M Ccba LB 03

Manual de Preparación de Medios de Cultivo, Colorantes y Soluciones
Código: M-CCBA-LB-03 Revisión: 03 Página: 1 de 35

Fecha de emisión: Fecha de modificación:
19 de abril de 2010 31 de agosto de 2016
Manual de
Preparación de Medios
de Cultivo, Colorantes y
Soluciones
ÍNDICE
Objetivo / Pág. 4
Alcance / Pág. 4
Políticas / Pág. 4
Contenido, Introducción / Pág. 5
Medios de Cultivo / Pág. 6
Requerimientos necesarios para el crecimiento bacteriano / Pág. 6
Proteínas / Pág. 6
Carbohidratos / Pág. 6
Factores accesorios del crecimiento / Pág. 7
Sales minerales / Pág. 7
Atmósfera / Pág. 7
Temperatura / Pág. 7
Luz / Pág. 7
pH / Pág. 7
Preparación de Medios de Cultivo / Pág. 8
Ajuste de pH / Pág. 8
Esterilización / Pág. 9
Vertido de placas / Pág. 9
Clasificación de los Medios de Cultivo / Pág. 9
Control de Esterilidad de los Medios de Cultivo / Pág. 11
Control de Calidad de los Medios de Cultivo / Pág. 12
Control de caducidad de los Medios de Cultivo / Pág. 12
Medios de Cultivo básicos usados en el laboratorio / Pág. 15
Preparación de Colorantes / Pág. 23
Cristal violeta / Pág. 23
Lugol / Pág. 23
Alcohol acetona / Pág. 23
Safranina / Pág. 23
Colorante Wayson / Pág. 23
Azul de metileno alcalino (Tinción de Hansen) / Pág. 24
Solución acuosa de safranina / Pág. 24
Azul de Metileno Alcalino Loeffler / Pág. 24
Fucsina Fenicada (Tinción de Ziehl -Neelsen) / Pág. 25
Alcohol Acido (Tinción de Ziehl-Neelsen) / Pág. 25
Verde Malaquita al 5 % (Tinción de esporas) / Pág. 25
Safranina al 5 % (Tinción de espora) / Pág. 26
Sulfato de cobre al 20 % (Tinción de cápsula) / Pág. 26
Fucsina básica (Tinción de cápsula) / Pág. 26
Fucsina fenicada (Tinción de Campylobacter) al 0.8 % / Pág. 26

Preparación de soluciones / Pág. 27
Indicador de rojo de metilo / Pág. 27
Soluciones, empleadas para la prueba (Reducción de nitratos) / Pág. 27
Reactivo de Kovac / Pág. 28
Reactivos empleados para la prueba de Voges Proskauer / Pág. 28
Hidróxido de potasio (KOH) 40 % agente oxidante / Pág. 28
Peróxido de hidrógeno al 30% / Pág. 29
Solución salina fisiológica 0.85 % / Pág. 29
Preparación de HCl 0.1 N / Pág. 29
Solución Verde Brillante al 0.1 % (Salmonella) / Pág. 29
Estándar sulfato de bario (para ANTIBIOGRAMAS) / Pág. 30
Solución buffer fosfatos para alimentos (PBS) / Pág. 31
Agua peptonada concentrada para salmonella en aves (APC) / Pág. 31
Agua peptonada diluida para salmonella en carne molida / Pág. 31
Buffer fosfatos para salmonella en aves / Pág. 31
Preparación de Lugol para Tetrathionate / Pág. 32
Preparación del hipurato de sodio al 1 % / Pág. 32
Solución de fosfatos para mantener remojados los electrodos / Pág. 32
Solución buffer diluyente para bacteriológico de alimentos / Pág. 32
Soluciones para ajustar pH de muestras / Pág. 33
Solución de Hidróxido de Sodio 1,0 N / Pág. 33
Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada) / Pág. 33
Agua Peptonada / Pág. 34
Documentos de Referencia / Pág. 35
Glosario / Pág. 35
Control de Revisiones / Pág. 35
I. OBJETIVO
Describir los diferentes medios de cultivo que se utilizan en el laboratorio de

Bacteriología, su clasificación, requerimientos, preparación, así como su control de calidad,
para el procesamiento de muestras de origen animal.
Proporcionar la información necesaria para la preparación de colorantes y
soluciones utilizadas en el laboratorio de bacteriología.
II. ALCANCE
Aplica a todo el personal del laboratorio de Bacteriología que procese medios de

cultivo, colorantes y soluciones.
III. POLÍTICAS
Todos los medios de cultivo deberan ser preparados y conservados según lo

establecido en este manual.
Todos los colorantes y soluciones mencionados en este manual deben apegarse a las
instrucciones del mismo para su preparación.
IV. CONTENIDO
INTRODUCCIÓN
Para estudiar debidamente los microorganismos se necesita como requisito previo el

cultivarlos en condiciones de laboratorio. Para lograr esto es preciso conocer cuáles son los
nutrientes y las condiciones físicas que requieren. Las distintas mezclas de sustancias
empleadas en el laboratorio para cultivos de bacterias se denominan genéricamente medios
de cultivo.
El medio de cultivo sirve como terreno sobre el que se siembra con fines de estudio, ya
que las necesidades nutricionales de las bacterias varían de manera muy amplia, existen
diferencias muy importantes en cuanto la composición de los medios empleados. Las bacterias
también tienen diferencias notables en lo que respecta a las condiciones del ambiente que
favorece su proliferación. Los medios de cultivo tienen como objetivo:
a. Fomentar el crecimiento microbiano en forma que puedan comprobarse las
características de cultivo.
b. Facilitar algunas reacciones bioquímicas, que luego pueden ser demostrables por
observación directa, o bien indirectamente por subsecuente reacción en presencia de
algunos reactivos adicionales.
Sólo algunos de los muchos compuestos orgánicos que actúan como colorantes se usan
para teñir microorganismos. Se trata de modificaciones de las primeras anilinas obtenidas de
productos del alquitrán, introducidas alrededor de 1880 por Koch, Weigert y Ehrlich en las
técnicas bacteriológicas.
Los colorantes se dividen en ácidos, básicos o neutros. En los colorantes ácidos, como
la eosina, el grupo iónico que imparte color (llamado cromóforo) tiene carga negativa (es un
anión) y forma una sal colorante al combinarse con una base (NaOH). Los colorantes básicos,
como el azul de metileno, son tinturas en la que el ión que lleva al color está cargado
positivamente (un catión), que se combina con un ácido (HCl) para formar la sal colorante. No
todas las tinturas actúan mediante la formación de sales.
Los colorantes neutros como el de Giemsa, son compuestos en los que se mezclan
colorantes ácidos y básicos. Debido a la presencia de abundantes partículas (ribosomas) que
contienen ácido ribonucleico en todo el protoplasma de la célula bacteriana, las tinturas
básicas son las más útiles en bacteriología. Con estos colorantes, la mayoría de las células
bacterianas intactas se tiñen profunda y uniformemente, como los núcleos de las células de
vegetales y animales superiores.
Las soluciones en química, son mezclas homogéneas de sustancias en iguales o
distintos estados de agregación. La concentración de una solución constituye una de sus
principales características. Bastantes propiedades de las soluciones dependen exclusivamente
de la concentración. Su estudio resulta de interés tanto para la física como para la química.
Algunos ejemplos de soluciones son: agua salada, oxígeno, nitrógeno del aire y el gas
carbónico en los refrescos. Todas las propiedades: color, sabor, densidad, punto de fusión y
ebullición dependen de las cantidades que pongamos de las diferentes sustancias. La sustancia
presente en mayor cantidad suele recibir el nombre de solvente, y a la de menor cantidad se le
llama soluto y es la sustancia disuelta.
MEDIOS DE CULTIVO
a) Requerimientos necesarios para el crecimiento bacteriano

