por calor húmedo se utiliza papel kraft o papel crepado y en su
defecto se puede utilizar papel secante. Mientras que para la esterilización por
calor seco se usa papel kraft o papel aluminio así como pipeteros de aluminio y
otros. Es importante comprender la necesidad de cubrir y envolver correctamente
el material para su esterilización, pues se requiere que el material una vez estéril
así se mantenga hasta su uso, y esto se logra gracias a la protección que le brinda
dicha envoltura o cubierta.
Material / equipo

2 Pipetas de vidrio de 1-5 ml

2 Cajas de Petri de vidrio
4Tubos de 18 x 150mm
1 Matraz Erlenmeyer de 250ml
1 bolsa de algodón
1 metro de gasa
1 tijeras
Papel secante kraft
Etiquetas
Cinta adhesiva indicadora

Actividades

Cada equipo preparará el siguiente material de vidrio:

A) Tubos de ensayo y matraces

1.- Colocar a cada tubo y matraz una torunda de algodón con gasa, siguiendo las
instrucciones dadas por el profesor.
2.- Colocar los tubos preparados en un cesto ( bote) destinado para tal fin.

NOTA: cuando se utiliza algodón para cubrir tubos y matraces se debe tomar la
precaución de que éste pueda ser manipulado con facilidad, para ello no debe
quedar ni muy apretado ni muy flojo y debe alcanzar aproximadamente 3 cm
dentro del material de vidrio.

B) Pipetas
1.- Colocar una pequeña torunda de algodón en el extremo superior de la pipeta
con la ayuda de un alambre.

2.- Envolver completamente con papel kraft, según las indicaciones dadas por el
profesor.

3. Rotular, por la parte superior externa del papel, la capacidad de la pipeta.

C) Cajas de Petri.
1.- Envolver con papel kraft siguiendo las indicaciones del profesor.
NOTA: Las pipetas, así como las placas de Petri, se pueden envolver
individualmente de la manera indicada, o se pueden colocar en grupos, en
recipientes metálicos especialmente diseñados para tal fin, denominados pipeteros
y plaqueros respectivamente.
Una vez preparado todo el material de vidrio: Esterilizar siguiendo las
Instrucciones señaladas en la siguiente práctica.

Resultados y discusiones

Conclusiones
Cuestionario

Literatura consultada
 PRÁCTICA No. 4

ESTERILIZACIÓN DE MATERIAL DE VIDRIO POR CALOR HÚMEDO

EN AUTOCLAVE Y EVALUACIÓN DE LA EFICIENCIA DEL
PROCESO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
Elementos de competencia:

Realizar el proceso de esterilización por calor húmedo a material de vidrio de

laboratorio.

Comprender el fundamento de esterilizar el material de vidrio, para lograr la

destrucción y eliminación total de microorganismos viables presentes en el
mismo.

Realizar verificación del proceso de esterilización por calor húmedo en autoclave y

olla de presión, para asegurar su efectividad en el laboratorio de microbiología.

Fundamento:

La esterilización es un proceso a través del cual, se logra la eliminación completa

de todos los microorganismos viables incluyendo virus presentes en un material.
Materiales de vidrio como pipetas, tubos, placas de Petri y otros, generalmente
son esterilizados mediante calor húmedo usando una autoclave u olla de presión,
donde se someten a 15 libras de presión por 15 min, bajo estas condiciones el
vapor de agua alcanza una temperatura de aproximadamente de 121°C. El vapor
de agua a esta temperatura deberá penetrar y liberar de microorganismo viables
todas las superficies internas y externas de cada uno de los materiales. El calor
húmedo es un agente físico que destruye a los microorganismos por
desnaturalización de sus proteínas. El calor es considerado el método de
esterilización por excelencia, siempre y cuando el material a esterilizar soporte
altas temperaturas sin sufrir ningún tipo de daño.
Todos los procesos de esterilización se deben controlar y evaluar para asegurar
su efectividad. Para lo cual se pueden usar indicadores físicos, químicos y
biológicos, los cuales deben ser colocados en cada carga de esterilización.
Material / equipo:

2 Pipetas de vidrio de 1-5 ml

2 Cajas de Petri de vidrio
4Tubos de 18 x 150mm
1 Matraz Erlenmeyer de 250ml
1 bolsa de algodón
1 metro de gasa
1 tijeras
Papel secante kraft o periódico
Etiquetas
Cinta maskin con indicador

Actividades

El material de vidrio previamente lavado, envuelto y rotulado con cinta adhesiva

con indicador químico, se debe colocar en el interior de un autoclave u olla de
presión, además de un termómetro de máximas y mínimas como indicador físico y
una ampolleta con esporas como indicador biológico para ser esterilizado a 15
libras de presión por 15 min, para lo cual se debe proceder de la siguiente manera:

1º Colocar el volumen correcto de agua en el recipiente.

