XXV REUNIÓN DE COMUNICACIONES

CIENTÍFICAS Y TECNOLÓGICAS
Edición 2019

Comportamiento diferencial del veneno de ejemplares

juveniles y adultos de Bothrops diporus
Otto, Bárbara – Van de Velde, Andrea –Nuñez, Sandra - Gómez,
Gabriela – Garcia Denegri, Ma. Emilia

Director de Beca:Garcia Denegri, María Emilia

Correo Electrónico:barbara.v.otto@gmail.com
Palabras Claves: Bothrops diporus, juveniles, serinoproteasas,
metaloproteasas.

-INTRODUCCIÓN:
En Argentina, Bothrops alternatus (“yarará grande”, “crucera”, “víbora de la
cruz”, “urutú”) y Bothrops diporus (“yarará chica”, “yarará overa”, “cabeza
candado”, “yararaca pintada”) son las causantes de la mayoría de los
accidentes ofídicos en todas las provincias. Kochva (1987) establece que el
veneno tiene tres efectos principales que pueden variar en intensidad según
la especie, edad y ubicación geográfica de la serpiente. El primero, el efecto
necrosante que se produce por la acción de miotoxinas. El efecto
coagulante, que se debe a la acción de enzimas procoagulantes sobre la
protrombina y el factor X. Y el efecto hemorrágico, el cual se ocasiona por
daño en el endotelio vascular.
Sin embargo, la composición de los venenos de serpientes varía entre las
diferentes Familias, Géneros y Especies, existiendo también variaciones
intraespecíficas. Además las variaciones, pueden ser de orden geográfico,
estacional, ontogénico o individual. El estudio de las variaciones
ontogenéticas en los venenos de serpiente posee importancia tanto desde
un punto de vista de la ciencia básica como en el campo clínico. Las
variaciones en las propiedades del veneno pueden causar diferentes
sintomatologías en el envenenamiento generado por una misma serpiente
o, en el peor de los casos, la ineficacia del antiveneno (producido
generalmente a partir de veneno de ejemplares adultos) en neutralizar los
efectos del envenenamiento. Por lo tanto, resulta de interés realizar los
análisis de actividad enzimática y su comparación entre distintos ejemplares
adultos y juveniles con el fin de determinar la existencia de variaciones en
las propiedades biológicas del veneno de una misma especie aunque en
estadíos ontogénicos diferentes. Si bien el veneno de Bda ha sido
ampliamente estudiado (Gay et al., 2016), no se cuenta con una
caracterización toxicológica sobre el veneno de individuos juveniles.
En este trabajo se evaluaron actividades bioquímicas y citológicas del
veneno de ejemplares juveniles y adultos de Bothrops diporus de la región
NEA de Argentina.

-MATERIALES Y MÉTODOS:
Materiales:
Veneno. Se trabajó con mezclas de venenos desecados, homogeneizados y
conservados a –20º C de ejemplares juveniles y adultos de B. diporus,
 XXV REUNIÓN DE COMUNICACIONES
CIENTÍFICAS Y TECNOLÓGICAS
Edición 2019

brindados por el Serpentario Provincial de la Dirección de Fauna y Flora de

Corrientes, Argentina.
Línea celular. Se utilizaron las células miogénicas de la línea C2C12
(ATCC®: CRL-1772™) (Yaffe and Saxel, 1977).