1. Proteínas. Se suministran generalmente como peptonas que se encuentran
disponibles en el comercio. Las peptonas se obtienen por diferentes tipos de
digestión ya sea ácida, alcalina o enzimática, consisten en polipéptidos y
aminoácidos, y suministra metabolitos nitrogenados.
2. Carbohidratos. En los medios de cultivo, los carbohidratos son muy usados como
fuente de energía por las bacterias y particularmente, para diferenciar géneros e
identificar especies.
3. Factores accesorios del crecimiento. Son también requeridos por algunas bacterias.
Entre ellos están las vitaminas del complejo B (Tiamina, ácido nicotínico, piridoxina
y biotina). Estas suministran enzimas necesarias para las bacterias que son incapaces
de sintetizar. Otros factores necesarios para algunas bacterias son obtenidas de
nutrimentos más complejos, como el suero, la sangre, la yema de huevo etc.
4. Sales minerales. Elementos con sodio, potasio, calcio, etc.; también son requeridos
por algunas bacterias en su desarrollo.
5. Atmósfera. Algunos microorganismos precisan de una atmósfera con oxígeno para
su desarrollo (aerobios obligados); otros son incapaces de reproducirse en presencia
de oxígeno libre (anaerobios obligados), en tanto que los de un tercer grupo aunque
pueden crecer en una atmósfera con oxígeno, logran sobrevivir y crecer sin él
(anaerobios facultativos) y aquellos que requieren de baja tensión de oxígeno
(microaerofílicos).
6. Temperatura. La temperatura en la cual el microorganismo bacteriano crece mejor,
es considerada temperatura óptima, para la mayoría de las especies patógenas es de
37° C. Los microorganismos importantes en Bacteriología Médica son generalmente
Mesofílicos (límites entre 5 y 43°C), sin embargo hay microorganismos que crecen
entre límites de temperatura mucho más bajas (Psicrofílicos), o bien superiores
(Termofílicos).
7. Luz. La mayoría de las bacterias se desarrollan mejor en ausencia de luz, la luz del
sol con su componente ultravioleta puede incluso ser letal.
8. pH. La mayoría de las bacterias crecen mejor en un medio ligeramente alcalino (pH
7.2 a 7.6), pero existente también un limite de potencialidad bastante amplio. Se
recomienda comprobar el pH y proceder a su corrección si fuera necesario. El valor
del pH de los medios depende mucho de la composición del medio de cultivo, de la
temperatura que tenga este medio de cultivo en el momento de su medición y del
tratamiento a que se halla sometido dicho medio.
b) Preparación de los medios de cultivo

1. Para la preparación de lo medios de cultivo se utiliza agua limpia, destilada o
desmineralizada y cuya reacción sea lo más cercana posible a pH neutro.
2. Los recipientes destinados a su preparación (por lo general Matraces Erlenmeyer) se
limpiarán escrupulosamente, con el fin de eliminar totalmente eventuales residuos de
otras sustancias. Deben ser lo suficientemente grandes para que el medio de cultivo
que se prepara pueda ser agitado con facilidad y concienzudamente.
3. De ser posible no se prepararán más de 1-2 litros por recipiente, si se va a preparar un
litro utilizar un matraz de 2 litros, si se va a preparar 500 mililitros utilizar un matraz
de 1 litro. Primero colocar la mitad del agua destilada al matraz, después agregar el
medio pesado y agitar vigorosamente para añadir después el resto del volumen total
del agua, aprovechando esta adición para desprender e incorporar al conjunto las
partículas del medio de cultivo que hubiera quedado adherida a la pared interna del
recipiente. Los medios de cultivo líquidos no requieren de calentamiento porque no
contienen agar como los medios sólidos. NOTA: Todo tipo de medio de cultivo es
sensible al calentamiento, por este motivo no debe calentarse más de lo
estrictamente necesario.
4. Ajuste de pH. El pH de los medios se ajusta en el momento de la fabricación, sin
embargo, la calidad del agua utilizada para la hidratación o la utilización de
medios no recientes pueden modificar este parámetro por lo que es aconsejable
verificarlo y reajustarlo si fuera necesario. Para realizar esta medición, lo mejor es
utilizar el potenciómetro (peachimetro) o bien utilizar tiras reactivas a pH. Para la
verificación del pH, se debe medir una muestra extraída del volumen total del
medio preparado, tanto en medios líquidos como sólidos. En los casos donde se
deba reajustar el pH, se puede utilizar una solución estéril de ácido clorhídrico
(para acidificar el medio) o hidróxido sódico (para basificar el medio). Si el medio
es sólido la medición y el eventual ajuste se hace a 45°-50°C (aún está liquido) y
en los medios líquidos se hace a temperatura ambiente. La corrección del pH se

efectúa con 0.1 M de HCl o 1M de NaOH tomando una muestra del medio de
cultivo preparado y estéril, se mide el pH y si fuera necesario se ajusta en la
muestra calculando después el volumen de ácido o base que sea requerido para el
total de medio.
5. Esterilización.Si las normas de preparación no indican otra cosa, la esterilización
se lleva a cabo en autoclave, a 121°C, (15 libras) durante 15 minutos. El autoclave
es la forma de esterilización más segura para los medios de cultivo. Si no se
dispone de autoclave, se puede utilizar una olla grande de presión.
6. Vertido de las placas. Para evitar la formación de vapor en las cajas, el medio
debe verterse a una temperatura de 45-55°C, cerca de un mechero Bunsen o en una
campana de flujo laminar, en un área estéril y si es necesario utilizar cubrebocas.
c) Clasificación de los Medios de Cultivo