2º Encender el equipo o la flama para que se caliente el agua.
3ª Depositar el material en el interior del recipiente.
4º Cerrar el recipiente y esperar a que se elimine el aire que quedo atrapado en el
mismo.
5º Colocar tapón o cerrar válvula de escape del vapor en la tapa del autoclave u
olla.
6º Esperar a que la presión marque en el manómetro 15 libras y regular el calor
para que se mantenga por 15 – 20 min. a dicha presión.
7º Apagar el equipo o bien cerrar la flama para que baje la presión del autoclave u
olla.
8º Cuando la presión marque cero en el manómetro del equipo, retirar tapón o
abrir válvula de escape para eliminar el vapor y abrir el recipiente.
9º Sustraer el material con guantes para evitar quemaduras.
10º Revisar la cinta adherida al material, si cambio de color, termómetro y en el
caso de la ampolleta con esporas, incubarlo a 55°C/48h ( evaluar si hay cambio de
color) y colocar los materiales en un lugar seguro y adecuado.

Resultados y discusiones

Conclusiones
Cuestionario

Literatura consultada
 PRÁCTICA No. 5

ELABORACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

Elementos de competencia:

Realizar la preparación correcta de medios de cultivo, hasta su esterilización por

calor húmedo.

Comprender el fundamento de esterilizar los medios de cultivo, para lograr la

destrucción y eliminación total de microorganismos viables presentes en los
mismos.

Realizar la verificación del proceso de esterilización por calor húmedo en

autoclave y olla de presión, para asegurar su efectividad en el laboratorio de
microbiología.

Fundamento:

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de

crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el
desarrollo de los microorganismos, siendo los constituyentes habituales: agar,
extractos, peptonas, fluidos corporales, sistemas amortiguadores, indicadores de
pH, agentes reductores y agentes selectivos.
En relación a su composición química los medios de cultivo pueden ser
de dos tipos: definidos (sintéticos) y complejos (no sintéticos). Los medios de
cultivo también son clasificados en base a su estado físico: líquidos (caldos),
sólidos (agar: 1.5 – 2.0%) y semisólidos (agar: 0.3 – 0.5%).
En general, la preparación de un medio de cultivo se reduce
simplemente a pesar la cantidad deseada del mismo y disolverla en agua
destilada, siguiendo las instrucciones del fabricante. Antes de su esterilización, los
medios líquidos en caldo se distribuyen en los recipientes adecuados (tubos o
matraces); si es un medio sólido, habitualmente se procede a fundir el agar antes
de esterilizar, una vez fundido, se distribuye en caliente en tubos o matraces (no
en placas de Petri ) y se esteriliza.
Material / Equipo:

1. Medios de cultivo deshidratados

2. Mechero
3. Alcohol al 70%
4. Cerillos, algodón, etiquetas
5. Balanza
6. Espátulas
7. Probeta de 100ml
8. Agua destilada a pH 7
9. Tripie y tela de asbesto
10. 2 - 4 placas de Petri
11. 10 tubos de 13 x 100
12. 2 matraces de 250 ml
13. Gasa
14. Cinta testigo
15. Guante para manipular objetos calientes
16. 1 pipeta de 10 ml.
17. 1 gradilla para tubos de 13 x 100
18. 1 bote plástico de 1L

Actividades

1.- Después de determinar el volumen del medio de cultivo requerido, calcule y pese
los gramos necesarios de medio de cultivo en un matraz Erlenmeyer.

2.- Adicione el volumen exacto de agua destilada a pH 7 usando una probeta para
medirla y colóquele una torunda de algodón con gasa al matraz.

3.- Disuelva completamente el medio de cultivo agitándolo, caliente si es necesario

(agares y medios semisólidos, calentar hasta que el medio corra libremente por las
paredes del matraz).
4.- Deposite con pipeta el volumen de medio requerido en cada tubo y coloque su
tapón a cada uno. ( si el tapón no es de algodón déjelo flojo).

5.- Para esterilizar en autoclave u olla de presión los medios en tubos y matraces, siga
las indicaciones:

a.- Revise el nivel del agua en el autoclave u olla, que corresponda al requerido o bien
reponga el volumen necesario de agua para alcanzar el nivel.

b.- Encienda el autoclave u olla de presión.

c.- Coloque los tubos con medio en canastilla metálica o en recipientes adecuados y
deposítelos en el autoclave, junto con el resto de medios y materiales que se requiera
esterilizar.

d.- Cierre el autoclave, cuidando de dejar abierta la salida del vapor, con la finalidad de
eliminar el aire presente en el interior del autoclave, el cual va a ser desplazado por el
vapor generado.

e.- Cierre la válvula de salida de aire, cuando la salida del vapor sea continua.

f.- Vigile el incremento de la presión hasta alcanzar 15 libras, regule el calor para tratar
de mantener a esta presión por 15 min.

g.- Después apague el equipo y deje que la presión baje hasta que el manómetro
marque cero de presión. ( no forzar ha que baje la presión).

h.- Abra la válvula de salida de aire para expulsar el vapor restante.