Metodologías:
1. Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) al 12% en presencia de
dodecil sulfato de sodio (SDS). Se realizó según el método de Laemmli
(1970) y en presencia de β-mercaptoetano. El gel fue teñido con azul
brillante de Coomassie R-250 al 0,1%.
2. Hemólisis radial indirecta. Se empleó la técnica descrita por Gutiérrez
(1988). Se aplicó una solución de veneno (1 mg/mL) de 15 μL de
juvenil/adulto en cada pocillo. Las placas se incubaron en cámara húmeda
durante 20 h a 37 °C, y luego se midieron los diámetros de los halos de
hemólisis.
3. Determinación del tiempo de coagulación (TC) sobre plasma. Cien μL del
veneno juvenil/adulto (2, 0,5 y 0,0625 mg/mL) se agregaron a 200 μL de
plasma citratado, registrándose los tiempos de coagulación a 37 ºC en
coagulómetro Fibrintimer (Wiener). Valores superiores a 600 s, determinado
en coagulómetro Fibrintimer (Wiener), se consideraron incoagulables.
4. Actividad amidolítica sobre BApNA. La actividad serinoproteinasa fue
ensayada sobre el sustrato cromogénico N-benzoil-arginina-p-nitroanilida
(BApNA) según modificaciones de la técnica descripta por Sant´Ana et al.,
2008. Veinte µl de los venenos juvenil/adulto (4, 3, 2, 1, 0,5 mg/mL) se
enfrentaron a 200 µl de BApNA 7,8 mM (en 13% de dimetilsulfoxido,
concentración final 1 mM) a 30ºC y se midió la absorbancia a 410 nm a
diferentes tiempos durante 50 min.
5. Actividad proteolítica sobre azocaseína. Fue determinada por el método
de Wang y Huang, 2002. El incremento de la absorbancia (450nm) es
directamente proporcional a la actividad proteolítica.
6. Ensayo de citotoxicidad. Se utilizaron mioblastos indiferenciados
obtenidos de monocapas subconfluentes. Al alcanzar la monocapa un 80%
de confluencia, se retiró el medio de cultivo y diferentes concentraciones de
los venenos de Bothrops diporus (adulto/juvenil), se adicionaron a las
células en cultivo (200 µL/pocillo). Luego de tres horas de incubación a
37°C y 5% de CO2 en atmósfera húmeda, la viabilidad celular fue
cuantificada por tinción con el colorante Cristal violeta. La citotoxicidad fue
expresada como porcentaje de viabilidad celular.

-RESULTADOS Y DISCUSIÓN:
La electroforesis en gel (Fig.1) muestra una distribución de proteínas típica
de venenos bothrópicos con masas moleculares entre 14 y 70 kDa en
condiciones reductoras, tanto en adultos como en juveniles no evidenciando
marcadas diferencias. Con respecto a la actividad fosfolipásica medida a
través de la hemólisis radial indirecta, el veneno de B. diporus juvenil (Bdj)
exhibió mayor capacidad hidrolítica, ya que 0,47 µg indujeron un halo
hemolítico de 15 mm de diámetro en tanto que el veneno de individuos
adultos de Bothrops diporus (Bda) requirió 3,75 µg para generar el mismo
halo.
 XXV REUNIÓN DE COMUNICACIONES
CIENTÍFICAS Y TECNOLÓGICAS
Edición 2019

Con respecto a la actividad coagulante, Bdj fue capaz de coagular el plasma

en 13,6 seg mientras que una solución de veneno de Bda de igual
concentración coaguló en 46,2 seg. La actividad amidolítica sólo fue
detectada en el veneno de B. diporus adulto que mostró capacidad de
escindir al sustrato cromogénico (BApNA) solo a la mayor concentración
estudiada (4mg/mL). En relación con la actividad proteolítica, los valores
hallados mediante el ensayo de digestión de la azocaseína indican similitud
en la actividad enzimática de los venenos de los ejemplares adultos y
juveniles, aunque en estos últimos la actividad se vio ligeramente más
elevada a iguales concentraciones. Finalmente, los ensayos de miotoxicidad
sobre C2C12 muestran un comportamiento significativamente diferencial en
las concentraciones mayores donde el veneno de Bda establece una
viabilidad celular menor (20%) que el correspondiente a los individuos
juveniles (30%) (Fig.2), datos además confirmatorios con aquellos
reportados por Bustillo y colaboradores (2009). Los resultados del presente
estudio indican que las diferencias en composición de familia de proteínas
del veneno de Bdj y Bda varían principalmente en relación con la actividad
proteolítica, con lo cual esta expresión diferencial de proteasas podría
corresponder a las distintas estrategias de alimentación o supervivencia que
presentan los vipéridos cuyos venenos son una fuente rica en
metaloproteasas y serinoproteasas. Más aún, los venenos de las especies de
Bothrops contienen numerosas proteínas que inducen varias alteraciones
hemostáticas comprometiendo el sistema plaquetario, coagulante y
fibrinolítico (Sanchez et al., 2007). Con el empleo de sustratos como el
plasma citratado o sustratos sintéticos como el BApNA fue posible detectar
y medir el nivel de actividad de las enzimas comprometidas en estas
alteraciones.
En conclusión, se constató una clara diferencia en el comportamiento de
ambos venenos (Bdj y Bda) observando respuestas diferentes según el
estadío ontogénico de la serpiente, como es el caso de la actividad de las
proteasas y fosfolipasas A2, mientras que otras aparecerían constantes
independientemente al estado de desarrollo del animal. El veneno de B.
diporus juvenil tendría concentraciones más elevadas de metaloproteasas
pro-coagulantes aunque, contrariamente, estas actividades se consideran
bajas si se las compara con los valores obtenidos para individuos juveniles
de la especie B. alternatus, conocida como yarará grande (Garcia Denegri et
al., 2018). Estos resultados aportan valiosa información que podría ser
tenido en cuenta en la producción de sueros antibotrópicos.