Los medios de cultivo son fabricados para promover el desarrollo de grupos
bacterianos más o menos homogéneos de bacterias. Como es lógico suponer no todos los
medios de cultivo son utilizados para el cultivo de todas las bacterias, en ocasiones no sólo no
son aptos para el desarrollo de microorganismos en general, sino que además poseen la
capacidad de inhibir a algunos y favorecer el desarrollo de otros. Debe tenerse cuidado de
emplear el medio más adecuado para el aislamiento e identificación de las colonias
bacterianas.
Los medios pueden ser de acuerdo a su:
1. Consistencia.- Líquidos, Semisólidos y Sólidos. La ventaja de estos últimos estriba
en la facilidad para reconocer los tipos de colonias y realizar una descripción
macroscópica (tamaño, color, textura, forma etc.).
2. Función o aplicación.- Simples, De Enriquecimiento, Selectivos, Diferenciales,
Especiales y De Transporte.
3. Medios simples: Son medios que sólo contienen algún extracto de carne u otra
infusión simple, peptona, sal y agua, estos medios son líquidos.
4. Medios enriquecidos: La adición de componentes como sangre, suero o extractos de
tejidos de animales y plantas al caldo nutritivo o agar les proporciona sustancias
nutritivas complementarias para que el medio pueda soportar el crecimiento de las
bacterias exigentes.
5. Medios Selectivos: La adición al agar nutritivo de ciertas sustancias químicas
específicas, por ejemplo, el cristal violeta en concentraciones adecuadas previene el
crecimiento de bacterias Grampositivas sin afectar el desarrollo de variedades de
Gramnegativas.
6. Medios Diferenciales: La adición de ciertos reactivos o sustancias químicas a los
medios de cultivo trae como resultado determinado tipo de crecimiento bacteriano o
de cambios, después de la siembra e incubación del medio, lo cual permite al
observador diferenciar distintos tipos de bacterias. Por ejemplo, si siembra una
mezcla de bacterias en un medio de agar sangre, algunas de las bacterias pueden
hemolizar (destruir) los glóbulos rojos mientras que otras no lo hacen. Cuando
aparece una zona clara alrededor de la colonia bacteriana, es indicativo de que ocurre
la hemólisis. Así es posible distinguir entre bacterias hemolíticas y no hemolíticas
que proliferan en el mismo medio. De hecho, el medio Agar Sangre sirve
simultáneamente como medio de enriquecimiento y diferencial.
7. Medios Especiales: La mayoría de estos medios son empleados para comprobar una
o más características bioquímicas.
8. Medios de Transporte: Son substratos empleados en el transporte y conservación de
especímenes para cultivos de diversos gérmenes como Estreptococos,
Enterobacterias y muchos otros más. Ejemplo solución salina glicerinada de Stuart.
d) Control de Esterilidad de los Medios de Cultivo

Actualmente los medios de cultivo para microorganismos se preparan a partir de
productos deshidratados, suplementados con aditivos de procedencia comercial. Cada vez
que el laboratorio recibe un nuevo lote de medios de cultivo deshidratado, el analista
anotará en la bitácora correspondiente los siguientes datos: la clave asignada en el
inventario, el nombre del medio del cultivo, la marca comercial, el número de lote, la fecha
de recepción, caducidad, cuando se realizó y el día de apertura. Posteriormente el analista,
almacenará y preparará el medio de cultivo, según datos de la firma suministradora,
teniendo en cuenta las siguientes normas:
1. Guardar los medios de cultivo en un área cuya temperatura se encuentre entre los
2-30°C, donde la humedad no exceda el 80% y no incida directamente la luz del
sol.
2. No dejar el frasco del medio abierto más que el tiempo indispensable.
3. Utilizar agua destilada o desionizada para su preparación.
4. Calentar de preferencia en placas calefactoras provistas de imán agitador.
5. Mantener durante un minuto la temperatura de ebullición de los medios sólidos,
los caldos solo se calientan hasta solubilizar sus ingredientes.
6. Comprobar el pH del medio, generalmente estará dentro de los límites expuestos
por el fabricante, si no lo está, se corregirá añadiendo soluciones de NaOH para
alcalinizar ó HCL para acidificar.
7. Esterilizar en autoclave a 121°C (15 libras) durante 15 minutos.
8. Enfriar los medios esterilizados a 48°C-50°C antes de añadir suplementos estériles
y termolábiles.
9. En el momento de la adición los suplementos estarán a temperatura ambiente
(nunca recién salidos del refrigerador).
10. Una parte proporcional da cada lote de fabricación (5%), se aparta para efectuar un
control de esterilidad, que consiste en comprobar la ausencia de crecimiento
después de dos días de incubación a 35° y 5 días a temperatura ambiente, para

descartar hongos.
11. Si no hay crecimiento del grupo control, se mantiene el resto del lote en
refrigeración hasta su utilización (suponiendo que pase el segundo control).
e) Control de Calidad de los Medios de Cultivo

Dada la variabilidad debida a pequeños errores en la preparación de los medios de
cultivo, tanto los generales como los selectivos, es preciso hacer controles periódicos que
permitan comprobar que las bacterias buscadas crecen incluso a partir de células aisladas
(colonias aisladas), además, que las bacterias de la flora general son satisfactoriamente
inhibidas (no crecen salvo cuando se siembra un gran volumen). Este tipo de control de los
medios de cultivo se denomina econométrico. Una parte proporcional de cada lote de
fabricación de medios de cultivo se aparta para ser inoculado, por lo menos con dos
microorganismos control característicos del citado medio. Así por ejemplo, si se quiere
comprobar la calidad de un medio selectivo, se siembra una placa con el germen control
conocido que a priori se sabe que cultiva, y otra, con un germen control que no pueda
crecer. Si el medio de cultivo es diferencial e incluye un determinado azúcar, se inocula una
placa con un germen productor de acidez y otra con un germen inerte. Para estandarizar el
método, las cepas patrón se incuban en caldo durante una noche, y al día siguiente, se
resiembra por agotamiento en estría, con el fin de conseguir un aislamiento.
f) Control de Caducidad de los Medios de Cultivo

Después de emplacar los agares es preciso rotular de forma visible sino sobre cada
placa, alguna etiqueta que indique el nombre del medio de cultivo, la fecha de su
preparación, caducidad, así como de la persona que lo preparó. De esta forma, será fácil en
todo momento identificarlo y conocer el tiempo que separa al gel de su límite de caducidad.
En la tabla 1 se exponen datos sobre el tiempo de almacenaje de algunos medios de

cultivo, partiendo del supuesto que se encuentren en la nevera, e introducidos o no en una
bolsa de plástico.
Tabla 1. Caducidad de los Medios de Cultivo emplacados, según temperatura de

almacenamiento y protección
Medios de Cultivo En nevera a 4°C En nevera a 4°C

Sin bolsa de plástico En bolsa de plástico
Agar Sangre 15 días 50 días
Agar Chocolate 15 días 60 días
Agar Mueller Hinton 15 días 70 días
Agar Mac Conkey 15 días 70 días
Agar Manitol 15 días 60 días
XLT-4 Agar 15 días 60 días
Medios sólidos en general 15 días 70 días
Medios Líquidos 15 días 60 días
Soluciones Preparadas 15 días 120 días
Los medios de cultivo mantenidos en tubo (pruebas bioquímicas u otros), están

sometidos a los mismos controles que los medios emplacados, es decir, previamente deben
pasar un control de esterilidad, después uno de calidad y finalmente, no sobrepasar un
límite de caducidad.
El control de esterilidad se efectúa incubando durante 5 días a 35°C, un lote de
tubos escogidos del grupo al azar, comprobando al final que no tienen crecimiento. El
control de calidad consiste en sembrar en cada tipo de medio, diferencial o de
identificación, por lo menos dos microorganismos con distinta actividad fisiológica o de
crecimiento. En la Tabla 2 se exponen algunos microorganismos que pueden emplearse
para comprobar la calidad de algunos medios entubados.
Tabla 2. Microorganismos utilizados en el Control de Calidad de Medios de Cultivo

mantenidos en tubo
Prueba Bioquímica Microorganismo Características de Reacción

cultivo
TSI Escherichia coli 24 hrs. aerobiosis Acido fondo y superficie
Pseudomona 24 hrs. aerobiosis Alcalino fondo y superficie
aeruginosa
Citrato de Simmons Escherichia coli 24 hrs. aerobiosis No cultiva. Verde(-)
Klebsiella 24 hrs. aerobiosis Cultiva. Azul (+)
pneumoniae
LIA Salmonella 24 hrs. aerobiosis Púrpura fondo y superficie. H2S (+)

Lisina y Hierro Typhimurium
Proteus mirabilis 24 hrs. aerobiosis Rojo fondo, amarillo superficie.
Movilidad (Agar Proteus mirabilis 24 hrs. aerobiosis Cultiva. Desplazamiento lateral.

semi-sólido)
Klebsiella 24 hrs. aerobiosis Cultiva. No desplaza.
pneumoniae
Indol (Kovac) Escherichia coli 24 hrs. aerobiosis Cultiva. Da color rojo.