i.- Abra el autoclave y retire el material y medios de cultivo, los tubos que sea necesario
inclinar así déjelos enfriar, el agar en matraz si es necesario viértalo a las placas antes
de que solidifique. ( en un área desinfectada y frente a la flama del mechero).

j.- Revise la cinta testigo adherida al material, si cambio de color y coloque los
materiales en un lugar seguro y adecuado ( desinfectado y libre de polvo).

k.- Todos los medios de cultivo ya fríos, colóquelos en una incubadora a 37ºC
por 24 h. para realizar la prueba de esterilidad.
l.- Después de la prueba de esterilidad, revise sus medios, no deben registrar
crecimiento o turbidez ni contaminación alguna. También muéstrelos a su maestro
como una evidencia de su práctica.

Resultados y discusiones:

Conclusiones:
Cuestionario:

Literatura consultada:
 PRÁCTICA No. 6

VERTIDO DE AGAR EN PLACA, DISPOSICIÓN DE MEDIOS DE

CULTIVO ESTÉRILES Y PRUEBA DE ESTERILIDAD

Elementos de competencia:

Realizar correctamente el vertido de agar a placas a una temperatura adecuada (45°

C), evitando los riesgos de contaminación, desarrollo microbiano y reducir la
generación de vapor en las tapas de las placas.

Comprender porque es necesario manipular, colocar y almacenar los medios de cultivo

en sitios limpios, desinfectados, secos y sin corrientes de aire.

Realizar prueba de esterilidad a todos los medios de cultivo preparados y esterilizados.

Comprender la importancia de trabajar con medios de cultivo realmente estériles y

libres de microorganismos viables.

Fundamento:

Durante el vertido de agar a placas en el laboratorio de Microbiología, debemos reducir

los riesgos de contaminación al máximo, por eso se recomienda trabajar con los
materiales estériles y secos en un área desinfectada, sin corrientes de aire y cerca de
la flama del mechero, o bien manipularlos en una cabina de siembra.

Además es importante que el medio de cultivo (agar) se enfríe lo suficiente, para

pasarlo a las placas evitando que se genere vapor en la tapa de la placa, que después
se escurre sobre el agar, generando un medio con humedad el cual no es adecuado
para obtener colonias microbianas aisladas. La manipulación incorrecta de materiales y
medios de cultivo ya preparados y estériles , conlleva a la contaminación y obtención
de resultados incorrectos, perdida de material biológico, mayor gasto de materiales, así
como requerir de mayor tiempo para elaborar de nuevo dicho material; por eso es muy
importante que siempre se trabaje aplicando las Buenas prácticas de laboratorio,
donde una muy importante es someter los medios de cultivo a prueba de esterilidad,
para confirmar si realmente están completamente libres de microorganismos viables.
Material / Equipo:

1. Medios de cultivo deshidratados ( agares)

2. Mechero
3. Alcohol al 70%
4. Cerillos, algodón, etiquetas
5. Balanza
6. Espátulas
7. Probeta de 100ml
8. Agua destilada a pH 7
9. 5 placas de Petri
10. 1 matraz de 250 ml con torunda
11. Gasa
12. Cinta testigo
13. Guante para manipular objetos calientes
14. 1 Tijera
15. Olla de presión o autoclave

Actividades

1.- Determinar el volumen del medio de cultivo requerido.

2.- Calcule y pese los gramos necesarios del agar en un matraz Erlenmeyer.

3.- Adicione el volumen exacto de agua destilada a pH 7 usando una probeta para

medirla y colóquele una torunda de algodón con gasa al matraz.

4.- Mezcle el medio de cultivo agitándolo muy bien, pero evitando que el medio alcance

el tapón del matraz.

5.- Pase a esterilizar en autoclave u olla de presión los agares en los matraces,

siguiendo las indicaciones ya sugeridas en la práctica No. 5.

16.- Mezcle muy bien y enfríe los agares hasta que alcancen una temperatura de
45°C. ( que se soporte al tocar las paredes del matraz). Si es necesario enfríelos
al chorro de agua de la llave.

17.- En la superficie de la mesa limpia y desinfectada, frente a la flama del

mechero, retire la cubierta a las placas estériles y tome una a la ves abriéndola
correctamente cerca de la flama del mechero, vierta suficiente agar a que se cubra
bien el fondo de la base de la caja de Petri. ( aproximadamente 15- 18ml).

18.- Cierre la placa y colóquela sobre la mesa limpia y desinfectada, déjela en

reposo sin movimiento hasta que solidifique por completo el agar.

19.- Invierta las placas con los agares y colóquelas en una incubadora a 37°C por
24 horas.

20.- Después de las 24 horas revise los agares en las placas, no debe observarse
desarrollo de colonias microbianas ( contaminantes).

21.- Deposite las placas con los agares que pasaron la prueba de esterilidad, en
un lugar seguro, limpio, desinfectado, libre de polvo y sin humedad, puede ser a
temperatura ambiente o en refrigeración, donde pueden almacenarse por
semanas o meses.