Figura 1. Electroforesis SDS-PAGE al

12% (w/v) de veneno de Bothrops
diporus de individuos en estado adulto
y juvenil, en condiciones reductoras.
Marcador de masa molecular:
Fosforilasa b 97 kDa, Albumina 66 kDa,
Ovoalbumina 45 kDa, Anhidrasa carbónica
30 kDa, Inhibidor de Tripsina 20.1 kDa, α-
Lactalbumina 14.4 kDa. (GE Healthcare
Life Science). Tinción Coomasie Blue.
 XXV REUNIÓN DE COMUNICACIONES
CIENTÍFICAS Y TECNOLÓGICAS
Edición 2019

Figura 2. Viabilidad celular de

mioblastos murinos de la línea C2C12,
3 h después de la incubación con los
venenos de Bothrops diporus adultos o
juveniles (2.5 - 25 µg/mL). Las barras
representan la media ±DS (n = 3). * p
< 0.05: veneno de B. diporus adulto
versus de B. diporus juvenil.

-BIBLIOGRAFÍA:
Bustillo, S., Lucero, H., Leiva, L.C., Acosta, O., Kier Joffé, E.B., Gorodner,
J.O. 2009. Cytotoxicity and morphological analysis of cell death induced by
Bothrops venoms from the northeast of Argentina. J Venom Anim Toxins
incl Trop Dis. 15 (1) 28-42.
Garcia Denegri, María E.; Van de Velde, Andrea; Gómez, Gabriela; Nuñez,
Sandra; Otto, Bárbara; Leiva, Laura; Teibler, Pamela. Comparative study of
proteolytic activities of venom from adult and juvenile species of Bothrops
alternatus. XX Jornadas Anuales de la Sociedad Argentina de Biología y XVII
Jornadas de la Sociedad Uruguaya de Biociencias y Segundas Jornadas
Rioplatenses de Biología. 2018, Buenas Aires, Argentina.
Gay, C., Sanz, L., Calvete, J.J. and Pla, D. 2016. Snake Venomics and
Antivenomics of Bothrops diporus, a Medically Important Pitviper in
Northeastern Argentina. Toxins 8, (9) 1-13.
Gutierrez, J.M., Avila, C., Rojas, E. An alternative in vitro method for testing
the potency of the polyvalent antivenom produced in Costa Rica. Toxicon.
1988; 26:411-13.
Kochva, E. y C. Gans. 1970. Salivary glands of snakes. Clinical Toxicol.,
New York, 3 (3): 363-387.
Laemmli, U.K., Molbert, E., Showe, M., and Kellenberger, E., J. Mol. Biol.,
49, 99 (1970).
Sanchez EF, Gabriel LM, Gontijo S, Gremski LH, Veiga SS, Evangelista KS,
et al. Structural and functional characterization of a P-III metalloproteinase,
leucurolysin-B, from Bothrops leucurus venom. Arch Biochem Biophys.
2007;468(2):193-204.
Sant' Ana, C.D., Ticli, F.K., Oliveira, L.L., Giglio, J.R., Rechia, C.G., Fuly,
A.L., de Araújo, H.S.S., Franco, J.J., Stabeli, R.G., Soares, A.M., 2008.
BjussuSP-I: a new thrombin-like enzyme isolated from Bothrops jararacussu
snake venom. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular &
Integrative Physiology 151, 443-454.
Wang, W.J., Huang, T.F., 2002. Purification and Characterization of a Novel
Metalloproteinase, Acurhagin, from Agkistrodon acutus Venom. Thrombosis
and Haemostasis 87, 641-650.
Yaffe, D., Saxel, O. 1977. Serial passaging and differentiation of myogenic
cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature 270, 725-727.
 XXV REUNIÓN DE COMUNICACIONES
CIENTÍFICAS Y TECNOLÓGICAS
Edición 2019

Dias, G.A.; Kitano, E.S.; Pagotto, A.H.; Sant’anna, S.S.; Teixeira Rocha,
M.M.; Zelanis, A. and Serrano, S.M.T. Individual variability in the venom
proteome of juvenile Bothrops jararaca specimens. J. Proteome Res.2013.
DOI: 10.1021/pr4007393.

-AVAL DEL RESUMEN EXTENDIDO

Al final del documento deben firmar y aclarar todos los autores del trabajo…