Klebsiella Cultiva. Da incoloro.
pneumoniae
Urea de christensen Escherichia coli 24 hrs. aerobiosis Cultiva pero no da color.
Proteus mirabilis 24 hrs. aerobiosis Todo el medio rosado.
Klebsiella pneumoniae 24 hrs. aerobiosis Solo el fondo rosa.
Rojo de metilo Escherichia coli 24 hrs. aerobiosis Cultiva. Color rojo

Enterobacter spp. 24 hrs. aerobiosis Cultiva. Color Amarillo
Voges Proskauer Escherichia coli 24 hrs. aerobiosis Cultiva. No da color

Enterobacter cloacae 24 hrs. aerobiosis Cultiva.Da color rojo
Urea caldo Escherichia coli 24 hrs. aerobiosis No cambia
Proteus mirabilis 24 hrs. aerobiosis Color púrpura.
Oxidasa Escherichia coli 24 hrs. aerobiosis No cambia.

Pseudomona 24 hrs. aerobiosis Color purpura.
Catalasa S.aureus 24 hrs. aerobiosis Forma burbujas.

Streptococcus 24 hrs. aerobiosis No forma burbujas.
Coagulasa S. aureus 24 hrs. aerobiosis Coágulo. Positivo

S. epidermidis 24 hrs. aerobiosis No coágulo.
CAMP S. agalactiae 24 hrs. aerobiosis Positivo. Flecha.
Streptococcus spp. 24 hrs. aerobiosis Negativo.
g) Medios de Cultivo Básicos usados en el Laboratorio

Medios de Cultivo Sólidos
1. Base de Agar Sangre. La base de agar sangre es adecuada para aislar y cultivar
diversos microorganismos que crecen con dificultad. Con la adición de sangre,
puede usarse para demostrar la actividad hemolítica. Para la preparación de Agar
Sangre, Agar Chocolate, Agar con Azida de sodio se utiliza la sangre de cordero
desfibrinada.
Obtención de la sangre para su uso en medios de cultivo. La vena yugular es el
sitio de obtención, este se desinfecta perfectamente lavando con agua y jabón, se
rasura y posteriormente se limpia con torundas con alcohol. La sangre se obtiene
con una jeringa estéril de 20 ml y se pasa a un matraz estéril con perlas de vidrio en
condiciones estériles cerca del mechero. La sangre se agita de modo que la fibrina
se elimina y se obtiene la sangre sin hemolizar. La sangre de cordero desfibrinada se
emplea en medios de cultivo como enriquecimiento, pero se usa especialmente para
la determinación de reacciones hemolíticas. Estando desfibrinada la sangre esta
libre de citratos y otros agentes quelantes que pueden interferir con el desarrollo
microbiano, impidiendo que los microorganismos puedan disponer de elementos
esenciales importantes. La sangre desfibrinada se puede almacenar en el
refrigerador hasta ser empleada, no congelar.
Forma de actuación. Su abundante base nutritiva ofrece condiciones óptimas de
crecimiento a todos los microorganismos presentes. El valor del pH de 6.8  2, es
especialmente favorable para la conservación de los eritrocitos y para la formación
de halos hemolíticos claros. Para la determinación de las formas de hemólisis es
adecuado añadir sangre de oveja, recién obtenida, desfibrinada.
Preparación. Al agar esterilizado, fundido y enfriado a 45°-50°C, se le añade
sangre desfibrinada estéril de carnero al 5-10% vertiendo la sangre sobre las paredes
del matraz y se hace rotar suavemente hasta que la sangre este uniformemente
mezclada con el medio, teniendo cuidado de no formar burbujas de aire. El medio

de cultivo preparado es, antes de la adición de la sangre, claro y amarillo parduzco y
posteriormente a la adición de la sangre del color de la misma y no hemolizado.
2. Agar Chocolate. Se utiliza para el aislamiento de microorganismos exigentes

como el Actinobacillus pleuropneumoniae (en nuestro laboratorio) adicionado con
Polienriquecimiento de Bioxon al 1% y extracto de levadura al 5 %.
Forma de actuación. Mediante la adición del Polienriquecimiento se estimula el
crecimiento de Actinobacillus pleuropneumoniae pero pueden crecer otros
microorganismos.
Preparación. La señalada por el fabricante.
3. Agar Mac Conkey. Se utiliza para el aislamiento de Salmonellas, y bacterias
coliformes a partir de heces fecales, para examen de productos lácteos.
Forma de actuación. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben
considerablemente la flora gram-positiva. La lactosa, junto con el indicador de pH
rojo neutro, sirven para la comprobación de la degradación de dicho azúcar.
Interpretación. Las colonias lactosa negativas son incoloras y las lactosa
positivas son rojas con un halo turbio debido de descenso de pH provocado por los
ácidos biliares.
Tabla 3. Interpretación de Agar Mac Conkey
COLONIAS MICROORGANISMOS
Incoloras, transparentes Salmonella, Shigella y otros.
Grandes, rojas, halo turbio. Escherichia coli.
Grandes rosadas mucosa. Enterobacter, Klebsiella.
Diminutas de crecimiento. Enterococos.

4. Agar Manitol Sal. Agar selectivo para la demostración de Estafilococos

patógenos en alimentos y en otros materiales objeto de investigación.
Forma de actuación. Debido a la concentración extremadamente alta de sal,
permite solamente el crecimiento de microorganismos tolerantes a ella, entre los
que se encuentran, entre otros, los del género Staphylococcus. La degradación del
manitol, con formación de ácido, está notablemente relacionada con la
patogenicidad del germen en cuestión y sirve, por lo tanto, como indicativo de la
presencia de Staphylococcus aureus.
Preparación. La señalada por el fabricante. Las placas con medio de cultivo son
claras y de color rojo.
Empleo e interpretación. Debido al potente efecto inhibidor de este medio, debe
sembrarse masivamente. Incubación: hasta 3 días a 37°C.
Tabla 4. Interpretación de Agar Manitol Sal
COLONIAS MICROORGANISMOS
Con halo amarillo, crecimiento Manitol positivo. S. aureus
intenso.
Sin cambio de color, crecimiento Manitol negativo. S. epidermidis y otros.
débil.
5. Medio XLT-4. Para el aislamiento de Salmonella. En combinación con un

enriquecimiento adecuado, con el Agar XLT-4, se puede detectar un número
notablemente mayor de Salmonellas que en otros medios de cultivo selectivos.
Forma de actuación. La degradación de los carbohidratos xilosa, lactosa y
trehalosa produce un viraje a amarillo del Rojo de fenol. El tiosulfato y la sal de
hierro (III) revelan la formación de ácido sulfhídrico por la precipitación de
sulfuro de hierro negro en las colonias. El efecto ihnibidor d este medio de cultivo
es débil.
Preparación. El medio se pesa y se disuelve en el agua se mezcla perfectamente
bien y se añade más agua, se añade el Suplemento (7 ethyl-2-methyl-4-
undecanol-hydrogen sulfate, sodium salt) (utilizar mascarilla) 4.6 ml por litro de

medio, se calienta hasta disolver el agar perfectamente, se hierve unos segundos y
se espera a que tenga una temperatura de 45-50°C. No se esteriliza en autoclave.
El Suplemento se usa con el XLT-4 Agar Base para aislamiento de no Salmonella
typhi. Se almacena en la obscuridad a 15-30°C. Las placas con medio de cultivo
son de color rojo y casi siempre claras.
Interpretación. Sembrar por estrías, en capa fina e incubar a 36 °C por 24-48hrs.
Tabla 5. Interpretación de medio XLT-4