Resultados y discusiones
Conclusiones

Cuestionario

Literatura consultada
 PRÁCTICA No. 7

CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO: PRUEBA DE

ESTERILIDAD Y PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO

Elementos de competencia:

Determinar la calidad a medios de cultivo preparados, mediante prueba de esterilidad,

características fisicoquímicas y prueba de crecimiento microbiano.

Comprender la necesidad del aseguramiento de la calidad de los medios de cultivo que

se manejan en el laboratorio de microbiología.

Realizar prueba de esterilidad a los medios de cultivo antes de ser utilizados para el
cultivo de microorganismos.

Comprender la importancia de trabajar con medios de cultivo realmente estériles y

libres de microorganismos viables.

Verificar características fisicoquímicas y capacidad del medio de cultivo para promover

el crecimiento microbiano.

Fundamento:

Los medios de cultivo son esenciales en el laboratorio de microbiología, por lo

tanto es necesario contar con un control de calidad de los mismos, desde su
fabricación, preparación, conservación hasta su uso, que nos asegure la exactitud,
confiabilidad y reproducibilidad de nuestros resultados. En primera instancia los
medios de cultivo que se manejen en el laboratorio, deben cumplir con los
requisitos mínimos (especificaciones de calidad) que marca la NOM-065-SSA1-
1993. El laboratorio debe registrar las fechas de recepción, apertura del envase y
caducidad de cada uno de los medios. Pero además los medios de cultivo ya
preparados deben ser validados antes de su utilización, mediante la verificación
de pruebas de esterilidad, de recuperación y propagación de microorganismos y
también con pruebas fisicoquímicas que les correspondan.
Material / Equipo:

1. Medios de cultivo en placas y tubos.

2. Cultivos microbianos de Escherichia coli, Staphylococcus aureus en caldo
nutritivo.
3. Mechero
4. Gradilla para tubos de 13 X 100.
5. Asa bacteriológica
6. Alcohol al 70%
7. Cerillos, algodón, etiquetas
8. Incubadora
9. 1 marcador para escribir sobre vidrio ( Sharpie)

Método:

1.- Revise el color y la solidez de los agares en placas y tubos.

2.- Revise el color y pH de los medios líquidos (use solo un tubo para determinar
el pH).

3.- Revise el color y grado de solidez del agar blando (medio semisólido).

4.- Coloque una placa y un tubo de cada uno de los diferentes medios de cultivo
sin inocularlos, en una incubadora a 37°C por 24 horas, para la prueba de
esterilidad.

5.- Inocule una placa de los medios correspondientes, por estría simple, tomando
una gota del cultivo microbiano correspondiente con el asa bacteriológica.(
trazando líneas horizontales sobre el agar, evitando romperlo).

6.- También inocule un tubo de cada caldo, tome una gota del cultivo que
corresponda con el asa bacteriológica y deposítela en el mismo.

7.- Lleve a incubar todos los medios inoculados a 37°C por 24 horas.

8.-Después del período de incubación revise los medios de cultivo, no debe

observarse desarrollo de colonias microbianas o turbidez en los no inoculados,
pero los que si se inocularon deben presentar crecimiento con características que
correspondan al microorganismo inoculado.

9.- Reporte si los medios de cultivo cumplieron con la prueba de esterilidad.

10.- Reporte en una tabla los resultados que se obtuvieron para cada medio de
cultivo que se revisó.

11.- Revise si los resultados corresponden a cada uno de los medios.

11.- Analice y discuta sus resultados

13.- Concluya en base a los objetivos planteados como competencias y los

resultados obtenidos.

Resultados y discusiones:

Conclusiones:
Cuestionario:

Literatura consultada:
 PRÁCTICA No. 8

TÉCNICAS DE INOCULACIÓN Y AISLAMIENTO DE

MICROORGANISMOS EN MEDIOS DE CULTIVO Y UTILIZACIÓN DE
CEPAS DE REFERENCIA

Elementos de competencia:

Manejar correctamente la técnica de la transferencia aséptica en la inoculación de

microorganismos.

Realizar adecuadamente la inoculación y aislamiento de microorganismos en medios

de cultivo.

Inocular correctamente caldos ( medios de cultivo líquidos), en tubos, agar blando por
picadura, estría en tubos inclinado, agar en tubos por picadura y estría.

Inocular y aislar colonias microbianas en agar de placas por estría, extensión y vertido.

