COLORACION ZIEHL-NEELSEN

PRINCIPIO
La Coloracin de Ziehl-Neelsen es una coloracin diferencial til en la identicacin de Micobacterias, aunque no permite la diferenciacin de distintas especies. La caracterstica de cido-resistencia de estos microorganismos hace de esta coloracin un mtodo rpido en el diagnstico, presuntivo, de infeccin micobacteriana. Las micobacterias son coloreadas de rojo por la Fucsina y retienen el color a pesar de la accin del cido y del alcohol Esta coloracin es til en la deteccin de bacterias del gnero Micobacterium en muestras de esputo. La presencia de bacilos rojos sobre fondo azul constituye un diagnstico casi definitivo de tuberculosis. La Coloracin de Ziehl-Neelsen utiliza tres reactivos. El colorante primario es la fucsina que tie toda la preparacin de rojo brillante. Como mordiente se utiliza flameado de la preparacin con el colorante. La solucin decolorante elimina el colorante primario excepto el de los bacilos cido alcohol resistente. (BAAR). Por ltimo el azul de metileno tie de azul el resto de la preparacin. Los BAAR se observan en rojo, todo el resto (contraste) aparece en celeste o azul.

UTILIDAD
Diagnstico de enfermedades infecciosas producidas por: a. Micobacterias Micobacterium tuberculosis (Tuberculosis) y Mycobacterium leprae (Lepra). b. Bacterias del gnero Nocardia Nocardiosis (similar a tuberculosis) y Micetoma actinomictico (micosis subcutnea).

FUNDAMENTO
Los BAAR poseen una pared celular rica en lpidos y cidos carboxlicos (cido miclico) que tienen la propiedad de unirse excepcionalmente fuerte al colorante frio (fucsina de Ziehl) cuando se usa el calor como mordiente. Una vez que se forma este complejo colorante-pared, ni siquiera la accin conjunta del cido y del alcohol puede deshacerlo, ya que las paredes retienen el colorante en forma "resistente".

TECNICA
Se realiza el frotis. Se aplica el colorante frio sobre la muestra y se deja reposar. Luego se emplea la llama de un mechero para calentar la muestra hasta la aparicin de vapores blancos. El calor se emplea como mordiente, gracias al calor los lpidos de la pared dejan pasar el colorante para que se combine con los cidos carboxlicos de la pared, as se forma el complejo colorante-pared. Se deja reposar y se lava con

agua. Las bacterias que no han formado el complejo en su pared (no BAAR) no retendrn el colorante, el exceso del mismo ser arrastrado por el agua. Se aplica el colorante 2rio, se deja reposar y se lava con agua.

FUNCION DE: LA Fucsina-Fenicada, Acido-Alcohol, Azul de Metileno

Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos (cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracin con alcohol-cido, despus de la coloracin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol resistente. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parsitos coccdeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificacin de lo cidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energa cintica de las molculas del colorante lo cual tambin facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloracin son de color rojo y la que no se ven de color azul, ya que se utiliza azul de metileno como coloracin de contraste. En el mtodo de coloracin de Ziehl-Neelsen, se utilizan loas sustancias: 1.- Fucsina-fenicada (se recomienda mas esta aunque se puede utilizar cristal violeta) 2.- Acido-alcohol (decolorante) 3.- Azul de metileno (tambin se puede utilizar verde de malaquita para mejor contraste) La fucsina-fenicada debe aplicarse con calor para que el colorante penetre las paredes de las Mycobacterias, que tienen altas cadenas de lpidos y ceras. Al aplicarse el acido-alcohol, las bacterias acido-alcohol resistentes no se desteirn, mientras que otras que tal ves se tieron se decoloraran, mostrando al microscopio solo las BAAR, por ultimo el azul de metileno, se aplica como colorante de contraste pero tambin se puede utilizar el verde de malaquita, en si la funcin del cristal violeta en la coloracin de Ziehl-Neelsen es teir las Mycobacterias con la aplicacin del calor, pero se recomienda mejor la fucsina-fenicada.

PROCEDIMIENTO DE LA COLORACION DE ZIEHL-NEELSEN Coloracin

Disponer dos varillas de vidrio en forma paralela, a una distancia de aproximadamente 5cm entre una y otra una sobre un soporte dentro del lavabo/pileta de coloracin; Filtrar la cantidad de fucsina necesaria para las tinciones a realizar en la jornada. Si el nmero de baciloscopias a colorear es pequeo, se puede filtrar la fucsina directamente cuando se la deposita sobre el extendido a travs de un pequeo embudo con papel de filtro.

Colocar sobre el soporte las lminas fijadas conservando el orden numrico con el extendido hacia arriba y manteniendo una separacin de al menos 1cm entre ellas. Cubrir totalmente la superficie del extendido con fucsina bsica fenicada recin filtrada. Dispensar el colorante con suavidad, sin salpicar y sin tocar con el gotero o con el embudo los extendidos. Con la llama de un hisopo embebido en alcohol calentar suavemente por debajo de los extendidos, con movimientos de vaivn, hasta que observe que se desprenden los primeros vapores blancos. No calentar con mechero. En caso de derrame del colorante, reponer la fucsina, no dejar secar el preparado. En el trmino de aproximadamente 5 minutos calentar tres veces hasta emisin de vapores; esto es suficiente para que la fucsina penetre adecuadamente en el bacilo y se fije a sus lpidos. No hervir la fucsina porque la pared de los bacilos puede destruirse y colorearse mal. Con una pinza, levantar cuidadosamente la lmina portaobjetos desde el extremo ms cercano al operador. Enjuagar con abundante agua a baja presin, con un frasco o un grifo. Lavar muy suave y cuidadosamente la superficie eliminando totalmente la solucin de fucsina. Girar el extendido y lavar con cuidado tambin la parte posterior. Inclinar el portaobjetos para eliminar el exceso de agua y as evitar diluir los reactivos que se utilizarn a continuacin.

Decoloracin
Cubrir la totalidad del extendido con solucin decolorante y dejar actuar aproximadamente 3 minutos. Enjuagar con abundante agua a baja presin. Verificar que el extendido se ha decolorado (las partes ms gruesas del extendido a lo sumo conservan un leve tinte rosado). Si se observan cmulos rojos o coloracin rosada intensa, volver a cubrir con solucin decolorante, dejarla actuar entre 1 y 3 minutos y enjuagar nuevamente. Eliminar el exceso de agua inclinando el portaobjetos.

Coloracin de fondo
Cubrir todo el extendido con solucin de azul de metileno. Dejar actuar durante un minuto. Enjuagar las lminas en ambas caras con agua a baja presin y limpiar la parte inferior con un algodn si ha quedado coloreada. Observar si las lminas conservan la numeracin clara y visible. Si no es as volver a numerarlas. Dejar secar las lminas a temperatura ambiente, apoyndolas en posicin vertical en un soporte sobre un papel absorbente. No apoyar papel absorbente sobre el extendido.

COLORACION DE ZIEHL NEELSEN

CUBRIR CON FUCSINA FILTRADA

CALENTAR HASTA EMISIN DE VAPORES TRES VECES DURANTE 5 MINUTOS

LAVAR CON AGUA

CUBRIR CON DECOLORANTE DURANTE 3 MINUTOS

LAVAR CON AGUA

CUBRIR CON AZUL DE METILENO DURANTE 1 MINUTO

LAVAR CON AGUA

SECAR AL AIRE