Empleo e
MICROORGANISMO COLONIAS
Escherichia coli, Enterobacter Colonias amarillas, con zona amarilla
spp. alrededor, opacas.
Klebsiella spp. Colonias amarillas, con halo amarillo,
opacas, mucosas.
Proteus spp. Colonias rosadas, ligeramente elevadas,
brillo.
Pseudomona Colonias rojas, planas, rugosas, bordes
irregulares.
Salmonella spp. Colonias rojas, elevadas, brillo, redondas,
lisas.
Medios de Cultivo líquidos
1. Caldo Brain Heart Infusion (BHI). Base para el Cultivo de microorganismos
difíciles entre los que se incluyen estreptococos, neumococos y meningococos.
Forma de actuación. Este medio está basado en el principio de que contiene
pequeñas piezas de tejido de cerebro y puede ser usado para cultivar organismos
fastidiosos. Puede ser usado para la prueba de coagulasa y para sembrar muestras
que necesiten enriquecimiento.
2. Gn Broth, Hajna. Base para el aislamiento de microorganismos Gram negativos

Forma de actuación. La triptosa sirve como base nutritiva. El citrato y el

desoxicolato actúan como agentes selectivos para inhibir el crecimiento de
microorganismos Gram positivos, especialmente Estreptococos fecales, todo tipo
de bacilos esporulantes y ciertas bacterias Coliformes. El manitol favorece
selectivamente el crecimiento de Salmonellas y Shigellas que la utilizan. Un
tampón de fosfatos impide la acidificación precoz del medio de cultivo a cargo de
productos metabólicos ácidos. Caso de estar presentes Proteus y Pseudomona
aeruginosa, estos germenes se multiplican, por regla general poquísimo en las
primeras 6 a 8 horas y más lentamente que Salmonella y Shigella. Este medio
contiene desoxicolato de sodio que inhibe microorganismos Gram positivos,
favoreciendo el desarrollo de Gram negativos entre ellos las Salmonellas.
Empleo e interpretación. Sembrar el caldo de enriquecimiento con el material
objeto de investigación. En caso de heces fecales 1 gr. por 10 ml del medio de
cultivo. Incubar a 36 °C por 24 horas.
3. Caldo de Enriquecimiento Tetrationato. Para el enriquecimiento selectivo de

Salmonellas, a partir de heces fecales y diversos materiales de investigación. El
medio de cultivo basal preparado, puede almacenarse durante largo tiempo, pues el
tetrationato no se sintetiza, a partir del tiosulfato, hasta que se añade el compuesto
de yodo antes del uso.
Forma de actuación. El tetrationato junto con el tiosulfato excedente, inhibe a
Coliformes y otras bacterias acompañantes. En cambio, todas la bacterias
reductoras de tetrationato, como por ejemplo las Salmonellas y Proteus, pueden
multiplicarse más o menos sin obstáculo. El ácido procedente de la reducción del
tetrationato es neutralizado por el carbonato cálcico. Las sales biliares inhiben
considerablemente a todos los microorganismos de presencia no obligatoria en el
intestino. La adición de verde brillante- recomendada por la United States

Pharmacopoeia-sirve, sobre todo, para inhibir a la flora Gram positiva. Dado que
el medio de cultivo con Verde Brillante posee un efecto inhibidor muy intenso,
resulta ventajoso a veces suprimir la adición de Verde Brillante a fin de obtener un
rendimiento satisfactorio de Salmonellas. Según Jefries (1959), el Proteus es
inhibido por la adición de 0.04g/litro de Novobiocina.
Preparación. La señalada por el fabricante. No esterilizar en autoclave. Antes de
su uso, añadir 20 ml/litro de yodo y yoduro potásico, además eventualmente 10
ml/litro de solución al 1% de Verde Brillante y en caso necesario, 0,04gr/litro de
Novobiocina. Evitar todo calentamiento posterior. Al distribuir el medio de
cultivo, repartir homogéneamente el precipitado que eventualmente hubiera
podido formarse. La preparación de la solución de yodo y yoduro de potasio se
realiza de la manera siguiente: Yodo 6 gr; Yoduro potásico 5 gr. mezclar, añadir
agua destilada 20 ml.
4. Caldo de Enriquecimiento para Salmonella según Rappaport y Vassiliadis.

Para el enriquecimiento selectivo de Salmonella con excepción de Salmonella
typhi y Salmonella paratyphi A, en alimentos y otros materiales.
Forma de actuación. El verde malaquita y cloruro de magnesio favorecen el
crecimiento de Salmonella, para el mismo fin sirve la peptona de harina. La
reducción del pH a 5.2 mejora la selectividad.
Preparación. La señalada por el fabricante. El medio de cultivo preparado puede
almacenarse en refrigerador como mínimo durante 7 meses.
Empleo e interpretación. El medio de cultivo se siembra con el material
procedente de otro medio líquido (no deberá ser inoculado con alta cantidad de
inoculo porque perdería su selectividad. Se incuba a 36°C por 24 horas. De este
medio se pasa a los medios sólidos.
5. Base Caldo Rojo de Fenol. Medio de cultivo de ensayo para identificación

bioquímica, mediante la adición de sustancias reaccionantes.
Forma de actuación. Se utiliza con el Caldo lactosado para las pruebas de
Coliformes en agua y otros materiales de investigación. La fermentación de la
sustancia reaccionante, producida por el cultivo sembrado, se pone de manifiesto
por un cambio del color del Rojo de fenol, que vira de rojo a amarillo. Las
sustancias reaccionantes se agregan al 1%.
Preparación. Disolver 15 gr./litro con la sustancia reaccionante al 1%, distribuir
en tubos con tapa de rosca de 12x120, provistos de campanas de DURHAM y
esterilizar en autoclave 15 minutos a 15 libras de presión. El caldo listo para su uso
es claro y de color rojo.
Empleo e interpretación. Para detectar Coliformes en agua se siembran con
volumen de la muestra según lo indique la técnica. Se incuban 24-48 hrs. a 36°C. y
se observa el cambio de color de rojo a amarillo y formación de gas en las
campanas producto de la fermentación del carbohidrato.
6. Caldo Lactosa. Medio de cultivo exento de sustancias inhibidoras para el ensayo

previo orientativo de bacterias Coliformes.
Forma de actuación. La utilización de la lactosa se demuestra con la presencia
del indicador Rojo de fenol base al cambiar de color rojo a amarillo y la
formación de gas en la campana de DURHAM.
Preparación. Disolver 13 gr./litro , en la base caldo Rojo de fenol, distribuir en
tubos con tapa de rosca de 12x125 con campana de DURHAM y esterilizar 15
minutos a 15 libras de presión, pH 6.9 0.1. El caldo preparado es claro y de color
rojo.
Empleo e interpretación. Se añade un volumen determinado de la muestra a