Fundamento:

La inoculación de medios para el cultivo de microorganismos es un procedimiento

fundamental que permite la propagación, aislamiento, diferenciación, identificación e
incluso la enumeración. Los microorganismos pueden inocularse en medios líquidos,
semisólidos y sólidos, solo que la técnica de inoculación a manejar va a depender del
estado físico de los medios, así como del objetivo que se requiera. Los medios líquidos
(caldos) son inoculados comúnmente por agitación, mientras que los agares blandos
son inoculados por punción o picadura y los agares completamente sólidos en tubo son
sembrados por estría simple o bien por picadura y estría, por otra parte los agares en
placas pueden ser inoculados por estría simple o cruzada, por extensión o por vertido
en placa. La estría simple consiste en estriar con el asa sin romper el agar, la superficie
del mismo con un movimiento en "S" trazando líneas paralelas, la estría cruzada se
realiza en placas y consiste en hacer una serie de estrías que se cruzan, esto con la
finalidad de diluir la muestra para obtener colonias aisladas.
Material / Equipo:

1. Medios de cultivo en placas y tubos. (agar en placas y tubos, caldo y agar

blando en tubos y tubos con agar inclinado con fondo).
2. Cultivos microbianos de Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Serratia
marcescens en caldo nutritivo.
3. Mechero
4. Gradilla para tubos de 13 X 100.
5. Asa bacteriológica
6. Alcohol al 70%
7. Cerillos, algodón, etiquetas
8. Incubadora
9. 1 asa de vidrio doblada en forma de L ( asa de Digralsky)
10. 1 pipeta de 1.0 ml.
11. 1 marcador para escribir sobre vidrio ( Sharpie)

12. Medio de agar nutritivo estéril en matraz

13. Placas de Petri estériles

Actividades

1.- Revise el color y la solidez de los agares en placas y tubos.

2.- Revise el color y turbidez de los medios de cultivo líquidos.
3.- Revise el color y grado de solidez del agar blando (medio semisólido).
4.- Inocule una placa y un tubo con agar inclinado de cada medio, por estría
simple, tomando una gota del cultivo microbiano correspondiente con el asa
bacteriológica. ( trazando líneas horizontales sobre el agar, evitando romperlo).
5.- También inocule un tubo de cada caldo, tome una gota del cultivo que
corresponda con el asa bacteriológica y deposítela en el mismo.
6.- Con el filamento del asa extendido tome muestra del cultivo e inocule el agar
blando en tubo haciendo una punción por la parte media del agar.
7.- Con el filamento del asa extendido tome muestra del cultivo e inocule el agar
inclinado con fondo en tubo, haciendo una punción por la parte media del agar
(muy cerca de la pared del tubo, donde el agar es más alto), enseguida retire el
filamento por el mismo sitio y después con el mismo inoculo estríe la superficie
del agar del mismo.
8.- Siembre una caja con agar por estría cruzada, de la siguiente manera.- extienda el
inoculo formando líneas paralelas en un cuadrante de la placa, después si es
necesario queme el asa y ahora gire 90º su placa para cruzar y arrastrar muestra de las
últimas líneas de la estría, realizando otra estría en el siguiente cuadrante, repita este
paso hasta llegar a estriar 4 cuadrantes (caja completa).

9.- Inocule otra caja con agar por extensión en superficie, de la siguiente manera.-
tome 0.1 ml del inóculo (cultivo o muestra) con una pipeta estéril y deposítelo
en la superficie del agar, extienda el inóculo con una varilla de vidrio estéril.

10.- En una placa estéril deposite 1.0 ml del cultivo o muestra utilizando una pipeta
estéril y después añada agar nutritivo estéril fundido a su caja de Petri y deslícela
suavemente sobre la superficie de la mesa desinfectada, para que quede inoculada por
vertido en placa. Permita que el agar de la placa solidifique e inviértala.

11.- Lleve a incubar todos los medios inoculados a 37°C por 24 horas.
12.- Revise el crecimiento microbiano, desarrollo y aislamiento de colonias
bacterianas en cada uno de los medios de cultivo.
13.- Analice y discuta sus resultados en base al crecimiento y aislamiento de los
microorganismos según el método de inoculación utilizado.
14.- Concluya en base a los objetivos planteados como competencias y los
resultados obtenidos.
Resultados y discusiones:

Conclusiones:

Cuestionario:

Literatura consultada:
 PRÁCTICA No. 9

MANEJO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO DE CAMPO CLARO Y

OBSERVACIÓN DE PREPARACIONES MICROSCÓPICAS EN EL
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

Elementos de competencia:

Aprender la correcta limpieza del microscopio óptico de campo claro.

Manejar correctamente el microscopio óptico de campo claro.

Aprender a enfocar en objetivos de 10X, 40X y 100X en el microscopio óptico.

Fundamento

Para la observación y estudio de los microorganismos es esencial contar con un

microscopio óptico compuesto, pues éste es un instrumento que amplifica la imagen de
la célula microbiana que se requiere distinguir y observar, este microscopio consta de
un sistema de iluminación constituido por una fuente de luz, un sistema óptico que
cuenta con tres lentes (condensador, objetivo y ocular) y un sistema mecánico que lo
integra y sujeta lentes y lámpara.
En microscopía óptica para lograr una buena observación se deben tomar en cuenta
tres factores primordiales: amplificación, poder de resolución y contraste.

Amplificación.- A través de la refracción de los rayos de luz mediante un sistema de

lentes de amplificación se forma una imagen del objeto que es mayor a la real, su valor
se obtiene multiplicando el aumento del ocular por el aumento del objetivo que se esté
utilizando.

Poder de resolución.- Es la máxima distancia de aproximación entre dos puntos muy

cercanos que nos permite distinguirlos como entidades independientes; su valor
depende de la longitud de onda de la luz empleada y de la apertura numérica de la
lente del objetivo que se utilice.
Contraste.- Se debe establecer una diferencia entre los índices de refracción de la
célula y el medio que nos permita distinguir la célula. Para aumentar el contraste
generalmente se tiñe la célula con colorantes.

Existen cuatro tipos principales de microscopio óptico compuesto: campo claro, campo
oscuro, contraste de fases y de fluorescencia.

El microscopio de campo claro es el convencional, donde el campo microscópico esta

intensamente iluminado y los objetos se observan oscuros. El aumento máximo útil que
se obtiene con este microscopio es de 1400X, y su poder de resolución máximo se
aproxima a 0.2 micrómetros. En microbiología éste microscopio es el más comúnmente
utilizado. Las preparaciones microscópicas que se manejan son de dos tipos
principales: frescas y secas. Las frescas son películas de líquido entre portaobjetos y
cubreobjetos y la de gota pendiente. Mientras que las preparaciones secas son los
frotis secos y fijados que generalmente son teñidos.

Material:

1.- Laminillas de bacterias y hongos

2.- Alcohol al 70%

3.- Aceite de inmersión

4.-. Microscopio óptico

Actividades

Observación de microorganismos al microscopio óptico

1. Encienda el microscopio óptico, abra el diafragma del mismo y con el revolver

coloque en posición cada uno de los objetivos para que revise la limpieza de
las lentes observando mediante el ocular.
2. Limpie con algodón las lentes sucias.
3. Coloque la laminilla que contiene el microorganismo, sobre la platina del
microscopio.
 4. Enfoque la muestra en objetivo de 10X, usando el macro y micrométrico.
5. Sin desenfocar la muestra, cambie a objetivo de 40X dándole vuelta al
revolver, ajuste el enfoque preciso con el micrométrico.
6. Para observar en objetivo de 100X, mueva el revolver para que coloque una
gota de aceite de inmersión sobre la muestra, pero no desenfoque y coloque
en posición el objetivo mencionado para que enfoque utilizando el
micrométrico.
7. Dibuje sus observaciones al microscopio.
8. Retire la laminilla y limpie con algodón la lente del objetivo de 100X, enfoque y
observe otras laminillas, o bien apague y desconecte el microscopio.
9. Con un algodón limpio retire el aceite de las lentes de los objetivos.

Resultados:

Observaciones al microscopio óptico:

Género bacteriano

Objetivo: 10X Objetivo: 40X Objetivo: 100X

Observaciones:________ Observaciones:________ Observaciones:________

_____________________ _____________________ _____________________
_____________________ _____________________ _____________________
_____________________ _____________________ _____________________
_____________________ _____________________ _____________________
_ _ _

Género de hongos

Objetivo: 10X Objetivo: 40X Objetivo: 100X

Observaciones:________ Observaciones:________ Observaciones:________

_____________________ _____________________ _____________________
_____________________ _____________________ _____________________
_____________________ _____________________
_____________________
_____________________ _____________________ _____________________
_ _ _
Discusiones:

Conclusiones:

Literatura consultada:
 PRACTICA No. 10

MORFOLOGÍA MACROSCÓPICA DE BACTERIAS

Elementos de competencia:

Manejar correctamente la inoculación de los cultivos, utilizando la técnica de la

transferencia aséptica.

Realizar adecuadamente la inoculación y aislamiento de microorganismos en medios

de cultivo.

Revisar la morfología de las colonias bacterianas de los cultivos proporcionados.

Revisar morfología colonial a su problema del PIA.

Comprender la importancia de conocer y revisar la morfología macroscópica de un

género bacteriano que se requiere diferenciar e identificar.

Fundamento:

Para inmovilizar y aislar células microbianas son utilizados medios de cultivo

sólidos, inicialmente se utilizó gelatina como agente solidificante, posteriormente
se introdujo el uso del agar en lugar de la gelatina. Cuando se multiplican una o
varias células bacterianas de la misma especie, estas dan origen a una masa
celular que se observa a simple vista y que se conoce como colonia bacteriana.
Las características de las colonias bacterianas son utilizadas con dos finalidades,
una es llegar a una identificación presuntiva o bien servir como guía en la
selección de pruebas para la identificación de una bacteria.

Para estudiar la morfología de las colonias se pueden utilizar cultivos creciendo en

placas con agar, donde las características consideradas son: tamaño, forma,
margen, elevación, cromogénesis, densidad óptica y consistencia (textura). Dichas
características van a depender del tipo de bacteria que se trate además del medio
de cultivo y de las condiciones de incubación empleados.
Características de las colonias bacterianas (Morfología colonial) en agar.