investigar según la técnica correspondiente. Incubar 24-48hrs. a 36°C. Color
amarillo con formación de gas en la campana de DURHAM, nos indica la
presencia de bacterias Coliformes.
7. Caldo EC. Para la demostración selectiva de Coliformes y de Escherichia coli en

aguas alimentos y otros materiales.
Forma de actuación. En tanto que el contenido en lactosa favorece a las bacterias
lactosa-positivas, especialmente Coliformes y E. coli las sales biliares inhiben
notablemente el crecimiento de gérmenes Gram positivos o de especies
microbianas no adaptadas al medio ambiente intestinal. Los gérmenes lactosa
positivos consumen lactosa, con producción de gas.
Preparación. Disolver 37 gr/litro o bien 74 gr/litro, distribuir en tubos provistos
con campana DURHAM y esterilizar en autoclave 15minutos 121°C. pH 6.90.1.
El caldo preparado y distribuido es claro y amarillento.
Empleo e interpretación. El material sometido a investigación proveniente de
una prueba presuntiva en caldo Lactosado, se incorpora directamente al Caldo EC
aproximadamente 100 microlitros. Se incuba a 45°C, si se busca E.coli más otras
Coliformes o a 37°C, si se busca solo la presencia de Coliformes. Turbidez con
formación de gas en el tubo de Durham es un tubo positivo.
PREPARACIÓN DE COLORANTES
CRISTAL VIOLETA.- Almacenar en frasco ámbar.

Cristal violeta (85%) 1 gr.

Etanol (95 %) 20 ml.
Oxalato de Amonio 0.8 gr.
Agua destilada 100 ml.
LUGOL
Cristales de Iodo 1 gr.
Yoduro de potasio 2 gr.
Disolver completamente en 5 ml. de agua destilada, luego adicionar:
Guardar en frasco ámbar.
ALCOHOL- ACETONA
Etanol 95 % 250 ml.
Acetona 250 ml.
SAFRANINA
Safranina 2.5 gr.
Alcohol (95 %) 100.0 ml.
COLORANTE DE WAYSON
Solución " A "
Fucsina básica 0.2 gr.
Alcohol etílico absoluto 20.0 ml.
Azul de metileno 0.75 gr.
Disolver los colorantes en el alcohol.
Solución " B "
Fenol 10 gr.
Solución para empleo.

1. Echar la solución A en B lentamente.
2. Dejar reposar durante 48 horas.
3. Filtrar y guardar en fresco ámbar. Nota: Este colorante ofrece mayor tinción después
de 1 ó 2 años.
AZUL DE METILENO ALCALINO (TINCIÓN DE HANSEN)

Solución " A "
Agua destilada 100.0 ml.
Solución " B "
Hidróxido de potasio 0.04 gr.
Mezclar 3 ml. de solución A + 10 ml. de solución B antes de usarla.
SOLUCIÓN ACUOSA DE SAFRANINA

Safranina 1 gr.
AZUL DE METILENO ALCALINO DE LOEFFLER

Tinción de gránulos metacrómaticos.
Solución " A”
Alcohol etílico (95 %) 30.0 ml.
Disolver completamente: se trata de una solución saturada.
Solución " B "
Para su empleo: Añadir la solución A en la solución B, agitando continuamente. Filtrar

antes de su empleo.
FUCSINA FENICADA (Tinción de Ziehl- Neelsen)

Alcohol etílico (95 %) 10.0 ml.
Fenol cristales 5.0 ml.
ALCOHOL - ÁCIDO (Tinción de Ziehl- Neelsen)

Alcohol etílico (95 %) 97 ml.
HCL Q. P. 3 ml.
1. Azul de metileno de Loeffler. (Tinción de Ziehl- Neelsen)
Alcohol ( 95 %) 30.0 ml.
2. KOH 0.01 % (Tinción de Ziehl - Neelsen)
Agua destilada 100.ml.
Mezclar 1 y 2 agitar continuamente. Filtrar antes de su empleo.
VERDE MALAQUITA AL 5 % (TINCIÓN DE ESPORAS)

Verde malaquita 5 gr.
SAFRANINA AL 5 % (TINCIÓN DE ESPORAS)

Safranina 5 gr.
SULFATO DE COBRE AL 20 % (TINCIÓN DE CÁPSULA)

Sulfato de cobre 20 gr.
FUCSINA BÁSICA (TINCIÓN DE CÁPSULA)

FUCSINA FENICADA (TINCIÓN DE CAMPYLOBACTER) AL 0.8%

Fenol 2.5 ml
Alcohol 100% 5.0 ml
Fucsina Básica 0.8 gr.
Agua destilada 100 ml
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES
INDICADOR DE ROJO DE METILO

1. Disolver 0.1 gr. de rojo de metilo en 300 ml. de alcohol etílico al 95 %.
2. Agregar 200 ml. de agua destilada a la mezcla alcohol-indicador.
Conservación: guardar el reactivo en un refrigerador 4°C mientras no se usa.
SOLUCIONES EMPLEADAS PARA LA PRUEBA REDUCCIÓN DE NITRATOS

Reactivo A
Dimetil alfa naftilamina al 0.6%:
250 ml de agua destilada
100 ml de ácido acético glacial
2.1 ml de dimetil alfa naftilamina
Mezclar en el orden que se mencionan.
Reactivo B
Ácido Sulfanílico al 0.8%:
250 de agua destilada
100 de ácido acético glacial
1.8 gr. de ácido sulfanílico.
Mezclar en el orden mencionado.
Zinc en polvo (reduce el nitrato a nitrito).
Guardar ambos reactivos en el refrigerador (4°C).
Por lo general estos reactivos se mantienen estables durante por lo menos tres meses.
Sin embargo, periódicamente se hará un control de calidad, desechándolos si dan una reacción
negativa o débil con un organismo conocido.
REACTIVO DE KOVAC
Alcohol amílico o isoamílico (puede sustituirse por alcohol butílico)

150 ml.
p- dimetil- amino- benzaldehido 10 gr.
HCl (concentrado) 50 ml.
Preparación: Disolver el aldehído en el alcohol. Agregar lentamente el ácido a la
mezcla aldehído-alcohol. Guardar en el refrigerador a 4°C. Su estabilidad es variable, por lo
tanto se hará todas las semanas un control de calidad, desechando si muestra una reacción
débil o negativa con un organismo positivo conocido.
REACTIVOS EMPLEADOS PARA LA PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER

Alfa naftol 5 %, intensificador del color.
Alfa naftol (1- naftol) 5 gr.
Alcohol etílico (absoluto) 100 ml.
Preparación: Disolver el alfa naftol en menos de 100 ml. de alcohol etílico absoluto.
Trasvasar la solución a un frasco volumétrico de 100 ml. y agregar a alcohol etílico absoluto
c.s.p. 100 ml.
HIDRÓXIDO DE POTASIO (KOH) 40 % AGENTE OXIDANTE

Hidróxido de potasio 40 gr.
Preparación: Pesar rápidamente el KOH y disolverlo en menos de 100 ml. de agua
destilada. Este reactivo es muy higroscópico. Colocar el vaso en un baño de agua fría
circulante para controlar la temperatura. Enfriar y transvasar la solución de KOH a un frasco
volumétrico de 100 ml. agregando agua destilada c.s.p. 100 ml. Guardar en un frasco para
reactivos color ámbar. Rotular perfectamente. Los reactivos deben ser controlados con
cultivos positivos y negativos conocidos antes de su empleo. Guardar los reactivos en el
refrigerador (4°C).
PERÓXIDO DE HIDRÓGENO AL 30 %
Conserve en un frasco ámbar, evitar la innecesaria exposición a la luz. Mantener a 4°C.
SOLUCIÓN SALINA FISIOLÓGICA 0.85 %

Cloruro de sodio (NaCl) 8.5 gr.
Agua destilada c.s.p. 1000 ml.
Disolver en agua destilada, aforar a 1000 ml. y filtrar con papel filtro Whatman No. 40
o equivalente. Esterilizar a 15 libras durante 15 minutos. Mantener en refrigeración a 4°C.
PREPARACIÓN DE HCl 0.1 N

HCl 0.1 N. 3.46/ lit.
P.E. 1.192 = 37.23 gr de HCl
44.3 gr. -------- 100ml .

3.646 gr. -------- X X= 8.23 ml./lit. 4.15 ml. / 500 ml.
Titulación del HCL 0.1 N con - NaHCO3 Q.P.
Pesar 0.15, 0.20, 0.25 gr. NaHCO3
Añadir a cada porción 50 ml de H20 + III gotas de naranja de metilo; a esto dejarle caer el
HCL preparado.
Cálculos: NORMALIDAD= Gr.
Milieq.x Lit.
SOLUCIÓN VERDE BRILLANTE AL 0.1 % (SALMONELLA)

Para inhibir otras bacterias Gram. (-) que no sean Salmonella.
Preparación
Verde Brillante 0.1 gr.
Agua destilada estéril 100.0 ml.
Conservar en frasco ámbar 4°C.
ESTÁNDAR DE SULFATO DE BARIO (PARA ANTIBIOGRAMAS)
Prepare dicho estándar agregando 0.5 ml del Cloruro de Bario (BaCl2) 0.048 M
(1.175% P/V BaCl2 . 2H2O) a 99.5 ml de H2SO4 0.18 M (0.36) (1%). Mezcle agitando las
soluciones en una parrilla agitadora. Verifique la densidad correcta del estándar usando un
espectrofotómetro. La absorbancia a 625 nm debería ser 0.08-0.1 para el estándar 0.5
MacFarland. Distribuir 5 ml dentro de tubos similares a los que se van a usar para preparar los
inóculos. Para evitar la evaporación mantenga sellado los tubos y almacenados a temperatura
ambiente al abrigo de la luz. Agite vigorosamente el estándar antes de su uso para lograr una
turbidez homogénea. Remplace o verifique la confiabilidad de los estándares mensualmente.
TABLA 6. Composición de estándar para turbidez Escala de McFarland.

Estándar de Cloruro de Bario Ácido Sulfúrico Densidad aprox. De
Turbidez N°- diluido 1.175% (1%) bacterias por ml
0.5 0.5 ml 99.5 ml 1 x 108
1 0.1 ml 9.9 ml 3 x 108
2 0.2 ml 9.8 ml 6 x 108
3 0.3 ml 9.7 ml 9 x 108
4 0.4 ml 9.6 ml 12 x 108
5 0.5 ml 9.5 ml 15 x 108
6 0.6 ml 9.4 ml 18 x 108
7 0.7 ml 9.3 ml 21 x 108
8 0.8 ml 9.2 ml 24 x 108
9 0.9 ml 9.1 ml 27 x 108
10 1.0 ml 9.0 ml 30 x 108
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico. Cuando se
indique agua debe entenderse como agua destilada.
SOLUCIÓN BUFFER FOSFATOS PARA ALIMENTOS (PBS)
Na2HPO4 2.3 gr.

NaH2PO4 0.5 gr.
NaCl 9.0 gr.
Agua 1000 ml.
pH 7.2
Distribuir en tubos con 20 ml y esterilizar a 15°C por 15 min. Este PBS es utilizado cuando se
hacen diluciones para muestras de alimento.
AGUA PEPTONADA CONCENTRADA PARA SALMONELLA EN AVES (APC)

Peptona 10 gr.
NaCl 5 gr
Na2HPO4 3.5 gr.
KH2PO4 1.5 gr.
Agua Destilada 100 ml
Distribuir en frascos 2 ml, esterilizar a 15 lib. Por 15 min.
AGUA PEPTONADA DILUIDA PARA SALMONELLA EN CARNE MOLIDA

La misma fórmula pero para 1000 ml de agua destilada y distribuir 100 ml en frascos con tapa
de rosca. Esterilizar a 15 lib. Por 15 min.
BUFFER FOSFATOS PARA SALMONELLA EN AVES

Na2HPO4 2.3 gr.
NaH2PO4 0.5 gr
NaCl 9.0 gr.
Agua destilada 1000 ml
Distribuir 20 ml en tubos con tapa de rosca. Esterilizar 15 lib. Por 15 min.
PREPARACIÓN DE LUGOL PARA TETRATHIONATE
Yodo 6.0 gr.

Yoduro de Potasio 5.0 gr.
Mezclar
Añadir Agua Destilada 20 ml.
PREPARACIÓN DEL HIPURATO DE SODIO AL 1%

Hipurato de sodio 1 gr.
Agua destilada estéril 97 ml
Disolver y repartir en volúmenes de 400 microlitros en tubos de rosca estériles.
Congelar a -20 °C.
SOLUCIÓN DE FOSFATOS PARA MANTENER REMOJADOS LOS

ELECTRODOS
Solución A
NaH 2 PO4 2.78 gr.
Solución B
Na2HPO4 . 7H2O 5.37 gr.
Mezclar: A : 30.0 ml + B: 61 0 ML pH 7.0-7.2
SOLUCIÓN BUFFER DILUYENTE PARA BACTERIOLÓGICO DE ALIMENTOS

KH2PO4 34 gr.
Diluir 1.25 en un litro de agua destilada pH 7.2
Distribuir 9 ml en tubos con tapa de rosca.
SOLUCIONES PARA AJUSTAR pH DE MUESTRAS.
NaOH 1 M 4.0 gr. de NaOH en 100 ml de Agua Destilada

NaOH 3 M 12 gr. de NaOH en 100 ml de Agua Destilada
HCL 1M 8.3 ml de HCl en 100 ml de Agua Destilada
HCL 0.1M 0.83 ml de HCL en 100 ml de Agua Destilada
SOLUCIÓN DE HIDRÓXIDO DE SODIO 1,0 N

Hidróxido de sodio 4,0 g
Agua 100,0 ml
Disolver el hidróxido de sodio y llevar a 100 ml con agua.
SOLUCIÓN REGULADORA DE FOSFATOS (SOLUCIÓN CONCENTRADA)
Fosfato de sodio monobásico 34,0 g

Agua 1,0 l
Preparación: Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7,2 con
solución de hidróxido de sodio 1,0 N. Llevar a un litro con agua.
Esterilizar durante 15 minutos a 121° ± 1,0°C.
Conservar en refrigeración (solución concentrada). Tomar 1,25 ml de la solución
concentrada y llevar a un litro con agua (solución de trabajo).
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml según se requiera.
Esterilizar a 121° ± 1,0°C durante 15 minutos.
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo
deberán ser iguales a los iniciales.
AGUA PEPTONADA
Peptona 1,0 g
Cloruro de sodio 8,5 g
Agua 1,0 l
Preparación: Disolver los componentes en un litro de agua. Ajustar el pH a 7 ± 0,1

con hidróxido de sodio 1,0 N. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml o en cualquier
volumen múltiplo de nueve según se requiera. Esterilizar a 121 ± 1,0°C durante 15 minutos.
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo
deberán ser iguales a los iniciales. Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar
en lugar oscuro a una temperatura entre 0 a 5°C por un tiempo no mayor de un mes, en
condiciones tales que no alteren su volumen o composición.
V. DOCUMENTOS DE REFERENCIA
Código Nombre del documento Lugar de almacenamiento

Manual de Bacteriología Veterinaria. UADY. Mérida
Laboratorio de
N/A Yucatán, México. Autores: Salazar F. M del R.,
Bacteriología
Echeverría C. Pilar E.(2000).
VI. GLOSARIO
CAMP: Nombre que se le da a la prueba que se utiliza para la identificación

presuntiva de Streptococcus del grupo B (Streptococcus agalactiae), su significado es
Christie, Atkins y Munch-Peterson, quienes la describieron en 1944.
VII. CONTROL DE REVISIONES
Nivel de Sección y/o Fecha de

Descripción de la modificación y mejora
revisión página modificación
01 1 Actualización de las firmas. Octubre 2012
Todo el Se modificó la redacción y el número de páginas de
documento cada apartado.
Se cambio la redacción de los párrafos en los
02 apartados de todas las secciones. 31/Agosto/2016
Se anexaron las secciones de preparación de
colorantes y de soluciones.
Se modifico el nombre del manual.
Nota: Esta sección será utilizada a partir de la primera modificación a este
documento. La revisión 00, se mantendrá en blanco.
Elaboró Revisó Aprobó
QFB Ana Ma. Rejón Magaña Dr. José Alberto Rosado Aguilar Dr. José Alberto Rosado Aguilar
Técnico Académico Responsable del Laboratorio Responsable del Laboratorio
Las firmas avalan la responsabilidad de las personas que: elaboran el

documento, revisan su adecuación y aprueban para su implementación
dentro del Sistema de Gestión de la Calidad de la Universidad Autónoma de
Yucatán

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Manual de Preparación de Medios de Cultivo, Colorantes y Soluciones

Código: M-CCBA-LB-03 Revisión: 03 Página: 1 de 35

Fucsina fenicada (Tinción de Campylobacter) al 0.8 % / Pág. 26

Describir los diferentes medios de cultivo que se utilizan en el laboratorio de

Aplica a todo el personal del laboratorio de Bacteriología que procese medios de

Todos los medios de cultivo deberan ser preparados y conservados según lo

Para estudiar debidamente los microorganismos se necesita como requisito previo el

a) Requerimientos necesarios para el crecimiento bacteriano

b) Preparación de los medios de cultivo

en los medios líquidos se hace a temperatura ambiente. La corrección del pH se

c) Clasificación de los Medios de Cultivo

d) Control de Esterilidad de los Medios de Cultivo

después de dos días de incubación a 35° y 5 días a temperatura ambiente, para

e) Control de Calidad de los Medios de Cultivo

f) Control de Caducidad de los Medios de Cultivo

En la tabla 1 se exponen datos sobre el tiempo de almacenaje de algunos medios de

Tabla 1. Caducidad de los Medios de Cultivo emplacados, según temperatura de

Medios de Cultivo En nevera a 4°C En nevera a 4°C

Los medios de cultivo mantenidos en tubo (pruebas bioquímicas u otros), están

Tabla 2. Microorganismos utilizados en el Control de Calidad de Medios de Cultivo

Prueba Bioquímica Microorganismo Características de Reacción

LIA Salmonella 24 hrs. aerobiosis Púrpura fondo y superficie. H2S (+)

Movilidad (Agar Proteus mirabilis 24 hrs. aerobiosis Cultiva. Desplazamiento lateral.

Indol (Kovac) Escherichia coli 24 hrs. aerobiosis Cultiva. Da color rojo.

Rojo de metilo Escherichia coli 24 hrs. aerobiosis Cultiva. Color rojo

Voges Proskauer Escherichia coli 24 hrs. aerobiosis Cultiva. No da color

Oxidasa Escherichia coli 24 hrs. aerobiosis No cambia.

Catalasa S.aureus 24 hrs. aerobiosis Forma burbujas.

Coagulasa S. aureus 24 hrs. aerobiosis Coágulo. Positivo

g) Medios de Cultivo Básicos usados en el Laboratorio

mezclada con el medio, teniendo cuidado de no formar burbujas de aire. El medio

2. Agar Chocolate. Se utiliza para el aislamiento de microorganismos exigentes

Grandes rosadas mucosa. Enterobacter, Klebsiella.

Diminutas de crecimiento. Enterococos.

4. Agar Manitol Sal. Agar selectivo para la demostración de Estafilococos

5. Medio XLT-4. Para el aislamiento de Salmonella. En combinación con un

undecanol-hydrogen sulfate, sodium salt) (utilizar mascarilla) 4.6 ml por litro de

Tabla 5. Interpretación de medio XLT-4

2. Gn Broth, Hajna. Base para el aislamiento de microorganismos Gram negativos

Forma de actuación. La triptosa sirve como base nutritiva. El citrato y el

3. Caldo de Enriquecimiento Tetrationato. Para el enriquecimiento selectivo de

intestino. La adición de verde brillante- recomendada por la United States

4. Caldo de Enriquecimiento para Salmonella según Rappaport y Vassiliadis.

5. Base Caldo Rojo de Fenol. Medio de cultivo de ensayo para identificación

6. Caldo Lactosa. Medio de cultivo exento de sustancias inhibidoras para el ensayo

Empleo e interpretación. Se añade un volumen determinado de la muestra a

7. Caldo EC. Para la demostración selectiva de Coliformes y de Escherichia coli en

CRISTAL VIOLETA.- Almacenar en frasco ámbar.

Cristal violeta (85%) 1 gr.

Solución para empleo.

AZUL DE METILENO ALCALINO (TINCIÓN DE HANSEN)

SOLUCIÓN ACUOSA DE SAFRANINA

AZUL DE METILENO ALCALINO DE LOEFFLER

Para su empleo: Añadir la solución A en la solución B, agitando continuamente. Filtrar

FUCSINA FENICADA (Tinción de Ziehl- Neelsen)

ALCOHOL - ÁCIDO (Tinción de Ziehl- Neelsen)

VERDE MALAQUITA AL 5 % (TINCIÓN DE ESPORAS)

SAFRANINA AL 5 % (TINCIÓN DE ESPORAS)

SULFATO DE COBRE AL 20 % (TINCIÓN DE CÁPSULA)

FUCSINA BÁSICA (TINCIÓN DE CÁPSULA)

FUCSINA FENICADA (TINCIÓN DE CAMPYLOBACTER) AL 0.8%

INDICADOR DE ROJO DE METILO

SOLUCIONES EMPLEADAS PARA LA PRUEBA REDUCCIÓN DE NITRATOS