(1) Tamaño: diámetro en milímetros.

(2) Forma: circular, puntiforme, fusiforme, filamentosa, irregular y rizoide.

(3) Elevación: plana, elevada, convexa, monticular, embonada y umbilicada.

(4) Margen: entero, ondulado, lobulado, aserrado, filamentoso y rizado.

(5) Color: blanco, amarillo, rojo, verde, naranja, etc.

(6) Densidad óptica: transparente, translúcida y opaca.

(7) Consistencia: butirosa, viscosa, membranosa y quebradiza.

Material:

1. Cultivos líquidos de 24 horas de incubación de Escherichia coli, Bacillus subtilis,

Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa.

2. Mechero

3. Asa bacteriológica

4. 1 placas de Petri con agar nutritivo estéril

5. 1 gradilla para tubos de 13 x 100

6. Algodón, etiquetas, cerillos y una regla

7. Alcohol al 70%

8. Incubadora a 37ºC

9. Cultivo problema
ACTIVIDADES

Estría cruzada cuatro cuadrantes

1.- Inocule por estría cruzada la superficie del agar de las placas, tomando con el asa
bacteriológica estéril una gota del cultivo microbiano que va a extender sobre el agar
de la siguiente manera.- extienda el inoculo formando líneas paralelas en un cuadrante
de la placa, después si es necesario queme el asa y ahora gire 90º su placa para
cruzar y arrastrar muestra de las últimas líneas de la estría, realizando otra estría en el
siguiente cuadrante, repita este paso hasta llegar a estriar 4 cuadrantes (caja
completa).
2.- Incube las placas a 37ºC por 24- 48 horas.
3.- Observe y determine a cada una de los géneros las características de las
colonias desarrolladas, basándose en el cuadro de características de las colonias
bacterianas.

PROBLEMA del PIA

1.- Inocule por estría cruzada su problema en una placa con agar nutritivo (para
obtener colonias aisladas).

2.- Incube a 37ºC por 24 – 48 h.

3.- Revise y reporte la morfología macroscópica de su muestra problema.

Resultados:

Elabore y reporte en una tabla, la morfología colonial de cada uno de los géneros
bacterianos utilizados en la práctica.

Discusiones:

Conclusiones:
Literatura consultada:
 PRÁCTICA No. 11

TINCIÓN SIMPLE Y TAMAÑO RELATIVO DE LA CÉLULA

BACTERIANA

Elementos de competencia:

Manejar correctamente la inoculación de los cultivos, utilizando la técnica de la

transferencia aséptica.

Realizar adecuadamente la inoculación y aislamiento de microorganismos en medios

de cultivo.

Conocer y realizar preparaciones frescas y tinciones simples a células microbianas

Comprender la importancia de conocer y revisar la morfología microscópica de un

género bacteriano que se requiere diferenciar e identificar.

Fundamento

Con la finalidad de incrementar el contraste en la observación de muestras al

microscopio de campo claro, se introdujo el uso de las tinciones, estás se llevan a
cabo utilizando una o más soluciones colorantes. Los colorantes son compuestos
químicos orgánicos constituidos por uno o más anillos de benceno que presentan
radicales cromóforos y auxocromos; los colorantes pueden presentar carga
positiva (catiónicos) que se combinan con componentes celulares cargados
negativamente como ácidos nucleicos y polisacáridos ácidos o carga negativa (
aniónicos) que reaccionan con los componentes celulares con carga positiva.

En la bacteriología se manejan tres tipos de tinciones: simples, especial y

diferencial, que nos permite impartir color(es) a la célula bacteriana. La tinción
simple nos muestra la morfología microscópica de la célula, la cual incluye forma,
disposición o agrupación y tamaño relativo.

Las bacterias presentan tres formas típicas: esférica, cilíndrica y espiral, mientras
que la manera de disponerse varía: pueden ser libres, agruparse en parejas o
cadenas.
Material:

1. Cultivos en agar nutritivo de 24 horas de incubación de Escherichia coli, Bacillus

subtilis, y Staphylococcus aureus.

2. Mechero

3. Asa bacteriológica

4. Portaobjetos y cubreobjetos

5. Frasco gotero con agua destilada

6. Algodón, etiquetas, cerillos y una regla

7. Alcohol al 70%

8. Vasos desechables

9. Colorantes: cristal violeta, safranina

10. Aceite de inmersión

11. Microscopio óptico con objetivos de 100x

Actividades

Elaboración de preparaciones frescas

1.- Coloque una gota de agua destilada sobre un portaobjetos limpio y etiquetado,
enseguida con el asa estéril y bajo condiciones de asepsia tome una pequeña
porción de una colonia bacteriana y suspéndala en el agua destilada, para ahora
con un cubreobjetos formar una película del líquido sin burbujas, entre el
portaobjetos y cubreobjetos.

2.- Observe la preparación al microscopio en los objetivos antes mencionados,

procurando evitar que se seque.
Elaboración de preparaciones secas

1.- Coloque sobre la superficie de un portaobjetos limpio y etiquetado, una gota

pequeña de agua destilada.

2.- Tome una asada del cultivo correspondiente bajo condiciones asépticas y

deposítela sobre la gota de agua, extienda la muestra para obtener un frotis

delgado.

3.- Deje secar el frotis al aire.

4.- Fije el frotis al calor, pasándolo varias veces sobre la flama del mechero,

manteniendo la superficie del frotis hacia arriba (no caliente demasiado).

5.- Cubra el frotis con unas gotas de un colorante básico ( cristal violeta) y deje

que actúe por 60-90 segundos.

6.- Lave su frotis con agua de la llave, procurando que el agua no barra con su

preparación.

7.- Séquelo al aire.

8.- Examine el frotis al microscopio óptico de campo claro.

Resultados

Preparación Fresca

Observaciones al microscopio óptico:

Género bacteriano

Objetivo: 10X Objetivo: 40X Objetivo: 100X

Observaciones:________ Observaciones:________ Observaciones:________

_____________________ _____________________ _____________________
_____________________ _____________________ _____________________
_____________________ _____________________ _____________________
_____________________ _____________________ _____________________
_ _ _

Preparación Seca

Género de bacterias

Objetivo: 10X Objetivo: 40X Objetivo: 100X

Observaciones:________ Observaciones:________ Observaciones:________

_____________________ _____________________ _____________________
_____________________ _____________________ _____________________
_____________________ _____________________ _____________________
_____________________ _____________________ _____________________
_ _ _
 Género de Hongo

Objetivo: 10X Objetivo: 40X Objetivo: 100X

Observaciones:________ Observaciones:________ Observaciones:________

_____________________ _____________________ _____________________
_____________________ _____________________ _____________________
_____________________ _____________________ _____________________
_____________________ _____________________ _____________________
_ _ _
Discusiones:

Conclusiones:

Literatura consultada:
 PRÁCTICA No. 12

TINCION DE GRAM
Elementos de competencia:

Conocer la técnica de tinción de Gram para aplicarla adecuadamente en la

identificación de cultivos bacterianos.

Comprender el fundamento de la técnica de Gram para entender el mecanismo

fisiológico que sucede en la pared celular bacteriana cuando se somete a dicho
proceso.

Fundamento:

Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse

en dos grupos, Grampositivas y Gramnegativas que tiñen de forma distinta debido
a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared
de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así como
para prevenir la lisis osmótica. La mayoría de los colorantes son compuestos
orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares.
Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas
positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes
celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los
polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el
cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas
negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados
positivamente, como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la
fucsina ácida y el rojo Congo.
Material y equipo
Asa bacteriológica
Portaobjetos
Mechero de Bunsen
Microscopio y papel seda.

Reactivos
Agua Destilada
Colorantes y soluciones de Gram: Cristal Violeta, Yodo de Gram, Solución de
Alcohol-Acetona y Safranina
Aceite de Inmersión

Muestras Biológicas
Cultivos de microorganismos Grampositivos y Gramnegativos

Actividades

1) Coloque una pequeña gota de agua destilada en un portaobjeto.

2) Retire la torunda o tapón del cultivo proporcionado
3) Tome una asada del mismo y cierre el cultivo después de flamear lo boca
del tubo.
4) Emulsione la asada con la gota que colocó en el portaobjetos.
5) Deje secar al aire.
6) Coloque un pedazo de cinta masking tape en una orilla del portaobjeto de
manera que reconozca el lado donde puso la emulsión.
7) Fije la emulsión microbiana pasando el portaobjetos por encima de la flama
del mechero y deje enfriar.
8) Cubra la preparación por 1 min con cristal violeta.
9) Retire la preparación y enjuague a chorro de agua ( procure colocar un
recipiente que capture el agua de enjuague)
10) Cubra la preparación por 1 min con yodo de Gram
11) Enjuague con agua de la llave como en el paso 9.
 12) Agregue unas gotas de alcohol acetona para decolorar (~ 10 seg).
13) Enjuague con agua de la llave.
14) Cubra con el colorante de contraste safranina por 1 min.
15) Enjuague con agua de la llave y deje secar al aire.
16) Visualice la preparación en el microscopio.

Resultados:

Dibuje la morfología de los microorganismos observados y coloree de acuerdo a la tinción

obtenida.

Microorganismo:__________________ Microorganismo:__________________

Gram obtenido: ___________________ Gram obtenido: ___________________

Agrupación: ______________________ Agrupación: ______________________

Consulte el Gram de las siguientes bacterias y su morfología

BACTERIA GRAM MORFOLOGÍA

Streptococcus pneumoniae
Staphylococcus aureus
Bacillus thuringiensis
Listeria monocytogenes
Shigella dysenteriae
Diplococcus pneumoniae
Bacillus stearothermophilus
Salmonella typhi
Streptoccoccus pyogenes
Bradyrhizobium japonicum

LITERATURA CONSULTADA: